Summary
L'attuale protocollo descrive in dettaglio l'isolamento dei ficobilisomi dai cianobatteri mediante centrifugazione attraverso un gradiente di densità discontinuo di saccarosio. Le frazioni di ficobilisomi intatti sono confermate dallo spettro di emissione fluorescente 77K e dall'analisi SDS-PAGE. Le frazioni ficobilisomiali risultanti sono adatte per la colorazione negativa del TEM e l'analisi della spettrometria di massa.
Abstract
Nei cianobatteri, il ficobilisoma è un complesso proteico antenna vitale che raccoglie la luce e trasferisce energia al fotosistema I e II per la fotochimica. Studiare la struttura e la composizione del ficobilisoma è di grande interesse per gli scienziati perché rivela l'evoluzione e la divergenza della fotosintesi nei cianobatteri. Questo protocollo fornisce un metodo dettagliato e ottimizzato per rompere le cellule cianobatteriche a basso costo da un battitore di perline in modo efficiente. Il ficobilisoma intatto può quindi essere isolato dall'estratto cellulare mediante ultracentrifugazione a gradiente di saccarosio. Questo metodo ha dimostrato di essere adatto sia per cianobatteri modello che non modello con diversi tipi di cellule. Viene inoltre fornita una procedura passo-passo per confermare l'integrità e la proprietà delle ficobiliproteine mediante spettroscopia di fluorescenza 77K e SDS-PAGE colorato da solfato di zinco e Coomassie Blue. Il ficobilisoma isolato può anche essere sottoposto ad ulteriori analisi strutturali e compositive. Nel complesso, questo protocollo fornisce un'utile guida di partenza che consente ai ricercatori che non hanno familiarità con i cianobatteri di isolare e caratterizzare rapidamente il ficobilisoma intatto.
Introduction
Il ficobilisoma (PBS) è un enorme complesso pigmento-proteina solubile in acqua che si attacca al lato citoplasmatico dei fotosistemi nelle membrane tilacoidi dei cianobatteri1. La PBS è composta principalmente da ficobiliproteine colorate e proteine linker incolori1,2. Le ficobiliproteine possono essere suddivise in quattro gruppi principali: ficoeritrina, ficoeritrocianina, ficocianina e alloficocianina3. I quattro gruppi principali assorbono diverse lunghezze d'onda dell'energia luminosa nell'intervallo 490-650 nm, che le clorofille hanno assorbito in modo inefficiente3. Il PBS può fungere da antenna per la raccolta della luce per la raccolta dell'energia luminosa e la consegna al fotosistema II e I4.
La struttura e la composizione del PBS variano da specie a specie. Collettivamente, tre forme di ficobilisoma (emidiscodiale, a forma di fascio e a forma di bastoncello) sono state identificate in diverse specie cianobatteriche5. Anche nella stessa specie, la composizione del PBS cambia in risposta all'ambiente, come la qualità della luce e l'esaurimento dei nutrienti6,7,8,9,10,11. Pertanto, la procedura sperimentale per isolare PBS dai cianobatteri è stata determinante nello studio di PBS12. Nel corso di diversi decenni, molti protocolli diversi hanno isolato PBS e analizzato la sua struttura, composizione e funzione6,7,8,12,13,14,15,16,17. L'ampia varietà di metodi per l'isolamento PBS fornisce infatti flessibilità nell'isolare il complesso in diverse specie con diversi reagenti e strumenti. Tuttavia, rende anche più difficile la scelta di un protocollo adatto per gli scienziati che non hanno familiarità con cianobatteri e PBS. Pertanto, in questo lavoro viene sviluppato un protocollo generalizzato e diretto per coloro che sono interessati ad avviare l'isolamento PBS dai cianobatteri.
I metodi per isolare PBS dalle pubblicazioni precedenti sono riassunti qui. Poiché PBS è un complesso proteico solubile in acqua ed è facilmente dissociato, è necessario un tampone fosfato ad alta forza ionica per stabilizzare PBS durante l'estrazione18. Diversi articoli di ricerca che descrivono i metodi per l'isolamento della PBS dal cianobatterio sono stati pubblicati in passato. La maggior parte dei metodi richiede un'alta concentrazione di tampone fosfato8,14,15,18,19. Tuttavia, le procedure per l'interruzione meccanica delle cellule variano, come l'estrazione assistita da perle di vetro, la sonicazione20 e la stampa francese6,8,14. Diverse ficobiliproteine possono essere ottenute per precipitazione con solfato di ammonio20 e purificate da HPLC21 o da una colonna cromatografica22. D'altra parte, il PBS intatto può essere facilmente isolato dall'ultracentrifugazione del gradiente di densità del saccarosio6,8,15.
In questo protocollo, un cianobatterio modello e un cianobatterio non modello sono stati utilizzati come materiali per l'isolamento PBS. Sono modello unicellulare tollerante al glucosio Synechocystis sp. PCC 6803 (di seguito Syn6803) e Leptolyngbya sp. filamentosa non modello JSC-1 (di seguito JSC-1), rispettivamente7,23,24. Il protocollo inizia con l'interruzione dei cianobatteri unicellulari e filamentosi in un tampone fosfato ad alta resistenza ionica. Dopo la lisi, i supernatanti vengono raccolti per centrifugazione e quindi trattati con un detergente non ionico (Triton X-100) per solubilizzare le proteine idrosolubili dalle membrane tilacoidi. Le proteine idrosolubili totali vengono applicate a un gradiente di densità discontinuo di saccarosio per frazionare il PBS. Il gradiente discontinuo di saccarosio in questo protocollo è costituito da quattro soluzioni di saccarosio e suddivide il PBS intatto nelle frazioni più basse dello strato di saccarosio25. L'integrità del PBS può essere analizzata mediante SDS-PAGE, colorazione dello zinco e spettroscopia di fluorescenza 77K6,7,8,26. Questo metodo è adatto per gli scienziati che mirano a isolare PBS intatto dai cianobatteri e studiare le sue proprietà spettrali, strutturali e compositive.
Ci sono diversi vantaggi di questo protocollo. (1) Questo metodo è standardizzato e può essere utilizzato per isolare PBS intatto da cianobatteri sia unicellulari che filamentosi. La maggior parte degli articoli descrive il metodo che si applicava in entrambi i tipi di cianobatteri4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Questo metodo viene eseguito a temperatura ambiente, poiché PBS si dissocia a bassa temperatura19,27. (3) Questo metodo descrive l'uso di un battitore di perline per interrompere le cellule; pertanto, è più economico e più sicuro della stampa francese ad alta pressione e possibili danni all'udito da sonicatore in altri metodi8,13,14,20. (4) Questo metodo isola il PBS intatto mediante ultracentrizzazione a gradiente di saccarosio. In questo modo, PBS intatto con dimensioni diverse e PBS parzialmente dissociato può essere separato in base alla concentrazione di saccarosio.
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Protocol
Il Synechocystis sp. PCC 6803, il ceppo modello tollerante al glucosio, è stato ottenuto dal Dr. Chu, Hsiu-An presso Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, il filamentoso non modello, è stato ottenuto dal Dr. Donald A. Bryant della Pennsylvania State University, USA.
1. Coltura cellulare e raccolta
- Inoculare le celle Syn6803 o JSC-1 utilizzando un anello di inoculazione metallico in un pallone conico da 100 ml contenente 50 mL di B-HEPES medium28. Coltura le cellule a 30 °C sotto 50 μmol fotoni m-2 s-1 (LED a luce bianca) in 1% (v/v) di CO2 con agitazione costante da parte di un agitatore magnetico (120 rpm) fino a quando la coltura raggiunge la fase di crescita media-esponenziale (OD750 = 0,6-0,8).
NOTA: Raccogliere la coltura cellulare quando la densità ottica della coltura a 750 nm (OD750) raggiunge 0,6-0,8 trasferendola in un nuovo pallone. La densità ottica è stata abitualmente utilizzata per stimare la densità delle cellule microbiche in colture liquide29. Le lunghezze d'onda da 720-750 nm sono state utilizzate in vari studi per misurare la crescita cianobatterica30,31,32. In questo protocollo, OD750 viene utilizzato perché JSC-1 può produrre pigmenti che assorbono la luce rossa lontana7. In alternativa, la concentrazione di clorofilla è stata utilizzata anche per misurare la crescita dei cianobatteri33. - Trasferire la coltura cellulare (OD750 ~ 0,8) in un matraccio conico da 1 L e diluirla a OD750 = 0,2 in 500 mL di terreno B-HEPES. Coltivare la coltura fino alla fase di crescita esponenziale tardiva (OD750 = 0,8-1,0) nella stessa condizione sopra menzionata (fase 1.1) e quindi raccogliere la coltura mediante centrifugazione.
- Centrifugare la coltura a 10.000 x g per 20 minuti a temperatura ambiente ed eliminare completamente il surnatante.
NOTA: I pellet di celle possono essere conservati a -80 °C per un massimo di 6 mesi.
2. Lisi cellulare
- Sospendere i pellet cellulari e lavare due volte con tampone K-fosfato da 0,75 M, pH 7.
NOTA: Per produrre un tampone K-fosfato da 0,75 M a pH 7, preparare separatamente 1,5 M di K2HPO4 e 1,5 M di KH2PO4. Mescolare 615 mL di 1,5 M K2HPO4 e 385 ml di 1,5M KH2PO4 per ottenere 1,5 M di tampone K-fosfato a pH 7. Basta diluirlo con la stessa quantità di ddH2O per ottenere un tampone K-fosfato da 0,75 M a pH 7. - Pellet le celle in tubi centrifuga da 50 mL mediante centrifugazione a 10.000 x g per 20 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospese le cellule con un tampone K-fosfato da 0,75 M. Misurare il peso umido del pellet con una bilancia elettronica e risospesare 1 g di peso umido del pellet in 5 mL del tampone.
NOTA: Il peso umido di un pellet è stato misurato sottraendo il peso di un tubo centrifugo vuoto dal peso del tubo della centrifuga contenente il pellet cellulare. - Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare e 0,4-0,6 g di perle di vetro da 0,1 mm (vedere Tabella dei materiali) in un flaconcino con tappo a vite da 2 mL.
- Rompere le celle per 30 s da un battitore di perline (vedi Tabella dei materiali). Lasciare raffreddare i tubi a bagnomaria a temperatura ambiente per 2 minuti e ripetere il ciclo di rottura 5 volte.
- Dopo la lisi, centrifugare i flaconcini a 500 x g per 10 s a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante con una pipetta in un tubo centrifugo da 15 ml. Lavare le perline con 0,5 mL di tampone K-fosfato da 0,75 M una volta, quindi trasferirle nello stesso tubo della centrifuga.
- Aggiungere Triton X-100 (2% p/v, concentrazione finale) alla sospensione cellulare lisata e incubare su uno shaker a dondolo (40 rpm) a temperatura ambiente fino a quando la soluzione diventa omogenea (~20 min).
- Centrifugare i tubi a 17.210 g per 20 minuti per rimuovere le celle intatte e i detriti cellulari di grandi dimensioni. Conservare il surnatante senza lo strato superiore di micella Triton a temperatura ambiente per un massimo di 1 ora.
NOTA: il surnatante contiene due strati separati. Lo strato idrofobico superiore di Triton X contiene proteine leganti la clorofilla e ficobilisomi idrofobici a forma di bastoncello6. Lo strato acquoso inferiore contiene PBS solubile in acqua.
3. Preparazione dei tamponi gradienti di saccarosio e isolamento PBS
- Effettuare quattro concentrazioni di saccarosio (2,0 M, 1,0 M, 0,75 M e 0,5 M) in tampone K-fosfato da 0,75 M a pH 7.
NOTA: Si consiglia di utilizzare un tampone K-fosfato da 1,5 M a pH 7 per preparare il gradiente di saccarosio perché l'aggiunta di saccarosio diluisce la concentrazione di tampone K-fosfato. Dopo che il saccarosio è completamente disciolto, aggiungere ddH2O per regolare la concentrazione a 0,75 M, pH 7. - Posizionare 2,8 mL di tampone di saccarosio da 2,0 M sul fondo del tubo della centrifuga da 40 mL e sovrapporre con tre strati di soluzioni di saccarosio (8 mL di 1,0 M; 12 mL di 0,75 M e 11 mL di 0,5 M per tubo centrifugo da 40 mL), e infine PBS contenente la frazione surnatante (3,0 mL) (Figura 1A).
NOTA: Aggiungere con cautela la soluzione di saccarosio e lasciare che il saccarosio goccioli molto lentamente all'interno del tubo. Tenere la punta della pipetta appena sopra la superficie della soluzione nel tubo durante il caricamento della soluzione. Gli strati di saccarosio possono essere osservati quando sono stratificati lentamente. - Centrifugare i gradienti risultanti a 125.800 x g per ~16h-20 h a 25 °C.NOTA: per questo passaggio è necessaria un'ultracentrifuga (vedi Tabella dei materiali).
- Dopo l'ultracentocuzione, condensare il PBS frazionato e le ficobiliproteine tra gli strati. Bande blu in Syn6803 (bande viola mostrate in JSC-1) sono state osservate nelle interfacce (Figura 1D).
- Raccogliere lentamente le frazioni con una pipetta dalla parte superiore dei gradienti di saccarosio. Rimuovere il saccarosio concentrandosi ripetutamente (3.500 x g per 20 min) e diluendo le frazioni con tampone K-fosfato da 0,75 M in unità filtranti centrifughe a membrana (cut-off a peso molecolare 10 K, vedere Tabella dei materiali).
4. Misurazione della fluorescenza PBS a 77K
NOTA: Un fluorimetro dotato di un contenitore di azoto liquido (vedi Tabella dei materiali) viene utilizzato per misurare gli spettri di fluorescenza a 77K.
- Diluire il campione PBS concentrato con tampone K-fosfato da 0,75 M per ottenere almeno 500 μL.
NOTA: Le concentrazioni di ficocianina dei campioni erano ~4,2 μg mL-1 in base alla formula: (OD615 0,474 x OD652)/5,34 [mg/mL]34. - Aggiungere 500 μL del campione PBS a un tubo di vetro trasparente e congelare il tubo in azoto liquido fino a quando non è completamente congelato. Spostare il tubo congelato in un contenitore Dewar trasparente (vedi Tabella dei materiali) preriempito con azoto liquido.
NOTA: Il diametro interno del tubo di vetro è di 3 mm in questo protocollo. Sono stati utilizzati sottili tubi di vetro per ridurre al minimo il riassorbimento dell'emissione di lunghezza d'onda corta nel campione. - Scegli le lunghezze d'onda di eccitazione per la ficoeritrina e la ficocianina rispettivamente a 550 nm e 580 nm.
NOTA: le emissioni di fluorescenza sono state registrate da 560-800 nm (per l'eccitazione a 550 nm) o 600-800 nm (per l'eccitazione a 580 nm).
5. Analisi SDS-PAGE di PBS
- Scambio tampone dei campioni PBS concentrati in 0,75 M di K-fosfato con 50 mM di tampone Tris (pH 8,0) in unità filtranti centrifughe a membrana (cut-off a peso molecolare 3K, vedi Tabella dei materiali).
- Mescolare 50 μL di soluzione PBS con 10 μL di 6x tampone di carico SDS [300 mM Tris pH 6,8, 12% (p/v) sodio dodecil solfato, 0,06% (p/v) blu bromfenolo, 50% (v/v) glicerolo, 6% (v/v) β-mercaptoetanolo] (vedere Tabella dei materiali) in un tubo di microrifrifuga e incubare a 95 °C per 10 minuti in un blocco termico.
- Separare i campioni proteici con SDS-PAGE (8%-20% (p/v) gel di poliacrilammide) e continuare con la colorazione di zinco e Coomassie. La procedura dettagliata è stata descritta in Reference8.
- Per la colorazione dello zinco, incubare il gel in soluzione ZnSO4 da 50 mM per 10 minuti a temperatura ambiente, lavare il gel con acqua distillata e visualizzare la fluorescenza indotta dallo zinco sotto irradiazione UV (312 nm).
- Per la colorazione blu Coomassie, incubare il gel nel tampone colorante Coomassie Blue [0,25% (p/v) di Coomassie R-250, 10% (v/v) di acido acetico, 50% (v/v) di metanolo, vedere Tabella dei materiali] per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare il gel con acqua distillata due volte per rimuovere il tampone di colorazione residuo e incubare il gel con tampone di destaining [10% (v/v) acido acetico, 30% (v/v) metanolo] su uno shaker a dondolo (40 rpm) a temperatura ambiente durante la notte. Visualizza il gel completamente decorticato con una fotocamera digitale o uno scanner.
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Representative Results
Le cellule Syn6803 e JSC-1 sono state coltivate in palloni conici con agitazione costante in mezzo B-HEPES a 30 °C, sotto una luce bianca a LED (50 fotoni μmol m-2s-1) in una camera di crescita riempita con l'1% (v/v) di CO2. Nella fase di crescita esponenziale (OD750 = ~0,5), le cellule sono state sottocoltate in mezzo fresco con una densità ottica finale OD750 = ~0,2. Dopo aver raggiunto la fase di crescita esponenziale tardiva (OD750 = 0,6-0,8), le colture sono state raccolte e centrifugate (10.000 x g a temperatura ambiente per 20 min). Il surnatante è stato scartato e i pellet di cellule sono stati conservati a -80 °C fino a quando non è stato disponibile il passaggio successivo.
Per rompere le cellule, le cellule sono state prima scongelate a temperatura ambiente. Le cellule sono state interrotte battendo le perline con perle di vetro da 0,1 mm all'interno del tampone K-fosfato da 0,75 M. La lisi cellulare completa mostra il surnatante in colore blu-verde scuro prima della centrifugazione (Figura 1B). Dopo la solubilizzazione mediante Triton X-100 e la centrifugazione per rimuovere le membrane insolubili e i detriti cellulari, il surnatante è stato caricato sulla parte superiore della soluzione di gradiente di saccarosio in un tubo di centrifuga da 40 ml (Figura 1C). Dopo 18 ore di centrifugazione, il PBS intatto si è spostato al centro del gradiente come una banda blu chiaro per Syn6803 e una banda viola per JSC-1. La differenza nel loro colore deriva dalle diverse composizioni di PBS in Syn6803 e JSC-1. Il PBS di Syn6803 trasporta ficocianina35, mentre il PBS di JSC-1 trasporta ficocianina e ficoeritrina7. Il risultato della separazione densità-gradiente di saccarosio di PBS isolato mostra diverse frazioni di ficobiliproteine dissociate e la frazione più bassa rappresenta il PBS intatto (Figura 1D).
Gli spettri di assorbimento delle diverse frazioni di PBS isolate da JSC-1 e Syn6803 sono confrontati nella Figura 2A. La procedura dettagliata degli spettri di assorbimento è stata descritta negli articoli 7,8. Gli spettri di assorbimento del PBS dissociato e del PBS intatto di JSC-1 e Syn6803 hanno lo stesso picco a 622 nm, corrispondente alla ficocianina. E il picco di assorbimento della ficoeritrina a 571 nm si trova sia nel PBS dissociato che nel PBS intatto di JSC-1. L'allococianina mostra un picco minore con una spalla a 670 nm nelle frazioni PBS intatte di JSC-1 e Syn6803. Le differenze spettrali indicano che il rapporto tra bastoncello (ficocianina) e nucleo (alloficocianina) è più alto nella PBS dissociata che nella frazione PBS intatta, poiché le proprietà spettrali delle ficobiliproteine sono state determinate in precedenza5. Poiché il PBS dissociato e le frazioni PBS intatte mostrano spettri di assorbimento e caratteristiche di emissione fluorescenti simili a temperatura ambiente, la spettroscopia di fluorescenza 77K è stata quindi utilizzata per analizzare le diverse frazioni isolate dal gradiente di saccarosio. Gli spettri di emissione fluorescente 77K del PBS dissociato e delle frazioni PBS intatte sono stati eccitati di 580 nm. Gli spettri di emissione del PBS dissociato hanno un forte picco a ~ 650 nm in Syn6803 e JSC-1, che rappresenta l'emissione di ficocianine (Figura 2B). Gli spettri di emissione fluorescente del PBS intatto mostrano due picchi massimi di emissione fluorescente: quello debole a 651 nm e quello forte a 684 nm, rivelando che l'energia raccolta dalla ficocianina è stata trasferita in modo efficiente all'allococianina e agli emettitori terminali (ApcD e ApcE) nel nucleo9 (Figura 2C). Queste caratteristiche dimostrano che le frazioni più basse nel gradiente di saccarosio contengono PBS intatto.
Il PBS dissociato e il PBS intatto sono stati separati da SDS-PAGE su un gel gradiente lineare di poliacrilammide SDS dell'8%-20% (p/v). Le subunità α e β di ficocianina e alloficocianina erano visibili sul gel senza macchia (Figura 3A). Il gel è stato successivamente colorato con 10 mM ZnSO4 per 10 minuti. Le ficobiliproteine contenenti cromoforo sono state osservate dalla colorazione dello zinco durante l'irradiazione UV8. Le subunità delle ficobiliproteine (14-21 kDa) sono fortemente fluorescenti e l'ApcE (freccia) ha mostrato una debole fluorescenza (Figura 3B). Inoltre, la colorazione Coomassie Blue mostra la diversa composizione proteica tra le frazioni PBS dissociate e le frazioni PBS intatte (Figura 3C). Le frazioni superiori contengono altre proteine idrosolubili non PBS poiché vengono colorate più proteine rispetto alle frazioni PBS intatte. Il PBS intatto in Syn6803 mostra una banda ApcE prominente (freccia) priva delle frazioni PBS dissociate (Figura 3C).
Il rapporto di volume tra l'estratto PBS e il gradiente di saccarosio è fondamentale per ottenere bande taglienti nel gradiente di saccarosio dopo l'ultracentrifugazione. Il rapporto suggerito tra estratti di PBS solubilizzati e soluzione di gradiente di saccarosio è 1:10. Sulla base dell'esperienza precedente, la realizzazione del gradiente di saccarosio in tubi di centrifuga da 40 mL mostra una risoluzione più elevata rispetto al gradiente di saccarosio prodotto nei tubi da 13 mL. Il gradiente discontinuo di saccarosio si diffonde nel tempo a causa delle vibrazioni sul banco. Pertanto, il tubo della centrifuga da 13 ml può essere una buona scelta per la gestione di molti campioni contemporaneamente. Per dimostrarlo, i gradienti di saccarosio in tubi centrifughi da 13 mL nei rapporti 1:3 e 1:10 sono stati preparati tra gli estratti grezzi di Syn6803 o JSC-1 alla soluzione di gradiente di saccarosio (Figura 4A). Dopo l'ultracentrifugazione, il gradiente di saccarosio preparato in rapporto 1:3 mostra bande più larghe rispetto al gradiente realizzato con rapporto 1:10 (Figura 4B). Le frazioni più basse di ciascun gradiente contengono PBS intatto, confermato dalla spettroscopia di emissione fluorescente 77K.
Figura 1: Interruzione delle cellule Syn6803 e JSC-1 e ultracentrifugazione del gradiente di saccarosio. (A) Illustrazione schematica della preparazione del gradiente di saccarosio fuori produzione in un tubo di centrifuga da 40 mL. (B) I flaconcini con tappo a vite sono stati riempiti con 0,4 g di perle di vetro e 1 mL di sospensione cellulare di Syn6803 o JSC-1, e quindi le cellule sono state lisate da un battitore di perline. (C) Il surnatante dell'estratto solubilizzato di Triton X-100 è stato stratificato sulla parte superiore di un gradiente di densità di saccarosio. (D) Dopo la centrifugazione per 18 ore, le frazioni PBS sono state visualizzate come bande blu chiare nel gradiente in Syn6803 e come bande viola in JSC-1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Caratterizzazione spettroscopica di diverse frazioni di gradienti di saccarosio. (A) Spettri di assorbimento di PBS dissociate e frazioni PBS intatte da JSC-1 e Syn6803. Gli spettri di emissione di fluorescenza sono stati misurati a 77 K utilizzando la lunghezza d'onda di eccitazione a 580 nm per (B) le frazioni PBS dissociate e (C) le frazioni PBS intatte di Syn6803 e JSC-1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi SDS-PAGE di PBS isolato da gradienti di saccarosio. Le frazioni PBS dissociate e intatte sono state quantificate (20 μg di proteine per corsia) e caricate su un gel di poliacrilammide gradiente dell'8%-20% (p/v). Dopo l'elettroforesi su gel, il gel è stato visualizzato mediante colorazione di zinco e colorazione Coomassie Blue, successivamente. (A) Il colore delle ficobiliproteine è visibile sul gel senza macchie. (B) Il gel colorato di zinco mostra la fluorescenza delle ficobiliproteine. (C) Il gel colorato con Coomassie Blue mostra ficobiliproteine e altre proteine. Le frecce indicano le posizioni dell'ApcE. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il gradiente di saccarosio realizzato in tubi centrifughi da 13 mL. I rapporti tra l'estratto grezzo e la soluzione di gradiente di saccarosio sono contrassegnati nella parte superiore delle immagini. (A) Il surnatante degli estratti solubilizzati Triton X-100 di Syn6803 e JSC-1 è stato stratificato su gradienti di densità di saccarosio con diversi rapporti tra gli estratti solubilizzati e la soluzione di gradiente di saccarosio. (B) Dopo centrifugazione per 18 ore, le frazioni PBS in Syn6803 e JSC-1 sono state osservate nei gradienti di saccarosio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un metodo semplice e standard per isolare PBS intatto in due tipi di cianobatteri, il modello unicellulare Syn6803 e il filamentoso non modello JSC-1. Le fasi critiche del protocollo sono l'omogeneizzazione cellulare e l'ultracentrifugazione su un gradiente di densità discontinuo di saccarosio. Generalmente, la distruzione delle cellule filamentose è più complicata di quelle unicellulari. L'aumento della quantità di materiale di partenza (il peso umido del pellet cellulare) e la ripetizione del battito delle perline sono stati utili per aumentare la resa di PBS da cellule cianobatteriche filamentose. Per il cianobatterio filamentoso, JSC-1, sono state utilizzate tre volte più cellule di quella unicellulare, Syn6803. Inoltre, per rompere completamente il cianobatterio filamentoso, richiede il battito delle perline più volte rispetto ai cianobatteri unicellulari per osservare il colore bluastro-viola scuro nel tampone di estrazione.
La durata della battitura delle perline non è suggerita per superare i 30 s poiché i campioni vengono riscaldati durante ogni ciclo di battitura delle perline. Si consiglia di raffreddare i tubi a temperatura ambiente su un banco (o a bagnomaria) tra un ciclo e l'altro, poiché il PBS intatto viene facilmente dissociato a bassa temperatura25. Pertanto, ogni procedura in questo protocollo è suggerita per essere eseguita a temperatura ambiente. Molti articoli di ricerca hanno descritto diversi metodi di interruzione cellulare, tra cui un omogeneizzatore ad alta pressione (French-Press) o un sonicatore6,8,20. Un omogeneizzatore per mulini a perline è suggerito perché è più economico, più sicuro, più facile da maneggiare, più veloce, più accessibile e più efficiente nell'elaborazione di più campioni contemporaneamente.
I ficobilisomi mostrano tre forme diverse, emidiscoidale, a forma di fascio e a forma di asta5. I ficobilisomi intatti isolati nella Figura 2 appartengono alla forma emidiscoidale come discusso nelle pubblicazioni precedenti7,13,36. La frazione superiore che rappresenta PBS dissociato, tuttavia, può anche contenere PBS a forma di asta. Syn6803 e JSC-1 codificano uno specifico linker rod-core CpcL, che suggerisce la presenza di PBS a forma di asta oltre al PBS emidiscoidale6,37. Il PBS a forma di asta è stato identificato direttamente in Syn6803 ma non in JSC-17,13,37. D'altra parte, JSC-1 rimodella il suo PBS eseguendo l'acclimatazione cromatica di tipo III in luce verde /rossa e la fotoaccupazione a luce rossa / rossa lontana6,7. Tutte queste diversità indicano che ci possono essere altri tipi di PBS nei gradienti di saccarosio, oltre alla frazione PBS emidiscoidale intatta più bassa. Ad esempio, due tipi di PBS sono presenti contemporaneamente quando Synechococcus sp. PCC 7335 e JSC-1 si acclimatano alla luce rossa lontana8,13. Si suggerisce che la persona che isola PBS da un ceppo cianobatterico non caratterizzato dovrebbe essere più cauta nell'analizzare ogni frazione nel gradiente di saccarosio per identificare eventuali tipi di PBS.
Nel complesso, questo protocollo fornisce un metodo economico, semplice e veloce per l'interruzione delle cellule. È stato anche dimostrato che questo metodo è affidabile per isolare PBS da diversi cianobatteri con diversi tipi di cellule e composizioni PBS.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun interesse concorrente.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University per il comodo uso dell'ultracentrifuga. I ceppi cianobatterici Synechocystis sp. PCC 6803 e Leptolyngbya sp. JSC-1 sono stati donati rispettivamente dal Dr. Chu, Hsiu-An presso Academia Sinica, Taiwan, e dal Dr. Donald A. Bryant presso la Pennsylvania State University, USA. Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (Taiwan) (109-2636-B-002-013- e 110-2628-B-002-065-) e dal Ministero dell'Istruzione (Taiwan) Yushan Young Scholar Program (109V1102 e 110V1102).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectroscopy. |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
References
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