Summary
O protocolo atual detalha o isolamento de ficobilísomees de cianobactérias por centrifugação através de um gradiente de densidade de sacarose descontínua. As frações de ficobilismos intactos são confirmadas pelo espectro de emissão fluorescente de 77K e pela análise de SDS-PAGE. As frações ficobilínicas resultantes são adequadas para coloração negativa da TEM e análise de espectrometria de massa.
Abstract
Em cianobactérias, o ficobiliso é um complexo proteico de antena vital que colhe luz e transfere energia para fotossistema I e II para fotoquímica. Estudar a estrutura e a composição do ficobilisome é de grande interesse para os cientistas porque revela a evolução e divergência da fotossíntese nas cianobactérias. Este protocolo fornece um método detalhado e otimizado para quebrar células cianobacterianas a baixo custo por um batedor de contas de forma eficiente. O ficobiliso intacto pode então ser isolado do extrato celular por ultracentrifugação gradiente de sacarose. Este método demonstrou ser adequado tanto para cianobactérias modelo quanto não modelo com diferentes tipos de células. Um procedimento passo a passo também é fornecido para confirmar a integridade e propriedade de ficobiliproteínas por espectroscopia de fluorescência de 77K e SDS-PAGE manchada por sulfato de zinco e Coomassie Blue. O ficobiliso isolado também pode ser submetido a novas análises estruturais e composicionais. No geral, este protocolo fornece um guia de partida útil que permite aos pesquisadores não familiarizados com cianobactérias isolar e caracterizar ficobilisma intacta.
Introduction
Ficobilisome (PBS) é um enorme complexo de proteína pigmento solúvel em água que se liga ao lado citoplasmático dos fotossistemas nas membranas thylakoidas de cianobactérias1. A PBS é composta principalmente de ficobiliproteínas coloridas e proteínas de linker incolor1,2. As ficobiliproteínas podem ser divididas em quatro grandes grupos: ficoerthrina, ficoerytrocyanina, ficocitanina e alofilianina3. Os quatro principais grupos absorvem diferentes comprimentos de onda de energia leve na faixa de 490-650 nm, que clorofilas absorviam ineficientemente3. O PBS pode servir como uma antena de captação de luz para coletar energia leve e entregá-la ao Photosystem II e I4.
A estrutura e a composição da PBS variam de espécie para espécie. Coletivamente, três formas de ficobiliso (hemidiscodial, em forma de feixe e em forma de vara) foram identificadas em diferentes espécies cianobacterianas5. Mesmo na mesma espécie, a composição da PBS muda em resposta ao meio ambiente, como qualidade da luz e esgotamento de nutrientes6,7,8,9,10,11. Portanto, o procedimento experimental para isolar a PBS das cianobactérias tem sido fundamental no estudo do PBS12. Ao longo de várias décadas, diversos protocolos isolaram a PBS e analisaram sua estrutura, composição e função6,7,8,12,13,14,15,16,17. A grande variedade de métodos para o isolamento da PBS de fato proporciona flexibilidade na isolação do complexo em diferentes espécies com diferentes reagentes e instrumentos. No entanto, também torna a escolha de um protocolo adequado mais difícil para cientistas que não estão familiarizados com cianobactérias e PBS. Portanto, um protocolo generalizado e direto é desenvolvido neste trabalho para os interessados em iniciar o isolamento da PBS a partir de cianobactérias.
Os métodos para isolar a PBS de publicações anteriores são resumidos aqui. Uma vez que o PBS é um complexo proteico solúvel em água e é prontamente dissociado, um tampão de fosfato de alta resistência iônica é necessário para estabilizar a PBS durante a extração18. Vários artigos de pesquisa que descrevem métodos para o isolamento da PBS de cianobacterium foram publicados no passado. A maioria dos métodos requer uma alta concentração de tampão fosfato8,14,15,18,19. No entanto, os procedimentos para interrupção mecânica das células variam, como extração assistida por contas de vidro, sonicação20 e prensa francesa6,8,14. Diferentes ficobiliproteínas podem ser obtidas por precipitação com sulfato de amônio20 e purificadas por HPLC21 ou uma coluna cromatográfica22. Por outro lado, a PBS intacta pode ser facilmente isolada por ultracentrifugação gradiente de densidade de sacarose6,8,15.
Neste protocolo, um modelo de cianobacterium e um cianobacterium não modelo foram utilizados como materiais para o isolamento da PBS. São eles modelo unicelular tolerante à glicose Synechocystis sp. PCC 6803 (doravante Syn6803) e não-modelo filamentous Leptolyngbya sp. JSC-1 (doravante JSC-1), respectivamente7,23,24. O protocolo começa pela interrupção das cianobactérias unicelulares e filamentosas em um tampão fosfato de alta resistência iônica. Após a lise, os supernacantes são coletados por centrifugação e, em seguida, tratados com um detergente noniônico (Triton X-100) para solubilizar as proteínas solúveis em água das membranas thylakoid. As proteínas solúveis em água totais são aplicadas a um gradiente de densidade de sacarose descontínua para fracionar o PBS. O gradiente de sacarose descontínuo neste protocolo consiste em quatro soluções de sacarose e partições o PBS intacto nas frações mais baixas da camada de sacarose25. A integridade do PBS pode ser analisada por SDS-PAGE, manchas de zinco e espectroscopia de fluorescência de 77K6,7,8,26. Este método é adequado para cientistas que visam isolar o PBS intacto das cianobactérias e estudar suas propriedades espectrais, estruturais e composicionais.
Há várias vantagens deste protocolo. (1) Este método é padronizado e pode ser usado para isolar PBS intacto tanto de cianobactérias unicelulares quanto filamentosas. A maioria dos artigos descreve o método aplicado em qualquer um tipo de cianobactéria4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Este método é realizado à temperatura ambiente, uma vez que o PBS se dissocia a baixa temperatura19,27. (3) Este método descreve o uso de um batedor de contas para interromper as células; portanto, é mais barato e mais seguro do que a imprensa francesa de alta pressão e possíveis danos auditivos do sonicator em outros métodos8,13,14,20. (4) Este método isola a PBS intacta por ultra centrifugação gradiente de sacarose. Desta forma, pbs intacto com diferentes tamanhos e PBS parcialmente dissociado pode ser separado com base na concentração de sacarose.
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Protocol
O Synechocystis sp. PCC 6803, o modelo de cepa tolerante à glicose, foi obtido do Dr. Chu, Hsiu-An na Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, o não-modelo filamentous, foi obtido do Dr. Donald A. Bryant na Universidade Estadual da Pensilvânia, EUA.
1. Cultura celular e colheita
- Inoculação Células Syn6803 ou JSC-1 usando um laço de inoculação metálica em um frasco cônico de 100 mL contendo 50 mL de B-HEPES médio28. Cultume as células a 30 °C sob 50 μmol fótons m-2 s-1 (LED de luz branca) em 1% (v/v) CO2 com agitação constante por um agitador magnético (120 rpm) até que a cultura atinja a fase de crescimento médio-exponencial (OD750 = 0,6-0,8).
NOTA: Colher a cultura celular quando a densidade óptica da cultura a 750 nm (OD750) atingir 0,6-0,8 transferindo-se para um novo frasco. A densidade óptica foi usada rotineiramente para estimar a densidade celular microbiana em culturas líquidas29. Os comprimentos de onda de 720-750 nm foram utilizados em vários estudos para medir o crescimento cianobacteriano30,31,32. Neste protocolo, OD750 é usado porque o JSC-1 pode produzir pigmentos que absorvem a luz vermelha distante7. Alternativamente, a concentração de clorofila também foi utilizada para medir o crescimento de cianobactérias33. - Transfira a cultura celular (OD750 ~0,8) em um frasco cônico 1L e dilua-a para OD750 = 0,2 em 500 mL de meio B-HEPES. Cresça a cultura até a fase final de crescimento exponencial (OD750 = 0,8-1,0) na mesma condição mencionada acima (passo 1.1) e depois colher a cultura por centrifugação.
- Centrifugar a cultura a 10.000 x g por 20 minutos à temperatura ambiente e descartar completamente o supernatante.
NOTA: As pelotas das células podem ser armazenadas a -80 °C por até 6 meses.
2. Lise celular
- Suspenda as pelotas celulares e lave duas vezes com tampão de fosfato K de 0,75 M, pH 7.
NOTA: Para fazer 0,75 M K-fosfato tampão no pH 7, prepare 1,5 M de K2HPO4 e 1,5 M de KH2PO4 separadamente. Misture 615 mL de 1,5 M K2HPO4 e 385 ml de 1,5M KH2PO4 para obter tampão de 1,5 M K-fosfato no pH 7. Basta diluí-lo com a mesma quantidade de ddH2O para fazer 0,75 M K-fosfato tampão em pH 7. - Pellet as células em tubos de centrífugas de 50 mL por centrifugação a 10.000 x g por 20 minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernasciente e resuspenque as células com 0,75 M K-fosfato tampão. Meça o peso úmido da pelota por um equilíbrio eletrônico e ressuspend 1 g de peso molhado da pelota em 5 mL do tampão.
NOTA: O peso úmido de uma pelota foi medido subtraindo o peso de um tubo de centrífuga vazio do peso do tubo centrífuga contendo a pelota celular. - Adicione 1 mL de suspensão celular e 0,4-0,6 g de contas de vidro de 0,1 mm (ver Tabela de Materiais) em um frasco de tampa de parafuso de 2 mL.
- Quebre as células por 30 s por um batedor de contas (ver Tabela de Materiais). Deixe os tubos esfriarem em um banho de água de temperatura ambiente por 2 minutos e repita o ciclo de ruptura 5 vezes.
- Após a lise, centrifugar os frascos a 500 x g para 10 s em temperatura ambiente. Colete o supernatante com uma pipeta em um tubo de centrífuga de 15 mL. Lave as contas com 0,5 mL de 0,75 M K-fosfato tampão uma vez, depois transfira para o mesmo tubo de centrífugas.
- Adicione Triton X-100 (2% c/v, concentração final) à suspensão celular líseda e incubar em um agitador de balanço (40 rpm) à temperatura ambiente até que a solução se torne homogênea (~20 min).
- Centrifugar os tubos a 17.210 g por 20 minutos para remover as células intactas e detritos celulares grandes. Armazene o supernatante sem a camada de micelle Triton superior à temperatura ambiente por até 1 h.
NOTA: O supernatante contém duas camadas separadas. A camada triton x hidrofóbica superior contém proteínas de ligação de clorofila e ficobilisos em forma de vara hidrofóbica6. A camada aquosa inferior contém PBS solúvel em água.
3. Preparação dos tampões de gradiente de sacarose e isolamento da PBS
- Faça quatro concentrações de sacarose (2,0 M, 1,0 M, 0,75 M e 0,5 M) em 0,75 M K-fosfato tampão no pH 7.
NOTA: Sugere-se usar tampão de fosfato de 1,5 M K no pH 7 para preparar o gradiente de sacarose, pois a adição de sacarose dilui a concentração do tampão de fosfato K. Depois que a sacarose estiver totalmente dissolvida, adicione ddH2O para ajustar a concentração a 0,75 M, pH 7. - Coloque 2,8 mL de tampão de sacarose de 2,0 M na parte inferior do tubo centrífuga de 40 mL e sobreposição com três camadas de soluções de sacarose (8 mL de 1,0 M; 12 mL de 0,75 M e 11 mL de 0,5 M para tubo centrífugo de 40 mL), e finalmente PBS contendo a fração sobrenante (3,0 mL) (Figura 1A).
NOTA: Adicione cuidadosamente a solução de sacarose e deixe a sacarose cair muito lentamente dentro do tubo. Segure a ponta da pipeta logo acima da superfície da solução no tubo enquanto carrega a solução. As camadas de sacarose podem ser observadas quando são colocadas lentamente em camadas. - Centrifugar os gradientes resultantes a 125.800 x g para ~16h-20 h a 25 °C.NOTA: É necessário um ultracentrifuge (ver Tabela de Materiais) para esta etapa.
- Após a ultra-centrifugação, condensar as PBS fracionadas e as ficobiliproteínas entre as camadas. Bandas azuis em Syn6803 (bandas roxas mostradas em JSC-1) foram observadas nas interfaces (Figura 1D).
- Colete lentamente as frações com uma pipeta do topo dos gradientes de sacarose. Remova a sacarose concentrando-se repetidamente (3.500 x g por 20 min) e diluindo as frações com tampão de fosfato K de 0,75 M em unidades de filtro centrífugo de membrana (corte de peso molecular de 10 K, ver Tabela de Materiais).
4. Medição da fluorescência pbs em 77K
NOTA: Um fluorímetro equipado com um recipiente de nitrogênio líquido (ver Tabela de Materiais) é usado para medir espectros de fluorescência a 77K.
- Diluir a amostra concentrada de PBS com tampão de fosfato K de 0,75 M para obter pelo menos 500 μL.
NOTA: As concentrações de ficocitanina das amostras foram ~4,2 μg mL-1 com base na fórmula: (OD615 0,474 x OD652)/5,34 [mg/mL]34. - Adicione 500 μL da amostra pbs a um tubo de vidro transparente e congele o tubo em nitrogênio líquido até que esteja completamente congelado. Mova o tubo congelado para um recipiente Dewar transparente (ver Tabela de Materiais) pré-preenchido com nitrogênio líquido.
NOTA: O diâmetro interno do tubo de vidro é de 3 mm neste protocolo. Tubos de vidro fino foram utilizados para minimizar a reabsorção da emissão de comprimento de onda curta na amostra. - Escolha os comprimentos de onda de excitação para ficoerythrina e ficocyanina de 550 nm e 580 nm, respectivamente.
NOTA: As emissões de fluorescência foram registradas de 560-800 nm (para excitação de 550 nm) ou 600-800 nm (para excitação de 580 nm).
5. Análise SDS-PAGE do PBS
- O buffer troca as amostras concentradas de PBS em 0,75 M de fosfato K com 50 mM de tampão Tris (pH 8.0) em unidades de filtro centrífugo de membrana (corte de peso molecular de 3K, ver Tabela de Materiais).
- Misture 50 μL de solução PBS com 10 μL de tampão de carregamento SDS 6x [300 mM Tris pH 6.8, 12% (p/v) Sulfato de dodecil de sódio, 0,06% (w/v) azul bromfenol, 50% (v/v) Glicerol, 6% (v/v) β-Mercaptoethanol] (ver Tabela de Materiais) em um tubo de microcentrifusagem e incubar a 95 °C por 10 minutos em um bloco de calor.
- Separe as amostras de proteínas por SDS-PAGE (8%-20% (w/v) gel de poliacrilamida) e continue com a coloração de zinco e Coomassie. O procedimento detalhado foi descrito em Reference8.
- Para coloração de zinco, incubar o gel em solução ZnSO4 de 50 mM por 10 min a temperatura ambiente, lavar o gel com água destilada e visualizar fluorescência induzida por zinco sob irradiação UV (312 nm).
- Para a coloração azul Coomassie, incubar o gel em coomassie blue tampão de coloração [0,25% (w/v) de Coomassie R-250, 10% (v/v) de ácido acético, 50% (v/v) de Metanol, ver Tabela de Materiais] por 1 h à temperatura ambiente. Lave o gel com água destilada duas vezes para remover o tampão de coloração residual e incubar o gel com tampão de desestabilização [10% (v/v) ácido acético, 30% (v/v) metanol] em um agitador de balanço (40 rpm) à temperatura ambiente durante a noite. Visualize o gel totalmente detido com uma câmera digital ou um scanner.
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Representative Results
As células Syn6803 e JSC-1 foram cultivadas em frascos cônicos com agitação constante em meio B-HEPES a 30 °C, sob uma luz branca led (50 fótons de μmol m-2s-1) em uma câmara de crescimento preenchida com 1% (v/v) CO2. Na fase de crescimento exponencial (OD750 = ~0,5), as células foram subculturadas em meio fresco com densidade óptica final OD750 = ~0,2. Após atingir a fase de crescimento exponencial tardio (OD750 = 0,6-0,8), as culturas foram coletadas e centrifadas (10.000 x g à temperatura ambiente por 20 min). O supernante foi descartado, e as pelotas de célula foram armazenadas a -80 °C até que o próximo passo estivesse disponível.
Para quebrar as células, as células foram descongeladas pela primeira vez à temperatura ambiente. As células foram interrompidas por contas com contas de vidro de 0,1 mm dentro do tampão de fosfato K de 0,75 M. A lise celular completa mostra o sobrenatante na cor azul-verde escuro antes da centrifugação (Figura 1B). Após a solubilização por Tritão X-100 e centrífuga para remover as membranas insolúveis e detritos celulares, o supernante foi carregado no topo da solução de gradiente de sacarose em um tubo de centrífugas de 40 mL (Figura 1C). Após 18 h de centrifugação, o PBS intacto mudou-se para o centro do gradiente como uma faixa azul clara para Syn6803 e uma banda roxa para JSC-1. A diferença de cor resulta das diferentes composições de PBS em Syn6803 e JSC-1. O PBS de Syn6803 carrega ficocyanin35, enquanto o PBS de JSC-1 carrega ficocyanina e ficoertrorina7. O resultado da separação de densidade de sacarose-gradiente da PBS isolada mostra várias frações de ficobiliproteínas dissociadas, e a fração mais baixa representa o PBS intacto (Figura 1D).
Os espectros de absorção das diferentes frações de PBS isolados de JSC-1 e Syn6803 são comparados na Figura 2A. O procedimento detalhado dos espectros de absorção foi descrito nos artigos7,8. Os espectros de absorção do PBS dissociado e do PBS intacto de JSC-1 e Syn6803 têm o mesmo pico de 622 nm, correspondente à ficocitanina. E o pico de absorção de ficoerythrin a 571 nm é encontrado tanto em PBS dissociado quanto em PBS intacto de JSC-1. A alofiliação mostra um pequeno pico com um ombro a 670 nm nas frações intactas de PBS de JSC-1 e Syn6803. As diferenças espectrais indicam que a relação haste (ficocyanina) ao núcleo (alofiliaanina) é maior na PBS dissociada do que na fração de PBS intacta, uma vez que as propriedades espectrais das ficobiliproteínas foram determinadas anteriormente5. Uma vez que o PBS dissociado e as frações intactas de PBS mostram espectros de absorção semelhantes e características de emissão fluorescente à temperatura ambiente, a espectroscopia de fluorescência de 77K foi então usada para analisar as diferentes frações isoladas do gradiente de sacarose. Os espectros de emissão fluorescente de 77K do PBS dissociado e as frações intactas do PBS foram animados por 580 nm. Os espectros de emissões do PBS dissociado têm um forte pico de ~650 nm em Syn6803 e JSC-1, representando a emissão da ficocinina (Figura 2B). Os espectros de emissões fluorescentes do PBS intacto mostram dois picos máximos de emissão fluorescente: o fraco a 651 nm e o forte a 684 nm, revelando que a energia colhida pela ficocinina foi transferida eficientemente para afilofilia e emissores terminais (ApcD e ApcE) no core9 (Figura 2C). Essas características demonstram que as frações mais baixas do gradiente de sacarose contêm PBS intacto.
O PBS dissociado e o PBS intacto foram separados por SDS-PAGE em um gel de gradiente linear de poliacrilamida SDS de 8%-20% (w/v). As subunidades α e β de ficocyanina e alofilia foram visíveis no gel sem coloração (Figura 3A). O gel foi posteriormente manchado com 10 mM ZnSO4 por 10 min. As ficobiliproteínas contendo cromoforeiro foram observadas pela coloração de zinco durante a irradiação UV8. As subunidades de ficobiliproteína (14-21 kDa) são fortemente fluorescentes, e a ApcE (seta) mostrou fluorescência fraca (Figura 3B). Além disso, a coloração azul coomassie mostra a composição proteica diferente entre as frações dissociadas de PBS e as frações intactas de PBS (Figura 3C). As frações superiores contêm outras proteínas solúveis em água não-PBS, pois mais proteínas são manchadas do que em frações intactas de PBS. O PBS intacto em Syn6803 mostra uma banda ApcE proeminente (seta) sem as frações dissociadas pbs (Figura 3C).
A razão de volume entre o extrato pbs e o gradiente de sacarose é fundamental para a obtenção de faixas afiadas no gradiente de sacarose após a ultracentrifugação. A proporção sugerida de extratos de PBS solubilizados para solução gradiente de sacarose é de 1:10. Com base na experiência anterior, fazer o gradiente de sacarose em tubos de centrífugas de 40 mL mostra uma resolução maior do que o gradiente de sacarose feito nos tubos de 13 mL. O gradiente de sacarose descontínuo difusa ao longo do tempo por causa da vibração no banco. Portanto, o tubo de centrífugas de 13 mL pode ser uma boa escolha para manusear muitas amostras simultaneamente. Para demonstrar isso, os gradientes de sacarose em tubos de centrífugas de 13 mL nas proporções como 1:3 e 1:10 foram preparados entre os extratos brutos de Syn6803 ou JSC-1 à solução de gradiente de sacarose (Figura 4A). Após a ultracentrifugação, o gradiente de sacarose preparado na razão 1:3 exibe faixas mais largas do que o gradiente feito na razão 1:10 (Figura 4B). As frações mais baixas de cada gradiente contêm PBS intacto, confirmada por espectroscopia de emissão fluorescente de 77K.
Figura 1: Interrupção das células Syn6803 e JSC-1 e ultracentrifugação de gradiente de sacarose. (A) Ilustração esquemática da preparação do gradiente de sacarose descontinuado em um tubo centrífuga de 40 mL. (B) Os frascos de tampa de parafuso foram preenchidos com 0,4 g de contas de vidro e 1 mL de suspensão celular de Syn6803 ou JSC-1, e então as células foram líficas por um batedor de contas. (C) O extrato solubilizado Tritão X-100 foi colocado em camadas no topo de um gradiente de densidade de sacarose. (D) Após a centrifugação por 18 h, as frações pbs foram visualizadas como faixas azuis claras no gradiente em Syn6803 e como bandas roxas em JSC-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Caracterização espectroscópica de diferentes frações de gradientes de sacarose. (A) Espectros de absorção de frações de PBS dissociadas e PBS intactas de JSC-1 e Syn6803. Os espectros de emissão de fluorescência foram medidos em 77 K usando o comprimento de onda de excitação a 580 nm para (B) as frações de PBS dissociadas e (C) as frações intactas de PBS de Syn6803 e JSC-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise SDS-PAGE de PBS isolado de gradientes de sacarose. As frações de PBS dissociadas e intactas foram quantificadas (20 μg de proteína por pista) e carregadas em um gel de poliacrilamida gradiente de 8%-20% (w/v). Após eletroforese de gel, o gel foi visualizado por manchas de zinco e coloração de Coomassie Blue, posteriormente. (A) A cor das ficobiliproteínas é visível no gel sem coloração. (B) O gel manchado de zinco mostra a fluorescência das ficobiliproteínas. (C) O gel manchado com Coomassie Blue mostra ficobiliproteínas e outras proteínas. As setas indicam as posições do ApcE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O gradiente de sacarose feito em tubos de centrífugas de 13 mL. As relações entre o extrato bruto e a solução gradiente de sacarose estão marcadas na parte superior das imagens. (A) O supernatante de Extratos solubilizados Tritão X-100 de Syn6803 e JSC-1 foi sobreposto sobre gradientes de densidade de sacarose com diferentes proporções dos extratos solubilizados à solução gradiente de sacarose. (B) Após centrifugação por 18h, as frações PBS em Syn6803 e JSC-1 foram observadas nos gradientes de sacarose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve um método simples e padrão para isolar PBS intacto em dois tipos de cianobactérias, modelo unicelular Syn6803 e não-modelo filamentous JSC-1. As etapas críticas do protocolo são a homogeneização celular e a ultracentrifugação em um gradiente de densidade descontínua de sacarose. Geralmente, a interrupção das células filamentosas é mais complicada do que as unicelulares. O aumento da quantidade do material inicial (o peso úmido da pelota celular) e a repetição da batida de contas foram úteis para aumentar o rendimento de PBS de células cianobacterianas filamentosas. Para o cianobacterium filamentoso, JSC-1, três vezes mais células foram usadas do que a unicelular, Syn6803. Além disso, para quebrar completamente o cianobacterium filamentoso, é necessário bater mais vezes do que as cianobactérias unicelulares para observar a cor azul-roxa escura no tampão de extração.
A duração do espancamento de contas não é sugerida para exceder 30 s, uma vez que as amostras são aquecidas durante cada ciclo de batida de contas. Recomenda-se que os tubos esfriem à temperatura ambiente em um banco (ou em um banho de água) entre cada ciclo, pois o PBS intacto é prontamente dissociado a baixa temperatura25. Portanto, todos os procedimentos neste protocolo são sugeridos para serem realizados à temperatura ambiente. Muitos artigos de pesquisa descreveram diferentes métodos de interrupção celular, incluindo um homogeneizador de alta pressão (French-Press) ou um sonicator6,8,20. Um homogeneizador de fábrica de contas é sugerido porque é mais barato, mais seguro, mais fácil de manusear, mais rápido, mais acessível e mais eficiente no processamento de várias amostras simultaneamente.
Ficobilóides mostram três formas diferentes, hemidiscoidal, em forma de feixe e em forma de vara5. Os ficobilóides intactos isolados na Figura 2 pertencem à forma hemidiscoidal, como discutido em publicações anteriores7,13,36. A fração superior que representa pbs dissociado, no entanto, também pode conter PBS em forma de haste. Syn6803 e JSC-1 codificam um linker específico de rod-core CpcL, o que sugere a presença de PBS em forma de haste, além do PBS6,37 hemidiscoidal. O PBS em forma de rod foi identificado diretamente no Syn6803, mas não no JSC-17,13,37. Por outro lado, o JSC-1 remodela seu PBS realizando aclimatação cromática tipo III em luz verde/vermelha e fotoacclimação de luz vermelha em vermelho/vermelho luz6,7. Todas essas diversidades indicam que pode haver outros tipos de PBS nos gradientes de sacarose, além da menor fração de PBS hemidiscoidal intacta. Por exemplo, dois tipos de PBS estão presentes ao mesmo tempo em que o Synechococcus sp. PCC 7335 e JSC-1 se aclimatam à luz vermelha distante8,13. Sugere-se que a pessoa que isolou a PBS de uma cepa cianobacteriana não caracterizada deve ser mais cautelosa ao analisar cada fração no gradiente de sacarose para identificar quaisquer tipos possíveis de PBS.
No geral, este protocolo fornece um método barato, simples e rápido para interrupção celular. Também foi demonstrado que este método é confiável para isolar a PBS de diferentes cianobactérias com diferentes tipos de células e composições de PBS.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesse concorrente.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University pelo uso conveniente da ultracentrifuge. As cepas cianobacterianas Synechocystis sp. PCC 6803 e Leptolyngbya sp. JSC-1 foram doadas pelo Dr. Chu, Hsiu-An na Academia Sinica, Taiwan, e pelo Dr. Donald A. Bryant da Universidade Estadual da Pensilvânia, EUA, respectivamente. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia (Taiwan) (109-2636-B-002-013- e 110-2628-B-002-065-) e pelo Programa Acadêmico Jovem do Ministério da Educação (Taiwan) Yushan Young Scholar (109V1102 e 110V1102).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectroscopy. |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
References
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