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Bioengineering

Fermentazioni a controllo leggero per la produzione chimica microbica e proteica

Published: March 22, 2022 doi: 10.3791/63269
Automatic Translation
*1, *1, 1,2,3,4
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute, Princeton University
* These authors contributed equally

Summary

Il controllo optogenetico del metabolismo microbico offre un controllo dinamico flessibile sui processi di fermentazione. Il protocollo qui mostra come impostare fermentazioni regolate dalla luce blu per la produzione chimica e proteica a diverse scale volumetriche.

Abstract

Le fabbriche di cellule microbiche offrono un'alternativa sostenibile per la produzione di sostanze chimiche e proteine ricombinanti da materie prime rinnovabili. Tuttavia, sovraccaricare un microrganismo con modificazioni genetiche può ridurre la forma fisica e la produttività dell'ospite. Questo problema può essere superato utilizzando il controllo dinamico: espressione inducibile di enzimi e percorsi, in genere utilizzando additivi chimici o nutrizionali, per bilanciare la crescita e la produzione cellulare. L'optogenetica offre un metodo non invasivo, altamente sintonizzabile e reversibile per regolare dinamicamente l'espressione genica. Qui, descriviamo come impostare fermentazioni controllate dalla luce di Escherichia coli ingegnerizzato e Saccharomyces cerevisiae per la produzione di sostanze chimiche o proteine ricombinanti. Discutiamo di come applicare la luce in momenti e dosaggi selezionati per disaccoppiare la crescita e la produzione microbica per migliorare il controllo e la produttività della fermentazione, nonché le considerazioni chiave di ottimizzazione per i migliori risultati. Inoltre, descriviamo come implementare i controlli della luce per esperimenti di bioreattori su scala di laboratorio. Questi protocolli facilitano l'adozione di controlli optogenetici in microrganismi ingegnerizzati per migliorare le prestazioni di fermentazione.

Introduction

L'optogenetica, il controllo dei processi biologici con proteine sensibili alla luce, offre una nuova strategia per controllare dinamicamente le fermentazioni microbiche per la produzione chimica e proteica1,2. L'onere delle vie metaboliche ingegnerizzate e la tossicità di alcuni intermedi e prodotti spesso compromettono la crescita cellulare3. Tali sollecitazioni possono portare a uno scarso accumulo di biomassa e a una ridotta produttività3. Questa sfida può essere affrontata dividendo temporalmente le fermentazioni in una fase di crescita e produzione, che dedicano risorse metaboliche rispettivamente all'accumulo di biomassa o alla sintesi del prodotto4. Recentemente abbiamo dimostrato che il passaggio dalla crescita alla produzione in questa fermentazione bifase può essere indotto con cambiamenti nelle condizioni di illuminazione5,6,7. L'elevata sintonizzazione, reversibilità e ortogonalità degli ingressi luminosi8 offre vantaggi unici alle fermentazioni controllate dalla luce che sono difficili o impossibili da replicare con induttori chimici utilizzati nel controllo dinamico delle fermentazioni bifase convenzionali4,9,10,11.

La proteina EL222 sensibile alla luce blu derivata da Erythrobacter litoralis è stata utilizzata per sviluppare diversi circuiti optogenetici per l'ingegneria metabolica in Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. EL222 contiene un dominio LOV (Light-Oxygen-Voltage Sensor) che subisce uno spostamento conformazionale all'attivazione della luce blu (465 nm), che gli consente di legarsi alla sua sequenza di DNA affine (C120)13. La fusione di EL222 con il dominio di attivazione virale VP16 (VP16-EL222) si traduce in un fattore di trascrizione sensibile alla luce blu che può attivare in modo reversibile l'espressione genica in S. cerevisiae7 e altri organismi14 dal promotore sintetico PC120. Diversi circuiti basati su EL222 sono stati sviluppati e utilizzati per la produzione chimica in S. cerevisiae, come il sistema optoEXP di base attivato dalla luce7, in cui il gene di interesse è espresso direttamente da PC120 (Figura 1A). Tuttavia, le preoccupazioni di penetrazione della luce alle alte densità cellulari tipicamente incontrate nella fase di produzione delle fermentazioni ci hanno motivato a sviluppare circuiti invertiti indotti al buio, come i circuiti OptoINVRT e OptoQ-INVRT (Figura 1B)5,7,13. Questi sistemi sfruttano i regolaloni di galattosio (GAL) o acido chinico (Q) di S. cerevisiae e N. crassa, rispettivamente, controllando i loro corrispondenti repressori (GAL80 e QS) con VP16-EL222, per reprimere l'espressione genica alla luce e indurla fortemente al buio. La combinazione dei circuiti OptoEXP e OptoINVRT si traduce in un controllo bidirezionale dell'espressione genica, consentendo fermentazioni bifase in cui la fase di crescita è indotta con luce blu e la fase di produzione con oscurità (Figura 2A)5,7.

L'uso della luce al posto dell'oscurità per indurre l'espressione genica durante la fase di produzione espanderebbe notevolmente le capacità dei controlli optogenetici, ma richiederebbe anche il superamento dei limiti di penetrazione della luce delle alte densità cellulari tipicamente incontrate in questa fase di fermentazione. A tal fine, abbiamo sviluppato circuiti, noti come OptoAMP e OptoQ-AMP, che amplificano la risposta trascrizionale alla stimolazione della luce blu. Questi circuiti utilizzano mutanti wild-type o ipersensibili di VP16-EL222 per controllare la produzione degli attivatori trascrizionali Gal4p o QF2 dei reguloni GAL o Q, rispettivamente, ottenendo una maggiore sensibilità e una maggiore espressione genica con la luce12,13 (Figura 1C). I circuiti OptoAMP possono ottenere un'induzione luminosa completa e omogenea in bioreattori da 5 L a densità ottica (misurata a 600 nm; OD600) valori di almeno 40 con solo ~0,35% di illuminazione (5% di dose di luce solo su ~7% della superficie di massa). Ciò dimostra un grado di sensibilità più elevato rispetto a OptoEXP, che richiede un'illuminazione vicina al 100%12. La capacità di indurre efficacemente l'espressione genica con la luce ad alte densità cellulari apre nuove opportunità per il controllo dinamico delle fermentazioni. Ciò include fermentazioni operative in più di due fasi temporali, come le fermentazioni trifase, in cui le fasi di crescita, induzione e produzione sono stabilite con programmi leggeri unici per ottimizzare la produzione chimica (Figura 2B)12.

Figure 1
Figura 1: Circuiti optogenetici per il controllo dinamico di S. cerevisiae. I circuiti OptoEXP, OptoINVRT e OptoAMP si basano sul sistema VP16-EL222 sensibile alla luce. (A) Nel circuito OptoEXP, l'esposizione alla luce blu provoca un cambiamento conformazionale e la dimerizzazione di VP16-EL222, che espone un dominio legante il DNA e consente la trascrizione da PC120. La figura è stata modificata da Zhao et al.7. (B) I circuiti OptoINVRT sfruttano i regolagni GAL (mostrati) o Q per indurre l'espressione al buio. Nei circuiti basati su GAL, VP16-EL222 e GAL4 sono espressi costitutivamente, mentre PC120 guida l'espressione del repressore GAL80 (nei circuiti basati su Q, GAL4 e GAL80 sono sostituiti rispettivamente da QF2 e QS e viene utilizzato un promotore sintetico contenente QUAS al posto di un promotore GAL). Alla luce, Gal80p impedisce l'attivazione del gene di interesse da PGAL1. Al buio, GAL80 non è espresso e rapidamente degradato fondendolo in un dominio costitutivo di degron (piccolo dominio marrone), che consente l'attivazione di PGAL1 da parte di Gal4p. La figura è stata modificata da Zhao et al.5. (C) I circuiti OptoAMP utilizzano anche VP16-EL222 per controllare i reguloni GAL (mostrato) o Q. In questi circuiti, il repressore GAL80 (o QS) è costitutivamente espresso e fuso in un degron fotosensibile (piccolo dominio blu) che garantisce una stretta repressione al buio. PC120 e un'espressione di controllo mutante ipersensibile VP16-EL222 di GAL4 (o QF2) con la luce, che attiva fortemente PGAL1 (o un promotore contenente QUAS) nella luce. I circuiti derivati da GAL possono utilizzare forme ingegnerizzate di PGAL1, come PGAL1-M o PGAL1-S, che hanno aumentato l'attività, così come promotori wild-type controllati dal regulon GAL (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). La figura è stata modificata da Zhao et al.12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Fermentazioni a due e tre fasi nel tempo. (A) Le fermentazioni bifase operate con circuiti invertiti consistono in una fase di crescita guidata dalla luce e una fase di produzione scura. Nella fase di crescita, la biomassa si accumula mentre il percorso di produzione rimane represso. Al raggiungimento dell'OD600 desiderato, le cellule vengono spostate al buio per regolarsi metabolicamente prima di essere risospese in mezzi freschi per la fase di produzione. (B) In un processo in tre fasi, le fasi di crescita, incubazione e produzione sono definite da programmi di luce unici, che possono consistere in un periodo di crescita scuro, incubazione pulsata e fase di produzione completamente illuminata. Figura creata con Biorender. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sono stati inoltre sviluppati circuiti optogenetici per il controllo dinamico della produzione chimica e proteica in E. coli. I circuiti OptoLAC controllano il repressore batterico LacI utilizzando il circuito pDawn sensibile alla luce, basato sul sistema bicomponente YF1/FixJ6 (Figura 3). Simile a OptoINVRT5, i circuiti OptoLAC sono progettati per reprimere l'espressione genica nella luce e indurla al buio. I livelli di espressione che utilizzano circuiti OptoLAC possono eguagliare o superare quelli raggiunti con l'induzione standard isopropil β-d-1-tiogalattopoliranoside (IPTG), mantenendo così la forza dell'induzione chimica offrendo al contempo una maggiore sintonizzazione e reversibilità6. Pertanto, i circuiti OptoLAC consentono un efficace controllo optogenetico per l'ingegneria metabolica in E. coli.

Figure 3
Figura 3: Circuiti OptoLAC per il controllo dinamico di E. coli. I circuiti OptoLAC adattano il sistema pDawn e l'operone lac per ottenere l'attivazione al buio e la repressione alla luce. Al buio, YF1 fosforila FixJ, che quindi attiva il promotore PFixK2 per esprimere il repressore cI . Il repressore cI impedisce l'espressione del repressore lacI dal promotore PR , che consente la trascrizione del gene di interesse da un promotore contenente lacO. Al contrario, la luce blu riduce l'attività della chinasi netta YF1, invertendo la fosforilazione di FixJ e quindi l'espressione di cI , che dereprime l'espressione di lacI e impedisce l'espressione dal promotore contenente lacO. La figura è stata modificata da Lalwani et al.6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Descriviamo qui i protocolli di base per le fermentazioni controllate dalla luce di S. cerevisiae ed E. coli per la produzione chimica o proteica. Sia per i lieviti che per i batteri, ci concentriamo innanzitutto sulle fermentazioni con una fase di crescita guidata dalla luce e una fase di produzione indotta dall'oscurità abilitata dai circuiti OptoINVRT e OptoLAC. Successivamente, descriviamo un protocollo per una fermentazione a tre fasi (crescita, induzione, produzione) controllata dalla luce abilitata dai circuiti OptoAMP. Inoltre, descriviamo come aumentare le fermentazioni optogeneticamente controllate dalle micropiastre ai bioreattori su scala di laboratorio. Con questo protocollo, miriamo a fornire una guida completa e facilmente riproducibile per eseguire fermentazioni controllate dalla luce per la produzione chimica o proteica.

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Protocol

1. Produzione chimica controllata dalla luce utilizzando il circuito S. cerevisiae OptoINVRT7

  1. Costruzione della deformazione
    1. Ottenere un ceppo con l'auxotrofia his3 , poiché questo marcatore è necessario per la maggior parte dei plasmidi OptoINVRT esistenti5. Se cerchi la regolazione optogenetica di un gene nativo di S. cerevisiae, costruisci un ceppo in cui qualsiasi copia endogena del gene viene eliminata.
    2. Linearizzare il plasmide contenente il circuito OptoINVRT7, come EZ-L4395, e integrarlo nell'his3-locus del ceppo auxotrofico utilizzando metodi standard di trasformazione litio-acetato15. Se si utilizza il plasmide EZ-L439, che contiene i componenti per reprimere PGAL1 alla luce e attivarlo al buio, linearizzare nel sito di restrizione PmeI.
    3. Dopo la trasformazione, centrifugare le cellule a 150 x g per 1 minuto e risospese delicatamente in 200 μL di mezzo sintetico completo (SC-His) istidina-dropout fresco.
    4. Placcare l'intero volume cellulare su piastre di agar SC-His e incubare a 30 °C per 2-3 giorni fino alla comparsa delle colonie.
    5. Preparare cellule competenti da questo ceppo utilizzando protocolli standard di trasformazione dell'acetato di litio e trasformarle con un plasmide contenente il gene o i geni da controllare optogeneticamente a valle del promotore PGAL1-M o PGAL1-S5.
      NOTA: L'utilizzo di un plasmide che si integra in siti δ (YARCdelta5) e seleziona con Zeocin consente un'integrazione multicopia stabile7,16,17,18.
    6. Dopo la trasformazione, centrifugare la coltura a 150 x g per 1 minuto e risospesare delicatamente in 200 μL di terreno fresco SC-dropout.
      NOTA: Il promotore PGAL1-M è una versione sintetica del promotore PGAL1 con i siti di repressione Mig1p eliminati, mentre PGAL1-S è una versione ingegnerizzata di PGAL1-M, che ha siti di legame dell'attivatore Gal4p extra. Il promotore PGAL1 regolare può essere utilizzato per controllare l'espressione; tuttavia, la forza di espressione sarà inferiore a quella di questi promotori ingegnerizzati.
    7. Placcare l'intero volume cellulare su una piastra di agar di peptone destrosio (YPD) estratto di lievito se si integra in siti δ o una piastra SC-dropout se si trasforma con un plasmide contenente un marcatore di selezione. Incubare a 30 °C per 16 ore sotto luce blu costante per mantenere represso il gene optogeneticamente controllato.
      NOTA: per alcuni ceppi, le colonie potrebbero crescere più velocemente se incubate in impulsi di luce blu (ad esempio, 1 s on/79 s off, 5 s on/75 s off, 10 s on/70 s off, ecc.) piuttosto che in illuminazione costante, che deve essere determinata sperimentalmente per ogni ceppo, se necessario.
    8. Utilizzare qualsiasi sorgente luminosa a 465 nm e posizionare un pannello LED ~ 40 cm sopra la piastra in modo tale che l'intensità della luce sia ~ 80-110 μmol / m2 / s. Misurare l'intensità utilizzando un misuratore quantistico (vedi Tabella dei materiali).
    9. Se si esegue l'integrazione in siti δ, creare una replica della piastra su piastre YPD contenenti un intervallo di concentrazioni di Zeocin tra 400 μg/mL e 1.200 μg/mL da selezionare per una varietà di numeri di copia di integrazione5,7,12,16,17,18. Incubare le piastre replica a 30 °C sotto luce blu costante o pulsata per 2-3 giorni fino alla comparsa delle colonie.
  2. Screening preliminare per le migliori colonie
    1. Selezionare otto colonie da ogni piastra e usarle per inoculare 1 mL di SC-Il suo mezzo integrato con il 2% di glucosio nei singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Crescere in piastre a 24 pozzetti sotto le celle durante la notte (16-20 h) a 30 °C con 200 rpm (diametro orbitale 19 mm) che scuotono sotto un'illuminazione a luce blu costante.
    2. La mattina successiva, diluire ogni coltura in 1 mL di un mezzo SC-His fresco con il 2% di glucosio a valori di OD600 che vanno da 0,01-0,3 e crescere in piastre a 24 pozzetti sotto luce costante o pulsata a 30 °C con 200 rpm scuotendo fino a raggiungere densità cellulari comprese tra 2 e 9 valori di OD600 (Figura 4A). La quantità di tempo necessaria per questa fase di crescita dipenderà dalla tensione.
    3. Incubare le piastre al buio per 4 ore a 30 °C con 200 giri/min scuotendo il pannello luminoso e avvolgendo le piastre in un foglio di alluminio.
      NOTA: Questo passaggio consente alle cellule di passare metabolicamente alla fase di produzione prima della risospensione nei mezzi di produzione.
    4. Per iniziare la fase di produzione, centrifugare le colture nella piastra a 24 pozzetti a 234 x g per 5 minuti e risospese le cellule in 1 mL di terreno fresco SC-dropout con il 2% di glucosio. Sigillare le piastre per evitare l'evaporazione del prodotto desiderato utilizzando nastro sigillante micropiastra sterile.
    5. Fermentare le piastre sigillate al buio per 48 ore a 30 °C con agitazione a 200 giri/min. Assicurarsi che le piastre siano avvolte in un foglio di alluminio per evitare qualsiasi esposizione alla luce.
      NOTA: Avvolgere le piastre in un foglio non limita la disponibilità di ossigeno o gas nelle fermentazioni; tuttavia, il nastro sigillante sterile limita il trasferimento di gas. Piccoli fori possono essere infilati nel nastro per introdurre ossigeno, se necessario.
  3. Raccolta e analisi
    1. Per raccogliere le fermentazioni, centrifugare le piastre per 5 minuti a 234 x g e trasferire 800 μL del surnatante in tubi microcentrifuga da 1,5 mL.
    2. A seconda della sostanza chimica di interesse, analizzare utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) o un altro metodo analitico utilizzando la tecnica di preparazione del campione più adatta allo strumento utilizzato.

2. Produzione di proteine controllate dalla luce utilizzando il sistema E. coli OptoLAC

  1. Costruzione della deformazione
    1. Co-trasformare l'elettrocompetente BL21 DE3 ΔlacI ΔlacI-DE3 con un plasmide contenente il circuito OptoLAC1B o OptoLAC2B6 e un plasmide che esprime la proteina ricombinante di interesse dal promotore PT719.
    2. Dopo la trasformazione, recuperare le cellule per 1 ora in 1 mL di brodo super ottimale con repressione della catabolite (SOC; 2% triptone, 0,5% estratto di lievito, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucosio) a 37 °C con rotazione o agitazione.
      NOTA: Il plasmide contenente la proteina di interesse deve essere compatibile con il plasmide OptoLAC (cioè diverso marcatore di resistenza e origine di replicazione) e non deve contenere una copia di lacI.
    3. Centrifugare le celle a 4845 x g per 3 min e concentrare il pellet in 200 μL di brodo di lisogenia (LB). Placcare le intere cellule concentrate su una piastra di agar LB con antibiotici appropriati e crescere a 37 ° C durante la notte sotto una luce blu costante per mantenere repressa l'espressione proteica.
  2. Screening iniziale per verificare l'espressione
    1. Prendere tre colonie singole e usarle per inoculare 1 mL di lb media con antibiotici appropriati in singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Crescere durante la notte (16-20 h) a 37 °C con 200 giri/min che scuotono sotto illuminazione a luce blu costante (Figura 4A).
    2. Il giorno successivo, utilizzare 1,5 μL di coltura per misurare OD600 in uno spettrofotometro con una misurazione del microvolume. Diluire le colture in 1 mL di LB fresco in piastre a 24 pozzetti a valori di OD600 compresi tra 0,01 e 0,1.
    3. Coltivare le colture a 37 °C con 200 giri/min scuotendo sotto la luce blu per 2-3 ore. A partire dalla seconda ora, effettuare misurazioni OD600 ogni 15 minuti per garantire che le colture non superino l'intervallo OD600 di 0,1-1,5.
    4. Una volta che le colture sono all'OD600 desiderato, spegnere il pannello luminoso e avvolgere la piastra in un foglio di alluminio per avviare la fase di produzione. Tenere la piastra al buio per 8 ore (37 °C), 20 ore (30 °C) o 48 ore (18 °C), con 200 giri/min di agitazione.
    5. Misurare e registrare il valore OD600 finale di ogni lingua.
  3. Raccolta e analisi
    1. Trasferire 800 μL di ogni coltura in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e centrifuga per 5 minuti a 17.000 x g.
    2. Risospesso il pellet cellulare in 200 μL di tampone di risospensione (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM).
      NOTA: La concentrazione di NaCl può essere regolata in base alla proteina ricombinante analizzata.
    3. Aggiungere 50 μL di tampone campione 6x sodio dodecil solfato (SDS) (Tris 375 mM, pH 6,8, SDS 9%, glicerolo 50%, blu bromofenolo 0,03%, DTT 9%). Incubare a 100 °C per 10 minuti con agitazione a 700 giri/min in un bimby.
    4. Caricare ~3-20 μL della coltura in un gel SDS-PAGE al 12%. Utilizzando la misurazione finale OD600 come guida, caricare approssimativamente la stessa quantità di proteine per ciascun campione (equivalente a 10 μL del campione corrispondente a un valore OD600 finale di 1). Utilizzare un alimentatore per eseguire l'elettroforesi a 100 V fino a quando il gel non è completamente risolto.
    5. Macchiare il gel con la soluzione blu brillante di Coomassie G-250 riscaldando per 30-40 s in un forno a microonde e quindi incubando su un rotatore a piattaforma per almeno 15 minuti.
    6. Risciacquare con acqua deionizzata due volte e detonare su un rotatore a piattaforma per almeno 30 minuti (o durante la notte), aggiungendo due salviette detergenti legate in un nodo per aiutare ad assorbire la macchia. Far bollire il gel in quantità sufficiente di acqua nel forno a microonde per 15 minuti per accelerare il processo di detaining.

3. Fermentazione trifase con il sistema S. cerevisiae OptoAMP

  1. Costruzione della deformazione
    1. Ottenere un ceppo con un marcatore auxotrofico his3 , poiché questo marcatore è necessario per utilizzare i plasmidi OptoAMP esistenti5. Se cerchi la regolazione optogenetica di un gene nativo di S. cerevisiae, costruisci un ceppo in cui la copia endogena di questo gene viene eliminata.
    2. Linearizzare un plasmide contenente il circuito OptoAMP4, come EZ-L58012, e integrarlo nel locus his3 del ceppo auxotrofico utilizzando metodi standard di trasformazione litio-acetato15. Se si utilizza EZ-L580, linearizzare il plasmide nel sito di restrizione PmeI.
    3. Dopo la trasformazione, centrifugare le cellule a 150 x g per 1 minuto e risospese delicatamente in 200 μL di mezzo SC-His fresco.
    4. Placcare l'intero volume cellulare su un mezzo selettivo (SC-His-agar) e incubare a 30 °C per 2-3 giorni fino alla comparsa delle colonie.
    5. Preparare cellule competenti da questo ceppo e trasformarle con un plasmide contenente il gene o i geni da controllare optogeneticamente a valle del promotore PGAL1-S12.
      NOTA: L'utilizzo di un plasmide che si integra in δ-siti e seleziona con Zeocin consente un'integrazione e una selezione multicopia stabili.
    6. Dopo la trasformazione, centrifugare la coltura a 150 x g per 1 minuto e risospenare delicatamente in 200 μL di terreno fresco SC-dropout.
      NOTA: Il promotore PGAL1-S è una versione sintetica del promotore PGAL1 in cui i siti di repressione Mig1p vengono eliminati e vengono aggiunti ulteriori siti di legame dell'attivatore Gal4p. È possibile utilizzare il normale promotore PGAL1 ; tuttavia, la forza di espressione sarà inferiore a quella di questo promotore ingegnerizzato.
    7. Placcare l'intero volume della cella su una piastra di agar YPD o SC-dropout e incubare a 30 °C per 16 ore al buio (avvolto in un foglio di alluminio). L'incubazione al buio mantiene represso il gene optogeneticamente controllato, il che consente alle cellule di dirigere le loro risorse metaboliche verso la crescita cellulare piuttosto che verso la produzione chimica.
    8. Se si esegue l'integrazione in siti δ, replicare la piastra su piastre YPD contenenti un intervallo di concentrazioni di Zeocin da selezionare per una varietà di numeri di copia di integrazione. Incubare le piastre a 30 °C al buio (avvolte in un foglio di alluminio) per 2-3 giorni fino alla comparsa delle colonie.
  2. Screening preliminare per le migliori colonie
    1. Selezionare otto colonie da ogni piastra e utilizzarle per inoculare 1 mL di SC-His mezzo con il 2% di glucosio nei singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Far crescere le cellule durante la notte (16-20 h) al buio a 30 °C con 200 giri/min scuotendo.
    2. La mattina successiva, diluire ogni coltura in 1 mL di terreno fresco SC-His con il 2% di glucosio a 0,1 OD600 e crescere al buio a 30 °C con 200 rpm scuotendo fino a raggiungere un OD600 di 3. Avvolgere le piastre in un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. La quantità di tempo necessaria per questa fase di crescita dipenderà dalla tensione.
    3. Per avviare la fase di induzione, incubare le piastre sotto luce pulsata (ad esempio, 5 s on/95 s off) per 12 h a 30 °C con 200 rpm di agitazione. Utilizzare qualsiasi sorgente luminosa a 465 nm e posizionare un pannello LED sopra la piastra in modo tale che l'intensità luminosa sia ~ 80-110 μmol / m2 / s per risultati ottimali (Figura 4A).
      NOTA: la durata ottimale dell'impulso luminoso per questa incubazione varierà in base alla sostanza chimica prodotta. Si consiglia di schermare una gamma di programmi di illuminazione dallo 0,1% (ad esempio, 1 s su 999 s spento) al 100% (piena luce).
    4. Per iniziare la fase di produzione, centrifugare le colture a 234 x g per 5 minuti e risospendare in mezzo SC-His fresco con il 2% di glucosio. Sigillare le piastre per evitare l'evaporazione del prodotto desiderato utilizzando nastro sigillante sterile a micropiastre.
    5. Fermentare le piastre sigillate alla luce per 48 ore a 30 °C con agitazione a 200 giri/min. Ottimizza il programma di luce durante questa fase poiché alcune sostanze chimiche beneficiano di una fase di produzione pulsata piuttosto che di luce piena.
  3. Raccolta e analisi
    1. Raccogliere le fermentazioni centrifugando le piastre per 5 minuti a 234 x g e trasferendo 800 μL del surnatante in tubi microcentrifuga da 1,5 mL.
    2. A seconda della sostanza chimica di interesse, analizzare utilizzando HPLC, GC-MS o un altro metodo analitico utilizzando la tecnica di preparazione del campione più adatta allo strumento utilizzato.

4. Produzione chimica (mevalonato) da E. coli in un bioreattore a controllo leggero

  1. Inoculazione iniziale e configurazione del bioreattore
    1. Inoculare una colonia di un ceppo di E. coli ingegnerizzato con produzione chimica controllata dalla luce in 5 mL di sali minimi M9 (3,37 mM Na2HPO4, 2,2 mM KH2PO4, 0,855 mM NaCl, 0,935 mM NH4Cl) integrati con 0,2% p/v casaminoacidi, 5% p/v glucosio e miscela di metalli in traccia20 (0,0084 g/L EDTA, 0,0025 g/L CoCl2, 0,015 g/L MnCl2, 0,0015 g/L CuCl2, 0,003 g/L H3BO3, 0,0025 g/L Na2MoO4, 0,008 g/L ZnCl2, 0,06 g/L Fe (III) citrato, 0,0045 g/L tiamina, 1,3 g/L MgSO4) in un tubo conico da 50 mL.
    2. Coltiva la coltura durante la notte a 30 °C con 200 giri/min scuotendo sotto l'illuminazione a luce blu.
    3. Impostare la piastra di testa del serbatoio del bioreattore, assicurandosi che siano installate le seguenti porte: inserto per sonda termica; sonda di ossigeno disciolto (DO); sparger di gas - collegarsi alla fonte d'aria attraverso un filtro da 0,2 μm; girante; condensatore di gas - collegare a un filtro da 0,2 μm; linea di raffreddamento (x2); linee di alimentazione (x2) - una per l'aggiunta di supporti, una per il controllo del pH; linea di campionamento - assicurarsi che raggiunga il fondo della nave; porta vuota; Sonda di pH - calibrare la sonda con standard di pH = 4 e pH = 7 prima dell'installazione, in autoclave con il resto del recipiente o sterilizzare con etanolo al 95% e inserire asetticamente prima dell'installazione.
    4. Riempire il recipiente con 1 L di acqua filtrata e fissare la piastra di testa e stringere, assicurandosi che l'O-ring si adatti perfettamente e sigilli.
    5. Coprire eventuali aperture nel reattore con un foglio di alluminio.
    6. Preparare tre strisce di tubi: una per rimuovere l'acqua, una per l'inserimento del mangime e una per il controllo del pH. Coprire le estremità con un foglio di alluminio e avvolgere tutto il tubo in un foglio di alluminio.
      NOTA: NH4OH, che viene utilizzato per la regolazione del pH, non scorre senza intoppi nei tubi in silicone, il che può portare a portate imprecise e sovra-basificazione della coltura. Per evitare questo problema, utilizzare tubi della pompa biocompatibili (BPT) per l'alimentazione NH4OH.
    7. Autoclave del bioreattore e del tubo, utilizzando un ciclo di 30 minuti del liquido.
    8. Rimuovere i materiali dall'autoclave. Una volta raffreddato abbastanza da gestire, collegare la girante, le sonde di pH e DO, la sorgente d'aria, l'ingresso e l'uscita del condensatore e l'ingresso e l'uscita del raffreddamento alla stazione di controllo.
    9. Inserire la sonda termica e coprire la nave con una camicia riscaldante. Fissare la giacca verso la parte superiore del recipiente per evitare di bloccare la coltura dall'esposizione alla luce.
    10. Collegare uno dei tubi sterili alla linea di campionamento e fissarlo attraverso la pompa di campionamento. Posizionare l'altra estremità in modo tale che scorra in un contenitore vuoto che può contenere almeno 1 L. Scaricare l'acqua all'interno della nave.
    11. Collegare un altro tubo sterile a una delle linee di alimentazione e fissarlo attraverso una delle pompe di alimentazione. Collegare l'altra estremità del tubo a una bottiglia di supporto M9. Alimentare i media nel reattore.
    12. Collegare un altro tubo sterile a una delle linee di alimentazione e fissarlo attraverso una delle pompe di alimentazione. Collegare l'altra estremità del tubo al flacone contenente il 28%-30% di NH4OH.
      ATTENZIONE: NH4OH è corrosivo. Lavorare in una cappa aspirante durante il trasferimento in un biberon e assicurarsi che il biberon sia posto in contenimento secondario.
    13. Posizionare tre pannelli luminosi in una formazione triangolare a circa 20 cm di distanza dal reattore, controllando che le intensità luminose sulla superficie del recipiente raggiungano ~ 80-110 μmol / m2 / s da ciascun lato (Figura 4B).
    14. Il giorno successivo, accendere il sistema di bioreattore e il refrigeratore. Impostare il setpoint della temperatura del reattore a 37 °C, il setpoint del pH a 7,0 e l'agitazione a 200 giri/min. La giacca riscaldante dovrebbe accendersi.
    15. Calibrare la sonda DO aspettando prima che la temperatura e le misurazioni DO diventino costanti (questo sarà il setpoint al 100%). Quindi, scollegare la sonda dal sistema (questo sarà il setpoint dello 0%). Ripetere l'operazione fino a quando la misurazione DO non si stabilizza al 100% quando la sonda è collegata, quindi impostare il setpoint DO su 20%.
  2. Produzione chimica controllata dalla luce
    1. Inoculare il bioreattore ad un OD600 iniziale di 0,001-0,1. Accendi i pannelli luminosi per avviare la crescita.
    2. Dopo 3 ore, iniziare a prelevare campioni dalla linea di campionamento per effettuare misurazioni OD600 per evitare di aumentare eccessivamente la densità cellulare ottimale di induzione (ρs). Una volta raggiunto il ρs ottimale (il valore ottimale per la produzione di mevalonato è 0,17), spegnere i pannelli luminosi, coprire il reattore con un foglio di alluminio e avvolgere il setup in un panno nero per avviare la fase di produzione scura.
    3. Aggiungere 50 μL di antischiuma, 8 ore dopo il passaggio all'oscurità. Svitare la porta vuota e pipettare l'antischiuma direttamente nel reattore.
    4. Utilizzare la porta di campionamento per prelevare periodicamente campioni per l'analisi HPLC o GC.
  3. Smontaggio e analisi
    1. Al termine dell'esperimento, spegnere il sistema. Svitare con cura le sonde DO e pH e lavarle con acqua e sapone. Svitare la piastra della testa e lavarla con acqua e sapone usando un pennello.
    2. Trasferire la coltura in un contenitore vuoto e aggiungere candeggina ad una concentrazione finale del 10% v/v. Mettere in una cappa aspirante e smaltire dopo 30 min.
    3. Lavare il recipiente del reattore con acqua e sapone usando un pennello.
    4. Preparare i campioni per l'analisi in base al prodotto di interesse. Per la produzione di mevalonato, mescolare 560 μL di coltura con 140 μL di 0,5 M HCl e vortice ad alta velocità per 1 min. Questo converte il mevalonato in (±)-mevalonolactone.
      ATTENZIONE: HCl è un pericolo per la salute. Maneggiare con DPI adeguati e assicurarsi che le provette del campione siano adeguatamente tappate prima del vortice.
    5. Centrifugare a 17.000 x g per 45 min a 4 °C. Trasferire 250 μL del surnatante in un flaconcino HPLC.
    6. Per il mevalonato, analizzare i campioni utilizzando una colonna di scambio ionico di acidi organici. Quantificare la produzione utilizzando un rivelatore di indice di rifrazione (RID), confrontando le aree di picco con uno standard di (±)-mevalonolattone.

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Representative Results

La regolazione optogenetica del metabolismo microbico è stata implementata con successo per produrre una varietà di prodotti, tra cui biocarburanti, sostanze chimiche sfuse, proteine e prodotti naturali5,6,7,12,13. La maggior parte di questi processi sono progettati per la crescita cellulare che avviene alla luce (quando la bassa densità cellulare pone sfide minime con la penetrazione della luce) e per indurre la produzione dall'oscurità una volta che le cellule sono cresciute. Varie sostanze chimiche che sono state prodotte dal lievito utilizzando questo approccio, tra cui l'acido lattico, un prezioso precursore polimerico e additivo alimentare, nonché l'isobutanolo, un biocarburante di prossima generazione. Per entrambe le sostanze chimiche, una sfida comune deriva dalla forte spinta di S. cerevisiae a metabolizzare il glucosio verso la produzione di etanolo piuttosto che il prodotto di interesse e l'incapacità di eliminare il percorso di fermentazione dell'etanolo senza causare un grave difetto di crescita7. Una combinazione di Circuiti OptoEXP attivati dalla luce e OptoINVRT repressi dalla luce sono stati utilizzati per attivare selettivamente con la luce il gene per la piruvato decarbossilasi (PDC1) necessario per la fermentazione dell'etanolo e indurre il percorso per il prodotto desiderato al buio5 (Figura 5A,B). Utilizzando questa strategia con una densità di induzione cellulare ottimizzata (ρs), è possibile ottenere titoli elevati di entrambe le sostanze chimiche desiderate (Figura 5C, D), evidenziando il valore del controllo bidirezionale offerto dall'optogenetica.

Mentre la maggior parte dei processi optogenetici a base di lievito si sono concentrati su una fase di crescita guidata dalla luce e una fase di produzione indotta dall'oscurità, il recente sviluppo di circuiti OptoAMP extra sensibili e forti ha aperto opportunità anche per fermentazioni guidate dalla luce12. Queste fermentazioni guidate dalla luce sono simili ai processi precedentemente descritti; tuttavia, i programmi di illuminazione sono invertiti in modo tale che la produzione avvenga alla luce. Inoltre, questi circuiti consentono l'implementazione di processi trifase, che aggiungono maggiore flessibilità e controllo alla produzione rispetto all'approccio standard a due fasi. Data la sensibilità e la forza di questi circuiti, questi processi trifase sono in genere ottimizzati schermando diversi programmi di luce in ogni fase. Gli impulsi luminosi ottimali dipendono dalla deformazione e dal prodotto di interesse. Tali circuiti sono stati applicati con successo alla produzione di naringenina, un prodotto naturale con applicazioni terapeutiche, oltre all'acido lattico e all'isobutanolo12 (Figura 6). L'aumento della produzione di tutte e tre le sostanze chimiche dimostra il valore della regolazione optogenetica attraverso una serie di complessità del percorso, nonché il nuovo potenziale offerto dalle fermentazioni trifase.

Oltre a queste dimostrazioni nel lievito, l'optogenetica è stata applicata anche per migliorare la produzione di proteine e sostanze chimiche nel cavallo di battaglia batterico E. coli. Le fermentazioni con questo ospite hanno seguito una crescita guidata dalla luce e un quadro di produzione indotto dall'oscurità utilizzando la suite di circuiti OptoLAC6. Quando viene utilizzato per produrre una proteina fluorescente gialla (YFP) o un fattore di trascrizione FdeR, la produzione controllata dalla luce è paragonabile o superiore ai livelli raggiunti con l'induzione IPTG standard, ma con una più facile sintonizzazione per i livelli intermedi di produzione (Figura 7A). Inoltre, i circuiti OptoLAC sono stati applicati per produrre mevalonato, un importante precursore terpenoide, sia a livello di micropiastre che di bioreattore (Figura 7B,C). Questi risultati selezionati forniscono una panoramica generale della forza, della versatilità e della sintoniabilità della regolazione optogenetica per la produzione microbica chimica e proteica.

Figure 4
Figura 4: Configurazione sperimentale per l'illuminazione di piastre e bioreattori. (A) Le piastre a 24 pozzetti possono essere illuminate durante l'agitazione posizionando un pannello luminoso a LED blu a circa 40 cm sopra lo shaker. L'intensità luminosa deve essere misurata con un misuratore quantistico per garantire che sia compresa tra ~ 80-110 μmol / m2 / s. (B) Per illuminare un bioreattore, posizionare tre pannelli luminosi in una formazione triangolare attorno al bioreattore. Come con le piastre a 24 pozzetti, l'intensità della luce deve essere misurata e regolata per raggiungere ~ 80-110 μmol / m2 / s da tutti i lati. Figura creata con Biorender. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Produzione di sostanze chimiche da S. cerevisiae, a bassa voce. Per migliorare la produzione di acido lattico (A) o isobutanolo (B), è stata utilizzata una combinazione di circuiti inducibili dalla luce e dal buio per attivare selettivamente percorsi specifici. In entrambi gli scenari, il percorso essenziale di produzione dell'etanolo viene indotto alla luce controllando l'espressione di PDC1 con OptoEXP, mentre i percorsi di produzione vengono attivati al buio utilizzando un circuito OptoINVRT. (C) La produzione di acido lattico è stata testata ad un intervallo di valori ρs con due circuiti della suite OptoINVRT. La versione OptoINVRT7 ha funzionato meglio, con un valore ρs ottimale di 7.0. (D) La versione OptoINVRT7 ha anche massimizzato la produzione di isobutanolo rispetto all'altro circuito, con un ρs ottimale di 8,75. **p < 0,01, ***p < 0,001. Le statistiche sono derivate utilizzando un t-test a due lati. I dati sono mostrati come valori medi e le barre di errore rappresentano le deviazioni standard di quattro repliche. La figura è stata modificata da Zhao et al.5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Produzione di sostanze chimiche attivate dalla luce nelle fermentazioni trifase di S. cerevisiae. Le fermentazioni che utilizzano i circuiti OptoAMP possono funzionare con tre fasi dinamiche: crescita (i), induzione (ii) e produzione (iii), ciascuna definita da diversi cicli di lavoro leggeri. (A) La biosintesi dell'acido lattico è indotta in luce blu dal controllo optogenetico dell'espressione di LDH . (B) La produzione di acido lattico può essere ottimizzata utilizzando un programma di luce pulsata (1 s on/79 s off) nella fase di crescita e la piena illuminazione nelle fasi di induzione e produzione. (C) La produzione di isobutanolo è indotta dal controllo optogenetico dell'espressione di ILV2 . (D) La produzione di isobutanolo è ottimizzata utilizzando una fase di crescita pulsata (1 s on/79 s off), una fase di induzione completamente illuminata e una fase di produzione pulsata (2 s on/118 s off). (E) Controllo della via biosintetica più complessa per la naringenina, indotta dall'espressione optogeneticamente controllante dei geni TAL e PAL . (F) La biosintesi della naringenina è ottimizzata al meglio utilizzando una crescita pulsata (1 s on / 79 s off), induzione completamente illuminata e fase di produzione scura. *p < 0,05, **p < 0,01, n.s. = nessun significato. Le statistiche sono derivate utilizzando un t-test a due lati. I dati sono mostrati come valori medi e le barre di errore rappresentano le deviazioni standard di quattro repliche indipendenti. La figura è stata modificata da Zhao et al.12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Produzione optogenetica di proteine e sostanze chimiche ricombinanti in E. coli. Il sistema OptoLAC è stato utilizzato per produrre sia proteine che sostanze chimiche a titoli paragonabili o superiori a quelli raggiunti utilizzando l'induzione chimica con IPTG. (A) L'espressione optogenetica di FdeR è sia forte che sintonizzabile utilizzando una varietà di cicli di lavoro leggeri, come risolto e quantificato con western blot. (B) Un ceppo progettato per la produzione di mevalonato supera i titoli ottenuti utilizzando l'induzione IPTG alla scala a 24 pozzetti al valore ottimale di ρs . (C) La produzione optogenetica di mevalonato in un bioreattore da 2 L dimostra la scalabilità della produzione al di là delle micropiastre. *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001. Le statistiche sono derivate utilizzando un t-test a due lati. Tutti i dati sono mostrati come valori medi e le barre di errore rappresentano le deviazioni standard di campioni biologicamente indipendenti. I dati per (A) e (C) rappresentano tre repliche, mentre per (B), il numero di repliche da sinistra a destra = 4, 4, 6, 3, 4, 4, 4. La figura è stata modificata da Lalwani et al.6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il controllo dinamico è stato a lungo applicato per migliorare le rese per l'ingegneria metabolica e la produzione di proteine ricombinanti4. I cambiamenti nell'espressione enzimatica sono più tipicamente implementati utilizzando induttori chimici come IPTG21, galattosio22 e tetraciclina23, ma sono stati anche mediati utilizzando condizioni di processo come temperatura e pH. Il controllo optogenetico dell'espressione genica elimina la necessità di modifiche ai parametri di fermentazione o alla composizione dei media, rendendolo un'alternativa facilmente applicabile alle tradizionali strategie di induzione. La facilità con cui la luce può essere accesa o spenta offre anche nuove funzionalità come la sintonizzazione rapida e reversibile del dosaggio genico. Inoltre, mentre questi protocolli si concentrano su sistemi sensibili alla luce blu, l'esistenza di strumenti optogenetici che invertono le risposte alla luce esistenti24 o rispondono ad altre lunghezze d'onda della luce25,26,27,28,29 offre un potenziale entusiasmante per controllare ortogonalmente più percorsi per un livello di controllo senza precedenti. Tali vantaggi rendono light una nuova soluzione versatile per un controllo flessibile sulle fermentazioni microbiche.

Oltre allo screening per le migliori colonie, come discusso nei protocolli, dovrebbero essere ottimizzati anche altri parametri come la densità cellulare a cui le colture vengono commutate dalla crescita alla produzione (ρs), le lunghezze dei periodi di produzione e incubazione e i cicli di lavoro leggeri. I migliori valori di questi parametri dipendono dal prodotto e dalla deformazione e dovrebbero quindi essere riottimizzati per qualsiasi nuova applicazione. Ad esempio, le vie che coinvolgono prodotti finali tossici possono beneficiare di valori di ρs più elevati, che consentono un sufficiente accumulo di cellule prima di indurre la produzione6,7, mentre un circuito più debole ma meno permeabile può favorire valori più bassi di ρs per massimizzare il tempo di espressione totale. Allo stesso modo, alcune vie e proteine ricombinanti possono beneficiare di livelli di espressione intermedi, che possono essere raggiunti con compiti leggeri unici. Inoltre, nel caso di fermentazioni che utilizzano circuiti OptoAMP, è possibile ottimizzare il numero di fasi temporali. Mentre il protocollo dimostrato descrive un processo a tre fasi, le fermentazioni che utilizzano questi circuiti possono essere controllate con un numero maggiore di fasi definite da programmi e durate di servizio leggeri unici. Pertanto, una serie di questi parametri dovrebbe essere testata per ottimizzare le prestazioni.

Evitare fonti di contaminazione luminosa rappresenta una considerazione importante durante la configurazione sperimentale. Per i processi che richiedono un ritardo della stimolazione luminosa fino a fasi successive (ad esempio, fermentazioni da scure a chiare), può essere consigliabile lavorare in una stanza buia per evitare l'attivazione prematura dei sistemi optogenetici. In questi casi, una sorgente di luce inerte può essere applicata per la visibilità durante la configurazione sperimentale (ad esempio, una sorgente di luce rossa lontana di ~ 700 nm quando si lavora con sistemi attivati dalla luce blu). Un vantaggio dei processi che iniziano con la crescita indotta dalla luce (dalla luce al buio) è che le manipolazioni sperimentali iniziali possono essere eseguite sotto la luce ambientale con ampia visibilità.

La facilità con cui un vasto numero di programmi leggeri può essere applicato alle fermentazioni offre l'opportunità di sviluppare metodi a più alto rendimento per bilanciare le vie biosintetiche e chiarire le condizioni ottimali che massimizzano la produttività della fermentazione. Invece di bilanciare le vie metaboliche testando un gran numero di costrutti assemblati combinatoriamente con ciascun enzima espresso da promotori di diversi punti di forza, i percorsi potrebbero essere bilanciati da diversi livelli di espressione genica utilizzando diversi cicli di lavoro leggero da un numero molto più piccolo di costrutti. Ciò evita la necessità di configurazioni sperimentali più ingombranti, come la risospensione in diversi mezzi di induzione o diluizioni seriali per induttori chimici. Gli esperimenti optogenetici potrebbero potenzialmente anche essere automatizzati per aumentare la produttività utilizzando controller in silico per fornire impulsi luminosi specificamente temporizzati o localizzati a diversi pool di campioni30. Tuttavia, gli esperimenti ad alto rendimento in diverse condizioni di luce devono essere sufficientemente separati per evitare la contaminazione incrociata della luce, che può porre vincoli spaziali. Inoltre, il requisito della stimolazione luminosa impedisce l'uso della maggior parte dei lettori di piastre e micro bioreattori per misurazioni continue. Sebbene non siano ancora ampiamente disponibili in commercio, diversi apparati e algoritmi sono stati recentemente sviluppati per esperimenti optogenetici ad alto rendimento e continui, che aiutano ad affrontare questi vincoli spaziali31,32,33,34. Pertanto, nonostante queste limitazioni, l'optogenetica offre un enorme potenziale per aumentare la produttività sperimentale fornendo al contempo una maggiore controllabilità.

Si spera che i protocolli e il video qui presentati abbasseranno le barriere per altri ricercatori per adottare controlli optogenetici del metabolismo cellulare e delle fermentazioni microbiche. L'optogenetica è una tecnologia abilitante per la ricerca di base e le applicazioni biotecnologiche che possono beneficiare di un controllo ottimizzato delle espressioni geniche, come la genetica, la biologia molecolare e cellulare, il metabolismo, la biologia dei sistemi e la cybergenetica35,36,37,38. Inoltre, la regolazione optogenetica dell'espressione genica è stata dimostrata in altri microrganismi come Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa, suggerendo che i benefici del controllo della luce possono essere estesi allo studio e all'applicazione di diverse specie39,40,41. Queste possibilità evidenziano il potenziale futuro dell'optogenetica per l'ingegneria metabolica, la produzione di proteine e altre applicazioni biotecnologiche.

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Disclosures

Gli autori hanno richiesto diversi brevetti per i circuiti e i metodi optogenetici descritti in questo articolo.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti, dall'Office of Science, dall'Office of Biological and Environmental Research Award Number DE-SC0019363, dal NSF CAREER Award CBET-1751840, dal Pew Charitable Trusts e dal Camille Dreyfus Teacher-Scholar Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Light-controlled chemical production using S. cerevisiae
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Agar powder Thermo Fisher Scientific 303991049
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid N/A N/A See Reference 1
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
PmeI New England Biolabs R0560L
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
Replica-plating device Thomas Scientific F37848-0000
Replica-plating pads Sunrise Science Products 3005-012
SC-His powder Sunrise Science Products 1303-030
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100
Sterile sealing film Excel Scientific STR-SEAL-PLT
YPD agar plates VWR 100217-054
Zeocin Thermo Fisher Scientific R25005
Light-controlled protein production using E. coli
6X SDS Sample Buffer Cepham Life Sciences 10502
12% Acrylamide protein gels Thermo Fisher Scientific NP0341BOX
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250 Thermo Fisher Scientific 20279
Electrophoresis cell Bio-Rad 1658004
Electrophoresis power supply Bio-Rad 1645050
LB broth (Miller) Fisher Scientific BP97235
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NaCl Thomas Scientific SX0425-1
OptoLAC plasmids N/A N/A See Reference 2
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SOC medium Thermo Fisher Scientific 15544034
Thermomixer Eppendorf 5382000015
Tris base Fisher Scientific BP1521
Three-phase fermentation using S. cerevisiae
Same materials as "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" protocol plus the following:
EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid N/A N/A See Reference 10
Chemical production in a light-controlled bioreactor
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
Antifoam Sigma-Aldrich A8311
Bioreactor with control station Eppendorf B120110001
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Bleach VWR Scientific 89501-620 (CS)
Blue LED panel HQRP 884667106091218
BPT tubing Fisher Scientific 14-170-15
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific 7647-01-0
M9 Minimal Salts Thermo Fisher Scientific A1374401
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NH4OH Solution Sigma-Aldrich I0503-1VL
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100

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Bioingegneria Numero 181
Fermentazioni a controllo leggero per la produzione chimica microbica e proteica
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Hoffman, S. M., Lalwani, M. A.,… More

Hoffman, S. M., Lalwani, M. A., Avalos, J. L. Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production. J. Vis. Exp. (181), e63269, doi:10.3791/63269 (2022).

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