Summary
Vi presenterar en metod för att utvärdera mikroRNA-uttryck i njure och serum hos möss med åldersberoende nedsatt njurfunktion genom kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion.
Abstract
MikroRNA (miRNA) är små, icke-kodande RNA som består av 21-25 baser. De översätts inte till proteiner utan arbetar snarare för att hindra funktionen hos deras målbudbärar-RNA (mRNA) genom att destabilisera dem och störa deras översättning. Även om miRNA-uttrycksprofilerna i olika musorgan och vävnader har undersökts har det inte funnits några standardmetoder för att rena och kvantifiera musnjure och serum-miRNA. Vi har etablerat en effektiv och pålitlig metod för att extrahera och utvärdera miRNA-uttrycket i serum och njure hos möss med åldersberoende nedsatt njurfunktion.
Metoden använder kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (qRT-PCR), och protokollet kräver sex steg: (1) förberedelse av åldrande-accelererad musresistens 1 (SAMR1) möss och åldrande-accelererad musbenägen (SAMP1) möss; 2) extrahera serumprover från dessa möss, (3) extrahera ett njurprov från varje mus; 4) extraktion av totalt RNA (inklusive miRNA) från njur- och serumprover från varje mus, (5) syntesen av komplementärt DNA (cDNA) med omvänd transkription från miRNA; (6) genomföra en qRT-PCR med användning av det erhållna cDNA.
Detta protokoll användes för att bekräfta att, jämfört med kontrollerna, uttrycket av miRNA-7218-5p och miRNA-7219-5p förändrades signifikant i njuren och serumet hos en musmodell med åldersberoende nedsatt njurfunktion. Detta protokoll klargjorde också förhållandet mellan njure och serum i musmodellen med åldersberoende nedsatt njurfunktion. Detta protokoll kan användas för att bestämma miRNA-uttryck i njure och serum hos möss med åldersberoende nedsatt njurfunktion.
Introduction
Uttrycket av olika mRNA som spelar viktiga roller i både fysiologi och sjukdom (t.ex. inflammation, fibros, metaboliska störningar och cancer) är känt för att regleras av miRNA, som är korta, icke-kodande RNA som orsakar nedbrytningen och hämmar transkriptionen av mRNA1. Det är därför möjligt att vissa miRNA kan fungera som nya kandidatbiomarkörer och/eller terapeutiska mål för olika sjukdomar 2,3,4,5. Forskning har utförts på miRNA-uttrycksprofiler i en mängd olika musorgan och vävnader (inklusive hjärna6, hjärta7, lunga8, lever9 och njure10). Det finns emellertid inga standardiserade eller etablerade metoder för att extrahera och utvärdera miRNA i njurarna eller serumet hos möss med åldersberoende nedsatt njurfunktion.
Därför upprättade vi ett protokoll som kan användas för att på ett tillförlitligt sätt rena och detektera miRNA-uttryck i serum och njure hos möss med åldersberoende nedsatt njurfunktion. Det finns sex huvudsteg i protokollet: (1) beredning av både 50 veckor gamla SAMR1-hanmöss och SAMP1-hanmöss; (2) extraktion av blodprover från den underlägsna vena cava av båda stammarna av möss, med efterföljande användning av ett spitzrör med heparin, följt av centrifugering, för att erhålla ett serumprov; (3) Extraktion av njurprov från möss-A-kiselhomogenisatorn används för att homogenisera njurprovet separat, och provet överförs sedan till ett biopolymerförstöringssystem på en mikrocentrifugspinnkolonn11; 4) Total RNA-extraktion (innehållande miRNA) från serumproverna med användning av en kiseldioxidmembranbaserad spinnkolonn12 och total RNA-innehållande miRNA-extraktion från njurproverna med användning av en kiseldioxidmembranbaserad spinnkolonn11. (5) syntes av komplementärt DNA (cDNA) från det totala RNA med användning av omvänt transkriptas, poly(A)polymeras och oligo-dT-primer13,14; och (6) slutligen bestämning av miRNA-uttryck med användning av qRT-PCR och ett interkalerande färgämne13,14.
Detta nya protokoll baserades på studier som lyckades extrahera och utvärdera miRNA i olika typer av vävnad11,12,13. Protokollets biopolymerförstöringssystem visade sig kunna rena högkvalitativt totalt RNA från vävnader11. Noggrannheten och känsligheten hos aspekter av detta protokoll som används för utvärdering av miRNA-uttryck med qRT-PCR med ett interkalerande färgämne har fastställts13,14, till exempel cDNA-syntesen med omvänd transkriptas, poly (A) polymeras och oligo-dT-primers från det extraherade totala RNA. Det nya protokollet har flera fördelar: enkelhet, tidsbesparingar och minskade tekniska fel. Det kan således användas för undersökningar som kräver noggrann och känslig identifiering av njur- och serum-miRNA-profiler. Studier av många patologiska tillstånd kan också använda det nya protokollet.
MiRNA-uttrycksprofilerna hos SAMP1-möss, som är en modell av åldersberoende nedsatt njurfunktion, kan bestämmas enligt nedan. Hos människor är åldersberoende nedsatt njurfunktion associerat med utvecklingen av njursvikt och kännetecknas av både en ökning av området för renal interstitiell fibros och progressionen av glomeruloskleros15,16. Åldersberoende nedsatt njurfunktion är också ett viktigt och frekvent inslag i kronisk njursjukdom och njursjukdom i slutstadiet15,16.
Protocol
Försöksprotokollet godkändes av djuretikkommittén vid Jichi Medical University och utfördes i enlighet med Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals och dess riktlinjer för användning och vård av försöksdjur. Detta protokoll använder fyra 50 veckor gamla SAMR1-hanmöss och SAMP1-hanmöss (40-45 g).
1. Insamling av serumprover
- Förbered följande för varje mus: 30 G nålar med en 1,0 ml spruta, ett 1,0 ml spitzcentrifugeringsrör med heparin, 1,5 ml mikrocentrifugrör, isofluranbedövningsmedel, ett korkark, 70% etanol, två bomullspinnar fuktade med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), en petriskål med PBS, pincett och kirurgisk sax.
- Bedöva musen med 1,5% isofluran och håll vid 1,5%. Administrera ett smärtstillande medel (Meloxicam 5 mg/kg) subkutant, injicera sedan 1,0 ml 70% etanol i buken och placera det i ryggläge på korkarket.
- Bekräfta anestesidjupet genom att pedaluttagsreflexen försvinner. Med pincett och kirurgisk sax, skär huden på buken. Skär musklerna och bukhinnan från blåsan till revbenens nedre vänstra kant.
- Använd pincetten för att lyfta bukhinnan och gör ett lateralt snitt i peritonealmembranets övre kant med den kirurgiska saxen. Fortsätt snittet längs revbenens nedre kant.
- Identifiera den sämre vena cava med hjälp av de två PBS-fuktade bomullspinnarna. Sätt in en av 30 G-nålarna med 1,0 ml sprutan i den underlägsna vena cava och dra sedan sprutan. Dra nålen ur den underlägsna vena cava långsamt för att undvika hemolys. Överför blodet till 1,0 ml spitzröret med heparin och blanda det sedan genom att invertera röret flera gånger.
OBS: Musen avlivas av livmoderhalsförskjutning. - Snurra spitzröret i rumstemperatur (RT), 3 000 × g i 10 minuter.
- Aspirera supernatanten långsamt, se till att den inte innehåller sediment och överför den sedan till ett oanvänt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Förvara röret vid −80 °C före användning.
OBS: Om du fortsätter till steg 3 omedelbart behöver röret inte förvaras vid −80 °C.
2. Insamling av njurprover
- Förbered följande för varje mus: 2,0 ml kryorör, isofluranbedövningsmedel, ett korkark, 70% etanol, en petriskål med PBS, pincett och kirurgisk sax.
- Bedöva musen med 1,5% isofluran och håll vid 1,5%. Administrera ett smärtstillande medel (Meloxicam 5 mg/kg) subkutant, injicera sedan 1,0 ml 70% etanol i buken och placera det i ryggläge på korkarket.
- Bekräfta anestesidjupet genom att pedaluttagsreflexen försvinner. Använd pincetten och den kirurgiska saxen för att göra ett snitt i bukhuden. Skär musklerna och peritonealmembranet från blåsan till revbenens nedre vänstra kant.
- Använd pincetten för att lyfta bukhinnan och gör ett lateralt snitt i peritonealmembranets övre kant med den kirurgiska saxen. Fortsätt snittet längs revbenens nedre kant.
- Identifiera vänster njure. Återflöde det med PBS för att spola blodet från kärlen tills njuren blir en gulvit färg. Skär ut hela njuren först med kirurgisk sax för att skära av vänster njurartär och ven. Placera njuren i en petriskål och tvätta den försiktigt med PBS.
OBS: Musen avlivas av livmoderhalsförskjutning. - Använd pincetten och den kirurgiska saxen för att skära njuren i 10 mg prover (10 mg är en lämplig provstorlek för nästa steg). Placera varje prov av njuren i sin egen 2,0 ml kryotube. Stäng rörets lock.
- För långvarig lagring, överför varje kryorör till flytande kväve och förvara det vid −80 °C.
3. Total RNA-extraktion från ett serumprov
- Förbered först följande föremål: en virvelblandare, fenol / guanidinbaserat lysreagens, 80% etanol, 100% etanol, 100% kloroform, biopolymerspinnkolonner (i 2,0 ml uppsamlingsrör 11), membranförankrade spinnkolonner (i 2,0 ml uppsamlingsrör11), tvättbuffert #1 (dvs. tvättbuffert innehållande guanidin och100% etanol i förhållandet 1: 2), tvättbuffert #2 (dvs. tvättbuffert innehållande guanidin och 100% etanol i förhållandet 1:4), RNasfritt vatten, 1,5 ml mikrocentrifugrör och 2,0 ml mikrocentrifugrör.
- Ta först ett 200 μL serumprov i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt sedan 1 000 μl av det fenol/guanidinbaserade lysreagenset. Vortex blandningen i 5 s.
- Inkubera provet vid rt i 5 minuter.
- Tillsätt 200 μl kloroform till serumprovet i röret och stäng rörlocket ordentligt. Vänd röret 15x för att blanda kloroformen och serumprovet.
- Varje prov inkuberas vid RT i 3 minuter. Snurra sedan provet vid 4 °C i 15 minuter vid 12 000 x g.
- Överför 300 μl supernatant till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör utan att störa pelleten. Tillsätt 450 μl 100% etanol och virvla röret i 5 s.
OBS: I alla följande steg, placera den membranförankrade spinnkolonnen för separation av RNA och DNA i ett 2,0 ml uppsamlingsrör för att centrifugera det. - Ta sedan bort 700 μl av provet, ladda det på en membranförankrad spinnkolonn och stäng locket. Snurra kolonnen vid RT i 15 s vid 8 000 × g och lämna supernatanten i kolonnen. Kassera pelleten som finns kvar i uppsamlingsröret.
- Tillsätt 700 μl tvättbuffert #1 som ingår i serum-/plasmasatsen (se materialförteckningen) till den membranförankrade spinnkolonnen för att rengöra provet noggrant. Stäng kolumnlocket och snurra kolonnen vid RT i 15 s vid 8 000 × g och lämna supernatanten i kolonnen. Kassera pelleten som finns kvar i uppsamlingsröret.
- För avlägsnande av spårsalter, ta 500 μL tvättbuffert #2 och ladda den på en membranförankrad spinnkolonn. När du har stängt kolumnlocket, snurra kolonnen vid RT i 15 s vid 8 000 × g och lämna supernatanten i kolonnen. Kassera pelleten i uppsamlingsröret.
- För avlägsnande av spårsalter, ta 500 μl 80% etanol och ladda den på en membranförankrad spinnkolonn. När du har stängt kolumnlocket, snurra kolonnen vid RT i 15 s vid 8 000 × g och lämna supernatanten i kolonnen. Kassera pelleten i uppsamlingsröret.
- Snurra den membranförankrade spinnkolonnen igen vid RT i 5 min vid 15 000 × g.
- Efter överföring av den membranförankrade spinnkolonnen till ett nytt uppsamlingsrör på 1,5 ml, tillsätt 14 μL RNasfritt vatten till kolonnen för att lösa upp det totala RNA:t. Efter att ha stängt pelarlocket, vänta 5 min med röret kvar vid RT. Snurra kolonnen igen i 1 min vid 15 000 × g vid RT.
- Förvara rören med prover vid −80 °C före användning.
4. Extraktion av totalt RNA från ett njurprov
- Förbered först följande föremål: en kiselhomogenisator, is, en virvelblandare, 100% etanol, 100% kloroform, biopolymerspinnkolonner (i 2,0 ml uppsamlingsrör 11), membranförankrade spinnkolonner (i 2,0 ml uppsamlingsrör11), fenol / guanidinbaserat lysreagens, tvättbuffert #1 (samma buffert som steg 3.1.), tvättbuffert #2 (samma buffert som steg 3.1), RNasfritt vatten, 1,5 ml mikrocentrifugrör och 2,0 ml mikrocentrifugrör.
- Placera ett 10 mg njurprov i kiselhomogenisatorn och tillsätt 700 μl av det fenol/guanidinbaserade lysreagenset.
- Ställ in homogenisatorn. Tryck försiktigt och vrid homogenisatorns stöt mot njurprovet för att homogenisera provet. Fortsätt att trycka och vrida stöten tills njurprovet är helt homogeniserat i det fenol / guanidinbaserade lysreagenset.
- För ytterligare homogenisering, ta det homogeniserade lysatet (i ett 2,0 ml uppsamlingsrör) och överför det till en biopolymerspinnkolonn.
- Centrifugera det homogeniserade lysatet vid RT i 3 minuter vid 14 000 × g och överför sedan hela den utfällda pelleten till ett oanvänt 1,5 ml mikrocentrifugrör för att invertera den utfällda pelleten
- Blanda pelleten med 140 μl kloroform i röret; Stäng sedan rörlocket ordentligt. Invertera röret 15x för att blanda lysat och kloroform.
OBS: Kloroformen kan användas säkert utan huva. - Inkubera provet vid RT i 2–3 minuter. Centrifugera provet vid 4 °C i 15 minuter vid 12 000 × g.
- Överför supernatanten (som vanligtvis är ~ 300 μL) till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör, utan att störa fällningen. Tillsätt 1,5 gånger dess volym (som vanligtvis är ~ 450 μL) 100% etanol. Vortex blandningen i 5 s.
OBS: I alla följande steg, placera den membranförankrade spinnkolonnen för att separera RNA och DNA i ett 2,0 ml uppsamlingsrör för att centrifugera det. - Lasta 700 μl prov på en av de membranförankrade spinnkolonnerna. Stäng locket och centrifugera kolonnen vid 15 000 × g i 15 s. Kassera det utfällda lysatet som finns kvar i uppsamlingsröret.
- Tillsätt 700 μL tvättbuffert #1 i centrifugeringskolonnen för att tvätta den noggrant. Stäng locket och centrifugera kolonnen vid 15 000 × g i 15 s. Kassera det utfällda lysatet som finns kvar i uppsamlingsröret.
- För avlägsnande av spårmängder av salt, ladda 500 μL tvättbuffert #2 på den membranförankrade spinnkolonnen. Efter stängning av kolonnlocket centrifugerar du kolonnen vid 15 000 × g i 15 s. Kassera det utfällda lysatet i uppsamlingsröret.
- Upprepa steg 4.11.
- Centrifugera den membranförankrade spinnkolonnen igen i 1 min vid 15 000 × g. Kassera det utfällda lysatet i uppsamlingsröret.
- Ta den membranförankrade spinnkolonnen och överför den till ett nytt uppsamlingsrör på 1,5 ml. Tillsätt 30 μl RNasfritt vatten till kolonnen för att lösa upp det totala RNA. När du har stängt kolonnens lock väntar du i 5 minuter med röret vid RT och centrifugerar sedan kolonnen i 1 min vid 15 000 × g.
- Överför den totala volymen av provet som innehåller totalt RNA till ett nytt mikrocentrifugrör. Placera röret på is och mät den totala RNA-koncentrationen med spektrofotometri. Se till att den totala RNA-koncentrationen är ~ 300-1,500 ng / μL.
- Förvara rör som innehåller prover vid −80 °C före användning.
5. Syntes av cDNA med omvänd transkription av totalt RNA i serum
OBS: Minimiinformationen för publicering av kvantitativa riktlinjer för PCR-experiment i realtid (MIQE) rekommenderar att man använder bättre experimentella metoder för att få tillförlitliga, entydiga resultat17. I detta protokoll syntetiseras cDNA från det totala RNA som renas i ett tvåstegsförfarande med användning av omvänt transkriptas, poly (A) polymeras och oligo-dT-primers.
- Förbered följande först: en virvelblandare, en termisk cykler, åtta brunnsbandsrör, locket på varje åtta-bandsrör, destillerat vatten, is, omvänd transkriptassats (se materialtabellen)13,14 i smält tillstånd och 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Starta den termiska cykeln.
- Förbered huvudblandningslösningen; För att erhålla totalt 8,0 μL masterblandning per åtta brunnars striprör, tillsätt 2,0 μL omvänd transkriptasblandning (ingår i satsen) och 2,0 μL 10x nukleinsyrablandning till 4,0 μL omvänd transkriptionsbuffert i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Placera 8,0 μL av huvudblandningslösningen i varje rör i ett åtta-brunns remsrör.
- Placera en alikvot på 12 μL totalt RNA i varje rör i det åtta brunnar långa remsröret och stäng rörets lock. Centrifugera röret i 15 s vid RT och 2 000 × g.
- Placera röret i den termiska cykeln och inkubera i 60 minuter vid 37 °C. Inkubera provet i ytterligare 5 minuter vid 95 °C min för att syntetisera cDNA.
- Efter inkubationen överför cDNA till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Späd cDNA tiofaldigt (1:10) med destillerat vatten. Virvla och centrifugera röret i 5 s vid RT och 2 000 × g.
- Förvara det utspädda cDNA tillfälligt på is. Förvara de utspädda proverna vid −80 °C före användning.
6. Syntes av cDNA med omvänd transkription av totalt RNA i njure
OBS: MIQE-riktlinjerna uppmuntrar till bättre experimentella metoder för att säkerställa tillförlitliga och entydiga resultat17. Detta protokoll använder omvänd transkriptas, poly (A) polymeras och oligo dT-primers för att syntetisera cDNA från 1,0 μg renat totalt RNA i ett tvåstegsförfarande.
- Förbered först följande: en virvelblandare, en termisk cykler, 1,5 ml mikrocentrifugrör, åtta brunnsremsor, locket på varje åtta-remsa rör, destillerat vatten, is och ett omvänd transkriptassats (se materialtabellen)13,14 i smält tillstånd.
- Starta den termiska cykeln.
- Förbered huvudblandningslösningen; För att erhålla totalt 8,0 μL masterblandningslösning per rör, tillsätt 2,0 μL av den omvända transkriptasblandningen som ingår i satsen och 2,0 μL 10x nukleinsyrablandningen till 4,0 μL av den omvända transkriptionsbufferten.
- Tillsätt 8,0 μL av huvudblandningslösningen till varje rör i ett åtta brunnsbandrör.
- Justera den totala RNA-densiteten enligt följande. För separation av 1,0 μg totalt RNA från ett njurprov med 12 μl RNasfritt vatten, ta en lämplig mängd totalt RNA och överför det till destillerat vatten med hjälp av den koncentration som uppmätts enligt beskrivningen ovan (i steg 4.15).
OBS: I närvaro av DNA-kontaminering förstärks det förorenade DNA:t med qRT-PCR. - Utför samma process som den som beskrivs ovan i steg 5.5.-5.8.
7. qRT-PCR för miRNA
OBS: En intercalatormetod används för qRT-PCR för miRNA. Primers används för RNA: U6 liten nukleär 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p och miRNA-7219-5p.
- Förbered följande: en virvelblandare, ett PCR-system i realtid, en 96-brunns reaktionsplatta för qRT-PCR, limfilm för 96-brunnsreaktionsplattan, limfilmapplikator, en 96-brunns centrifugrotor, miRNA-specifika primers, ett grönt färgämnesbaserat PCR-kit innehållande 2x PCR-masterblandning och 10x universell primer (se materialtabellen)13,14, och ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Vortex följande efter blandning i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör: 6,25 μL destillerat vatten, 1,25 μL vardera av 5 μM miRNA-primer upplöst i nukleasfritt vatten, 12,5 μL 2x PCR-masterblandning och 2,5 μL 10x universalprimer.
- Förbered och smält cDNA syntetiserat enligt beskrivningen i steg 5 (serum) eller steg 6 (njure). Vortex och centrifugera cDNA i 5 s.
- Ta 22,5 μL alikvoter av reagenset (enligt beskrivningen i steg 7.2 ovan) och placera dem separat i varje brunn på 96-brunnsplattan.
- Tillsätt en alikvot på 2,5 μL cDNA till varje brunn på plattan.
- För att fästa limfilmen på plattan, använd limfilmapplikatorn. Centrifugera plattan i 30 s vid 1 000 x g i centrifugrotorn med 96 brunnar. Stabilisera reaktionen längst ner i varje brunn.
8. Använda PCR-systemet och programvaran i realtid för att köra PCR-cykelprogrammet
- Börja PCR-systemet i realtid. Placera plattan som skapats enligt beskrivningen i steg 7.6. i PCR-systemet i realtid. Ändra inställningarna; ange ett namn för experimentet och välj sedan 96-brunn (0,2 ml ) som systemets experimenttyp, Jämförande CT (ΔΔCT) som kvantifieringsmetod, standard som systemkörningsläge och SYBR Green Reagents som reagenser för att detektera målsekvensen.
- Ange namn på provet och mål-miRNA och namnge provet och mål-miRNA i varje brunn. Tilldela dubbla prover för att få data som är lämpliga för att bekräfta resultaten och välj ett referensprov och den endogena kontrollen. För att färgämnet ska användas som passiv referens väljer du ingen. För att eliminera reagenskorskontaminering, ställ in negativt omvänt transkriptas och en icke-mallkontroll för miRNA-uttryck.
- Se sedan till att reaktionsvolymen är inställd på 20 μL och att PCR-cykelförhållandena är inställda enligt följande: 95 °C i 15 minuter, därefter 40 cykler av denaturering vid 94 °C i 15 s, glödgning vid 55 °C i 30 s och slutligen förlängning vid 70 °C i 30 s.
- Klicka på analysera i systemets program för att analysera qRT-PCR-data efter att processen är klar. Bekräfta att tröskellinjen som automatiskt väljs av programmet är lämplig för varje brunn.
- Kontrollera tröskelvärdet (CT) för den endogena kontrollen och mål-miRNA som analyseras i varje prov. Bestäm CT-värdena genom skärningspunkten mellan förstärkningskurvan och tröskellinjen.
OBS: I den aktuella studien användes RNU6-2 och miRNA-423-5p som endogena kontroller för mål-miRNA-uttrycksnivåer, och ΔΔCT-metoden användes för att bestämma de relativa uttrycksnivåerna för varje mål-miRNA18.
Representative Results
För den åldersberoende musmodellen med nedsatt njurfunktion använde vi 50 veckor gamla SAMP1-hanmöss som väger 40-45 g. Cirka 0,8 ml blod samlades in per mus och överfördes till ett 1,0 ml spitzrör med heparin, inverterat och centrifugerat. Varje njure sköljdes med PBS, dissekerades och lagrades i flytande kväve för vidare analys. Femtio veckor gamla SAMR1-möss fungerade som kontroller. Baserat på miRNA qRT-PCR-data som erhållits med hjälp av denna åldersberoende njursviktsmodell observerade vi att njurnivån av miRNA-7219-5p ökade signifikant och njurnivån av miRNA-7218-5p minskade avsevärt hos SAMP1-mössen jämfört med kontrollerna (figur 1). Serumnivåerna av både miRNA-7219-5p och miRNA-7218-5p ökade avsevärt hos SAMP1-mössen jämfört med kontrollerna (figur 2). Uttrycksnivåerna av miRNA-223-3p förändrades inte i någon av stammarna eller mellan njure och serum (figur 1 och figur 2).
Figur 1: Differentiellt uttryckta mikroRNA i njurarna hos SAMP1-möss. qRT-PCR-analys av uttrycket av miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p och miRNA-7219-5p hos SAMR1-möss (kontroll, n = 4) och SAMP1-möss (n = 4). Uppgifterna är genomsnittliga ± standardfel (felstaplar); t-tester användes för att analysera skillnader mellan grupper; p < 0,05 ansågs signifikant (*p < 0,05), n.s.: inte signifikant. Förkortningar: miRNA = mikroRNA; SAMP1 = åldrande-accelererad mus benägen; SAMR1 = åldrande-accelererad musresistens 1; qRT-PCR = kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Differentiellt uttryckta miRNA i serum från SAMP1-möss. qRT-PCR-analys av uttrycket av miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p och miRNA-7219-5p hos SAMR1-möss (kontroll, n = 4) och SAMP1-möss (n = 4). Uppgifterna är genomsnittliga ± SE (felstaplar); t-tester användes för att undersöka signifikanta skillnader mellan grupper. *p < 0,05 med t-test. Förkortningar: miRNA = mikroRNA; SAMP1 = åldrande-accelererad mus benägen; SAMR1 = åldrande-accelererad musresistens 1; qRT-PCR = kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Uttrycksnivåerna för mål-miRNA bestämdes framgångsrikt av det ovan beskrivna protokollet med användning av qRT-PCR. Utvärderingen av de extraherade miRNA är ett viktigt steg för att erhålla meningsfulla qRT-PCR-data. För att bekräfta den adekvata kvaliteten på miRNA innan qRT-PCR utförs, bör spektrofotometri användas för att bestämma förhållandet mellan absorbans vid 260 nm och det vid 280 nm. DNA-kontaminering kan förekomma, och/eller primerdimerer i varje brunn på reaktionsplattan kan förekomma om qRT-PCR inte ger en enda PCR-förstärkning av den förväntade längden och smälttemperaturen, eller om den ger en monomodal smältkurva.
MiRNA-uttrycksnivåer kan utvärderas med flera andra metoder än qRT-PCR, inklusive northern blotting, en mikroarray och ribonukleasskyddsanalyser. QRT-PCR-metoden är dock ett känsligt, exakt, enkelt och reproducerbart förfarande som kräver en mindre provvolym än de som krävs för nordlig blotting och ribonukleasskyddsanalyser19. Eftersom mikroarrayer kan mäta uttrycket av tiotusentals miRNA samtidigt kan de användas för att identifiera kandidat-miRNA-markörer. Microarray-data visar också en hög övergripande korrelation med data som erhållits av qRT-PCR20. Ingen konsensus har dock nåtts om den optimala metoden för att jämföra mikroarraydata som erhållits i olika studier21.
Utvärderingen av serum-miRNA har följande egenskaper. För det första är det lätt att samla serum, och eftersom serum-miRNA är stabila mot frysning och upptining, temperatur och syra kan miRNA vara bra biomarkörer. För det andra finns det hög homologi av miRNA bland arter, och resultaten av djurförsök extrapoleras lätt till människor. För det tredje har serum-miRNA visat potential för användning som terapeutiska läkemedel3. Flera studier har också visat att nivån av uttryck av miRNA i organ är korrelerad med miRNA i serum22,23,24. I den aktuella studien visade miRNA-223-3p, vars njurnivåer inte visade någon signifikant skillnad mellan SAMR1- och SAMP1-mössen, inte heller någon signifikant skillnad mellan stammarna i serumet. Däremot visade miRNA-7218-5p och miRNA-7219-5p, vars njurnivåer visade en signifikant skillnad mellan SAMR1- och SAMP1-mössen, betydande skillnader mellan stammar i serumet.
Detta protokoll har följande begränsningar. För det första har dess användbarhet inte verifierats i andra organ som lever och lunga, och för det andra har den inte testats på andra laboratoriedjur som råttor, hundar och grisar. Flera forskargrupper har använt detta protokoll för rening och detektion av miRNA med qRT-PCR och rapporterat att detta protokoll möjliggjorde rening av högkvalitativt RNA från vävnader och serum 13,14,22,23,24. Denna metod har visat sig ha hög noggrannhet och känslighet för att detektera uttrycket av miRNA 13,14,22,23,24. Den aktuella studiens resultat visar att detta protokoll framgångsrikt kan detektera miRNA-uttryck i serum och njure hos möss. Därför kan protokollet användas för att bestämma serum- och njurmiRNA-uttrycksprofilerna hos möss med olika patologier. På grund av protokollets enkelhet kan ett stort antal prover bearbetas samtidigt. Analyser av uttrycket av många miRNA vid olika patologiska tillstånd i njurarna kan således använda protokollet som beskrivs häri.
Det finns vissa aspekter av protokollet att tänka på. För att undvika nedbrytning av de renade miRNA som skulle inträffa vid rumstemperatur måste miRNA hållas på is. Njurproverna måste homogeniseras tills de är helt upplösta i lysreagenset. Musnjure innehåller en betydande mängd bindväv som är olöslig i lysreagens, och därför krävs en kolonnförstörare för ytterligare homogenisering. Dessutom bör lämpligt endogent kontroll-miRNA (med stabilt uttryck bland proverna) valideras under hela installationen av ett qRT-PCR-experiment. Detta beror på att interferensen av olika ämnen under utförandet av detta protokoll kan förändra uttrycksnivåerna för endogena kontroll-miRNA, vilket kan äventyra resultaten. Sammanfattningsvis beskriver detta papper ett qRT-PCR-protokoll för detektion, rening och utvärdering av miRNA-uttryck i serum och njure hos möss med åldersberoende nedsatt njurfunktion.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL spitz with heparin | Greiner-bio-one | 450534 | |
| Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3' |
| miRNA-423-5p primer | Qiagen | MS00012005 | 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3' |
| miRNA-7218-5p primer | Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -3' |
| miRNA-7219-5p primer | Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3' |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miRNeasy Serum/Plasma kit | Qiagen | 217184 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miScript II RT kit (reverse transcription buffer) | Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not disclosed due to confidentiality |
| SAMP1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| SAMR1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| Takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer |
References
- Huang, Y. The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).
- Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker. Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211 (2020).
- Lu, T. X., Rothenberg, M. E.
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 145-155 (2015).
- Bjorkman, S., Taylor, H. S. MicroRNAs in endometriosis: biological function and emerging biomarker candidates. Biology of Reproduction. 100 (5), 1135-1146 (2019).
- Zhou, C. X., et al. miRNA and circRNA expression patterns in mouse brain during toxoplasmosis development. BMC Genomics. 21 (1), 46 (2020).
- Jing, R., Zhong, Q. Q., Long, T. Y., Pan, W., Qian, Z. X. Downregulated miRNA-26a-5p induces the apoptosis of endothelial cells in coronary heart disease by inhibiting PI3K/AKT pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 23 (11), 4940-4947 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatology. 56 (5), 1946-1957 (2012).
- Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research. 237, 31-52 (2021).
- Latorre Luque, J. Relevance of the epigenetic regulation exercised by hepatic microRNAs in the fatty liver arena: from the bedside to the bench. , Available from: http://hdl.handle.net/10803/671499 (2019).
- Mastropasqua, R., et al. Serum microRNA levels in diabetes mellitus. Diagnostics (Basel). 11 (2), 284 (2021).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qPCR). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3874 (2012).
- Ahn, J. H., Kwak, J., Lee, J. H., Lee, S. S. Efficient and accurate analysis of microRNA using a specific extension sequence. Molecular Biology Reports. 45 (4), 611-619 (2018).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes With the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Weinstein, J. R., Anderson, S. The aging kidney: physiological changes. Advances in Chronic Kidney Disease. 17 (4), 302-307 (2010).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. R. Validation of array-based gene expression profiles by real-time (kinetic) RT-PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 3 (1), 26-31 (2001).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Petriella, D., et al. miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome. Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).
- Skrzypa, M., et al. miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis. Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).
- Farzanehpour, M., et al. Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer. Journal of Virology Journal. 16 (1), 116 (2019).
