Summary
Vi presenterer en metode for å evaluere mikroRNA-ekspresjon i nyre og serum hos mus med aldersavhengig nedsatt nyrefunksjon ved kvantitativ revers-transkripsjon polymerasekjedereaksjon.
Abstract
MikroRNA (miRNA) er små, ikke-kodende RNA som består av 21-25 baser. De blir ikke oversatt til proteiner, men arbeider heller for å hindre funksjonen til deres målbudbringer-RNA (mRNA) ved å destabilisere dem og forstyrre oversettelsen. Selv om miRNA-ekspresjonsprofilene i forskjellige museorganer og vev har blitt undersøkt, har det ikke vært noen standardmetoder for rensing og kvantifisering av mus nyre og serum miRNA. Vi har etablert en effektiv og pålitelig metode for å ekstrahere og evaluere miRNA-uttrykket i serum og nyre hos mus med aldersavhengig nedsatt nyrefunksjon.
Metoden bruker kvantitativ revers-transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR), og protokollen krever seks trinn: (1) fremstilling av senescensakselerert musemotstand 1 (SAMR1) mus og senescensakselerert museutsatt (SAMP1) mus; (2) ekstrahering av serumprøver fra disse musene; (3) trekke ut en nyreprøve fra hver mus; (4) ekstrahering av totalt RNA (inkludert miRNA) fra nyre- og serumprøver fra hver mus; (5) syntesen av komplementært DNA (cDNA) med revers transkripsjon fra miRNA; (6) gjennomføre en qRT-PCR ved hjelp av cDNA oppnådd.
Denne protokollen ble brukt til å bekrefte at, sammenlignet med kontrollene, ble uttrykket av miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p signifikant endret i nyre og serum av en musemodell av aldersavhengig nedsatt nyrefunksjon. Denne protokollen klargjorde også forholdet mellom nyre og serum i musemodellen for aldersavhengig nedsatt nyrefunksjon. Denne protokollen kan brukes til å bestemme miRNA-uttrykk i nyre og serum hos mus med aldersavhengig nedsatt nyrefunksjon.
Introduction
Uttrykket av ulike mRNA som spiller viktige roller i både fysiologi og sykdom (f.eks. Betennelse, fibrose, metabolske forstyrrelser og kreft) er kjent for å være regulert av miRNA, som er korte, ikke-kodende RNA som forårsaker nedbrytningen og hemmer transkripsjonen av mRNA1. Det er derfor mulig at visse miRNA kan fungere som nye kandidatbiomarkører og/eller terapeutiske mål for ulike sykdommer 2,3,4,5. Forskning har blitt utført på miRNA-uttrykksprofiler i en rekke museorganer og vev (inkludert hjerne6, hjerte7, lunge8, lever9 og nyre10). Imidlertid er det ingen standard eller etablerte metoder for å ekstrahere og evaluere miRNA i nyrene eller serumet hos mus med aldersavhengig nedsatt nyrefunksjon.
Derfor etablerte vi en protokoll som kan brukes til pålitelig rensing og deteksjon av miRNA-uttrykk i serum og nyre hos mus med aldersavhengig nedsatt nyrefunksjon. Det er seks hovedtrinn i protokollen: (1) tilberedning av både 50 uker gamle SAMR1 hannmus og SAMP1 hannmus; (2) ekstraksjon av blodprøver fra den dårligere vena cava av begge musestammer, med påfølgende bruk av et spitzrør med heparin, etterfulgt av sentrifugering, for å oppnå en serumprøve; (3) nyreprøveekstraksjon fra musene - en silisiumhomogenisator brukes til å homogenisere nyreprøven separat, og prøven overføres deretter til et biopolymer-makuleringssystem på en mikrocentrifuge spin kolonne11; (4) total RNA (inneholdende miRNA) ekstraksjon fra serumprøvene ved bruk av en silikamembranbasert spinnkolonne12 og totalt RNA som inneholder miRNA-ekstraksjon fra nyreprøvene ved bruk av en silikamembranbasert spinnkolonne11; (5) syntese av komplementært DNA (cDNA) fra det totale RNA ved bruk av revers transkriptase, poly (A) polymerase og oligo-dT primer13,14; og (6) til slutt, bestemmelse av miRNA-uttrykk ved bruk av qRT-PCR og et interkalerende fargestoff13,14.
Denne nye protokollen var basert på studier som lyktes i å ekstrahere og evaluere miRNA i ulike typer vev11,12,13. Protokollens biopolymer-shredding-system ble vist å kunne rense høykvalitets totalt RNA fra vev11. Nøyaktigheten og følsomheten til aspekter av denne protokollen som brukes til evaluering av miRNA-uttrykk ved qRT-PCR med et interkalerende fargestoff, er etablert13,14, for eksempel cDNA-syntesen med revers transkriptase, poly (A) polymerase og oligo-dT-primere fra det ekstraherte totale RNA. Den nye protokollen har flere fordeler: enkelhet, tidsbesparelser og reduserte tekniske feil. Det kan dermed brukes til undersøkelser som krever nøyaktig og sensitiv identifisering av nyre- og serum miRNA-profiler. Studier av mange patologiske forhold kan også benytte den nye protokollen.
MiRNA-ekspresjonsprofilene i SAMP1-mus, som er en modell for aldersavhengig nedsatt nyrefunksjon, kan bestemmes som vist nedenfor. Hos mennesker er aldersavhengig nedsatt nyrefunksjon forbundet med utviklingen av nyresvikt og kjennetegnes både av en økning i området for renal interstitiell fibrose og progresjonen av glomerulosklerose15,16. Aldersavhengig nedsatt nyrefunksjon er også et viktig og hyppig trekk ved kronisk nyresykdom og nyresykdom i sluttstadiet15,16.
Protocol
Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av Animal Ethics Committee of Jichi Medical University og utført i samsvar med Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals og dens retningslinjer for bruk og pleie av forsøksdyr. Denne protokollen bruker fire 50 uker gamle SAMR1 hannmus og SAMP1 hannmus (40-45 g).
1. Innsamling av serumprøver
- Forbered følgende for hver mus: 30 G nåler med en 1,0 ml sprøyte, et 1,0 ml spitz sentrifugerrør med heparin, 1,5 ml mikrosentrifugerør, isofluranbedøvelse, korkplate, 70% etanol, to bomullspinner fuktet med fosfatbufret saltvann (PBS), en petriskål med PBS, pinsett og kirurgisk saks.
- Bedøv musen med 1,5% isofluran og hold deg på 1,5%. Administrer et smertestillende middel (Meloxicam 5 mg / kg) subkutant, injiser deretter 1,0 ml 70% etanol i magen og legg det i den bakre posisjonen på korkplaten.
- Bekreft anestesidybden ved at pedaluttaksrefleksen forsvinner. Med pinsett og kirurgisk saks, snitt huden på magen. Klipp musklene og bukhinnen fra blæren til nedre venstre kant av ribbeina.
- Bruk pinsetten til å løfte bukhinnen, og lag et lateralt snitt i øvre kant av bukhinnen med kirurgisk saks. Fortsett snittet langs den laveste kanten av ribbeina.
- Identifiser den dårligere vena cava ved å bruke de to PBS-fuktede bomullspinnene. Stikk en av 30 G kanylene med sprøyten på 1,0 ml inn i vena cava dårligere og trekk deretter sprøyten. Trekk nålen sakte ut av vena cava inferior for å unngå hemolyse. Overfør blodet til 1,0 ml spitzrøret med heparin og bland det deretter ved å invertere røret flere ganger.
MERK: Musen avlives ved cervikal dislokasjon. - Spinn spitzrøret ved romtemperatur (RT), 3000 × g i 10 minutter.
- Aspirer supernatanten sakte, sørg for at den ikke inneholder sediment, og overfør den deretter til et ubrukt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Oppbevar tuben ved −80 °C før bruk.
MERK: Hvis du går videre til trinn 3 umiddelbart, trenger ikke slangen oppbevares ved -80 °C.
2. Innsamling av nyreprøver
- Forbered følgende for hver mus: 2,0 ml kryorør, isofluranbedøvelse, et korkark, 70% etanol, en petriskål med PBS, pinsett og kirurgisk saks.
- Bedøv musen med 1,5% isofluran og hold deg på 1,5%. Administrer et smertestillende middel (Meloxicam 5 mg / kg) subkutant, injiser deretter 1,0 ml 70% etanol i magen, og legg den i liggende stilling på korkplaten.
- Bekreft anestesidybden ved at pedaluttaksrefleksen forsvinner. Bruk pinsett og kirurgisk saks for å lage et snitt i bukhuden. Klipp musklene og bukhinnen fra blæren til nedre venstre kant av ribbeina.
- Bruk pinsetten til å løfte bukhinnen og lage et lateralt snitt i bukhinnens øvre kant med den kirurgiske saksen. Fortsett snittet langs den laveste kanten av ribbeina.
- Identifiser venstre nyre. Refluks det med PBS for å skylle blodet fra karene til nyrene blir en gulaktig hvit farge. Excise hele nyren først ved hjelp av kirurgisk saks for å kutte venstre nyrearterie og vene. Legg nyrene i en petriskål og vask den forsiktig med PBS.
MERK: Musen avlives ved cervikal dislokasjon. - Bruk pinsetten og den kirurgiske saksen til å kutte nyrene i 10 mg prøver (10 mg er en passende prøvestørrelse for neste trinn). Plasser hver prøve av nyrene i sin egen 2,0 ml kryotube. Lukk rørets hette.
- For langtidslagring, overfør hvert kryorør til flytende nitrogen og oppbevar det ved -80 °C.
3. Total RNA-ekstraksjon fra en serumprøve
- Forbered følgende elementer først: en virvelblander, fenol / guanidinbasert lysereagens, 80% etanol, 100% etanol, 100% kloroform, biopolymerspinnkolonner (i 2,0 ml oppsamlingsrør 11), membranforankrede spinnkolonner (i 2,0 ml oppsamlingsrør11), vaskebuffer # 1 (dvs. vaskebuffer som inneholder guanidin og100% etanol i forholdet 1: 2), vaskebuffer # 2 (dvs. vaskebuffer som inneholder guanidin og 100 % etanol i forholdet 1:4), RNase-fritt vann, 1,5 ml mikrosentrifugerør og 2,0 ml mikrosentrifugerør.
- Ta først en 200 μL serumprøve i et 1,5 ml mikrosentrifugerør, og tilsett deretter 1000 μL av fenol / guanidinbasert lysereagens. Vortex blandingen i 5 s.
- Inkuber prøven ved RT i 5 min.
- Tilsett 200 μL kloroform til serumprøven i røret og lukk rørhetten tett. Inverter røret 15x for å blande kloroformen og serumprøven.
- Hver prøve inkuberes ved RT i 3 minutter. Deretter spinner du prøven ved 4 °C i 15 minutter ved 12 000 x g.
- Overfør 300 μL supernatant til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør uten å forstyrre pelleten. Tilsett 450 μL 100% etanol, og virvle røret i 5 s.
MERK: I alle de følgende trinnene plasserer du den membranforankrede spinnkolonnen for separasjon av RNA og DNA i et 2,0 ml oppsamlingsrør for å sentrifugere det. - Fjern deretter 700 μL av prøven, legg den på en membranforankret spinnsøyle og lukk hetten. Spinn kolonnen ved RT i 15 s ved 8 000 × g, og la supernatanten være i kolonnen. Kast pelleten som er igjen i oppsamlingsslangen.
- Tilsett 700 μL vaskebuffer #1 som er en del av serum/plasma-settet (se materialtabellen) i den membranforankrede spinnsøylen for å rengjøre prøven grundig. Lukk kolonnehetten og spinn kolonnen ved RT i 15 s ved 8 000 × g, og la supernatanten være i kolonnen. Kast pelleten som er igjen i oppsamlingsslangen.
- For fjerning av sporsalter, ta 500 μL vaskebuffer #2 og legg den på en membranforankret spinnsøyle. Etter å ha lukket kolonnehetten, spinn kolonnen ved RT i 15 s ved 8 000 × g, og la supernatanten være i kolonnen. Kast pelleten i oppsamlingsslangen.
- For fjerning av sporsalter, ta 500 μL 80% etanol og legg den på en membranforankret spinnsøyle. Etter å ha lukket kolonnehetten, spinn kolonnen ved RT i 15 s ved 8 000 × g, og la supernatanten stå i kolonnen. Kast pelleten i oppsamlingsslangen.
- Spinn den membranforankrede spinnsøylen igjen ved RT i 5 minutter ved 15 000 × g.
- Etter å ha overført den membranforankrede spinnsøylen til et nytt 1,5 ml oppsamlingsrør, tilsett 14 μL RNase-fritt vann til kolonnen for å oppløse det totale RNA. Etter å ha lukket kolonnehetten, vent 5 min med røret igjen ved RT. Spinn kolonnen igjen i 1 min ved 15 000 × g ved RT.
- Oppbevar rørene med prøver ved -80 °C før bruk.
4. Ekstraksjon av totalt RNA fra en nyreprøve
- Forbered følgende elementer først: en silisiumhomogenisator, is, en virvelblander, 100% etanol, 100% kloroform, biopolymerspinnkolonner (i 2,0 ml oppsamlingsrør 11), membranforankrede spinnkolonner (i 2,0 ml oppsamlingsrør11), fenol / guanidinbasert lysereagens, vaskebuffer # 1 (samme buffer som trinn 3.1.), vaskebuffer # 2 (samme buffer som trinn 3.1.), RNase-fritt vann, 1,5 ml mikrosentrifugerør og 2,0 ml mikrosentrifugerør.
- Plasser en 10 mg nyreprøve i silisiumhomogenisatoren, og tilsett 700 μL av fenol / guanidinbasert lysereagens.
- Sett opp homogenisatoren. Trykk og vri homogenisatorens pestle forsiktig mot nyreprøven for å homogenisere prøven. Fortsett å presse og vri pestelen til nyreprøven er fullstendig homogenisert i fenol / guanidinbasert lysereagens.
- For ytterligere homogenisering, ta det homogeniserte lysatet (i et 2,0 ml oppsamlingsrør) og overfør det til en biopolymer spinnkolonne.
- Sentrifuge det homogeniserte lysatet ved RT i 3 minutter ved 14 000 × g og deretter overføre hele den utfelte pelleten til et ubrukt 1,5 ml mikrosentrifugerør for å invertere den utfelte pelleten
- Bland pelletsen med 140 μL kloroform i røret; Lukk deretter rørhetten tett. Inverter røret 15x for å blande lysat og kloroform.
MERK: Kloroformen kan brukes trygt uten hette. - Inkuber prøven ved RT i 2-3 min. Sentrifuge prøven ved 4 °C i 15 minutter ved 12 000 × g.
- Overfør supernatanten (som vanligvis er ~ 300 μL) til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør, uten å forstyrre bunnfallet. Tilsett 1,5 ganger volumet (som vanligvis er ~ 450 μL) av 100% etanol. Vortex blandingen i 5 s.
MERK: I alle de følgende trinnene plasserer du den membranforankrede spinnkolonnen for å separere RNA og DNA i et 2,0 ml oppsamlingsrør for å sentrifugere det. - Last 700 μL prøve på en av de membranforankrede spinnsøylene. Lukk hetten og sentrifuger kolonnen på 15 000 × g i 15 s. Kast det utfelte lysatet som er igjen i oppsamlingsrøret.
- Tilsett 700 μL vaskebuffer #1 i spinnkolonnen for å vaske den grundig. Lukk hetten og sentrifuger kolonnen på 15 000 × g i 15 s. Kast det utfelte lysatet som er igjen i oppsamlingsrøret.
- For fjerning av spormengder av salt, last 500 μL vaskebuffer #2 på den membranforankrede spinnsøylen. Etter å ha lukket kolonnehetten, sentrifuger kolonnen ved 15 000 × g i 15 s. Kast det utfelte lysatet i oppsamlingsrøret.
- Gjenta trinn 4.11.
- Sentrifuge den membranforankrede spinnsøylen igjen i 1 minutt ved 15 000 × g. Kast det utfelte lysatet i oppsamlingsrøret.
- Ta den membranforankrede spinnsøylen og overfør den til et nytt 1,5 ml oppsamlingsrør. Tilsett 30 μL RNase-fritt vann til kolonnen for å oppløse det totale RNA. Etter å ha lukket kolonnens hette, vent i 5 minutter med røret ved RT, og sentrifuger deretter kolonnen i 1 min ved 15 000 × g.
- Overfør det totale volumet av prøven som inneholder totalt RNA til et nytt mikrosentrifugerør. Legg røret på is, og mål den totale RNA-konsentrasjonen ved hjelp av spektrofotometri. Forsikre deg om at den totale RNA-konsentrasjonen er ~ 300-1,500 ng / μL.
- Oppbevar tuber som inneholder prøver ved −80 °C før bruk.
5. Syntese av cDNA med revers transkripsjon av totalt RNA i serum
MERK: Minimumsinformasjonen for publisering av kvantitative sanntids PCR-eksperimenter (MIQE) retningslinjer anbefaler å bruke bedre eksperimentell praksis for å oppnå pålitelige, utvetydige resultater17. I denne protokollen syntetiseres cDNA fra det totale RNA renset i en to-trinns prosedyre ved bruk av revers transkriptase, poly (A) polymerase og oligo-dT-primere.
- Forbered følgende først: en virvelblander, en termisk syklus, åtte-brønns striperør, hetten på hvert åtte-striperør, destillert vann, is, revers transkriptasesett (se materialtabellen)13,14 i smeltet tilstand og 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Start den termiske syklisten.
- Forbered masterblandingsløsningen; for å oppnå totalt 8,0 μL masterblanding per åtte-brønns striperør, tilsett 2,0 μL revers transkriptaseblanding (inkludert i settet) og 2,0 μL 10x nukleinsyreblanding til 4,0 μL revers-transkripsjonsbuffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Plasser 8,0 μL av masterblandingsoppløsningen i hvert rør i et åttebrønns strimmelrør.
- Plasser en 12 μL aliquot av totalt RNA i hvert rør av åtte-brønns striperøret, og lukk rørets hette. Sentrifuge røret for 15 s ved RT og 2000 × g.
- Plasser røret i den termiske syklusen og inkuber i 60 minutter ved 37 °C. Inkuber prøven i ytterligere 5 minutter ved 95 °C min for å syntetisere cDNA.
- Etter inkubasjonen, overfør cDNA til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Fortynn cDNA ti ganger (1:10) med destillert vann. Vortex og sentrifuger røret i 5 s ved RT og 2000 × g.
- Oppbevar fortynnet cDNA midlertidig på is. Oppbevar de fortynnede prøvene ved −80 °C før bruk.
6. Syntese av cDNA med revers transkripsjon av totalt RNA i nyre
MERK: MIQE-retningslinjene oppmuntrer til bedre eksperimentell praksis for å sikre pålitelige og utvetydige resultater17. Denne protokollen bruker revers transkriptase, poly (A) polymerase og oligo dT primere for å syntetisere cDNA fra 1,0 μg renset totalt RNA i en to-trinns prosedyre.
- Forbered først følgende: en virvelblander, en termisk syklus, 1,5 ml mikrosentrifugerør, åttebrønns striperør, hetten til hvert åtte-striperør, destillert vann, is og et omvendt transkriptasesett (se materialtabellen)13,14 i smeltet tilstand.
- Start den termiske syklisten.
- Forbered masterblandingsløsningen; for å oppnå totalt 8,0 μL masterblandingsoppløsning per rør, tilsett 2,0 μL av revers transkriptaseblandingen som er inkludert i settet og 2,0 μL 10x nukleinsyreblanding til 4,0 μL av revers-transkripsjonsbufferen.
- Tilsett 8,0 μL av masterblandingsløsningen til hvert rør i et åttebrønns striperør.
- Juster den totale RNA-tettheten som følger. For separasjon av 1,0 μg totalt RNA fra en nyreprøve med 12 μL RNase-fritt vann, ta en passende mengde totalt RNA og overfør det til destillert vann ved å bruke konsentrasjonen målt som beskrevet ovenfor (i trinn 4.15.).
MERK: I nærvær av DNA-forurensning blir det forurensede DNA forsterket av qRT-PCR. - Utfør den samme prosessen som beskrevet ovenfor i trinn 5.5.-5.8.
7. qRT-PCR av miRNA
MERK: En interkalatormetode brukes for qRT-PCR av miRNAene. Primere brukes til RNA: U6 liten nukleær 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p.
- Forbered følgende: en virvelblander, et sanntids PCR-system, en 96-brønns reaksjonsplate for qRT-PCR, limfilm for 96-brønns reaksjonsplate, selvklebende filmapplikator, en 96-brønns sentrifugerrotor, miRNA-spesifikke primere, et grønt fargestoffbasert PCR-sett som inneholder 2x PCR-masterblanding og 10x universell primer (se materialtabellen)13,14, og et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Vortex følgende etter blanding av dem i et 1,5 ml mikrosentrifugerør: 6,25 μL destillert vann, 1,25 μL hver av 5 μM miRNA-primer oppløst i nukleasefritt vann, 12,5 μL 2x PCR-masterblanding og 2,5 μL 10x universalprimer.
- Klargjør og smelt cDNA syntetisert som beskrevet i trinn 5 (serum) eller trinn 6 (nyre). Vortex og sentrifuger cDNA i 5 s.
- Ta 22,5 μL aliquots av reagenset (som beskrevet i trinn 7.2. ovenfor) og plasser dem separat i hver brønn i 96-brønnsplaten.
- Tilsett en 2,5 μL aliquot av cDNA til hver brønn på platen.
- For å feste limfilmen til platen, bruk limfilmapplikatoren. Sentrifuge platen for 30 s ved 1,000 x g i 96-brønns sentrifugerotoren. Stabiliser reaksjonen på bunnen av hver brønn.
8. Bruke sanntids PCR-systemet og programvaren til å kjøre PCR-sykkelprogrammet
- Begynn sanntids PCR-systemet. Plasser platen som er opprettet, som beskrevet i trinn 7.6. i sanntids PCR-systemet. Endre innstillingene; angi et navn for eksperimentet, og velg deretter 96-brønn (0,2 ml ) som systemets eksperimenttype, Sammenlignende CT (ΔΔCT) som kvantifiseringsmetode, standard som systemkjøringsmodus og SYBR Green Reagents som reagenser for å oppdage målsekvensen.
- Oppgi navn på prøven og mål-miRNA-ene, og navngi prøven og målet miRNA i hver brønn. Tilordne dupliserte prøver for å hente data som er egnet for å bekrefte resultatene, og velg en referanseprøve og den endogene kontrollen. For at fargestoffet skal brukes som passiv referanse, velger du ingen. For å eliminere krysskontaminering av reagens, sett opp negativ revers transkriptase og en ikke-malkontroll for miRNA-uttrykk.
- Deretter må du sørge for at reaksjonsvolumet er satt til 20 μL og PCR-syklusforholdene er satt som følger: 95 °C i 15 minutter, deretter 40 denatureringssykluser ved 94 °C i 15 s, glødning ved 55 °C i 30 s, og til slutt forlengelse ved 70 °C i 30 s.
- Klikk på analyser i systemets programvare for å analysere qRT-PCR-dataene etter at prosessen er fullført. Bekreft at terskellinjen som automatisk velges av programmet, passer for hver brønn.
- Kontroller terskelsyklusverdien (CT) for den endogene kontrollen og mål-miRNA analysert i hver prøve. Bestem CT-verdiene ved skjæringspunktet mellom forsterkningskurven og terskellinjen.
MERK: I denne studien ble RNU6-2 og miRNA-423-5p brukt som endogene kontroller for mål-miRNA-ekspresjonsnivåer, og ΔΔCT-metoden ble brukt til å bestemme de relative ekspresjonsnivåene for hvert mål miRNA18.
Representative Results
For den aldersavhengige musemodellen for nedsatt nyrefunksjon brukte vi 50 uker gamle SAMP1 hannmus som veide 40-45 g. Omtrent 0,8 ml blod ble samlet per mus og overført til et 1,0 ml spitzrør med heparin, invertert og sentrifugert. Hver nyre ble skyllet med PBS, dissekert og lagret i flytende nitrogen for videre analyse. Femti uker gamle SAMR1-mus fungerte som kontroller. Basert på miRNA qRT-PCR-dataene oppnådd ved bruk av denne aldersavhengige nyresviktsmodellen, observerte vi at nyrenivået til miRNA-7219-5p ble signifikant økt og nyrenivået av miRNA-7218-5p ble betydelig redusert i SAMP1-musene sammenlignet med kontrollene (figur 1). Serumnivåene av både miRNA-7219-5p og miRNA-7218-5p ble betydelig økt i SAMP1-musene sammenlignet med kontrollene (figur 2). Ekspresjonsnivåene av miRNA-223-3p endret seg ikke i noen av stammene og mellom nyre og serum (figur 1 og figur 2).
Figur 1: Differensielt uttrykte mikroRNA i nyrene til SAMP1-mus. qRT-PCR-analyse av uttrykket av miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p hos SAMR1-mus (kontroll, n = 4) og SAMP1-mus (n = 4). Dataene er gjennomsnittlige ± standardfeil (feilfelt); T-tester ble brukt til å analysere forskjeller mellom grupper; p < 0,05 ble ansett som signifikant (*p < 0,05), n.s.: ikke signifikant. Forkortelser: miRNA = microRNA; SAMP1 = senescence-akselerert museutsatt; SAMR1 = senescence-akselerert musemotstand 1; qRT-PCR = kvantitativ revers-transkripsjon-polymerasekjedereaksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Differensielt uttrykte miRNA i serum hos SAMP1-mus. qRT-PCR-analyse av uttrykket av miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p hos SAMR1-mus (kontroll, n = 4) og SAMP1-mus (n = 4). Dataene er gjennomsnittlige ± SE (feilfelt); T-test ble brukt for å undersøke signifikante forskjeller mellom gruppene. *p < 0,05 ved t-test. Forkortelser: miRNA = microRNA; SAMP1 = senescence-akselerert museutsatt; SAMR1 = senescence-akselerert musemotstand 1; qRT-PCR = kvantitativ revers-transkripsjon-polymerasekjedereaksjon Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Ekspresjonsnivåene til mål-miRNA-ene ble vellykket bestemt av den ovenfor beskrevne protokollen ved bruk av qRT-PCR. Evalueringen av de ekstraherte miRNA-ene er et viktig skritt i å skaffe meningsfulle qRT-PCR-data. For å bekrefte tilstrekkelig kvalitet på miRNA før qRT-PCR utføres, bør spektrofotometri brukes til å bestemme forholdet mellom absorbans ved 260 nm og forholdet ved 280 nm. DNA-kontaminering kan forekomme, og/eller primerdimerer i hver brønn i reaksjonsplaten kan være til stede hvis qRT-PCR ikke gir en enkelt PCR-forsterkning av forventet lengde og smeltetemperatur, eller hvis den gir en monomodal smeltekurve.
MiRNA-ekspresjonsnivåer kan evalueres ved flere andre metoder enn qRT-PCR, inkludert nordlig blotting, en mikromatrise og ribonukleasebeskyttelsesanalyser. Imidlertid er qRT-PCR-metoden en sensitiv, nøyaktig, enkel og reproduserbar prosedyre som krever et mindre prøvevolum enn de som kreves for nordlige blotting- og ribonukleasebeskyttelsesanalyser19. Siden mikromatriser kan måle uttrykket av titusenvis av miRNA samtidig, kan de brukes til å identifisere kandidat miRNA-markører. Microarray-data viser også en høy samlet korrelasjon med data oppnådd av qRT-PCR20. Det er imidlertid ikke oppnådd enighet om den optimale metoden for å sammenligne mikromatrisedata oppnådd i forskjellige studier21.
Evalueringen av serum miRNA har følgende egenskaper. For det første er det lett å samle serum, og ettersom serum-miRNA er stabile mot frysing og tining, temperatur og syre, kan miRNA være gode biomarkører. For det andre er det høy homologi av miRNA blant arter, og resultatene av dyreforsøk blir lett ekstrapolert til mennesker. For det tredje har serum miRNA vist potensial for bruk som terapeutiske legemidler3. Flere studier har også vist at ekspresjonsnivået av miRNA i organer er korrelert med miRNA i serum22,23,24. I denne studien viste miRNA-223-3p, hvis nyrenivåer ikke viste en signifikant forskjell mellom SAMR1- og SAMP1-musene, heller ingen signifikant forskjell mellom stammen i serumet. I motsetning til dette viste miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p, hvor nyrenivåene viste en signifikant forskjell mellom SAMR1- og SAMP1-musene, betydelige forskjeller mellom stammen i serumet.
Denne protokollen har følgende begrensninger. For det første har nytten ikke blitt verifisert i andre organer som lever og lunge, og for det andre har den ikke blitt testet på andre laboratoriedyr som rotter, hunder og griser. Flere forskningsgrupper har brukt denne protokollen for rensing og påvisning av miRNA ved qRT-PCR og rapportert at denne protokollen muliggjorde rensing av RNA av høy kvalitet fra vev og serum 13,14,22,23,24. Denne metoden har vist seg å ha høy nøyaktighet og følsomhet for å oppdage uttrykket av miRNA 13,14,22,23,24. Resultatene fra denne studien viser at denne protokollen med hell kan oppdage miRNA-uttrykk i serum og nyre hos mus. Derfor kan protokollen brukes til å bestemme serum- og nyre-miRNA-uttrykksprofilene hos mus med en rekke patologier. På grunn av protokollens enkelhet kan et stort antall prøver behandles samtidig. Analyser av uttrykket av mange miRNA i ulike patologiske forhold i nyrene kan dermed bruke protokollen beskrevet her.
Det er visse aspekter av protokollen å huske på. For å unngå nedbrytning av de rensede miRNA-ene som vil oppstå ved romtemperatur, må miRNA-ene holdes på is. Nyreprøvene må homogeniseres til de er helt oppløst i lysisreagenset. Musnyre inneholder en betydelig mengde bindevev som er uoppløselig i lysereagens, og dermed er det nødvendig med en kolonnekvern for ytterligere homogenisering. I tillegg bør det passende endogene kontroll-miRNA (med stabilt uttrykk blant prøvene) valideres gjennom oppsettet av et qRT-PCR-eksperiment. Dette skyldes at forstyrrelsen av forskjellige stoffer under utførelsen av denne protokollen kan endre uttrykksnivåene av endogene kontroll-miRNA, noe som muligens kompromitterer resultatene. Avslutningsvis beskriver dette papiret en qRT-PCR-protokoll for påvisning, rensing og evaluering av miRNA-uttrykk i serum og nyre hos mus med aldersavhengig nedsatt nyrefunksjon.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL spitz with heparin | Greiner-bio-one | 450534 | |
| Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3' |
| miRNA-423-5p primer | Qiagen | MS00012005 | 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3' |
| miRNA-7218-5p primer | Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -3' |
| miRNA-7219-5p primer | Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3' |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miRNeasy Serum/Plasma kit | Qiagen | 217184 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miScript II RT kit (reverse transcription buffer) | Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not disclosed due to confidentiality |
| SAMP1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| SAMR1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| Takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer |
References
- Huang, Y. The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).
- Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker. Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211 (2020).
- Lu, T. X., Rothenberg, M. E.
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 145-155 (2015).
- Bjorkman, S., Taylor, H. S. MicroRNAs in endometriosis: biological function and emerging biomarker candidates. Biology of Reproduction. 100 (5), 1135-1146 (2019).
- Zhou, C. X., et al. miRNA and circRNA expression patterns in mouse brain during toxoplasmosis development. BMC Genomics. 21 (1), 46 (2020).
- Jing, R., Zhong, Q. Q., Long, T. Y., Pan, W., Qian, Z. X. Downregulated miRNA-26a-5p induces the apoptosis of endothelial cells in coronary heart disease by inhibiting PI3K/AKT pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 23 (11), 4940-4947 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatology. 56 (5), 1946-1957 (2012).
- Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research. 237, 31-52 (2021).
- Latorre Luque, J. Relevance of the epigenetic regulation exercised by hepatic microRNAs in the fatty liver arena: from the bedside to the bench. , Available from: http://hdl.handle.net/10803/671499 (2019).
- Mastropasqua, R., et al. Serum microRNA levels in diabetes mellitus. Diagnostics (Basel). 11 (2), 284 (2021).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qPCR). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3874 (2012).
- Ahn, J. H., Kwak, J., Lee, J. H., Lee, S. S. Efficient and accurate analysis of microRNA using a specific extension sequence. Molecular Biology Reports. 45 (4), 611-619 (2018).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes With the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Weinstein, J. R., Anderson, S. The aging kidney: physiological changes. Advances in Chronic Kidney Disease. 17 (4), 302-307 (2010).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. R. Validation of array-based gene expression profiles by real-time (kinetic) RT-PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 3 (1), 26-31 (2001).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Petriella, D., et al. miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome. Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).
- Skrzypa, M., et al. miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis. Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).
- Farzanehpour, M., et al. Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer. Journal of Virology Journal. 16 (1), 116 (2019).
