Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Ljuskontrollerade jäsningar för mikrobiell kemisk och proteinproduktion

Published: March 22, 2022 doi: 10.3791/63269
Automatic Translation
*1, *1, 1,2,3,4
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute, Princeton University
* These authors contributed equally

Summary

Optogenetisk kontroll av mikrobiell metabolism erbjuder flexibel dynamisk kontroll över jäsningsprocesser. Protokollet här visar hur man ställer in blå ljusreglerade jäsningar för kemisk och proteinproduktion i olika volymetriska skalor.

Abstract

Mikrobiella cellfabriker erbjuder ett hållbart alternativ för att producera kemikalier och rekombinanta proteiner från förnybara råvaror. Överbelastning av en mikroorganism med genetiska modifieringar kan dock minska värdens kondition och produktivitet. Detta problem kan övervinnas genom att använda dynamisk kontroll: induktiva uttryck av enzymer och vägar, vanligtvis med kemiska eller näringsbaserade tillsatser, för att balansera cellulär tillväxt och produktion. Optogenetik erbjuder en icke-invasiv, mycket tunable och reversibel metod för dynamisk reglering av genuttryck. Här beskriver vi hur man ställer in ljuskontrollerade jäsningar av konstruerade Escherichia coli och Saccharomyces cerevisiae för produktion av kemikalier eller rekombinanta proteiner. Vi diskuterar hur man applicerar ljus vid utvalda tidpunkter och doser för att frikoppla mikrobiell tillväxt och produktion för förbättrad jäsningskontroll och produktivitet, samt de viktigaste optimeringsövervägandena för bästa resultat. Dessutom beskriver vi hur man implementerar ljuskontroller för bioreaktorexperiment i labbskala. Dessa protokoll underlättar antagandet av optogenetiska kontroller i konstruerade mikroorganismer för förbättrad jäsningsprestanda.

Introduction

Optogenetik, bekämpning av biologiska processer med ljuskänsliga proteiner, erbjuder en ny strategi för att dynamiskt kontrollera mikrobiella jäsningar för kemisk och proteinproduktion1,2. Bördan av konstruerade metaboliska vägar och toxiciteten hos vissa intermediärer och produkter försämrar ofta celltillväxten3. Sådana påfrestningar kan leda till dålig ackumulering av biomassa och minskad produktivitet3. Denna utmaning kan hanteras genom att tidsmässigt dela upp jäsningar i en tillväxt- och produktionsfas, som ägnar metaboliska resurser åt biomassaackumulering respektive produktsyntes4. Vi visade nyligen att övergången från tillväxt till produktion i denna tvåfasfermentering kan induceras med förändringar i belysningsförhållandena5,6,7. Den höga omtunningsbarheten, reversibiliteten och ortogonaliteten hos ljusingångar8 erbjuder unika fördelar för ljuskontrollerade jäsningar som är svåra eller omöjliga att replikera med kemiska inducerare som används vid dynamisk kontroll av konventionella tvåfasfermenteringar4,9,10,11.

Det blåljus responsiva EL222-proteinet som härrör från Erythrobacter litoralis har använts för att utveckla flera optogenetiska kretsar för metabolisk teknik i Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. EL222 innehåller en ljus-syre-spänningssensor (LOV) domän som genomgår en konformationell förskjutning vid blå ljusaktivering (465 nm), vilket gör att den kan binda till sin cognate DNA-sekvens (C120)13. Att smälta EL222 till den virala VP16 aktiveringsdomänen (VP16-EL222) resulterar i en blåljusresponsiv transkriptionsfaktor som på ett reversibelt sätt kan aktivera genuttryck i S. cerevisiae7 och andra organismer14 från den syntetiska promotorn PC120. Flera kretsar baserade på EL222 har utvecklats och använts för kemisk produktion i S. cerevisiae, såsom det grundläggande ljusaktiverade OptoEXP-systemet7, där den av intressegenen uttrycks direkt från PC120 (figur 1A). Oron för lätt penetration vid de höga celltätheter som vanligtvis påträffas i produktionsfasen av jäsningar motiverade oss dock att utveckla inverterade kretsar som induceras i mörkret, såsom OptoINVRT- och OptoQ-INVRT-kretsarna (figur 1B)5,7,13. Dessa system utnyttjar galaktos (GAL) eller kininsyra (Q) reguloner från S. cerevisiae respektive N. crassa, kontrollerar deras motsvarande undertryckare (GAL80 och QS) med VP16-EL222, för att undertrycka genuttryck i ljuset och starkt inducera det i mörkret. Kombinationen av OptoEXP- och OptoINVRT-kretsar resulterar i dubbelriktad kontroll av genuttryck, vilket möjliggör tvåfasfermentering där tillväxtfasen induceras med blått ljus och produktionsfasen med mörker (figur 2A)5,7.

Att använda ljus istället för mörker för att inducera genuttryck under produktionsfasen skulle kraftigt utöka kapaciteten hos optogenetiska kontroller men skulle också kräva att övervinna de lätta penetrationsbegränsningarna för de höga celltätheter som vanligtvis uppstår i denna fas av jäsning. För detta ändamål har vi utvecklat kretsar, kända som OptoAMP och OptoQ-AMP, som förstärker transkriptionssvaret på blå ljusstimulering. Dessa kretsar använder vilda eller överkänsliga mutanter av VP16-EL222 för att kontrollera produktionen av transkriptionsaktivatorerna Gal4p respektive QF2 av GAL- respektive Q-regulonerna, vilket ger ökad känslighet och starkare genuttryck med ljus12,13 (figur 1C). OptoAMP-kretsar kan uppnå fullständig och homogen ljusinduktion i 5 L bioreaktorer med optisk densitet (mätt vid 600 nm; OD600) värden på minst 40 med endast ~ 0,35% av belysningen (5% ljusdos på endast ~ 7% av bulkytan). Detta visar en högre grad av känslighet jämfört med OptoEXP, vilket kräver nära 100% belysning12. Förmågan att effektivt inducera genuttryck med ljus vid högcellstäthet öppnar nya möjligheter till dynamisk kontroll av jäsningar. Detta inkluderar drift av jäsningar i mer än två temporala faser, såsom trefasfermensningar, där tillväxt-, induktions- och produktionsfaser upprättas med unika ljusscheman för att optimera kemisk produktion (figur 2B)12.

Figure 1
Figur 1: Optogenetiska kretsar för dynamisk kontroll av S. cerevisiae. OptoEXP-, OptoINVRT- och OptoAMP-kretsarna är baserade på det ljuskänsliga VP16-EL222-systemet. (A) I OptoEXP-kretsen orsakar exponering för blått ljus en konformationsförändring och dimerisering av VP16-EL222, som exponerar en DNA-bindande domän och möjliggör transkription från PC120. Figuren har ändrats från Zhao et al.7. (B) OptoINVRT-kretsar utnyttjar GAL -regulonerna (visas) eller Q för att framkalla uttryck i mörker. I GAL-baserade kretsar uttrycks VP16-EL222 och GAL4 konstituerande, medan PC120-frekvensomtryck av GAL80-tryckorn (i Q-baserade kretsar ersätts GAL4 och GAL80 av QF2 respektive QS, och en syntetisk QUAS-innehållande promotor används istället för en GAL-promotor). I ljuset förhindrar Gal80p aktivering av den av intressegenen från PGAL1. I mörkret uttrycks inte GAL80 och bryts snabbt ned genom att den smälter till en konstituerande degrondomän (liten brun domän), vilket möjliggör aktivering av PGAL1 av Gal4p. Figuren har ändrats från Zhao et al.5. (C) OptoAMP-kretsar använder också VP16-EL222 för att styra GAL (visas) eller Q-regulons. I dessa kretsar uttrycks och smälts GAL80-tryckpressorn (eller QS) konstituerande till en fotokänslig degron (liten blå domän) som säkerställer hårt förtryck i mörkret. PC120 och ett överkänsligt VP16-EL222 mutant kontroll uttryck av GAL4 (eller QF2) med ljus, som starkt aktiverar PGAL1 (eller en QUAS-innehållande promotor) i ljuset. GAL-härledda kretsar kan använda konstruerade former av PGAL1, såsom PGAL1-M eller PGAL1-S, som har ökad aktivitet, liksom vilda promotorer som styrs av GAL-regulon (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). Figuren har ändrats från Zhao et al.12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Två- och trefasfermensningar genom tiden. (A) Tvåfasfermensningar som drivs med inverterade kretsar består av en ljusdriven tillväxtfas och en mörk produktionsfas. I tillväxtfasen ackumuleras biomassa när produktionsvägen förblir undertryckt. När man når önskad OD600 flyttas cellerna till mörkret för att metaboliskt justera innan de återanvänds i färska medier för produktionsfasen. (B) I en trefasprocess definieras tillväxt-, inkubations- och produktionsfaserna av unika ljusscheman, som kan bestå av en mörk tillväxtperiod, pulsad inkubation och fullt upplyst produktionsfas. Figur skapad med Biorender. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Optogenetiska kretsar har också utvecklats för dynamisk kontroll av kemisk och proteinproduktion i E. coli. OptoLAC-kretsar styr bakterien LacI-tryckorn med hjälp av den ljuskänsliga pDawn-kretsen, som är baserad på YF1/FixJ tvåkomponentsystem6 (bild 3). I likhet med OptoINVRT5 är OptoLAC-kretsar utformade för att undertrycka genuttryck i ljuset och inducera det i mörkret. Uttrycksnivåer med optoLAC-kretsar kan matcha eller överträffa de som uppnås med standard isopropyl β-d-1-tiogalactopyranoside (IPTG) induktion, vilket bibehåller styrkan av kemisk induktion samtidigt som den erbjuder förbättrad bedövningsförmåga och reversibilitet6. Därför möjliggör OptoLAC-kretsar effektiv optogenetisk kontroll för metabolisk teknik i E. coli.

Figure 3
Bild 3: OptoLAC-kretsar för dynamisk styrning av E. coli. OptoLAC-kretsarna anpassar pDawn-systemet och lac operon för att uppnå aktivering i mörker och förtryck i ljuset. I mörkret, YF1 fosforylater FixJ, som sedan aktiverar PFixK2 promotorn för att uttrycka cI-undertryckaren . cI-trycksättaren förhindrar uttryck av lacI-tryckorn från PR-promotorn , vilket tillåter transkription av den av intressegenen från en lacO-innehållande promotor. Omvänt minskar blått ljus YF1 nettokinasaktivitet, vänder FixJ fosforylering och därmed cI uttryck, som dereprimerar uttryck av lacI och förhindrar uttryck från lacO-innehållande promotorn. Figuren har ändrats från Lalwani et al.6. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Vi beskriver här de grundläggande protokollen för ljuskontrollerade jäsningar av S. cerevisiae och E. coli för kemisk eller proteinproduktion. För både jäst och bakterier fokuserar vi först på jäsningar med en ljusdriven tillväxtfas och en mörkinducerad produktionsfas som möjliggörs av OptoINVRT- och OptoLAC-kretsar. Därefter beskriver vi ett protokoll för en trefas (tillväxt, induktion, produktion) ljusstyrd jäsning som möjliggörs av OptoAMP-kretsar. Dessutom beskriver vi hur man kan skala upp optogenetiskt kontrollerade jäsningar från mikroplattor till laboratorieskala bioreaktorer. Med detta protokoll strävar vi efter att tillhandahålla en komplett och lätt reproducerbar guide för att utföra ljuskontrollerade jäsningar för kemisk eller proteinproduktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ljusstyrd kemisk produktion med hjälp av kretsen S. cerevisiae OptoINVRT7

  1. Stamkonstruktion
    1. Få en stam med hans3 auxotrofi, eftersom denna markör är nödvändig för de flesta befintliga OptoINVRT plasmider5. Om du söker optogenetisk reglering av en gen som är infödd till S. cerevisiae, konstruera en stam där någon endogen kopia av genen raderas.
    2. Linjärisera plasmiden som innehåller OptoINVRT7-kretsen, såsom EZ-L4395, och integrera den i hans3-locus av den auxotrofa stammen med hjälp av vanliga litiumacetat omvandlingsmetoder15. Om du använder EZ-L439-plasmiden, som innehåller komponenterna för att undertrycka PGAL1 i ljuset och aktivera den i mörker, linjärisera på PmeI-begränsningsstället.
    3. Efter omvandlingen centrifugerar du cellerna vid 150 x g i 1 min och återanvänds försiktigt i 200 μL färskt histidinavhopp syntetiskt komplett medium (SC-His) medium.
    4. Plätera hela cellvolymen på SC-Hans agarplattor och inkubera vid 30 °C i 2-3 dagar tills kolonier dyker upp.
    5. Förbered kompetenta celler från denna stam med hjälp av standardprotokoll för litiumacetatomvandling och omvandla dem med en plasmid som innehåller generna som ska kontrolleras optogenetiskt nedströms antingen PGAL1-M eller PGAL1-S promotorn5.
      OBS: Att använda en plasmid som integreras på δ platser (YARCdelta5) och väljer med Zeocin möjliggör stabil multikopiintegration7,16,17,18.
    6. Efter omvandlingen, centrifugera kulturen vid 150 x g i 1 min och försiktigt återanvända i 200 μL färskt SC-dropout medium.
      OBS: PGAL1-M-promotorn är en syntetisk version av PGAL1-promotorn med Mig1p-förtrycksplatserna raderade, medan PGAL1-S är en konstruerad version av PGAL1-M, som har extra Gal4p-aktivatorbindningsplatser. Den vanliga PGAL1-promotorn kan användas för att styra uttrycket; Uttrycksstyrkan kommer dock att vara lägre än från dessa konstruerade promotors.
    7. Plätera hela cellvolymen på en jästextrakt pepton dextros (YPD) agarplatta om den integreras i δ platser, eller en SC-dropout-platta om den omvandlas med en plasmid som innehåller en markeringsmarkör. Inkubera vid 30 °C i 16 timmar under konstant blått ljus för att hålla den optogenetiskt kontrollerade genen undertryckt.
      OBS: För vissa stammar kan kolonier växa snabbare när de inkuberas i blåljuspulser (t.ex. 1 s på/79 s av, 5 s på/75 s av, 10 s på/70 s av, etc.) snarare än i konstant belysning, som måste bestämmas experimentellt för varje stam, om det behövs.
    8. Använd en 465 nm ljuskälla och placera en LED-panel ~40 cm ovanför plattan så att ljusintensiteten är ~80-110 μmol/m2/s. Mät intensiteten med hjälp av en kvantmätare (se Tabell över material).
    9. Om du integrerar i δ platser, skapa en kopia av plattan på YPD-plattor som innehåller en rad Zeocinkoncentrationer mellan 400 μg/ml och 1 200 μg/ml för att välja för en mängd olika integrationskopior5,7,12,16,17,18. Inkubera replikplattorna vid 30 °C under konstant eller pulserat blått ljus i 2-3 dagar tills kolonierna dyker upp.
  2. Preliminär screening för de bästa kolonierna
    1. Välj åtta kolonier från varje tallrik och använd dem för att inokulera 1 ml SC-Hans medium kompletterat med 2% glukos i enskilda brunnar av en 24-välplatta. Odla i 24-brunnsplattor under cellerna över natten (16-20 h) vid 30 °C med 200 rpm (19 mm omloppsdiameter) som skakar under konstant blå ljusbelysning.
    2. Nästa morgon späd varje kultur i 1 ml av ett färskt SC-Hans medium med 2% glukos till OD600 värden som sträcker sig från 0,01-0,3 och växer i 24-brunnsplattor under konstant eller pulserat ljus vid 30 °C med 200 rpm skakningar tills de når celltätheter mellan 2 och 9 OD600-värden (figur 4A). Hur lång tid som behövs för denna tillväxtfas beror på belastningen.
    3. Inkubera plattorna i mörker i 4 timmar vid 30 °C med 200 varv/min skakar genom att stänga av ljuspanelen och linda plattorna i aluminiumfolie.
      OBS: Detta steg gör det möjligt för cellerna att metaboliskt övergå till produktionsfasen före återsuspension i produktionsmediet.
    4. För att starta produktionsfasen, centrifugera kulturerna i 24-brunnsplattan vid 234 x g i 5 min och återanvänd cellerna i 1 ml färskt SC-dropout-medium med 2% glukos. Försegla plattorna för att förhindra avdunstning av önskad produkt med sterilt tätningstejp för mikroplattor.
    5. Jäs de förseglade plattorna i mörker i 48 timmar vid 30 °C med skakning vid 200 varv/min. Se till att plattorna är inslagna i aluminiumfolie för att förhindra exponering för ljus.
      OBS: Omslagning av plattorna i folie begränsar inte syre- eller gastillgången i jäsningar. Den sterila tätningstejpen begränsar dock gasöverföringen. Små hål kan petas i tejpen för att införa syre, om det behövs.
  3. Skörd och analys
    1. För att skörda jäsningarna, centrifugera plattorna i 5 min vid 234 x g och överför 800 μL av supernatanten till 1,5 ml mikrocentrifugerör.
    2. Beroende på den kemiska av intresse, analysera med hjälp av högpresterande vätskekromatografi (HPLC), gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS) eller annan analysmetod med hjälp av den provberedningsteknik som är bäst lämpad för det instrument som används.

2. Ljusstyrd proteinproduktion med E . coli OptoLAC-systemet

  1. Stamkonstruktion
    1. Samtransformatorn BL21 DE3 ΔlacI ΔlacI-DE3 med en plasmid som innehåller OptoLAC1B- eller OptoLAC2B-kretsen6 och en plasmid som uttrycker det rekombinanta proteinet av intresse från PT7-promotorn19.
    2. Efter omvandling, återställa cellerna för 1 h i 1 mL superoptimal buljong med katabolit förtryck (SOC; 2% tryptone, 0,5% jästextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukos) vid 37 °C med rotation eller skakningar.
      OBS: Plasmiden som innehåller det protein som är av intresse måste vara kompatibel med OptoLAC-plasmiden (dvs. olika resistensmarkörer och replikationens ursprung) och får inte innehålla en kopia av lacI.
    3. Centrifugera cellerna vid 4845 x g i 3 minuter och koncentrera pelleten i 200 μL lysogena buljongmedier (LB). Plätera hela de koncentrerade cellerna på en LB-agarplatta med lämplig antibiotika och odla vid 37 °C över natten under konstant blått ljus för att hålla proteinuttrycket undertryckt.
  2. Inledande screening för att verifiera uttryck
    1. Ta tre enda kolonier och använd dem för att inokulera 1 ml LB-media med lämpliga antibiotika i enskilda brunnar i en 24-välplatta. Väx över natten (16-20 h) vid 37 °C med 200 varv/min som skakar under konstant blå ljusbelysning (figur 4A).
    2. Nästa dag, använd 1,5 μL kultur för att mäta OD600 i en spektrofotometer med en mikrovolummätning. Späd ut kulturer till 1 ml färsk LB i 24-brunnsplattor till OD600-värden från 0,01-0,1.
    3. Odla kulturerna vid 37 °C med 200 varv/min som skakar under blått ljus i 2-3 timmar. Från och med den andra timmen, ta OD600 mätningar var 15: e minut för att säkerställa att kulturerna inte överväxt OD600-intervallet 0,1-1,5.
    4. När kulturerna är på önskad OD600, stäng av ljuspanelen och linda plattan i aluminiumfolie för att initiera produktionsfasen. Håll plattan i mörker i 8 timmar (37 °C), 20 h (30 °C) eller 48 h (18 °C), med 200 varv/min skakningar.
    5. Mät och registrera det slutliga OD600-värdet för varje kultur.
  3. Skörd och analys
    1. Överför 800 μL av varje kultur till ett 1,5 ml mikrocentrifugerör och centrifug i 5 minuter vid 17 000 x g.
    2. Återanvänd cellpelleten i 200 μL resuspensionbuffert (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM).
      OBS: Koncentrationen av NaCl kan justeras baserat på det rekombinanta proteinet som analyseras.
    3. Tillsätt 50 μL 6x natriumdodecylsulfat (SDS) provbuffert (Tris 375 mM, pH 6,8, SDS 9%, glycerol 50%, bromofenolblå 0,03%, DTT 9%). Inkubera vid 100 °C i 10 minuter med skakningar vid 700 varv/min i en termomixer.
    4. Ladda ~3-20 μL av kulturen i en 12% SDS-PAGE gel. Använd den slutliga OD600-mätningen som vägledning och lasta ungefär samma mängd protein för varje prov (motsvarande 10 μL av provet motsvarande ett slutligt OD600-värde på 1). Använd en strömförsörjning för att köra elektrofores vid 100 V tills gelén är helt löst.
    5. Färga gelén med Coomassie briljant blå G-250-lösning genom att värma i 30-40 s i en mikrovågsugn och sedan inkubera på en plattformsrotator i minst 15 min.
    6. Skölj med avjoniserat vatten två gånger och avsticka på en plattformsrotator i minst 30 min (eller över natten), tillsätt två rengöringsservetter bundna i en knut för att absorbera fläcken. Koka gelén i tillräcklig mängd vatten i mikrovågsugnen i 15 minuter för att påskynda avtaineringsprocessen.

3. Trefasfermentering med S. cerevisiae OptoAMP-systemet

  1. Stamkonstruktion
    1. Få en stam med en his3 auxotrophic markör, eftersom denna markör är nödvändig för att använda befintliga OptoAMP plasmider5. Om du söker optogenetisk reglering av en gen som är infödd till S. cerevisiae, konstruera en stam där den endogena kopian av denna gen raderas.
    2. Linjärisera en plasmid som innehåller OptoAMP4-kretsen, såsom EZ-L58012, och integrera den i his3 locus av auxotrophic stam med hjälp av vanliga litiumacetat omvandlingsmetoder15. Om du använder EZ-L580, linjärisera plasmiden på PmeI-begränsningsplatsen.
    3. Efter omvandlingen centrifugerar du cellerna vid 150 x g i 1 min och återanvänds försiktigt i 200 μL färskt SC-Hans medium.
    4. Plätera hela cellvolymen på selektiva medier (SC-His-agar) och inkubera vid 30 °C i 2-3 dagar tills kolonier uppträder.
    5. Förbered kompetenta celler från denna stam och omvandla dem med en plasmid som innehåller generna som ska kontrolleras optogenetiskt nedströms PGAL1-S-promotorn12.
      OBS: Att använda en plasmid som integreras på δ platser och väljer med Zeocin möjliggör stabil multikopiintegration och val.
    6. Centrifugera kulturen vid 150 x g i 1 min efter omvandlingen och återsuspend försiktigt i 200 μL färskt SC-dropout-medium.
      OBS: PGAL1-S-promotorn är en syntetisk version av PGAL1-promotorn där Mig1p-förtrycksplatserna raderas och extra Gal4p-aktivatorbindningsplatser läggs till. Den vanliga PGAL1-promotorn kan användas; Uttrycksstyrkan kommer dock att vara lägre än den konstruerade promotorn.
    7. Plätera hela cellvolymen på en YPD- eller SC-dropout-agarplatta och inkubera vid 30 °C i 16 timmar i mörker (insvept i aluminiumfolie). Inkubation i mörkret håller den optogenetiskt kontrollerade genen undertryckt, vilket gör det möjligt för cellerna att rikta sina metaboliska resurser mot celltillväxt snarare än kemisk produktion.
    8. Om du integrerar i δ platser, replika plattan på YPD-plattor som innehåller en rad Zeocin koncentrationer att välja för en mängd olika integrationskopior nummer. Inkubera plattorna vid 30 °C i mörkret (insvept i aluminiumfolie) i 2-3 dagar tills kolonier uppträder.
  2. Preliminär screening för de bästa kolonierna
    1. Välj åtta kolonier från varje tallrik och använd dem för att inokulera 1 ml SC-Hans medium med 2% glukos i enskilda brunnar på en 24-välplatta. Odla cellerna över natten (16-20 h) i mörkret vid 30 °C med 200 rpm skakningar.
    2. Nästa morgon späd varje kultur i 1 ml färsk SC-Hans medium med 2% glukos till 0,1 OD600 och växa i mörker vid 30 °C med 200 rpm skakningar tills de når en OD600 av 3. Linda plattorna i aluminiumfolie för att förhindra exponering för ljus. Hur lång tid som behövs för denna tillväxtfas beror på belastningen.
    3. För att starta induktionsfasen, inkubera plattorna under pulsat ljus (till exempel 5 s på/95 s av) i 12 h vid 30 °C med 200 varv/min skakningar. Använd en 465 nm ljuskälla och placera en LED-panel ovanför plattan så att ljusintensiteten är ~80-110 μmol/m2/s för optimalt resultat (figur 4A).
      OBS: Den optimala ljuspulsens varaktighet för denna inkubation varierar beroende på vilken kemikalie som produceras. Det rekommenderas att screena en rad ljusscheman från 0,1% (t.ex. 1 s på 999 s off) till 100% (fullt ljus).
    4. För att starta produktionsfasen, centrifugera kulturerna vid 234 x g i 5 min och återanvänds i färsk SC-Hans medium med 2% glukos. Försegla plattorna för att förhindra avdunstning av önskad produkt med sterilt tätningstejp för mikroplattor.
    5. Jäs de förseglade plattorna i ljus i 48 timmar vid 30 °C med skakning vid 200 varv/min. Optimera ljusschemat under detta steg eftersom vissa kemikalier drar nytta av en pulsad produktionsfas snarare än fullt ljus.
  3. Skörd och analys
    1. Skörda jäsningarna genom att centrifugera plattorna i 5 min vid 234 x g och överföra 800 μL av supernatanten till 1,5 ml mikrocentrifugerör.
    2. Beroende på den kemikalie som är av intresse, analysera med hjälp av HPLC, GC-MS eller annan analysmetod med hjälp av den provberedningsteknik som är bäst lämpad för det instrument som används.

4. Kemisk (mevalonat) produktion från E. coli i en ljusstyrd bioreaktor

  1. Inledande inokulering och bioreaktorinställning
    1. Inokulera en koloni av en E. coli-stam konstruerad med ljuskontrollerad kemisk produktion till 5 ml M9 minimala salter (3,37 mM Na2HPO4, 2,2 mM KH2PO4, 0,855 mM NaCl, 0,935 mM NH4Cl) kompletterad med 0,2% w/v casamino syror, 5% w/v 0.0025 g/L CoCl2, 0.015 g/L MnCl2, 0.0015 g/L CuCl2, 0.003 g/L H3BO3, 0.0025 g/L Na2MoO4, 0.008 g/L ZnCl2, 0.06 g/L Fe (III) citrat
    2. Odla kulturen över natten vid 30 °C med 200 varv/min som skakar under blå ljusbelysning.
    3. Ställ in bioreaktorkärlets huvudplatta och se till att följande portar är installerade: insats för termisk sond; sonden upplöst syre (DO). gassparger - anslut till luftkällan genom ett 0,2 μm-filter; pumphjul; gaskondensator - anslut till ett 0,2 μm-filter; Kylledning (x2). matningslinjer (x2) - en för medietillägg, en för pH-kontroll; provtagningslinje - se till att den når botten av fartyget; Tom port; pH-sond - kalibrera sonden med pH- standarderna = 4 och pH = 7 före installationen, antingen autoklav med resten av kärlet eller sterilisera med 95% etanol och aseptiskt sätt in före installationen.
    4. Fyll kärlet med 1 L filtrerat vatten och fäst huvudplattan och dra åt, se till att O-ringen sitter tätt och förseglar.
    5. Täck eventuella öppningar i reaktorn med aluminiumfolie.
    6. Förbered tre remsor av slangar: en för att ta bort vattnet, en för att sätta in matningen och en för pH-kontroll. Täck ändarna med aluminiumfolie och linda alla slangar i aluminiumfolie.
      OBS: NH4OH, som används för pH-justering, flyter inte smidigt i silikonrör, vilket kan leda till felaktiga flödeshastigheter och överbasifiering av kulturen. Undvik det här problemet genom att använda biokompatibla pumprör (BPT) för NH4OH-matningen.
    7. Autoklav bioreaktorn och slangen med en 30 minuters vätskecykel.
    8. Ta bort materialet från autoklaven. När pumphjulet, pH- och DO-sonder, luftkälla, kondensorintag och utlopp har svalnat tillräckligt för att hantera, ansluts du till pumphjulet, pH- och DO-sonder, luftkälla, kondensorinlopp och utlopp samt kylinlopp och utlopp till kontrollstationen.
    9. Sätt i värmesonden och täck kärlet med en värmejacka. Fäst jackan mot toppen av kärlet för att undvika att blockera kulturen från ljusexponering.
    10. Anslut ett av de sterila rören till provtagningsledningen och säkra genom provtagningspumpen. Placera den andra änden så att den strömmar in i en tom behållare som kan rymma minst 1 L. Töm vattnet inuti kärlet.
    11. Anslut ett annat sterilt rör till en av matningsledningarna och säkra genom en av matningspumparna. Anslut den andra änden av röret till en flaska M9-media. Mata in media i reaktorn.
    12. Anslut ett annat sterilt rör till en av matningsledningarna och säkra genom en av matningspumparna. Anslut den andra änden av röret till flaskan som innehåller 28%-30% NH4OH.
      VARNING: NH4OH är frätande. Arbeta i en rökhuv medan du överför till en matningsflaska och se till att matningsflaskan placeras i sekundär inneslutning.
    13. Placera tre ljuspaneler i en triangulär formation ~20 cm från reaktorn och kontrollera att ljusintensiteterna på kärlets yta når ~80-110 μmol/m2/s från varje sida (figur 4B).
    14. Nästa dag, slå på bioreaktorsystemet och kylaggregatet. Ställ in reaktorns temperaturvärde till 37 °C, pH-börvärdet till 7,0 och omrörningen till 200 varv/min. Värmejackan ska slås på.
    15. Kalibrera DO-sonden genom att först vänta tills temperatur- och DO-mätningarna blir konstanta (detta kommer att vara 100% börvärde). Koppla sedan bort sonden från systemet (det här blir börvärdet 0 %). Upprepa tills DO-mätningen stabiliseras på 100% när sonden är ansluten och ställ sedan in DO-börvärdet på 20%.
  2. Ljusstyrd kemisk produktion
    1. Inokulera bioreaktorn till en första OD600 på 0,001-0,1. Slå på ljuspanelerna för att initiera tillväxt.
    2. Efter 3 h, börja ta prover från provtagningslinjen för att göra OD600-mätningar för att undvika att övervuxen den optimala celltätheten för induktion (ρs). När den optimala ρs har uppnåtts (det optimala värdet för mevalonatproduktion är 0,17), stäng av ljuspanelerna, täck reaktorn i aluminiumfolie och linda installationen i svart trasa för att initiera den mörka produktionsfasen.
    3. Tillsätt 50 μL antifoam, 8 h efter byte till mörker. Skruva loss den tomma porten och pipetten antifoam direkt in i reaktorn.
    4. Använd provtagningsporten för att regelbundet ta prover för HPLC- eller GC-analys.
  3. Demontering och analys
    1. När experimentet är avslutat stänger du av systemet. Skruva försiktigt loss DO- och pH-sonderna och tvätta dem med tvål och vatten. Skruva loss huvudplattan och tvätta den med tvål och vatten med en borste.
    2. Överför kulturen till en tom behållare och tillsätt blekmedel till en slutlig koncentration på 10% v/v. Placera i en rökhuv och kassera efter 30 min.
    3. Tvätta reaktorkärlet med tvål och vatten med en borste.
    4. Förbered proverna för analys baserat på den produkt som är av intresse. För mevalonatproduktion, blanda 560 μL kultur med 140 μL 0,5 M HCl och virvel med hög hastighet i 1 min. Detta omvandlar mevalonat till (±)-mevalonolakton.
      VARNING: HCl är en hälsorisk. Hantera med rätt personlig skyddsutrustning och se till att provrören är ordentligt täckta innan du virvlar.
    5. Centrifug vid 17 000 x g i 45 min vid 4 °C. Överför 250 μL av supernatanten till en HPLC-flaska.
    6. För mevalonat, analysera prover med hjälp av en organisk syror jon utbyte kolumn. Kvantifiera produktionen med hjälp av en brytningsindexdetektor (RID) och jämför toppområden med en standard på (±)-mevalonolakton.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optogenetisk reglering av mikrobiell metabolism har framgångsrikt implementerats för att producera en mängd olika produkter, inklusive biobränslen, bulkkemikalier, proteiner och naturliga produkter5,6,7,12,13. De flesta av dessa processer är utformade för att celltillväxt ska ske i ljuset (när låg celltäthet innebär minimala utmaningar med ljuspenetration) och för att produktionen ska induceras av mörker när cellerna har odlats. Olika kemikalier som har producerats av jäst med detta tillvägagångssätt, inklusive mjölksyra, en värdefull polymerprekursor och livsmedelstillsats, samt isobutanol, en nästa generations biobränsle. För båda kemikalierna härrör en gemensam utmaning från den starka drivkraften hos S. cerevisiae att metabolisera glukos mot etanolproduktion snarare än produkten av intresse och oförmågan att ta bort etanolfermenteringsvägen utan att orsaka en allvarlig tillväxtdefekt7. En kombination av ljusaktiverade OptoEXP- och ljusförträngda OptoINVRT-kretsar har använts för att selektivt aktivera genen för pyruvatdekarboxyas (PDC1) som krävs för etanolfermentering och inducera vägen för önskad produkt i mörker5 (figur 5A,B). Med hjälp av denna strategi med en optimerad celldensitet av induktion (ρs) kan höga titrar av båda önskade kemikalier uppnås (figur 5C, D), vilket belyser värdet av dubbelriktad kontroll som erbjuds av optogenetik.

Medan de flesta jästbaserade optogenetiska processer har centrerats på en ljusdriven tillväxtfas och mörkerinducerad produktionsfas, har den senaste utvecklingen av extra känsliga och starka OptoAMP-kretsar öppnat möjligheter för ljusdrivna jäsningar också12. Dessa ljusdrivna jäsningar liknar de tidigare beskrivna processerna; Ljusschemana är dock omvända så att produktionen sker i ljuset. Dessutom möjliggör dessa kretsar genomförandet av trefasprocesser, vilket ger mer flexibilitet och kontroll till produktionen jämfört med den vanliga tvåfasmetoden. Med tanke på känsligheten och styrkan hos dessa kretsar optimeras dessa trefasprocesser vanligtvis genom att granska olika ljusscheman i varje fas. Optimala ljuspulser beror på belastningen och produkten av intresse. Sådana kretsar har framgångsrikt tillämpats på produktion av naringenin, en naturlig produkt med terapeutiska tillämpningar, förutom mjölksyra och isobutanol12 (figur 6). Den ökade produktionen av alla tre kemikalier visar värdet av optogenetisk reglering över en rad olika utbildningskomplexiteter samt den nya potential som erbjuds genom trefasfermentering.

Utöver dessa demonstrationer i jäst har optogenetik också tillämpats för att öka produktionen av proteiner och kemikalier i den bakteriella arbetshästen E. coli. Fermenteringar med denna värd har följt en ljusdriven tillväxt och mörkerinducerad produktionsram med OptoLAC-sviten av kretsar6. När det används för att producera ett gult fluorescerande protein (YFP) eller transkriptionsfaktor FdeR är ljusstyrd produktion jämförbar eller överlägsen de nivåer som uppnås med standard IPTG-induktion, men med enklare bedövningsförmåga för mellanliggande produktionsnivåer (figur 7A). Dessutom har OptoLAC-kretsar tillämpats för att producera mevalonat, en viktig terpenoidprekursor, både på mikroplate- och bioreaktornivåerna (figur 7B, C). Dessa utvalda resultat ger en allmän översikt över styrkan, mångsidigheten och lämpligheten av optogenetisk reglering för mikrobiell kemisk och proteinproduktion.

Figure 4
Bild 4: Experimentell inställning för belysning av plattor och bioreaktorer. (A) 24-brunnsplattor kan belysas vid skakning genom att placera en blå LED-ljuspanel cirka 40 cm ovanför skakapparaten. Ljusintensiteten bör mätas med en kvantmätare för att säkerställa att den är mellan ~80-110 μmol/m2/s. (B) För att belysa en bioreaktor placerar du tre ljuspaneler i en triangulär formation runt bioreaktorn. Precis som med 24-brunnsplattorna bör ljusintensiteten mätas och justeras för att nå ~80-110 μmol/m2/s från alla håll. Figur skapad med Biorender. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Lätt undertryckt produktion av kemikalier från S. cerevisiae. För att förbättra produktionen av mjölksyra (A) eller isobutanol (B) har en kombination av ljus- och mörkinducerbara kretsar använts för att selektivt aktivera specifika vägar. I båda scenarierna induceras den väsentliga etanolproduktionsvägen i ljuset genom att kontrollera PDC1-uttrycket med OptoEXP, medan produktionsvägarna aktiveras i mörkret med hjälp av en OptoINVRT-krets. (C) Produktionen av mjölksyra testades med en rad ρs-värden med två kretsar från OptoINVRT-sviten. OptoINVRT7-versionen fungerade bäst, med ett optimalt ρs-värde på 7,0. (D) OptoINVRT7-versionen maximerade också isobutanolproduktionen jämfört med den andra kretsen, med en optimal ρs på 8,75. **p < 0,01, ***p < 0,001. Statistiken härleds med hjälp av ett dubbelsidigt t-test. Data visas som medelvärden och felstaplar representerar standardavvikelserna för fyra replikat. Figuren har ändrats från Zhao et al.5. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Ljusaktiverad produktion av kemikalier i trefasfermentering av S. cerevisiae. Fermenteringar med OptoAMP-kretsarna kan fungera med tre dynamiska faser: tillväxt (i), induktion (ii) och produktion (iii), var och en definierad av olika lätta cykler. (A) Biosyntes av mjölksyra induceras i blått ljus genom optogenetisk kontroll av LDH-uttryck . (B) Mjölksyraproduktionen kan optimeras med hjälp av ett pulsat (1 s on/79 s off) ljusschema i tillväxtfasen och full belysning i induktions- och produktionsfaserna. C) Produktion av isobutanol induceras genom optogenetiskt kontrollerande ILV2-uttryck . (D) Isobutanolproduktionen optimeras med hjälp av en pulsad tillväxtfas (1 s on/79 s off), fullt belyst induktionsfas och pulsad (2 s on/118 s off) produktionsfas. (E) Kontroll av den mer komplexa biosyntetiska vägen för naringenin, framkallad av optogenetiskt kontrollerande uttryck för TAL - och PAL-generna . (F) Naringenin biosyntes är bäst optimerad med hjälp av en pulsad tillväxt (1 s on/79 s off), fullt belyst induktion och mörk produktionsfas. *p < 0,05, **p < 0,01, n.s. = ingen betydelse. Statistiken härleds med hjälp av ett dubbelsidigt t-test. Data visas som medelvärden och felstaplar representerar standardavvikelserna för fyra oberoende replikat. Figuren har ändrats från Zhao et al.12. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Optogenetisk produktion av rekombinanta proteiner och kemikalier i E. coli. OptoLAC-systemet har använts för att producera både proteiner och kemikalier vid titers som är jämförbara med eller högre än de som uppnås med kemisk induktion med IPTG. A) Optogenetiskt uttryck för FdeR är både starkt och tunable med hjälp av en mängd olika lätta cykler, som lösts och kvantifierats med västra fläcken. (B) En stam konstruerad för mevalonatproduktion överstiger titer som uppnås med hjälp av IPTG-induktion vid 24-brunnsskalan till optimalt ρs-värde . C) Optogenetisk produktion av mevalonat i en 2 L-bioreaktor visar att produktionen är skalbar bortom mikroplattor. *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001. Statistiken härleds med hjälp av ett dubbelsidigt t-test. Alla data visas som medelvärden och felstaplar representerar standardavvikelserna för biologiskt oberoende prover. Data för (A) och (C) representerar tre replikat, medan antalet replikat från vänster till höger= 4, 4, 6, 3, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4. Figuren har ändrats från Lalwani et al.6. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dynamisk kontroll har länge tillämpats för att förbättra avkastningen för metabolisk teknik och rekombinant proteinproduktion4. Förändringar i enzymatiska uttryck genomförs oftast med hjälp av kemiska inducerare som IPTG21, galaktos22 och tetracyklin23, men har också medierats med processförhållanden som temperatur och pH. Optogenetisk kontroll av genuttryck eliminerar behovet av förändringar i jäsningsparametrar eller mediekomposition, vilket gör det till ett lätt tillämpligt alternativ till traditionella induktionsstrategier. Den lätthet med vilken ljus kan slås på eller av erbjuder också nya funktioner som snabb och reversibel justering av gendosering. Dessutom, medan dessa protokoll fokuserar på blå ljuskänsliga system, erbjuder förekomsten av optogenetiska verktyg som inverterar befintliga ljussvar24 eller svarar på andra våglängder av ljus25,26,27,28,29 spännande potential att ortogonalt kontrollera flera vägar för en aldrig tidigare skådad kontrollnivå. Sådana fördelar gör ljuset till en mångsidig ny lösning för flexibel kontroll över mikrobiella jäsningar.

Utöver screening för de bästa kolonierna, som diskuteras i protokollen, bör andra parametrar som celltätheten vid vilken kulturer växlas från tillväxt till produktion (ρs), längder av produktions- och inkubationsperioderna och lätta arbetscykler också optimeras. De bästa värdena för dessa parametrar är produkt- och stamberoende och bör därför optimeras igen för alla nya tillämpningar. Till exempel kan vägar som involverar giftiga slutprodukter dra nytta av högre ρs-värden, vilket möjliggör tillräcklig ackumulering av celler innan produktionen induceras6,7, medan en svagare men mindre läckande krets kan gynna lägre värden på ρs för att maximera den totala uttryckstiden. På samma sätt kan vissa vägar och rekombinanta proteiner dra nytta av mellanliggande uttrycksnivåer, vilket kan uppnås med unika ljusuppgifter. Dessutom, när det gäller jäsningar som använder OptoAMP-kretsar, kan antalet temporala faser optimeras. Medan det demonstrerade protokollet beskriver en trefasprocess, kan jäsningar med dessa kretsar styras med ett större antal faser som definieras av unika ljustjänstgöringsscheman och varaktigheter. Således bör en rad av dessa parametrar testas för att optimera prestanda.

Att undvika källor till ljusförorening utgör en viktig faktor under experimentell installation. För processer som kräver en fördröjning av ljusstimulering till senare stadier (t.ex. mörk till ljus jäsning) kan det vara lämpligt att arbeta i ett mörkt rum för att undvika för tidig aktivering av optogenetiska system. I dessa fall kan en inert ljuskälla tillämpas för synlighet under den experimentella installationen (till exempel en långt röd ljuskälla på ~ 700 nm när du arbetar med blå ljusaktiverade system). En fördel med processer som börjar med ljusinducerad tillväxt (ljus till mörker) är att inledande experimentella manipuleringar kan utföras under omgivande ljus med gott om synlighet.

Den lätthet med vilken ett stort antal lätta scheman kan tillämpas på jäsningar ger möjlighet att utveckla metoder med högre genomströmning för att balansera biosyntetiska vägar och klargöra de optimala förhållandena som maximerar jäsningsproduktiviteten. I stället för att balansera metaboliska vägar genom att testa ett stort antal kombinatorially monterade konstruktioner med varje enzym uttryckt av promotorer av olika styrkor, kan vägar balanseras av varierande genuttrycksnivåer med hjälp av olika lätta cykler från ett mycket mindre antal konstruktioner. Detta undanröjer behovet av mer besvärliga experimentella inställningar, såsom resuspension i olika induktionsmedier eller seriella utspädningar för kemiska inducerare. Optogenetiska experiment kan till och med automatiseras för att öka genomströmningen genom att använda i silico-styrenheter för att leverera specifikt tidsbestämplade eller lokaliserade ljuspulser till olika provpooler30. Experiment med hög genomströmning under olika ljusförhållanden måste dock vara tillräckligt åtskilda för att undvika korskontaminering av ljus, vilket kan utgöra rumsliga begränsningar. Dessutom förhindrar kravet på ljusstimulering användningen av de flesta plattläsare och mikrobioreaktorer för kontinuerliga mätningar. Även om det ännu inte är allmänt tillgängligt kommersiellt, har flera apparater och algoritmer nyligen utvecklats för experiment med hög genomströmning och kontinuerlig optogenetiska experiment, vilket hjälper till att ta itu med dessa rumsliga begränsningar31,32,33,34. Således, trots dessa begränsningar, optogenetik erbjuder en enorm potential att öka experimentell genomströmning samtidigt som den ger förbättrad kontrollerbarhet.

Protokollen och videon som presenteras här kommer förhoppningsvis att sänka hindren för andra forskare att anta optogenetiska kontroller av cellulär metabolism och mikrobiella jäsningar. Optogenetik är en möjliggörande teknik för grundforskning och biotekniska applikationer som kan dra nytta av finjusterad kontroll av genuttryck, såsom genetik, molekylär- och cellbiologi, metabolism, systembiologi och cybergenetik35,36,37,38. Dessutom har optogenetisk reglering av genuttryck visats i andra mikroorganismer som Bacillus subtilis och Pseudomonas aeruginosa, vilket tyder på att fördelarna med ljuskontroll kan utvidgas till att omfatta studier och tillämpning av olika arter39,40,41. Dessa möjligheter belyser den framtida potentialen hos optogenetik för metabolisk teknik, proteinproduktion och andra biotekniska tillämpningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ansökt om flera patent för de optogenetiska kretsar och metoder som beskrivs i denna artikel.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av U.S. Department of Energy, Office of Science, Office of Biological and Environmental Research Award Number DE-SC0019363, NSF CAREER Award CBET-1751840, The Pew Charitable Trusts och Camille Dreyfus Teacher-Scholar Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Light-controlled chemical production using S. cerevisiae
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Agar powder Thermo Fisher Scientific 303991049
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid N/A N/A See Reference 1
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
PmeI New England Biolabs R0560L
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
Replica-plating device Thomas Scientific F37848-0000
Replica-plating pads Sunrise Science Products 3005-012
SC-His powder Sunrise Science Products 1303-030
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100
Sterile sealing film Excel Scientific STR-SEAL-PLT
YPD agar plates VWR 100217-054
Zeocin Thermo Fisher Scientific R25005
Light-controlled protein production using E. coli
6X SDS Sample Buffer Cepham Life Sciences 10502
12% Acrylamide protein gels Thermo Fisher Scientific NP0341BOX
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250 Thermo Fisher Scientific 20279
Electrophoresis cell Bio-Rad 1658004
Electrophoresis power supply Bio-Rad 1645050
LB broth (Miller) Fisher Scientific BP97235
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NaCl Thomas Scientific SX0425-1
OptoLAC plasmids N/A N/A See Reference 2
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SOC medium Thermo Fisher Scientific 15544034
Thermomixer Eppendorf 5382000015
Tris base Fisher Scientific BP1521
Three-phase fermentation using S. cerevisiae
Same materials as "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" protocol plus the following:
EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid N/A N/A See Reference 10
Chemical production in a light-controlled bioreactor
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
Antifoam Sigma-Aldrich A8311
Bioreactor with control station Eppendorf B120110001
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Bleach VWR Scientific 89501-620 (CS)
Blue LED panel HQRP 884667106091218
BPT tubing Fisher Scientific 14-170-15
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific 7647-01-0
M9 Minimal Salts Thermo Fisher Scientific A1374401
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NH4OH Solution Sigma-Aldrich I0503-1VL
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. The rise and shine of yeast optogenetics. Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).
  2. Pouzet, S., et al. The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
  3. Venayak, N., Anesiadis, N., Cluett, W. R., Mahadevan, R. Engineering metabolism through dynamic control. Current Opinion in Biotechnology. 34, 142-152 (2015).
  4. Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Avalos, J. L. Current and future modalities of dynamic control in metabolic engineering. Current Opinion in Biotechnology. 52, 56-65 (2018).
  5. Zhao, E. M., et al. Design and characterization of rapid optogenetic circuits for dynamic control in yeast metabolic engineering. ACS Synthetic Biology. 9 (12), 3254-3266 (2020).
  6. Lalwani, M. A., et al. Optogenetic control of the lac operon for bacterial chemical and protein production. Nature Chemical Biology. 17 (1), 71-79 (2021).
  7. Zhao, E. M., et al. Optogenetic regulation of engineered cellular metabolism for microbial chemical production. Nature. 555 (7698), 683-687 (2018).
  8. Baumschlager, A., Khammash, M. Synthetic biological approaches for optogenetics and tools for transcriptional light-control in bacteria. Advanced Biology. 5 (5), 2000256 (2021).
  9. Dvorak, P., et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) carrying a synthetic metabolic pathway. Microbial Cell Factories. 14, 201 (2015).
  10. Hartline, C. J., Schmitz, A. C., Han, Y., Zhang, F. Dynamic control in metabolic engineering: Theories, tools, and applications. Metabolic Engineering. 63, 126-140 (2021).
  11. Ni, C., Dinh, C. V., Prather, K. L. J. Dynamic control of metabolism. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 12, 519-560 (2021).
  12. Zhao, E. M., et al. Optogenetic amplification circuits for light-induced metabolic control. ACS Synthetic Biology. 10 (5), 1143-1154 (2021).
  13. Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Wegner, S. A., Avalos, J. L. The Neurospora crassa Inducible Q System Enables Simultaneous Optogenetic Amplification and Inversion in Saccharomyces cerevisiae for Bidirectional Control of Gene Expression. ACS Synthetic Biology. 10 (8), 2060-2075 (2021).
  14. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  16. Marx, H., Mecklenbräuker, A., Gasser, B., Sauer, M., Mattanovich, D. Directed gene copy number amplification in Pichia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus. FEMS Yeast Research. 9 (8), 1260-1270 (2009).
  17. Nordén, K., et al. Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris. BMC Biotechnology. 11, 47 (2011).
  18. Zhao, E. M., et al. Light-based control of metabolic flux through assembly of synthetic organelles. Nature Chemical Biology. 15 (6), 589-597 (2019).
  19. Dowee, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
  20. Zhou, K., Edgar, S., Stephanopoulos, G. Engineering microbes to synthesize plant isoprenoids. Methods in Enzymology. 575, 225-245 (2016).
  21. Arfman, N., Worrell, V., Ingram, L. O. Use of the tac promoter and lacI(q) for the controlled expression of Zymomonas mobilis fermentative genes in Escherichia coli and Zymomonas mobilis. Journal of Bacteriology. 174 (22), 7370-7378 (1992).
  22. Steen, E. J., et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol. Microbial Cell Factories. 7 (1), 1-8 (2008).
  23. Tan, S. Z., Manchester, S., Prather, K. L. J. Controlling central carbon metabolism for improved pathway yields in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 5 (2), 116-124 (2015).
  24. Jayaraman, P., et al. Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6994 (2016).
  25. Fernandez-Rodriguez, J., Moser, F., Song, M., Voigt, C. A. Engineering RGB color vision into Escherichia coli. Nature Chemical Biology. 13 (7), 706-708 (2017).
  26. Ding, Q., et al. Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production. Nature Communications. 11 (1), 1-14 (2020).
  27. Senoo, S., Tandar, S. T., Kitamura, S., Toya, Y., Shimizu, H. Light-inducible flux control of triosephosphate isomerase on glycolysis in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 116 (12), 3292-3300 (2019).
  28. Ramakrishnan, P., Tabor, J. J. Repurposing synechocystis PCC6803 UirS-UirR as a UV-violet/green photoreversible transcriptional regulatory tool in E. Coli. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 733-740 (2016).
  29. Tabor, J. J., Levskaya, A., Voigt, C. A. Multichromatic control of gene expression in escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 405 (2), 315-324 (2011).
  30. Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (120), e54894 (2017).
  31. Grødem, E. O. S., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
  32. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, (2016).
  33. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  34. Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLoS Biology. 18 (7), (2020).
  35. Carrasco-López, C., García-Echauri, S. A., Kichuk, T., Avalos, J. L. Optogenetics and biosensors set the stage for metabolic cybergenetics. Current Opinion in Biotechnology. 65, 296-309 (2020).
  36. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (1), 1-11 (2016).
  37. Melendez, J., et al. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology: Quantitative Biosciences From Nano to Macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  38. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  39. Castillo-Hair, S. M., Baerman, E. A., Fujita, M., Igoshin, O. A., Tabor, J. J. Optogenetic control of Bacillus subtilis gene expression. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  40. Xia, A., et al. Optogenetic modification of pseudomonas aeruginosa enables controllable twitching motility and host infection. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 531-541 (2021).
  41. Pu, L., Yang, S., Xia, A., Jin, F. Optogenetics manipulation enables prevention of biofilm formation of engineered pseudomonas aeruginosa on surfaces. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 200-208 (2018).

Tags

Bioengineering nummer 181
Ljuskontrollerade jäsningar för mikrobiell kemisk och proteinproduktion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hoffman, S. M., Lalwani, M. A.,… More

Hoffman, S. M., Lalwani, M. A., Avalos, J. L. Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production. J. Vis. Exp. (181), e63269, doi:10.3791/63269 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter