Summary
Die optogenetische Kontrolle des mikrobiellen Stoffwechsels bietet eine flexible dynamische Kontrolle über Fermentationsprozesse. Das Protokoll zeigt hier, wie man blaulichtregulierte Fermentationen für die chemische und Proteinproduktion auf verschiedenen volumetrischen Skalen aufbaut.
Abstract
Mikrobielle Zellfabriken bieten eine nachhaltige Alternative zur Herstellung von Chemikalien und rekombinanten Proteinen aus nachwachsenden Rohstoffen. Die Überlastung eines Mikroorganismus mit genetischen Veränderungen kann jedoch die Fitness und Produktivität des Wirts verringern. Dieses Problem kann durch dynamische Kontrolle überwunden werden: induzierbare Expression von Enzymen und Signalwegen, typischerweise unter Verwendung von chemischen oder nährstoffbasierten Zusätzen, um das Zellwachstum und die Zellproduktion auszugleichen. Die Optogenetik bietet eine nicht-invasive, hochgradig abstimmbare und reversible Methode zur dynamischen Regulierung der Genexpression. Hier beschreiben wir, wie man lichtgesteuerte Fermentationen von technisch hergestellten Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae zur Herstellung von Chemikalien oder rekombinanten Proteinen aufbaut. Wir diskutieren, wie Licht zu ausgewählten Zeiten und Dosierungen angewendet werden kann, um mikrobielles Wachstum und Produktion für eine verbesserte Fermentationskontrolle und Produktivität zu entkoppeln, sowie die wichtigsten Optimierungsüberlegungen für beste Ergebnisse. Darüber hinaus beschreiben wir, wie Lichtsteuerungen für Bioreaktorexperimente im Labormaßstab implementiert werden können. Diese Protokolle erleichtern die Einführung optogenetischer Kontrollen in technisch hergestellten Mikroorganismen zur Verbesserung der Fermentationsleistung.
Introduction
Die Optogenetik, die Steuerung biologischer Prozesse mit lichtempfindlichen Proteinen, bietet eine neue Strategie zur dynamischen Steuerung mikrobieller Fermentationen für die chemische und Proteinproduktion1,2. Die Belastung durch technische Stoffwechselwege und die Toxizität einiger Zwischenprodukte und Produkte beeinträchtigen häufig das Zellwachstum3. Solche Belastungen können zu einer schlechten Biomasseakkumulation und einer verminderten Produktivität führen3. Dieser Herausforderung kann begegnet werden, indem die Fermentationen zeitlich in eine Wachstums- und Produktionsphase unterteilt werden, die metabolische Ressourcen der Biomasseakkumulation bzw. Produktsynthese widmen4. Wir haben kürzlich gezeigt, dass der Übergang vom Wachstum zur Produktion in dieser zweiphasigen Fermentation mit Änderungen der Beleuchtungsbedingungen induziert werden kann5,6,7. Die hohe Abstimmbarkeit, Reversibilität und Orthogonalität von Lichteinträgen8 bieten einzigartige Vorteile für lichtgesteuerte Fermentationen, die mit chemischen Induktoren, die zur dynamischen Steuerung herkömmlicher Zweiphasenfermentationen eingesetzt werden, schwer oder gar nicht repliziert werden können4,9,10,11.
Das blaulichtempfindliche Protein EL222, das aus Erythrobacter litoralis gewonnen wird, wurde verwendet, um mehrere optogenetische Schaltkreise für das Metabolic Engineering in Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13 zu entwickeln. EL222 enthält eine LOV-Domäne (Light-Oxygen-Voltage-Sensor), die bei Blaulichtaktivierung (465 nm) eine Konformationsverschiebung erfährt, wodurch sie an ihre verwandte DNA-Sequenz (C120)13 binden kann. Die Fusion von EL222 mit der viralen VP16-Aktivierungsdomäne (VP16-EL222) führt zu einem auf Blaulicht reagierenden Transkriptionsfaktor, der die Genexpression in S. cerevisiae7 und anderen Organismen14 aus dem synthetischen Promotor PC120 reversibel aktivieren kann. Mehrere Schaltkreise, die auf EL222 basieren, wurden für die chemische Produktion in S. cerevisiae entwickelt und verwendet, wie das grundlegende lichtaktivierte OptoEXP-System7, in dem das Gen von Interesse direkt aus PC120 exprimiert wird (Abbildung 1A). Bedenken hinsichtlich der Lichtdurchdringung bei den hohen Zelldichten, die typischerweise in der Produktionsphase von Fermentationen auftreten, motivierten uns jedoch, invertierte Schaltkreise zu entwickeln, die im Dunkeln induziert werden, wie die OptoINVRT- und OptoQ-INVRT-Schaltungen (Abbildung 1B) 5,7,13. Diese Systeme nutzen die Galactose- (GAL) oder Chinainsäure (Q)-Regulone aus S. cerevisiae bzw. N. crassa und kontrollieren ihre entsprechenden Repressoren (GAL80 und QS) mit VP16-EL222, um die Genexpression im Licht zu unterdrücken und im Dunkeln stark zu induzieren. Die Kombination von OptoEXP- und OptoINVRT-Schaltkreisen führt zu einer bidirektionalen Kontrolle der Genexpression und ermöglicht zweiphasige Fermentationen, bei denen die Wachstumsphase mit blauem Licht und die Produktionsphase mit Dunkelheit induziert wird (Abbildung 2A) 5,7.
Die Verwendung von Licht anstelle von Dunkelheit zur Induktion der Genexpression während der Produktionsphase würde die Fähigkeiten der optogenetischen Kontrollen erheblich erweitern, würde aber auch die Überwindung der Lichtdurchdringungsbeschränkungen der hohen Zelldichten erfordern, die typischerweise in dieser Phase der Fermentation auftreten. Zu diesem Zweck haben wir Schaltkreise entwickelt, die als OptoAMP und OptoQ-AMP bekannt sind und die transkriptionelle Reaktion auf die Blaulichtstimulation verstärken. Diese Schaltkreise verwenden Wildtyp- oder überempfindliche Mutanten von VP16-EL222, um die Produktion der transkriptionellen Aktivatoren Gal4p oder QF2 der GAL- bzw. Q-Regulonen zu kontrollieren und eine erhöhte Empfindlichkeit und stärkere Genexpression mit Licht zu erreichen12,13 (Abbildung 1C). OptoAMP-Schaltungen können eine vollständige und homogene Lichtinduktion in 5-L-Bioreaktoren bei einer optischen Dichte (gemessen bei 600 nm; OD600) Werte von mindestens 40 mit nur ~0,35% der Beleuchtung (5% Lichtdosis auf nur ~7% der Schüttfläche). Dies zeigt eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu OptoEXP, das eine Beleuchtung von nahezu 100% erfordert12. Die Fähigkeit, die Genexpression mit Licht bei hohen Zelldichten effektiv zu induzieren, eröffnet neue Möglichkeiten zur dynamischen Steuerung von Fermentationen. Dazu gehören Betriebsfermentationen in mehr als zwei zeitlichen Phasen, wie z. B. dreiphasige Fermentationen, bei denen Wachstums-, Induktions- und Produktionsphasen mit einzigartigen Lichtplänen zur Optimierung der chemischen Produktion festgelegt werden (Abbildung 2B)12.
Abbildung 1: Optogenetische Schaltkreise zur dynamischen Regelung von S. cerevisiae. Die Schaltungen OptoEXP, OptoINVRT und OptoAMP basieren auf dem lichtempfindlichen VP16-EL222-System. (A) Im OptoEXP-Kreislauf führt die Exposition gegenüber blauem Licht zu einer Konformationsänderung und Dimerisierung von VP16-EL222, die eine DNA-bindende Domäne freilegt und eine Transkription von PC120 ermöglicht. Die Figur wurde von Zhao et al.7 modifiziert. (B) OptoINVRT-Schaltungen nutzen die GAL (siehe abgebildeten) oder Q-Regulinen, um die Expression im Dunkeln zu induzieren. In GAL-basierten Schaltungen werden VP16-EL222 und GAL4 konstitutiv ausgedrückt, während PC120-Laufwerke Ausdruck des GAL80-Repressors erzeugen (in Q-basierten Schaltungen werden GAL4 und GAL80 durch QF2 bzw. QS ersetzt, und anstelle eines GAL-Promotors wird ein synthetischer QUAS-haltiger Promotor verwendet). Im Licht verhindert Gal80p die Aktivierung des interessierenden Gens aus PGAL1. Im Dunkeln wird GAL80 nicht exprimiert und schnell abgebaut, indem es zu einer konstitutiven Degron-Domäne (kleine braune Domäne) verschmolzen wird, was die Aktivierung von PGAL1 durch Gal4p ermöglicht. Die Figur wurde von Zhao et al.5 modifiziert. (C) OptoAMP-Schaltungen verwenden auch VP16-EL222 zur Steuerung der GAL- (siehe abgebildeten) oder Q-Regulien. In diesen Schaltkreisen wird der GAL80-Repressor (oder QS) konstitutiv ausgedrückt und mit einem lichtempfindlichen Degron (kleine blaue Domäne) verschmolzen, der eine strenge Unterdrückung im Dunkeln gewährleistet. PC120 und eine überempfindliche VP16-EL222-Mutantenkontrollexpression von GAL4 (oder QF2) mit Licht, die PGAL1 (oder einen QUAS-haltigen Promotor) im Licht stark aktiviert. GAL-abgeleitete Schaltungen können technische Formen von PGAL1 verwenden, wie PGAL1-M oder PGAL1-S, die eine erhöhte Aktivität aufweisen, sowie Wildtyp-Promotoren, die von der GAL-Regulierung kontrolliert werden (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). Die Figur wurde von Zhao et al.12 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Zwei- und dreiphasige Fermentationen im Laufe der Zeit . (A) Zweiphasige Fermentationen, die mit invertierten Schaltkreisen betrieben werden, bestehen aus einer lichtgetriebenen Wachstumsphase und einer dunklen Produktionsphase. In der Wachstumsphase reichert sich Biomasse an, da der Produktionsweg unterdrückt bleibt. Nach Erreichen des gewünschten OD600 werden die Zellen ins Dunkel verschoben, um sich metabolisch anzupassen, bevor sie für die Produktionsphase in frischen Medien resuspendiert werden. (B) In einem dreiphasigen Prozess werden die Wachstums-, Inkubations- und Produktionsphasen durch einzigartige Lichtpläne definiert, die aus einer dunklen Wachstumsperiode, einer gepulsten Inkubation und einer vollständig beleuchteten Produktionsphase bestehen können. Mit Biorender erstellte Figur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Optogenetische Schaltkreise wurden auch für die dynamische Steuerung der chemischen und Proteinproduktion in E. coli entwickelt. OptoLAC-Schaltungen steuern den bakteriellen LacI-Repressor über die lichtempfindliche pDawn-Schaltung, die auf dem Zweikomponentensystem YF1/FixJ6 basiert (Abbildung 3). Ähnlich wie OptoINVRT5 sind OptoLAC-Schaltkreise so konzipiert, dass sie die Genexpression im Licht unterdrücken und im Dunkeln induzieren. Die Expressionsniveaus, die OptoLAC-Schaltungen verwenden, können mit denen der Standard-Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid-Induktion (IPTG) mithalten oder diese übertreffen, wodurch die Festigkeit der chemischen Induktion erhalten bleibt und gleichzeitig eine verbesserte Abstimmbarkeit und Reversibilität geboten wird6. Daher ermöglichen OptoLAC-Schaltkreise eine effektive optogenetische Kontrolle für das Metabolic Engineering in E. coli.
Abbildung 3: OptoLAC-Schaltungen zur dynamischen Regelung von E. coli. Die OptoLAC-Schaltungen passen das pDawn-System und das lac-Operon an, um eine Aktivierung im Dunkeln und eine Unterdrückung im Licht zu erreichen. Im Dunkeln phosphoryliert YF1 FixJ, wodurch dann der PFixK2-Promotor aktiviert wird, um den cI-Repressor auszudrücken. Der cI-Repressor verhindert die Expression des lacI-Repressors aus dem PR-Promotor, der die Transkription des interessierenden Gens von einem lacO-haltigen Promotor ermöglicht. Umgekehrt reduziert blaues Licht die YF1-Nettokinaseaktivität, kehrt die FixJ-Phosphorylierung und damit die cI-Expression um, was die Expression von lacI unterdrückt und die Expression durch den lacO-haltigen Promotor verhindert. Die Figur wurde von Lalwani et al.6 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Wir beschreiben hier die grundlegenden Protokolle für lichtgesteuerte Fermentationen von S. cerevisiae und E. coli zur chemischen oder Proteinproduktion. Sowohl für Hefe als auch für Bakterien konzentrieren wir uns zunächst auf Fermentationen mit einer lichtgetriebenen Wachstumsphase und einer dunkelheitsinduzierten Produktionsphase, die durch OptoINVRT- und OptoLAC-Schaltkreise ermöglicht wird. Anschließend beschreiben wir ein Protokoll für eine dreiphasige (Wachstum, Induktion, Produktion) lichtgesteuerte Fermentation, die durch OptoAMP-Schaltungen ermöglicht wird. Darüber hinaus beschreiben wir, wie optogenetisch kontrollierte Fermentationen von Mikrotiterplatten auf Bioreaktoren im Labormaßstab hochskaliert werden können. Mit diesem Protokoll wollen wir einen vollständigen und leicht reproduzierbaren Leitfaden für die Durchführung lichtgesteuerter Fermentationen für die chemische oder Proteinproduktion bereitstellen.
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Protocol
1. Lichtgesteuerte chemische Produktion mit dem S. cerevisiae OptoINVRT7 Schaltkreis
- Dehnungsbau
- Erhalten Sie einen Stamm mit his3-Auxotrophie, da dieser Marker für die meisten vorhandenen OptoINVRT-Plasmide5 erforderlich ist. Wenn Sie eine optogenetische Regulation eines Gens anstreben, das in S. cerevisiae beheimatet ist, konstruieren Sie einen Stamm, bei dem jede endogene Kopie des Gens gelöscht wird.
- Linearisieren Sie das Plasmid, das die OptoINVRT7-Schaltung enthält, wie z. B. EZ-L4395, und integrieren Sie es mit Standard-Lithiumacetat-Transformationsmethoden in den his3-Locus des auxotrophen Stammes15. Wenn Sie das Plasmid EZ-L439 verwenden, das die Komponenten enthält, um PGAL1 im Licht zu unterdrücken und im Dunkeln zu aktivieren, linearisieren Sie es an der PmeI-Restriktionsstelle.
- Nach der Transformation zentrifugieren Sie die Zellen bei 150 x g für 1 min und resuspendieren vorsichtig in 200 μL frischem Histidin-Dropout-Medium (SC-His) Medium.
- Das gesamte Zellvolumen auf SC-His-Agarplatten auffüllen und bei 30 °C für 2-3 Tage inkubieren, bis Kolonien erscheinen.
- Bereiten Sie kompetente Zellen aus diesem Stamm unter Verwendung von Standard-Lithiumacetat-Transformationsprotokollen vor und transformieren Sie sie mit einem Plasmid, das die zu kontrollierenden Gene enthält, die optogenetisch entweder dem PGAL1-M- oder PGAL1-S-Promotor nachgeschaltet werden sollen5.
HINWEIS: Die Verwendung eines Plasmids, das sich an δ-Sites (YARCdelta5) integriert und mit Zeocin selektiert, ermöglicht eine stabile Multicopy-Integration7,16,17,18. - Nach der Transformation zentrifugieren Sie die Kultur bei 150 x g für 1 min und resuspendieren Sie vorsichtig in 200 μL frischem SC-Dropout-Medium.
HINWEIS: Der PGAL1-M-Promotor ist eine synthetische Version des PGAL1-Promotors, bei der die Mig1p-Repressionssites gelöscht wurden, während PGAL1-S eine technische Version von PGAL1-M ist, die über zusätzliche Gal4p-Aktivator-Bindungsstellen verfügt. Der reguläre PGAL1-Promotor kann verwendet werden, um den Ausdruck zu steuern. Die Ausdrucksstärke ist jedoch geringer als bei diesen technischen Promotoren. - Das gesamte Zellvolumen wird auf einer Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD)-Agarplatte plattiert, wenn sie in δ-Stellen integriert wird, oder auf einer SC-Dropout-Platte, wenn sie mit einem Plasmid transformiert wird, das einen Selektionsmarker enthält. 16 h bei 30 °C unter konstantem blauem Licht inkubieren, um das optogenetisch kontrollierte Gen unterdrückt zu halten.
HINWEIS: Bei einigen Stämmen können Kolonien schneller wachsen, wenn sie in blauen Lichtimpulsen (z. B. 1 s ein/79 s aus, 5 s ein/75 s aus, 10 s ein/70 s aus, etc.) inkubiert werden, anstatt in konstanter Beleuchtung, die bei Bedarf für jeden Stamm experimentell bestimmt werden muss. - Verwenden Sie eine beliebige 465-nm-Lichtquelle und platzieren Sie ein LED-Panel ~ 40 cm über der Platte, so dass die Lichtintensität ~ 80-110 μmol / m2 / s beträgt. Messen Sie die Intensität mit einem Quantenmeter (siehe Tabelle der Materialien).
- Erstellen Sie bei der Integration in δ-Standorte eine Nachbildung der Platte auf YPD-Platten, die einen Bereich von Zeocin-Konzentrationen zwischen 400 μg/ml und 1.200 μg/ml enthalten, um sie für eine Vielzahl von Integrationskopiennummern5,7,12,16,17,18 auszuwählen. Inkubieren Sie die Nachbauplatten bei 30 °C unter konstantem oder gepulstem blauem Licht für 2-3 Tage, bis die Kolonien erscheinen.
- Vorab-Screening für die besten Kolonien
- Wählen Sie acht Kolonien aus jeder Platte aus und verwenden Sie sie, um 1 ml SC-His-Medium zu impfen, das mit 2% Glukose in einzelnen Vertiefungen einer 24-Well-Platte ergänzt wird. Wachsen Sie in 24-Well-Platten unter den Zellen über Nacht (16-20 h) bei 30 ° C mit 200 U / min (19 mm Orbitaldurchmesser), die unter konstanter blauer Lichtbeleuchtung schütteln.
- Verdünnen Sie am nächsten Morgen jede Kultur in 1 ml eines frischen SC-His-Mediums mit 2% Glukose auf OD600-Werte im Bereich von 0,01-0,3 und wachsen Sie in 24-Well-Platten unter konstantem oder gepulstem Licht bei 30 ° C mit 200 U / min Schütteln, bis sie Zelldichten zwischen 2 und 9 OD600-Werten erreichen (Abbildung 4A). Die Zeit, die für diese Wachstumsphase benötigt wird, hängt von der Belastung ab.
- Inkubieren Sie die Platten bei Dunkelheit für 4 h bei 30 °C mit 200 U/min Schütteln, indem Sie die Leuchtplatte ausschalten und die Platten in Aluminiumfolie einwickeln.
HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht es den Zellen, metabolisch in die Produktionsphase überzugehen, bevor sie in den Produktionsmedien resuspendiert werden. - Um die Produktionsphase zu beginnen, zentrifugieren Sie die Kulturen in der 24-Well-Platte bei 234 x g für 5 min und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml frischem SC-Dropout-Medium mit 2% Glukose. Versiegeln Sie die Platten, um das Verdampfen des gewünschten Produkts zu verhindern, indem Sie steriles Mikroplatten-Dichtband verwenden.
- Die versiegelten Platten im Dunkeln 48 h bei 30 °C mit Schütteln bei 200 U/min fermentieren. Stellen Sie sicher, dass die Platten in Aluminiumfolie eingewickelt sind, um Lichteinwirkung zu vermeiden.
HINWEIS: Das Einwickeln der Platten in Folie schränkt die Sauerstoff- oder Gasverfügbarkeit in Fermentationen nicht ein; Das sterile Dichtband begrenzt jedoch den Gastransfer. Kleine Löcher können in das Band gestochen werden, um bei Bedarf Sauerstoff einzuführen.
- Ernte und Analyse
- Um die Fermentationen zu ernten, zentrifugieren Sie die Platten für 5 min bei 234 x g und übertragen Sie 800 μL des Überstands in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Abhängig von der interessierenden Chemikalie analysieren Sie mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) oder einer anderen analytischen Methode unter Verwendung der Probenvorbereitungstechnik, die für das verwendete Instrument am besten geeignet ist.
2. Lichtgesteuerte Proteinproduktion mit dem E. coli OptoLAC System
- Dehnungsbau
- Co-Transformation des elektrokompetenten BL21 DE3 ΔlacI ΔlacI-DE3 mit einem Plasmid, das den OptoLAC1B- oder OptoLAC2B-Schaltkreis6 und ein Plasmid enthält, das das rekombinante Protein von Interesse aus dem PT7-Promotor exprimiert19.
- Nach der Transformation werden die Zellen für 1 h in 1 ml superoptimaler Brühe mit Katabolitverdrängung (SOC; 2% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM Glucose) bei 37 °C mit Rotation oder Schütteln wiederhergestellt.
HINWEIS: Das Plasmid, das das interessierende Protein enthält, muss mit dem OptoLAC-Plasmid kompatibel sein (d. h. unterschiedlicher Resistenzmarker und Herkunft der Replikation) und darf keine Kopie von lacI enthalten. - Zentrifugieren Sie die Zellen bei 4845 x g für 3 min und konzentrieren Sie das Pellet in 200 μL Lysogenesbrühe (LB) -Medien. Die gesamten konzentrierten Zellen mit geeigneten Antibiotika auf eine LB-Agarplatte auffüllen und über Nacht unter konstantem blauem Licht bei 37 °C wachsen, um die Proteinexpression unterdrückt zu halten.
- Erstes Screening zur Überprüfung des Ausdrucks
- Nehmen Sie drei einzelne Kolonien und verwenden Sie sie, um 1 ml LB-Medien mit geeigneten Antibiotika in einzelnen Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu impfen. Über Nacht (16-20 h) bei 37 °C wachsen, wobei 200 U/min bei konstanter Blaulichtbeleuchtung schütteln (Abbildung 4A).
- Verwenden Sie am nächsten Tag 1,5 μL Kultur, um OD600 in einem Spektralphotometer mit einer Mikrovolumenmessung zu messen. Verdünnen Sie Kulturen in 1 ml frisches LB in 24-Well-Platten auf OD600-Werte im Bereich von 0,01-0,1.
- Züchten Sie die Kulturen bei 37 °C mit 200 U/min und schütteln Sie unter blauem Licht für 2-3 h. Nehmen Sie ab der zweiten Stunde alle 15 Minuten OD600-Messungen vor, um sicherzustellen, dass die Kulturen den OD600-Bereich von 0,1 bis 1,5 nicht überschreiten.
- Sobald die Kulturen auf dem gewünschten OD600 sind, schalten Sie die Leuchtplatte aus und wickeln Sie die Platte in Aluminiumfolie, um die Produktionsphase einzuleiten. Halten Sie die Platte 8 h (37 °C), 20 h (30 °C) oder 48 h (18 °C) im Dunkeln, wobei 200 U/min schütteln.
- Messen und zeichnen Sie den endgültigen OD600-Wert jeder Kultur auf.
- Ernte und Analyse
- Übertragen Sie 800 μL jeder Kultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und eine Zentrifuge für 5 min bei 17.000 x g.
- Resuspendiert das Zellpellet in 200 μL Resuspensionspuffer (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM).
HINWEIS: Die Konzentration von NaCl kann basierend auf dem zu analysierenden rekombinanten Protein angepasst werden. - Fügen Sie 50 μL 6x Natriumdodecylsulfat (SDS) Probenpuffer hinzu (Tris 375 mM, pH 6,8, SDS 9%, Glycerin 50%, Bromphenolblau 0,03%, DTT 9%). Bei 100 °C für 10 min mit Schütteln bei 700 U/min in einem Thermomischer inkubieren.
- Laden Sie ~3-20 μL der Kultur in ein 12% SDS-PAGE Gel. Verwenden Sie die endgültige OD600-Messung als Richtwert, laden Sie ungefähr die gleiche Menge an Protein für jede Probe (entspricht 10 μL der Probe, was einem endgültigen OD600-Wert von 1 entspricht). Verwenden Sie ein Netzteil, um die Elektrophorese mit 100 V durchzuführen, bis das Gel vollständig aufgelöst ist.
- Färben Sie das Gel mit Coomassie brilliant blue G-250-Lösung, indem Sie es in einem Mikrowellenherd für 30-40 s erhitzen und dann mindestens 15 Minuten lang auf einem Plattformrotator inkubieren.
- Zweimal mit entionisiertem Wasser abspülen und mindestens 30 Minuten (oder über Nacht) auf einem Plattformrotator abflecken, wobei Sie zwei Reinigungstücher hinzufügen, die zu einem Knoten gebunden sind, um den Fleck zu absorbieren. Kochen Sie das Gel in ausreichender Menge Wasser in der Mikrowelle für 15 Minuten, um den Färbungsprozess zu beschleunigen.
3. Dreiphasige Fermentation mit dem S. cerevisiae OptoAMP-System
- Dehnungsbau
- Erhalten Sie einen Stamm mit einem his3 auxotrophen Marker, da dieser Marker notwendig ist, um die vorhandenen OptoAMP-Plasmide5 zu verwenden. Wenn Sie eine optogenetische Regulation eines Gens anstreben, das in S. cerevisiae heimisch ist, konstruieren Sie einen Stamm, bei dem die endogene Kopie dieses Gens gelöscht wird.
- Linearisieren Sie ein Plasmid, das die OptoAMP4-Schaltung enthält, wie z. B. EZ-L58012, und integrieren Sie es mit Standard-Lithiumacetat-Transformationsmethoden in den his3-Locus des auxotrophen Stammes15. Wenn Sie EZ-L580 verwenden, linearisieren Sie das Plasmid an der PmeI-Restriktionsstelle.
- Nach der Transformation zentrifugieren Sie die Zellen bei 150 x g für 1 min und resuspendieren Sie vorsichtig in 200 μL frischem SC-His-Medium.
- Das gesamte Zellvolumen auf selektiven Medien (SC-His-Agar) plattieren und bei 30 °C für 2-3 Tage inkubieren, bis Kolonien auftreten.
- Bereiten Sie kompetente Zellen aus diesem Stamm vor und transformieren Sie sie mit einem Plasmid, das die zu kontrollierenden Gene enthält, die optogenetisch nach dem PGAL1-S-Promotor zu kontrollieren sind12.
HINWEIS: Die Verwendung eines Plasmids, das sich an δ-Standorten integriert und mit Zeocin selektiert, ermöglicht eine stabile Multicopy-Integration und -Auswahl. - Nach der Umwandlung zentrifugieren Sie die Kultur bei 150 x g für 1 min und resuspendieren Sie vorsichtig in 200 μL frischem SC-Dropout-Medium.
HINWEIS: Der PGAL1-S-Promotor ist eine synthetische Version des PGAL1-Promotors, bei der die Mig1p-Repressionssites gelöscht und zusätzliche Gal4p-Aktivator-Bindungssites hinzugefügt werden. Der reguläre PGAL1-Promotor kann verwendet werden; Die Ausdrucksstärke ist jedoch geringer als bei diesem technischen Promotor. - Das gesamte Zellvolumen auf einer YPD- oder SC-Dropout-Agarplatte plattieren und bei 30 °C für 16 h im Dunkeln (eingewickelt in Aluminiumfolie) inkubieren. Die Inkubation im Dunkeln hält das optogenetisch kontrollierte Gen unterdrückt, was es den Zellen ermöglicht, ihre metabolischen Ressourcen auf das Zellwachstum und nicht auf die chemische Produktion auszurichten.
- Bei der Integration in δ-Standorte replizieren Sie die Platte auf YPD-Platten, die einen Bereich von Zeocin-Konzentrationen enthalten, um sie für eine Vielzahl von Integrationskopiennummern auszuwählen. Inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C im Dunkeln (eingewickelt in Aluminiumfolie) für 2-3 Tage, bis Kolonien erscheinen.
- Vorab-Screening für die besten Kolonien
- Wählen Sie acht Kolonien aus jeder Platte aus und verwenden Sie sie, um 1 ml SC-His-Medium mit 2% Glukose in einzelnen Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu impfen. Züchten Sie die Zellen über Nacht (16-20 h) im Dunkeln bei 30 °C mit 200 U/min Schütteln.
- Verdünnen Sie am nächsten Morgen jede Kultur in 1 ml frischem SC-His Medium mit 2% Glukose auf 0,1 OD600 und wachsen Sie im Dunkeln bei 30 ° C mit 200 U / min Schütteln, bis sie einen OD600 von 3 erreichen. Wickeln Sie die Platten in Aluminiumfolie, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Die Zeit, die für diese Wachstumsphase benötigt wird, hängt von der Belastung ab.
- Um die Induktionsphase zu starten, inkubieren Sie die Platten unter gepulstem Licht (z. B. 5 s ein/95 s aus) für 12 h bei 30 °C mit 200 U/min schütteln. Verwenden Sie eine beliebige 465-nm-Lichtquelle und platzieren Sie ein LED-Panel über der Platte, so dass die Lichtintensität ~ 80-110 μmol / m2 / s beträgt, um optimale Ergebnisse zu erzielen (Abbildung 4A).
HINWEIS: Die optimale Lichtpulsdauer für diese Inkubation variiert je nach produzierter Chemikalie. Es wird empfohlen, eine Reihe von Lichtplänen von 0,1% (z. B. 1 s bei 999 s aus) bis 100% (Volllicht) abzuschirmen. - Um die Produktionsphase zu starten, zentrifugieren Sie die Kulturen bei 234 x g für 5 min und resuspendieren Sie in frischem SC-His-Medium mit 2% Glukose. Versiegeln Sie die Platten, um das Verdampfen des gewünschten Produkts zu verhindern, mit sterilem Mikroplatten-Siegelband.
- Fermentieren Sie die versiegelten Platten bei Licht für 48 h bei 30 °C mit Schütteln bei 200 U / min. Optimieren Sie den Lichtplan während dieses Schritts, da einige Chemikalien von einer gepulsten Produktionsphase und nicht von vollem Licht profitieren.
- Ernte und Analyse
- Ernten Sie die Fermentationen, indem Sie die Platten für 5 min bei 234 x g zentrifugieren und 800 μL des Überstands in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
- Abhängig von der interessierenden Chemikalie analysieren Sie mit HPLC, GC-MS oder einer anderen Analysemethode unter Verwendung der Probenvorbereitungstechnik, die für das verwendete Instrument am besten geeignet ist.
4. Chemische (Mevalonat-) Produktion aus E. coli in einem lichtgesteuerten Bioreaktor
- Erstimpfung und Bioreaktoraufbau
- Beimpfen Sie eine Kolonie eines E. coli-Stammes, der mit lichtkontrollierter chemischer Produktion entwickelt wurde, in 5 ml M9 minimale Salze (3,37 mM Na2HPO4, 2,2 mM KH2PO4, 0,855 mM NaCl, 0,935 mM NH4Cl), ergänzt mit 0,2% w/v Casaminosäuren, 5% w/v Glukose und Spurenmetallgemisch20 (0,0084 g/L EDTA, 0,0025 g/L CoCl2, 0,015 g/L MnCl2, 0,0015 g/L CuCl2, 0,003 g/L H3BO3, 0,0025 g/L Na2MoO4, 0,008 g/L ZnCl2, 0,06 g/L Fe(III)-Citrat, 0,0045 g/L Thiamin, 1,3 g/L MgSO4) in einem 50 ml konischen Röhrchen.
- Züchten Sie die Kultur über Nacht bei 30 ° C mit 200 U / min, die unter blauer Lichtbeleuchtung schütteln.
- Richten Sie die Bioreaktor-Behälterkopfplatte ein und stellen Sie sicher, dass die folgenden Anschlüsse installiert sind: Einsatz für Wärmesonde; Sonde für gelösten Sauerstoff (DO); Gassparger - Anschluss an die Luftquelle über einen 0,2-μm-Filter; Laufrad; Gaskondensator - Anschluss an einen 0,2-μm-Filter; Kühlleitung (x2); Zuleitungen (x2) - eine für die Medienzugabe, eine für die pH-Kontrolle; Probenahmelinie - stellen Sie sicher, dass sie den Boden des Schiffes erreicht; leerer Port; pH-Sonde - kalibrieren Sie die Sonde vor der Installation mit den Standards pH = 4 und pH = 7, entweder mit dem Rest des Gefäßes autoklavieren oder mit 95% Ethanol sterilisieren und vor dem Aufbau aseptisch einsetzen.
- Füllen Sie das Gefäß mit 1 L gefiltertem Wasser, befestigen Sie die Kopfplatte und ziehen Sie es fest, um sicherzustellen, dass der O-Ring gut sitzt und abdichtet.
- Decken Sie alle Öffnungen in den Reaktor mit Aluminiumfolie ab.
- Bereiten Sie drei Schlauchstreifen vor: einen zum Entfernen des Wassers, einen zum Einführen des Futters und einen zur pH-Kontrolle. Decken Sie die Enden mit Aluminiumfolie ab und wickeln Sie alle Schläuche in Aluminiumfolie.
HINWEIS: NH4OH, das zur pH-Einstellung verwendet wird, fließt in Silikonschläuchen nicht reibungslos, was zu ungenauen Durchflussraten und einer Überbasifizierung der Kultur führen kann. Um dieses Problem zu vermeiden, verwenden Sie biokompatible Pumpenschläuche (BPT) für die NH4OH-Zufuhr. - Autoklavieren Sie den Bioreaktor und den Schlauch mit einem 30-minütigen Flüssigkeitszyklus.
- Entfernen Sie die Materialien aus dem Autoklaven. Sobald es kühl genug ist, um es zu handhaben, schließen Sie das Laufrad, die pH- und DO-Sonden, die Luftquelle, den Kondensatoreinlass und -auslass sowie den Kühleinlass und -auslass an die Steuerstation an.
- Setzen Sie die Wärmesonde ein und bedecken Sie das Gefäß mit einem Heizmantel. Befestigen Sie die Jacke an der Oberseite des Schiffes, um zu vermeiden, dass die Kultur vor Lichteinwirkung geschützt wird.
- Schließen Sie eines der sterilen Rohre an die Probenahmeleitung an und sichern Sie es durch die Probenahmepumpe. Platzieren Sie das andere Ende so, dass es in einen leeren Behälter fließt, der mindestens 1 l aufnehmen kann.
- Schließen Sie ein weiteres steriles Rohr an eine der Zuleitungen an und sichern Sie es durch eine der Förderpumpen. Schließen Sie das andere Ende des Röhrchens an eine Flasche M9-Medien an. Führen Sie die Medien in den Reaktor ein.
- Schließen Sie ein weiteres steriles Rohr an eine der Zuleitungen an und sichern Sie es durch eine der Förderpumpen. Schließen Sie das andere Ende des Rohres an die Flasche an, die 28% -30% NH4OH enthält.
ACHTUNG: NH4OH ist korrosiv. Arbeiten Sie in einem Abzug, während Sie zu einer Futterflasche wechseln, und stellen Sie sicher, dass die Futterflasche in einem sekundären Containment platziert ist. - Platzieren Sie drei Leuchtplatten in einer dreieckigen Formation ~ 20 cm vom Reaktor entfernt und überprüfen Sie, ob die Lichtintensitäten auf der Oberfläche des Behälters von jeder Seite ~ 80-110 μmol / m2 / s erreichen (Abbildung 4B).
- Schalten Sie am nächsten Tag das Bioreaktorsystem und den Kühler ein. Stellen Sie den Sollwert der Reaktortemperatur auf 37 °C, den pH-Sollwert auf 7,0 und das Rühren auf 200 U/min ein. Die Heizjacke sollte sich einschalten.
- Kalibrieren Sie die DO-Sonde, indem Sie zuerst warten, bis die Temperatur- und DO-Messungen konstant sind (dies ist der Sollwert von 100%). Trennen Sie dann die Sonde vom System (dies ist der 0%-Sollwert). Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis sich die DO-Messung bei 100 % stabilisiert hat, wenn die Sonde angeschlossen ist, und stellen Sie dann den DO-Sollwert auf 20 % ein.
- Lichtgesteuerte chemische Produktion
- Beimpfen Sie den Bioreaktor auf einen anfänglichen OD600 von 0,001-0,1. Schalten Sie die Leuchtplatten ein, um das Wachstum einzuleiten.
- Nach 3 Stunden beginnen Sie mit der Entnahme von Proben aus der Probenahmelinie, um OD600-Messungen durchzuführen, um ein Überwachsen der optimalen Zelldichte der Induktion (ρs) zu vermeiden. Sobald das optimale ρs erreicht ist (der optimale Wert für die Mevalonatproduktion ist 0,17), schalten Sie die Leuchtplatten aus, bedecken Sie den Reaktor mit Aluminiumfolie und wickeln Sie den Aufbau in ein schwarzes Tuch, um die dunkle Produktionsphase einzuleiten.
- Fügen Sie 50 μL Antischaummittel hinzu, 8 h nach dem Wechsel in die Dunkelheit. Schrauben Sie den leeren Port ab und pipettieren Sie das Antischaummittel direkt in den Reaktor.
- Verwenden Sie den Probenahmeanschluss, um regelmäßig Proben für die HPLC- oder GC-Analyse zu entnehmen.
- Demontage und Analyse
- Schalten Sie das System nach Abschluss des Experiments aus. Schrauben Sie die DO- und pH-Sonden vorsichtig ab und waschen Sie sie mit Wasser und Seife. Schrauben Sie die Kopfplatte ab und waschen Sie sie mit einer Bürste mit Wasser und Seife.
- Die Kultur in einen leeren Behälter geben und Bleichmittel bis zu einer Endkonzentration von 10% v/v hinzufügen. In einen Abzug geben und nach 30 min entsorgen.
- Waschen Sie den Reaktorbehälter mit einer Bürste mit Wasser und Seife.
- Bereiten Sie die Proben für die Analyse auf der Grundlage des interessierenden Produkts vor. Für die Mevalonatproduktion werden 560 μL Kultur mit 140 μL 0,5 M HCl gemischt und 1 min lang bei hoher Geschwindigkeit vorgewirbelt. Dadurch wird Mevalonat in (±)-Mevalonolacton umgewandelt.
ACHTUNG: HCl ist ein Gesundheitsrisiko. Behandeln Sie mit der richtigen PSA und stellen Sie sicher, dass die Probenröhrchen vor dem Vortexen ordnungsgemäß verschlossen sind. - Zentrifuge bei 17.000 x g für 45 min bei 4 °C. Übertragen Sie 250 μL des Überstands auf eine HPLC-Durchstechflasche.
- Für Mevalonat analysieren Sie Proben mit einer Ionenaustauschsäule für organische Säuren. Quantifizieren Sie die Produktion mit einem Brechungsindexdetektor (RID) und vergleichen Sie die Spitzenbereiche mit einem Standard von (±)-Mevalonolacton.
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Representative Results
Die optogenetische Regulation des mikrobiellen Stoffwechsels wurde erfolgreich zur Herstellung einer Vielzahl von Produkten implementiert, darunter Biokraftstoffe, Massenchemikalien, Proteine und Naturstoffe5,6,7,12,13. Die meisten dieser Prozesse sind so konzipiert, dass das Zellwachstum im Licht stattfindet (wenn eine niedrige Zelldichte minimale Herausforderungen bei der Lichtdurchdringung darstellt) und dass die Produktion durch Dunkelheit induziert wird, sobald die Zellen gezüchtet sind. Verschiedene Chemikalien, die mit diesem Ansatz aus Hefe hergestellt wurden, darunter Milchsäure, eine wertvolle Polymervorstufe und Lebensmittelzusatzstoff, sowie Isobutanol, ein Biokraftstoff der nächsten Generation. Für beide Chemikalien ergibt sich eine gemeinsame Herausforderung aus dem starken Bestreben von S. cerevisiae, Glukose in Richtung Ethanolproduktion und nicht in das Produkt von Interesse zu metabolisieren, und der Unfähigkeit, den Ethanolfermentationsweg zu löschen, ohne einen schweren Wachstumsdefekt zu verursachen7. Eine Kombination aus lichtaktivierten OptoEXP- und lichtunterdrückten OptoINVRT-Schaltkreisen wurde verwendet, um selektiv das für die Ethanolfermentation erforderliche Gen für die Pyruvatdecarboxylase (PDC1) mit Licht zu aktivieren und den Weg für das gewünschte Produkt im Dunkeln zu induzieren5 (Abbildung 5A,B). Mit dieser Strategie mit einer optimierten Zelldichte der Induktion (ρs) können hohe Titer beider gewünschter Chemikalien erreicht werden (Abbildung 5C,D), was den Wert der bidirektionalen Kontrolle durch die Optogenetik unterstreicht.
Während sich die meisten hefebasierten optogenetischen Prozesse auf eine lichtgetriebene Wachstumsphase und eine dunkelheitsinduzierte Produktionsphase konzentriert haben, hat die jüngste Entwicklung besonders empfindlicher und starker OptoAMP-Schaltkreise auch Möglichkeiten für lichtgetriebene Fermentationen eröffnet12. Diese lichtgetriebenen Fermentationen ähneln den zuvor beschriebenen Prozessen; Die Lichtpläne sind jedoch umgekehrt, so dass die Produktion im Licht stattfindet. Darüber hinaus ermöglichen diese Schaltungen die Implementierung von dreiphasigen Prozessen, was der Produktion im Vergleich zum Standard-Zweiphasenansatz mehr Flexibilität und Kontrolle verleiht. Angesichts der Empfindlichkeit und Stärke dieser Schaltkreise werden diese dreiphasigen Prozesse typischerweise optimiert, indem in jeder Phase unterschiedliche Lichtpläne abgeschirmt werden. Optimale Lichtimpulse hängen von der Dehnung und dem Produkt des Interesses ab. Solche Schaltkreise wurden erfolgreich bei der Herstellung von Naringenin, einem Naturprodukt mit therapeutischen Anwendungen, zusätzlich zu Milchsäure und Isobutanol12 angewendet (Abbildung 6). Die erhöhte Produktion aller drei Chemikalien zeigt den Wert der optogenetischen Regulation über eine Reihe von Signalwegkomplexitäten sowie das neue Potenzial, das dreiphasige Fermentationen bieten.
Über diese Demonstrationen in Hefe hinaus wurde die Optogenetik auch angewendet, um die Produktion von Proteinen und Chemikalien im bakteriellen Arbeitspferd E. coli zu verbessern. Fermentationen mit diesem Wirt folgten einem lichtgetriebenen Wachstums- und Dunkelheitsinduzierungs-Produktions-Framework unter Verwendung der OptoLAC-Suite von Schaltungen6. Bei der Herstellung eines gelbfluoreszierenden Proteins (YFP) oder des Transkriptionsfaktors FdeR ist die lichtgesteuerte Produktion vergleichbar oder besser als die mit der Standard-IPTG-Induktion erreichten Werte, jedoch mit einfacherer Abstimmbarkeit für mittlere Produktionsstufen (Abbildung 7A). Darüber hinaus wurden OptoLAC-Schaltkreise zur Herstellung von Mevalonat, einem wichtigen Terpenoid-Vorläufer, sowohl auf Mikroplatten- als auch auf Bioreaktorebene eingesetzt (Abbildung 7B,C). Diese ausgewählten Ergebnisse geben einen allgemeinen Überblick über die Stärke, Vielseitigkeit und Abstimmbarkeit der optogenetischen Regulation für die mikrobielle chemische und Proteinproduktion.
Abbildung 4: Versuchsaufbau zur Beleuchtung von Platten und Bioreaktoren. (A) 24-Well-Platten können während des Schüttelns beleuchtet werden, indem eine blaue LED-Leuchtplatte etwa 40 cm über dem Shaker platziert wird. Die Lichtintensität sollte mit einem Quantenmeter gemessen werden, um sicherzustellen, dass sie zwischen ~ 80-110 μmol / m2 / s liegt. (B) Um einen Bioreaktor zu beleuchten, platzieren Sie drei Lichttafeln in einer dreieckigen Formation um den Bioreaktor. Wie bei den 24-Well-Platten sollte die Lichtintensität gemessen und eingestellt werden, um von allen Seiten ~ 80-110 μmol / m2 / s zu erreichen. Mit Biorender erstellte Figur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Lichtverdrängte Produktion von Chemikalien aus S. cerevisiae. Um die Produktion von Milchsäure (A) oder Isobutanol (B) zu verbessern, wurde eine Kombination aus hell- und dunkelinduzierbaren Schaltkreisen verwendet, um selektiv bestimmte Signalwege zu aktivieren. In beiden Szenarien wird der essentielle Ethanolproduktionsweg im Licht induziert, indem die PDC1-Expression mit OptoEXP gesteuert wird, während die Produktionswege im Dunkeln über eine OptoINVRT-Schaltung aktiviert werden. (C) Die Herstellung von Milchsäure wurde in einem Bereich von ρs-Werten mit zwei Schaltkreisen aus der OptoINVRT-Suite getestet. Die OptoINVRT7-Version schnitt mit einem optimalen ρs-Wert von 7,0 am besten ab. (D) Die OptoINVRT7-Version maximierte auch die Isobutanolproduktion im Vergleich zur anderen Schaltung mit einem optimalen ρs von 8,75. ** p < 0,01, ***p < 0,001 . Statistiken werden mit einem zweiseitigen t-Test abgeleitet. Die Daten werden als Mittelwerte dargestellt und Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen von vier Replikaten dar. Die Figur wurde von Zhao et al.5 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Lichtaktivierte Produktion von Chemikalien in dreiphasigen Fermentationen von S. cerevisiae. Fermentationen mit den OptoAMP-Schaltungen können mit drei dynamischen Phasen betrieben werden: Wachstum (i), Induktion (ii) und Produktion (iii), die jeweils durch unterschiedliche leichte Tastverhältnisse definiert sind. (A) Die Biosynthese von Milchsäure wird in blauem Licht durch optogenetische Kontrolle der LDH-Expression induziert. (B) Die Milchsäureproduktion kann optimiert werden, indem ein gepulster Lichtplan (1 s ein/79 s aus) in der Wachstumsphase und eine vollständige Beleuchtung in der Induktions- und Produktionsphase verwendet werden. (C) Die Produktion von Isobutanol wird durch die optogenetisch kontrollierende ILV2-Expression induziert. (D) Die Isobutanolproduktion wird unter Verwendung einer gepulsten Wachstumsphase (1 s on/79 s off), einer vollständig beleuchteten Induktionsphase und einer gepulsten (2 s on/118 s off) Produktionsphase optimiert. (E) Kontrolle des komplexeren Biosynthesewegs für Naringenin, induziert durch optogenetisch kontrollierende Expression der TAL- und PAL-Gene. (F) Die Naringenin-Biosynthese wird am besten durch ein gepulstes Wachstum (1 s an / 79 s aus), eine vollständig beleuchtete Induktion und eine dunkle Produktionsphase optimiert. *p < 0,05, **p < 0,01, n.s. = keine Signifikanz. Statistiken werden mit einem zweiseitigen t-Test abgeleitet. Die Daten werden als Mittelwerte dargestellt und Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen von vier unabhängigen Replikaten dar. Die Figur wurde von Zhao et al.12 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Optogenetische Produktion von rekombinanten Proteinen und Chemikalien in E. coli. Das OptoLAC-System wurde verwendet, um sowohl Proteine als auch Chemikalien an Titern herzustellen, die mit denen vergleichbar oder höher sind als diejenigen, die durch chemische Induktion mit IPTG erreicht wurden. (A) Die optogenetische Expression von FdeR ist sowohl stark als auch abstimmbar unter Verwendung einer Vielzahl von leichten Tastverhältnissen, wie sie mit Western Blot aufgelöst und quantifiziert wurden. (B) Ein für die Mevalonatproduktion entwickelter Stamm übertrifft die Titer, die mit IPTG-Induktion auf der 24-Well-Skala beim optimalen ρs-Wert erreicht werden. (C) Die optogenetische Produktion von Mevalonat in einem 2-L-Bioreaktor zeigt die Skalierbarkeit der Produktion über Mikrotiterplatten hinaus. *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001 . Statistiken werden mit einem zweiseitigen t-Test abgeleitet. Alle Daten werden als Mittelwerte dargestellt und Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen biologisch unabhängiger Proben dar. Daten für (A) und (C) stellen drei Replikate dar, während für (B) die Anzahl der Replikate von links nach rechts = 4, 4, 6, 3, 4, 4, 4, 4, 4. Die Figur wurde von Lalwani et al.6 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dynamische Kontrolle wird seit langem angewendet, um die Ausbeute für metabolisches Engineering und rekombinante Proteinproduktion zu verbessern4. Verschiebungen in der enzymatischen Expression werden am häufigsten mit chemischen Induktoren wie IPTG21, Galactose22 und Tetracyclin23 durchgeführt, aber auch unter Verwendung von Prozessbedingungen wie Temperatur und pH-Wert vermittelt. Die optogenetische Kontrolle der Genexpression macht Änderungen der Fermentationsparameter oder der Medienzusammensetzung überflüssig und macht sie zu einer leicht anwendbaren Alternative zu herkömmlichen Induktionsstrategien. Die Leichtigkeit, mit der Licht ein- oder ausgeschaltet werden kann, bietet auch neue Möglichkeiten wie die schnelle und reversible Abstimmung der Gendosierung. Während sich diese Protokolle auf auf blaues Licht reagierende Systeme konzentrieren, bietet die Existenz optogenetischer Werkzeuge, die bestehende Lichtreaktionen24 umkehren oder auf andere Wellenlängen des Lichts reagieren25,26,27,28,29, ein aufregendes Potenzial, mehrere Signalwege orthogonal zu kontrollieren, um ein beispielloses Maß an Kontrolle zu erreichen. Solche Vorteile machen Licht zu einer vielseitigen neuen Lösung für die flexible Kontrolle mikrobieller Fermentationen.
Neben dem Screening auf die besten Kolonien, wie in den Protokollen diskutiert, sollten auch andere Parameter wie die Zelldichte, bei der Kulturen vom Wachstum auf die Produktion umgestellt werden (ρs), die Länge der Produktions- und Inkubationszeiten sowie leichte Arbeitszyklen optimiert werden. Die besten Werte dieser Parameter sind produkt- und dehnungsabhängig und sollten daher für jede neue Anwendung neu optimiert werden. Zum Beispiel können Signalwege mit toxischen Endprodukten von höheren ρs-Werten profitieren, die eine ausreichende Ansammlung von Zellen ermöglichen, bevor sie die Produktion induzieren6,7, während eine schwächere, aber weniger undichte Schaltung niedrigere Werte von ρs begünstigen kann, um die Gesamtexpressionszeit zu maximieren. Ebenso können einige Signalwege und rekombinante Proteine von intermediären Expressionsniveaus profitieren, die mit einzigartigen Lichtaufgaben erreicht werden können. Darüber hinaus kann bei Fermentationen, die OptoAMP-Schaltungen verwenden, die Anzahl der zeitlichen Phasen optimiert werden. Während das demonstrierte Protokoll einen dreiphasigen Prozess beschreibt, können Fermentationen mit diesen Schaltkreisen mit einer größeren Anzahl von Phasen gesteuert werden, die durch einzigartige Lichtarbeitspläne und -dauern definiert sind. Daher sollte eine Reihe dieser Parameter getestet werden, um die Leistung zu optimieren.
Die Vermeidung von Lichtverschmutzungsquellen stellt beim Versuchsaufbau eine wichtige Überlegung dar. Bei Prozessen, die eine Verzögerung der Lichtstimulation bis zu späteren Stadien erfordern (z. B. Dunkel-zu-Licht-Fermentationen), kann es ratsam sein, in einem dunklen Raum zu arbeiten, um eine vorzeitige Aktivierung optogenetischer Systeme zu vermeiden. In diesen Fällen kann eine inerte Lichtquelle für die Sichtbarkeit während des Versuchsaufbaus verwendet werden (z. B. eine fernrote Lichtquelle von ~ 700 nm bei der Arbeit mit blaulichtaktivierten Systemen). Ein Vorteil von Prozessen, die mit lichtinduziertem Wachstum (hell bis dunkel) beginnen, besteht darin, dass erste experimentelle Manipulationen unter Umgebungslicht mit ausreichender Sichtbarkeit durchgeführt werden können.
Die Leichtigkeit, mit der eine große Anzahl von leichten Arbeitsplänen auf Fermentationen angewendet werden kann, bietet die Möglichkeit, Methoden mit höherem Durchsatz zu entwickeln, um Biosynthesewege auszugleichen und die optimalen Bedingungen aufzuklären, die die Fermentationsproduktivität maximieren. Anstatt Stoffwechselwege auszugleichen, indem eine große Anzahl von kombinatorisch zusammengesetzten Konstrukten getestet wird, bei denen jedes Enzym von Promotoren unterschiedlicher Stärke exprimiert wird, könnten die Signalwege durch unterschiedliche Genexprimierungsniveaus unter Verwendung verschiedener Lichteinschaltzyklen aus einer viel kleineren Anzahl von Konstrukten ausgeglichen werden. Dadurch entfallen schwerfälligere Versuchsaufbauten wie Resuspension in verschiedenen Induktionsmedien oder serielle Verdünnungen für chemische Induktoren. Optogenetische Experimente könnten möglicherweise sogar automatisiert werden, um den Durchsatz zu erhöhen, indem In-silico-Controller verwendet werden, um spezifisch getaktete oder lokalisierte Lichtimpulse an verschiedene Probenpools zu liefern30. Hochdurchsatzexperimente unter verschiedenen Lichtbedingungen müssen jedoch ausreichend voneinander getrennt sein, um eine Kreuzkontamination des Lichts zu vermeiden, die räumliche Einschränkungen mit sich bringen kann. Darüber hinaus verhindert die Anforderung der Lichtstimulation die Verwendung der meisten Plattenleser und Mikrobioreaktoren für kontinuierliche Messungen. Obwohl noch nicht allgemein kommerziell verfügbar, wurden in jüngster Zeit mehrere Apparate und Algorithmen für Hochdurchsatz- und kontinuierliche optogenetische Experimente entwickelt, die dazu beitragen, diese räumlichen Einschränkungen zu überwinden31,32,33,34. Trotz dieser Einschränkungen bietet die Optogenetik ein enormes Potenzial, den experimentellen Durchsatz zu erhöhen und gleichzeitig eine verbesserte Kontrollierbarkeit zu bieten.
Die hier vorgestellten Protokolle und Videos werden hoffentlich die Barrieren für andere Forscher senken, um optogenetische Kontrollen des Zellstoffwechsels und der mikrobiellen Fermentationen einzuführen. Optogenetik ist eine Grundlagentechnologie für Grundlagenforschung und biotechnologische Anwendungen, die von einer fein abgestimmten Kontrolle von Genexpressionen wie Genetik, Molekular- und Zellbiologie, Stoffwechsel, Systembiologie und Cybergenetik profitieren können35,36,37,38. Darüber hinaus wurde die optogenetische Regulation der Genexpression in anderen Mikroorganismen wie Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die Vorteile der Lichtkontrolle auf die Untersuchung und Anwendung verschiedener Arten ausgedehnt werden können39,40,41. Diese Möglichkeiten verdeutlichen das zukünftige Potenzial der Optogenetik für Metabolic Engineering, Proteinproduktion und andere biotechnologische Anwendungen.
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Disclosures
Die Autoren haben mehrere Patente für die in diesem Artikel beschriebenen optogenetischen Schaltkreise und Verfahren angemeldet.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde vom U.S. Department of Energy, Office of Science, Office of Biological and Environmental Research Award Number DE-SC0019363, dem NSF CAREER Award CBET-1751840, The Pew Charitable Trusts und dem Camille Dreyfus Teacher-Scholar Award unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light-controlled chemical production using S. cerevisiae | |||
| 24-well culture plate | USA Scientific | CC7672-7524 | |
| Agar powder | Thermo Fisher Scientific | 303991049 | |
| Aluminum foil | Reynolds | B004NG90YO | |
| BioSpectrometer with μcuvette | Eppendorf | 6135000923 | |
| Blue LED panel | HQRP | 884667106091218 | |
| EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid | N/A | N/A | See Reference 1 |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | 501879892 (G8270-5KG) | |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002403 | |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Orbital Shaker | Yamato Scientific America | SOU-300 | |
| Petri dish | Celltreat | 229656 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560L | |
| Quantum meter | Apogee Instruments | MQ-510 | |
| Replica-plating device | Thomas Scientific | F37848-0000 | |
| Replica-plating pads | Sunrise Science Products | 3005-012 | |
| SC-His powder | Sunrise Science Products | 1303-030 | |
| SC Complete powder | Sunrise Science Products | 1459-100 | |
| Sterile sealing film | Excel Scientific | STR-SEAL-PLT | |
| YPD agar plates | VWR | 100217-054 | |
| Zeocin | Thermo Fisher Scientific | R25005 | |
| Light-controlled protein production using E. coli | |||
| 6X SDS Sample Buffer | Cepham Life Sciences | 10502 | |
| 12% Acrylamide protein gels | Thermo Fisher Scientific | NP0341BOX | |
| 24-well culture plate | USA Scientific | CC7672-7524 | |
| Aluminum foil | Reynolds | B004NG90YO | |
| BioSpectrometer with μcuvette | Eppendorf | 6135000923 | |
| Blue LED panel | HQRP | 884667106091218 | |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Thermo Fisher Scientific | 20279 | |
| Electrophoresis cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Electrophoresis power supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| LB broth (Miller) | Fisher Scientific | BP97235 | |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002403 | |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| NaCl | Thomas Scientific | SX0425-1 | |
| OptoLAC plasmids | N/A | N/A | See Reference 2 |
| Orbital Shaker | Yamato Scientific America | SOU-300 | |
| Petri dish | Celltreat | 229656 | |
| Quantum meter | Apogee Instruments | MQ-510 | |
| SOC medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Three-phase fermentation using S. cerevisiae | |||
| Same materials as "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" protocol plus the following: | |||
| EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid | N/A | N/A | See Reference 10 |
| Chemical production in a light-controlled bioreactor | |||
| Aluminum foil | Reynolds | B004NG90YO | |
| Antifoam | Sigma-Aldrich | A8311 | |
| Bioreactor with control station | Eppendorf | B120110001 | |
| BioSpectrometer with μcuvette | Eppendorf | 6135000923 | |
| Bleach | VWR Scientific | 89501-620 (CS) | |
| Blue LED panel | HQRP | 884667106091218 | |
| BPT tubing | Fisher Scientific | 14-170-15 | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | 501879892 (G8270-5KG) | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | 7647-01-0 | |
| M9 Minimal Salts | Thermo Fisher Scientific | A1374401 | |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002403 | |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| NH4OH Solution | Sigma-Aldrich | I0503-1VL | |
| Orbital Shaker | Yamato Scientific America | SOU-300 | |
| Quantum meter | Apogee Instruments | MQ-510 | |
| SC Complete powder | Sunrise Science Products | 1459-100 |
References
- Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. The rise and shine of yeast optogenetics. Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).
- Pouzet, S., et al. The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
- Venayak, N., Anesiadis, N., Cluett, W. R., Mahadevan, R. Engineering metabolism through dynamic control. Current Opinion in Biotechnology. 34, 142-152 (2015).
- Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Avalos, J. L. Current and future modalities of dynamic control in metabolic engineering. Current Opinion in Biotechnology. 52, 56-65 (2018).
- Zhao, E. M., et al. Design and characterization of rapid optogenetic circuits for dynamic control in yeast metabolic engineering. ACS Synthetic Biology. 9 (12), 3254-3266 (2020).
- Lalwani, M. A., et al. Optogenetic control of the lac operon for bacterial chemical and protein production. Nature Chemical Biology. 17 (1), 71-79 (2021).
- Zhao, E. M., et al. Optogenetic regulation of engineered cellular metabolism for microbial chemical production. Nature. 555 (7698), 683-687 (2018).
- Baumschlager, A., Khammash, M. Synthetic biological approaches for optogenetics and tools for transcriptional light-control in bacteria. Advanced Biology. 5 (5), 2000256 (2021).
- Dvorak, P., et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) carrying a synthetic metabolic pathway. Microbial Cell Factories. 14, 201 (2015).
- Hartline, C. J., Schmitz, A. C., Han, Y., Zhang, F. Dynamic control in metabolic engineering: Theories, tools, and applications. Metabolic Engineering. 63, 126-140 (2021).
- Ni, C., Dinh, C. V., Prather, K. L. J.
- Zhao, E. M., et al. Optogenetic amplification circuits for light-induced metabolic control. ACS Synthetic Biology. 10 (5), 1143-1154 (2021).
- Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Wegner, S. A., Avalos, J. L. The Neurospora crassa Inducible Q System Enables Simultaneous Optogenetic Amplification and Inversion in Saccharomyces cerevisiae for Bidirectional Control of Gene Expression. ACS Synthetic Biology. 10 (8), 2060-2075 (2021).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
- Marx, H., Mecklenbräuker, A., Gasser, B., Sauer, M., Mattanovich, D. Directed gene copy number amplification in Pichia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus. FEMS Yeast Research. 9 (8), 1260-1270 (2009).
- Nordén, K., et al. Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris. BMC Biotechnology. 11, 47 (2011).
- Zhao, E. M., et al. Light-based control of metabolic flux through assembly of synthetic organelles. Nature Chemical Biology. 15 (6), 589-597 (2019).
- Dowee, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Zhou, K., Edgar, S., Stephanopoulos, G. Engineering microbes to synthesize plant isoprenoids. Methods in Enzymology. 575, 225-245 (2016).
- Arfman, N., Worrell, V., Ingram, L. O. Use of the tac promoter and lacI(q) for the controlled expression of Zymomonas mobilis fermentative genes in Escherichia coli and Zymomonas mobilis. Journal of Bacteriology. 174 (22), 7370-7378 (1992).
- Steen, E. J., et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol. Microbial Cell Factories. 7 (1), 1-8 (2008).
- Tan, S. Z., Manchester, S., Prather, K. L. J. Controlling central carbon metabolism for improved pathway yields in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 5 (2), 116-124 (2015).
- Jayaraman, P., et al. Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6994 (2016).
- Fernandez-Rodriguez, J., Moser, F., Song, M., Voigt, C. A. Engineering RGB color vision into Escherichia coli. Nature Chemical Biology. 13 (7), 706-708 (2017).
- Ding, Q., et al. Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production. Nature Communications. 11 (1), 1-14 (2020).
- Senoo, S., Tandar, S. T., Kitamura, S., Toya, Y., Shimizu, H. Light-inducible flux control of triosephosphate isomerase on glycolysis in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 116 (12), 3292-3300 (2019).
- Ramakrishnan, P., Tabor, J. J. Repurposing synechocystis PCC6803 UirS-UirR as a UV-violet/green photoreversible transcriptional regulatory tool in E. Coli. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 733-740 (2016).
- Tabor, J. J., Levskaya, A., Voigt, C. A. Multichromatic control of gene expression in escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 405 (2), 315-324 (2011).
- Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (120), e54894 (2017).
- Grødem, E. O. S., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLoS Biology. 18 (7), (2020).
- Carrasco-López, C., García-Echauri, S. A., Kichuk, T., Avalos, J. L. Optogenetics and biosensors set the stage for metabolic cybergenetics. Current Opinion in Biotechnology. 65, 296-309 (2020).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (1), 1-11 (2016).
- Melendez, J., et al. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology: Quantitative Biosciences From Nano to Macro. 6 (3), 366-372 (2014).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Castillo-Hair, S. M., Baerman, E. A., Fujita, M., Igoshin, O. A., Tabor, J. J. Optogenetic control of Bacillus subtilis gene expression. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Xia, A., et al. Optogenetic modification of pseudomonas aeruginosa enables controllable twitching motility and host infection. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 531-541 (2021).
- Pu, L., Yang, S., Xia, A., Jin, F. Optogenetics manipulation enables prevention of biofilm formation of engineered pseudomonas aeruginosa on surfaces. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 200-208 (2018).
