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Summary
O presente protocolo descreve um método para induzir lesões específicas de tecido e altamente reprodutíveis em larvas de zebrafish usando um sistema de lesão a laser combinado com uma plataforma microfluida automatizada para o manuseio de larvas.
Abstract
As larvas de zebrafish possuem um sistema nervoso central totalmente funcional (SNC) com alta capacidade regenerativa apenas alguns dias após a fertilização. Isso torna este modelo animal muito útil para estudar lesão medular e regeneração. O protocolo padrão para induzir tais lesões é transectar a parte dorsal do tronco manualmente. No entanto, essa técnica requer treinamento extensivo e danifica tecidos adicionais. Um protocolo foi desenvolvido para lesões induzidas por laser para contornar essas limitações, permitindo alta reprodutibilidade e completude da transeção da medula espinhal sobre muitos animais e entre diferentes sessões, mesmo para um operador não treinado. Além disso, os danos teciduais são limitados principalmente à medula espinhal em si, reduzindo os efeitos de confusão de ferir diferentes tecidos, por exemplo, pele, músculo e CNS. Além disso, são possíveis lesões hemi-lesões da medula espinhal. A melhoria da preservação da integridade tecidual após lesão a laser facilita novas dissecções necessárias para análises adicionais, como a eletrofisiologia. Assim, este método oferece um controle preciso da extensão da lesão que é inalcançável manualmente. Isso permite novos paradigmas experimentais neste modelo poderoso no futuro.
Introduction
Em contraste com os mamíferos, o zebrafish (Danio rerio) pode reparar seu sistema nervoso central (SNC) após lesões1. O uso de larvas de zebrafish como modelo de regeneração da medula espinhal é relativamente recente. Provou-se valioso para investigar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao reparo2. Isso se deve à facilidade de manipulação, ao curto ciclo experimental (novas larvas a cada semana), à transparência óptica dos tecidos e ao pequeno tamanho das larvas, idealmente adequada para microscopia de fluorescência in vivo .
No caso da regeneração da medula espinhal, duas vantagens adicionais do uso de larvas são a velocidade de recuperação, alguns dias em comparação com algumas semanas para adultos, e a facilidade de induzir lesões usando técnicas manuais. Isso tem sido usado com sucesso em muitos estudos3,4,5, incluindo investigações recentes6,7. No geral, isso leva ao aumento da produção significativa de dados, alta adaptabilidade dos protocolos experimentais e diminuição dos custos experimentais. O uso de larvas com menos de 5 dias após a fertilização também reduz o uso de animais seguindo os princípios 3R em pesquisas animais8.
Após uma lesão medular em larvas de zebrafish, muitos processos biológicos ocorrem, incluindo resposta inflamatória, proliferação celular, neurogênese, migração de células sobreviventes ou recém-geradas, reforma de axônios funcionais e uma remodelagem global de circuitos de processos neurais e tecidos da coluna vertebral6,7,9,10 . Para serem orquestrados com sucesso, esses processos envolvem uma interação finamente regulada entre uma gama de tipos de células, componentes de matriz extracelular e sinais bioquímicos11,12. Desvendar os detalhes dessa reorganização significativa de um tecido complexo como a medula espinhal requer o uso e o desenvolvimento de abordagens experimentais precisas e controladas.
O paradigma experimental primário usado para estudar a regeneração da medula espinhal em zebrafish é usar meios cirúrgicos para induzir danos teciduais por ressecção, esfaqueamento ou crio lesão3,13. Essas abordagens têm a desvantagem de exigir treinamento específico em habilidades de microcirurgia, que é demorado para qualquer novo operador e pode impedir seu uso em projetos de curto prazo. Além disso, eles geralmente induzem danos aos tecidos circundantes, o que pode influenciar a regeneração.
Outra abordagem é induzir danos celulares quimicamente14 ou por manipulações genéticas15. Este último permite danos altamente direcionados. No entanto, tal técnica requer um longo trabalho preparatório para gerar novos peixes transgênicos antes de fazer qualquer experimento, renovado cada vez que um tipo de célula única é alvo.
Há, portanto, a necessidade de um método que permita lesões direcionadas, mas versáteis, adequadas a uma variedade de estudos em regeneração. Uma solução é usar um laser para induzir danos localizados no tecido de interesse16,17,18,19,20. De fato, o uso de danos teciduais induzidos por laser apresenta uma abordagem robusta para gerar lesões medular com muitas vantagens. Os microscópios equipados com tais módulos de manipulação a laser permitem especificar uma área em forma personalizada onde ocorrerá a ablação celular, com o benefício extra do controle temporal. O tamanho e a posição da lesão podem ser assim adaptados para responder a quaisquer questões.
A característica que falta na maioria dos sistemas de lesão a laser é a possibilidade de induzir lesões de forma altamente reprodutível para uma série de larvas. Aqui, um protocolo original é descrito usando um laser UV para induzir lesões precisas e controladas semi-automatizadas em larvas de zebrafish baseadas em uma plataforma microfluidica projetada para manuseio automatizado de larvas21. Além disso, no sistema aqui apresentado, as larvas são inseridas em um capilar de vidro, o que permite a livre rotação do animal em torno de seu eixo rostrocaudal. O usuário pode escolher qual lado da larva apresentar ao laser, permitindo que a imagem de fluorescência direja precisamente o raio laser e avalie o dano após a lesão.
O protocolo descrito aqui é usado com um sistema semi-automatizado de imagens de larvas de zebrafish combinado com um disco giratório equipado com um laser UV (designado a partir de agora como o sistema VAST). No entanto, os principais pontos do protocolo e a maioria das alegações da técnica são válidos para qualquer sistema equipado com um laser capaz de ablação celular, incluindo microscópios de varredura a laser de dois fótons, microscópios de disco giratório fornecidos com um laser UV (módulo FRAP), ou microscópios de vídeo com um módulo laser para manipulação de fotos. Uma das principais diferenças entre o sistema VAST e o manuseio convencional da amostra será que, para este último, serão necessárias larvas de montagem em pontos de baixa fusão em tampas de vidro/placas de petri de fundo de vidro no lugar de carregá-las em uma placa de 96 poços.
Os benefícios oferecidos por este método abrem oportunidades para pesquisas inovadoras sobre os mecanismos celulares e moleculares durante o processo de regeneração. Além disso, a alta qualidade dos dados permite investigações quantitativas em um contexto multidisciplinar.
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Protocol
Todos os estudos em animais foram realizados com aprovação do Ministério do Interior do Reino Unido e de acordo com suas regulamentações, sob licença de projeto PP8160052. O projeto foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Edimburgo. Para análises experimentais, larvas de zebrafish até 5 dias de idade de ambos os sexos foram utilizadas das seguintes linhas transgênicas disponíveis: Tg (Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg (Xla.Tubb:DsRed), Tg (betaactin:utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb:GCaMP6s) e Tg(mnx1:gfp) (ver Arquivo Suplementar 1 sobre a geração das linhas de zebrafish transgênicos). Um esquema do protocolo usando a plataforma automatizada de manipulação de larvas de zebrafish é mostrado na Figura 1. Todos os softwares personalizados, scripts e protocolos experimentais detalhados usados neste trabalho estão disponíveis em https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.
1. Preparação da amostra
- Em 5h pós-fertilização, classifique os embriões para o estágio correto de desenvolvimento21. Descarte ovos mortos e embriões mal desenvolvidos e superdesenvolvidos.
- Aos 3 dias pós-fertilização (dpf), anestesiam larvas adicionando 2 mL de 0,4% aminobenzoico-ácido-etil-éster a 50 mL de água de instalações de peixe em uma placa de Petri de 90 mm. Use animais criados com fenilhiourea (PTU) (ver Tabela de Material) para prevenir a pigmentação da pele se for um problema, o que não é o caso de lesões na medula espinhal em 3 larvas dpf descritas neste protocolo.
NOTA: Esta concentração anestésico relativamente alta é usada para evitar movimentos das larvas após o impacto do laser. - Tela os embriões para expressão de repórter fluorescente (Arquivo Suplementar 1).
NOTA: Um repórter fluorescente para a medula espinhal (ou outra estrutura de interesse) é frequentemente necessário para avaliar a eficiência da lesão. O uso de tg (Xla.Tubb:DsRed) ajuda a identificar a medula espinhal. - Transfira as larvas selecionadas para uma placa de 96 poços para uso no sistema VAST (ver Tabela de Materiais) com 300 μL de água de instalações de peixe por poço. Use diretamente o meio contendo o anestésico da placa de Petri de 90 mm. Certifique-se de ter apenas uma larva por poço. Prepare uma placa extra vazia de 96 poços para coletar as larvas lesionadas.
NOTA: Se usar outro sistema de lesão a laser, monte as larvas em gel de agarose de ponto de fusão baixa (LMP) em uma câmara de observação apropriada.
2. Preparação do microscópio
- Ligue todos os componentes do sistema (VAST, microscópio, laser, PC), incluindo o laser para ablação.
- Uma vez que o hardware esteja totalmente inicializado, inicie o software de microscópio, ImageJ/Fiji, um ambiente de desenvolvimento integrado python (IDE) e o software automatizado de imagem de zebrafish (SISTEMA VAST) se usar essa plataforma (ver Tabela de Materiais).
- Configure o software VAST seguindo as etapas abaixo.
- Quando o software VAST for lançado, escolha Placa na primeira janela e clique no botão Feito (Figura 2A). Outra pequena janela aparecerá perguntando se o capilar está vazio e limpo. Verifique olhando para a imagem do capilar se há alguma bolha de ar dentro. Se não, clique em Sim. Se houver alguma bolha, clique em Não e siga o passo 2.3.2-2.3.3 (Figura 2B).
- Na janela Sampler de partículas grandes (LP), clique em Prime para remover bolhas de ar (Figura 2C).
- Vá para a janela principal do software (com a imagem capilar) e clique com o botão direito do mouse na imagem. Selecione Gravar imagens capilares vazias no menu pop-up (Figura 2B).
- Na janela LP Sampler , vá para o menu Arquivo e selecione a opção Abrir script . Escolha um arquivo contendo o script correspondente ao experimento a ser realizado.
- Na janela principal do software VAST, vá para Arquivo e escolha Open Experiment. Escolha o arquivo de experimento correspondente ao experimento planejado.
NOTA: Certifique-se de que as caixas descarregam automaticamente e a saída em massa para resíduos NÃO sejam verificadas.
- Configure o software de microscópio para imagens.
- Inicie o software de imagem do microscópio (ver Tabela de Materiais) para inicializar o hardware. Isso pode levar alguns minutos, dependendo do sistema.
- Vá para as configurações de aquisição e configure o microscópio para imagem do fluoróforo expresso nas larvas. Use um objetivo de mergulho de água 10x NA 0.5 para garantir que o volume focal seja alongado o suficiente ao longo do eixo óptico para lesionar toda a profundidade da medula espinhal ou do tecido alvo.
- Configure ImageJ/Fiji para lesões a laser.
- Vá para o menu Arquivo , escolha Novo/Script para abrir a janela do script.
- Na janela Novo , vá para o menu Arquivo e escolha Abrir para carregar o script de lesão a laser (Manual_MP_Operation.ijm).
- Configure o Python IDE.
- Inicie o Python IDE.
- Vá para o menu Arquivo e escolha Arquivo Aberto para carregar o script para gerenciar o laser (Watch_for_ROIs_py3.py).
- Vá para o menu Executar e escolha Executar sem depuração para executar o script. Verifique se uma sequência de mensagens no painel TERMINAL aparece junto com algum ruído enquanto o atenuante a laser inicializa (Figura 2D).
3. Realizar lesões a laser no sistema VAST
- Centralizar o capilar em relação ao objetivo do microscópio movendo o palco clicando nos botões de seta na janela principal do software VAST (Figura 2B).
- Concentre-se na parte superior do capilar olhando através das oculares e usando a luz transmitida do microscópio.
ATENÇÃO: O capilar é muito frágil e pode quebrar se tocado pelo objetivo. Mova o botão do microscópio lentamente ao se concentrar dentro e fora. - Coloque as placas de 96 poços no porta-placas do Sampler LP do sistema VAST. Coloque a placa contendo larvas no suporte esquerdo e a placa para coleta à direita. Certifique-se de que as placas estão corretamente orientadas: o poço A1 deve estar no canto frontal-esquerdo do suporte.
- No software VAST, na janela Sampler LP, clique no botão Modelo de placa e selecione todos os poços que contêm larvas. Clique no botão OK para validar e fechar a janela (Figura 2C).
- Na janela LP Sampler, clique no botão Executar placa para começar a carregar uma larva.
NOTA: Após algum tempo, a larva deve ser visível no capilar na posição (predefinido no arquivo de definição do experimento), permitindo ferir a medula espinhal. A luz da bandeja VAST se desligará após algumas rotações para definir a larva com o lado lateral voltado para o objetivo do microscópio. - Vá para o software do microscópio e clique no botão Viver para imagem da larva.
- Gire o botão de foco do microscópio até que o canal central da medula espinhal esteja visível.
NOTA: Pode ser mais fácil focar usando a luz transmitida primeiro e, em seguida, refinar com fluorescência. - Tire uma foto em fluorescência e salve a imagem em uma pasta dedicada.
- Abra a imagem no ImageJ e ajuste o contraste se necessário (usando o menu Imagem/Ajuste/Brilho/contraste... no ImageJ).
- Clique na ferramenta de linha Região de Interesse (ROI) e desenhe uma linha curta (20 μm) centrada na medula espinhal (Figura 3A).
- Mude o microscópio para a posição do espelho 100% reflexivo.
- Carregue o script ImageJ e clique no botão Executar . Use os seguintes parâmetros: Repetição - 2; Amostra - 1; Largura - 40 mícron; Atenuação - 89 (Potência laser total) (Figura 3C).
- Quando a sequência de tiro laser estiver terminada, mude para imagens de fluorescência no software de imagem e ajuste o foco, se necessário.
NOTA: Uma mudança de foco é frequentemente observada devido ao deslocamento da cauda durante a exposição ao laser. - Tire uma nova foto e salve-a.
- Abra esta nova imagem no ImageJ e desenhe uma nova linha que deve ser maior que a medula espinhal em si (~80 μm), começando abaixo do lado ventral da medula espinhal na parte superior do notochord e indo em direção ao lado dorsal para terminar no espaço entre a medula espinhal e a pele (Figura 3B).
- Mude o microscópio para a posição do espelho 100% reflexivo.
- Vá para a janela do script ImageJ e clique no botão Executar . Use os seguintes parâmetros: Repetição - 2; Amostra - 1; Largura - 40 mícrons; Atenuação - 89 (Potência máxima do laser).
- Após o (mais longo) sequência de tiro laser ser concluída, verifique a qualidade da transeção por fluorescência de imagem e foco. Certifique-se de que nenhuma célula ou axônios permaneçam intactos no local da lesão, que deve aparecer como uma área fluorescente escura ou homogênea (Figura 3D, painel inferior).
- Colete as larvas lesionadas na placa vazia de 96 poços (com as mesmas coordenadas do poço do poço original) indo para a janela principal do software VAST e clicando no botão Coletar .
- Ligue de volta a luz do sistema VAST clicando na caixa de seleção Tray Light no canto inferior esquerdo da janela.
- Repita o passo 3.3-3.17 para cada nova larva ser ferida.
4. Manuseio pós-lesão e experimentos adicionais
- Retire as larvas da placa de 96 poços o mais rápido possível e transfira-as para uma placa de Petri limpa com água fresca para que as larvas recuperem a pós-lesão. Coloque a placa de Petri em uma incubadora a 28 °C.
NOTA: O dano muitas vezes continua a se propagar na primeira hora após a lesão. A extensão real da lesão deve, portanto, ser avaliada por imagens de fluorescência após um atraso de aproximadamente 1 h.
5. Solução de problemas
- Se as bolhas de ar estiverem presentes nos tubos e capilares do sistema VAST, clique no botão Prime na janela LP Sampler para removê-las.
- Considere as lesões mal sucedidas (avaliadas a partir da fluorescência remanescente no local da lesão, além do histórico residual e homogêneo esperado), que podem ser devido a várias razões mencionadas abaixo.
- Baixa potência laser: Quando isso acontecer, tente com um valor mais alto.
NOTA: O sistema VAST é equipado com um laser de corante. Isso implica que a concentração da solução de corante usada para a geração de luz a laser pode mudar com o tempo, levando a uma diminuição da potência laser. Substituir por uma solução nova geralmente resolve o problema22. - Má calibração: Quando isso acontecer, verifique a calibração e a potência do sistema laser conforme a etapa 5.2.2.1-5.2.2.4. Se não estiver calibrado corretamente, o laser não será direcionado para o local desejado, levando a lesões mal sucedidas ou danos indesejados em tecidos adjacentes.
- Coloque um deslizamento de espelho em cima da câmara capilar. Concentre-se no lado revestido (deve enfrentar o objetivo). Use um padrão anterior no slide para se concentrar mais facilmente.
- Aplique um padrão de ablação a laser usando um script de calibração.
- Avalie a qualidade do padrão. As manchas ou linhas devem parecer nítidas e não embaçadas.
- Use uma rampa com potência crescente para avaliar se a potência do laser mudou em comparação com as sessões anteriores.
- Movimento larval durante lesões: Larvas respondem de forma diferente à anestesia; assim, a lesão a laser pode desencadear movimentos da cauda durante o processo, impedindo assim uma transeção bem sucedida. Quando isso acontecer, tome uma iteração extra das etapas da lesão laser para completá-la, evitando danos aos tecidos circundantes.
- Foco ruim: Quando isso ocorrer, concentre-se no meio do canal central para obter os melhores resultados.
- Desenho, posição e tamanho do ROI: A posição e o tamanho do ROI são fundamentais para transeções bem sucedidas. O ROI deve ser maior que a medula espinhal e centrado no centro da medula espinhal. Para resolver isso, comece a retirar o ROI do lado ventral da medula espinhal e suba em direção ao lado dorsal para obter uma transeção bem sucedida. Isso é provavelmente devido aos movimentos da cauda desencadeados pela sequência de tiros a laser durante o procedimento de ablação.
- Baixa potência laser: Quando isso acontecer, tente com um valor mais alto.
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Representative Results
Validação da transeção da medula espinhal
Foram realizadas investigações estruturais e funcionais para avaliar se o protocolo permite uma transeção completa da medula espinhal.
Primeiro, verificar se a perda de fluorescência no local da lesão foi devido a danos no tecido neuronal e não à fotoblemação da fluorescência da iluminação laser, foi realizada a imunostenção utilizando um anticorpo contra tubulina acetilada (ver Tabela de Materiais e Arquivo Suplementar 1). Observou-se interrupção completa dos axônios entre os lados caudal e rostral da lesão, confirmando a transeção completa da medula espinhal (Figura 4B). Uma transeção bem sucedida da medula espinhal não deve deixar nenhuma projeção neuronal remanescente em todo o local da lesão (ver Figura 4C como exemplo de uma lesão mal sucedida). Com essa técnica, a taxa de sucesso das lesões a laser da medula espinhal foi estimada em 75% (quatro trans seções incompletas em 16 animais).
A perda de funcionalidade após lesão a laser foi investigada por meio de imagem de cálcio. Em peixes intactos, a atividade espontânea da rede neuronal coordenada gera picos de fluorescência ao longo de toda a medula espinhal. Uma transeção bem sucedida interromperia a propagação desta atividade entre ambos os lados da lesão. Para controlar a qualidade da transeção da medula espinhal, foram realizadas lesões a laser em larvas tg (Xla.Tubb:GCaMP6s) a 3 dpf. Após a coleta em uma nova placa multi-poço, as larvas foram ligeiramente anestesiadas. Eles foram montados em uma mancha de vidro em agarose ponto de fusão baixo para realizar gravações de fluorescência time-lapse em um microscópio confocal de 3 h pós-lesão. Observou-se perda de atividade no lado caudal do local da lesão. De fato, a quantificação da fluorescência mostra que os picos devido à atividade espontânea do peixe só estavam presentes no lado rostral após a lesão, mas ocorreram de forma coordenada nas posições rostral e caudal equivalentes em peixes intactos (Figura 4D,E). O baixo sinal residual no lado caudal após a lesão foi provavelmente devido à atividade de neurônios sensoriais (provavelmente neurônios sensoriais Rohon-Beard no lado caudal da medula espinhal23) em reação ao movimento da cauda induzido pela contração muscular no lado rostral.
Processos de regeneração induzidos por lesões a laser
Após 24 horas após a lesão (hpi), a ferida começou a se fechar, levando a uma restauração parcial da estrutura inicial da medula espinhal após 48 h (Figura 5D). Utilizando imagem de cálcio, foi confirmada uma reconexão funcional parcial (Figura 5E,F) após 48 hpi. O cálculo da razão (denominada Índice de Restauração de Conectividade pelos autores) entre a amplitude dos picos na área caudal e na área rostral (Figura 5G), mostrou um aumento entre 3, 24 e 48 hpi, como esperado durante a regeneração da medula espinhal.
Lesões a laser desencadeiam uma resposta imune
O recrutamento de macrófagos (mpeg1:GFP + células) foi observado após lesões a laser usando lesões a laser usando lesões laser tg (Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) lesões a laser larvas (Figura 5H,I). Isso é consistente com estudos anteriores dos autores utilizando lesões manuais que demonstram o papel essencial dos macrófagos para a regeneração bem sucedida da medula espinhal em larvas de zebrafish6,24. Esta observação indica que as reações imunológicas podem ser estudadas após a lesão a laser e corrobora que o dano tecidual ocorreu.
Lesões a laser e lesões manuais desencadeiam aumento da neurogênese na medula espinhal
Estudos anteriores utilizaram lesões manuais para estudar a neurogênese que ocorre após uma lesão medular6,15. Lesões a laser podem ser uma ferramenta valiosa para estudar esse fenômeno. Um experimento publicado anteriormente mostrou aumento da neurogênese após uma lesão manual da medula espinhal em comparação com controles não insusícidos15. Aqui os peixes tg (mnx1:gfp) foram usados como neurônios motores e foram rotulados fluorescentemente. A coloração de anticorpos anti-GFP foi utilizada para melhorar a visibilidade do GFP nas larvas. Isso foi combinado com a coloração edu25 (ver Arquivo Suplementar 1), que rotula neurônios recém-gerados. EdU foi adicionado imediatamente após uma lesão em 3 dpf, o que significa que todas as células rotuladas com EdU foram geradas após a lesão. Portanto, as células que exibem coloração colocalizada representam novos neurônios motores que nascem após lesão medular. O número de células colocalizadas em ambos os lados do local da lesão, ou em uma área correspondente à localização e tamanho do local da lesão em controles não localizados (capturados em duas janelas de 50 μm) foi contado, e a diferença no número médio de células colocalizadas foi analisada usando um ANOVA26 unidirecional.
Este protocolo foi utilizado em larvas lesionadas manualmente e a laser para comparar os efeitos de cada método de lesão na neurogênese (Figura 6). Não foi observada diferença no número de células rotuladas entre lesões manuais e laser. Peixes não selados apresentaram menos células duplamente rotuladas do que peixes lesados em ambas as condições de lesão (Figura 6D). Isso é consistente com os achados anteriores que mostram aumento da neurogênese em peixes com lesões manuais em comparação com peixes não pulsionados15.
Esses resultados suportam os resultados de coloração de cálcio e de tubulina acetilada, pois a lesão do laser provoca uma resposta de regeneração comparável a uma lesão manual. Isso indica que a lesão do laser não está simplesmente branqueando a fluorescência nas células, mas resulta em uma lesão que desencadeia as mesmas respostas celulares que uma lesão manual faz.
Lesões a laser resultam em menos danos na pele e músculo do que lesões manuais
Lesões manuais muitas vezes resultam em grandes quantidades de danos musculares e de pele. Em contraste, as lesões a laser podem ser direcionadas mais especificamente à medula espinhal, reduzindo os danos a outros tecidos. Para ilustrar isso, foram utilizadas larvas Tg (beta-actin:utrophin-mCh) para realizar lesões manuais e laser. Esta linha rotula fluorescentemente uma proteína de ligação F-actin, permitindo a visualização de células medular e fibras musculares. As larvas foram então montadas ao vivo e imagens (Figura 7A,B). A Figura 7A mostra o dano à medula espinhal. A falta de utrophin no local da lesão em condições de lesão laser e manual sugere que ambos os métodos de lesão danificaram as células da medula espinhal. A figura 7B mostra a lesão muscular. Há uma estrutura clara como chevron para os miômen na condição não insionada, e feixes de fibras de actina são visíveis. Há uma interrupção visível da forma do miotômo na condição manual da lesão, e menos fibras de actina estão presentes. Isso demonstra danos musculares significativos. No entanto, na condição de lesão a laser, a estrutura chevron do miotome é mantida. Há algum dano às fibras musculares, mas isso está contido dentro de um ou dois miômeros em comparação com dentro de quatro na condição de lesão manual. Além disso, há danos leves na pele na condição de lesão a laser em comparação com a condição manual da lesão, como mostrado em imagens tiradas em um microscópio estéreo na Figura 7C.
Ao todo, esses resultados demonstram que lesões laser reprodutíveis e semi-automatizadas têm o potencial de ser uma ferramenta poderosa para estudar a regeneração neural em zebrafish.
Figura 1: Esquema do fluxo de trabalho semiautomático de lesão a laser. Três dias após a fertilização (dpf), as larvas são carregadas em uma placa de 96 poços e colocadas na plataforma automatizada de manuseio de larvas. Em seguida, cada larva é carregada em uma capilar colocada sob uma lente 10x NA 0.5 em um microscópio vertical para imagem e lesão a laser. Após lesões, as larvas são descarregadas em uma nova placa de 96 poços para coleta e outros experimentos. Na parte superior, imagens transmitidas e fluorescência de tg (Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf larvas antes e depois da lesão do laser (barra de escala = 50 μm). Larvas são orientadas rostral esquerda e dorsal para cima (para todas as figuras). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Start-up de software para o sistema semi-automatizado de imagens de larvas de zebrafish e sistema de controle a laser. (A) SOFTWARE VAST na inicialização. (B) A janela principal do software VAST mostra o capilar vazio. (C) janela sampler LP com um modelo de placa em branco. (D) A visão do IDE python com o script Watch_for_ROIs_py3.py em execução. O retângulo laranja aponta a aba terminal com mensagens exibidas durante a inicialização do atenuante laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplo de sequência de lesão a laser em tg (Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf larvas. (A) O primeiro passo da lesão a laser usando uma linha de 20 μm após selecionar a ferramenta ROI de linha na barra de ferramentas ImageJ. (B) Segundo passo com uma linha de 80 μm para transeção completa da medula espinhal. (C) Visualização do script usado para controlar o laser do ImageJ. (D) A sequência de imagens durante lesões a laser. Topo: antes da lesão; Meio: imediatamente após o primeiro passo; Inferior: imediatamente após a segunda etapa (barra de escala = 50 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imunostaining de tubulina acetilada (A-C) e imagem de cálcio (D,E) indicam que a lesão laser interrompe completamente a continuidade do tecido espinhal. (A) Medula espinhal intacta. (B) Transeção completa da coluna vertebral mostrando uma completa ruptura do tecido medular ao longo dos eixos dorsal-ventral e medial-lateral. (C) Transeção incompleta. (barra de escala = 50 μm). (D) Medula espinhal transcectada em um tg (Xla.Tubb:GCaMP6s) 3 larva dpf. Os retângulos mostram os ROIs usados para quantificar a intensidade da fluorescência nos lados rostral (azul) e caudal (laranja) da lesão. (E) Gráfico da intensidade da fluorescência muda ao longo do tempo nos ROIs de análise rostral e caudal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Lesão a laser provoca uma resposta imune e leva a uma recuperação anatômica e funcional bem sucedida. (A-D) As imagens de fluorescência de projeção de intensidade máxima de uma larva tg (Xla.Tubb:DsRed) 3dpf antes (A) e em diferentes momentos após a lesão do laser: após 3 h (B), após 24 h (C), e depois de 48 h (D). (E-G) O uso de imagens de cálcio para avaliar a restauração da função. (E) Larva tg lesionada (Xla.Tubb:GCaMP6s) com ROIs de análise. (F) Gráfico da intensidade da fluorescência muda ao longo do tempo nos ROIs de análise rostral e caudal. (G) Quantificação da razão entre amplitudes de pico caudal e rostral (Índice de Restauração de Conectividade) em 3, 24, 48 h pós-lesão (N = 3). (H-I) Caracterização da resposta imune após lesão. (H) Imagens de fluorescência de mífagos não elhões (esquerda) e lesionadas (direita) tg (Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) 3 dfp larva mostrando o acúmulo de macrófagos (célula mpeg1+, verde) a 6 hpi. (I) Quantificação do número de macrófagos a 6h pós-lesão em larvas feridas e intactas (N = 3) (barras de escala = 50 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: A geração induzida por lesões de neurônios motores é comparável entre laser e lesão manual. (A-C) Imagens do microscópio ApoTome de tg(mnx1:gfp) 5 larvas dpf com coloração da EdU, em lesão laser (A), lesão manual (B) e condições não adulteradas (C). Pontas de flecha denotam células duplamente rotuladas para ambos os marcadores. Barra de escala = 100 μm. (A'-C') Ampliação mais elevada de células de dupla rotulagem denotadas por caixas brancas. (D) Quantificação da contagem celular para o número de células colocalized em cada larva. Janelas de 50 μm foram colocadas em ambos os lados do local da lesão, e células colocalized foram contadas em todas as imagens de pilha Z. A ANOVA unidirecional foi realizada com o teste pós-doutorado de Tukey27. Não há diferença significativa entre as lesões laser e manual (p = 0,909). Significativamente menos células mnx1:gfp+/EdU+ em controles não insusícidos em comparação com a lesão laser (2,4 vezes de variação, p = 0,011) e lesão manual (2,3 dobras de alteração, p = 0,018). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: A lesão a laser induz menos dano muscular e de pele do que a lesão manual. (A-B) Imagens únicas de pilha Z de tg (beta-actin:utrophin-mCherry) 3 larvas dpf nas condições não colhidas, de lesão manual e lesão a laser, tomadas no microscópio confocal na ampliação de 20x. Flechas brancas denotam o local da lesão. Barra de escala = 50 μm. (A) denota z-stacks onde a medula espinhal e notochord são visíveis. SC rotula a medula espinhal, e NC rotula o notochord. (B) denota pilhas Z onde as fibras musculares são visíveis. (C) As imagens foram tiradas no microscópio estéreo de 3 larvas dpf nas condições não colhidas, de lesão manual e de lesão a laser. Larvas foram presas a uma plataforma usando pinos de arame de tungstênio (visíveis na imagem da lesão a laser). A caixa preta denota o local da lesão. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo Complementar 1: Os detalhes experimentais do protocolo. A geração das linhas transgênicas de zebrafish, lesões manuais da medula espinhal, imunohistoquímica acetilada-tubulina, coloração hb9/edu, imagem e processamento e análise de imagem são descritos. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Há uma necessidade urgente de uma compreensão mais profunda dos processos em jogo durante a regeneração em zebrafish. Este modelo animal oferece muitos benefícios para a pesquisa biomédica, em especial para lesões medular1. A maioria dos estudos envolve lesões manuais que requerem um operador bem treinado e induzem danos multi tecidos. Aqui é apresentado um protocolo de lesão a laser, permitindo o controle sobre as características da lesão e danos reduzidos aos tecidos circundantes. Além disso, esta técnica é fácil o suficiente para ser usada com sucesso por experimentadores relativamente destreinados.
Passos críticos no protocolo são a calibração do laser e a definição de ROIs. Na prática, a calibração é muito estável (mesmo por meses), e uma vez determinado o tamanho e a posição certos do ROI, o uso desta técnica é simples. Embora o protocolo tenha descrito como realizar as lesões em equipamentos específicos, a maioria dos benefícios das lesões a laser estão disponíveis para diferentes sistemas, como um microscópio de disco giratório.
As principais limitações deste protocolo são a necessidade de usar um repórter de fluorescência da medula espinhal e o tempo necessário para realizar as lesões (~5 min/peixe). Este último é compensado pela alta reprodutibilidade que requer menos animais. No entanto, lesões manuais ainda são viáveis para aplicações como testes de drogas, onde muitos animais lesionados são necessários. Como mostrado aqui, a extensão da neurogênese induzida pela lesão é comparável entre lesões laser e manuais.
No entanto, a lesão a laser tem enormes aplicações potenciais, algumas delas relacionadas aos benefícios únicos oferecidos. Por exemplo, um capilar rotativo permite realizar lesões em uma grande variedade de posições de forma controlada. Por exemplo, poderia ser usado para induzir axotomia de neurônio único em células mauthner (dados não mostrados), como também foi demonstrado no trabalho de Bhatt et al.15. Isso não seria possível usando lesões manuais.
Os resultados também demonstram que o dano está contido principalmente na medula espinhal, com danos mínimos aos tecidos circundantes. Isso pode significar que as respostas celulares vistas após uma lesão a laser são mais propensas a serem atribuídas à medula espinhal especificamente do que a sinalização de outros tecidos danificados. Também pode significar que as larvas lesionadas a laser são mais capazes de suportar mais preparações para experimentos. Por exemplo, a dissecção para eletrofisiologia envolve a remoção da pele do tronco usando fórceps28,29,30, o que resultaria em alta pressão mecânica colocada no já delicado local da lesão e arriscaria que quaisquer conexões axonas fossem quebradas novamente. A integridade da pele e do tecido muscular visto em larvas lesionadas a laser poderia proteger o local da lesão de danos adicionais e resultar em uma representação mais precisa do nível de regeneração alcançado.
Além disso, a melhor localização dos danos após lesões a laser limita a extensão do acoplamento entre diferentes processos de regeneração, o que pode mascarar processos mais sutis ao usar lesões manuais. A abordagem da lesão experimental no zebrafish larval descrito aqui pode abrir uma série de novas investigações no contexto da biologia quantitativa, física biológica e biologia computacional.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo BBSRC (BB/S0001778/1). A CR é financiada pelo Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Program. Agradecemos a David Greenald (CRH, Universidade de Edimburgo) e Katy Reid (CDBS, Universidade de Edimburgo) pelo tipo de presente de peixe transgênico (Ver Arquivo Suplementar). Agradecemos a Daniel Soong (CRH, Universidade de Edimburgo) pelo tipo de acesso ao 3i spinning-disk confocal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
References
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Medicina Edição 177Erratum
Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 04/07/2022.
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