Summary
目前的方案详细介绍了通过不连续蔗糖密度梯度离心从蓝藻中分离藻胆体的过程。完整的藻糖体的分数通过77K荧光发射光谱和SDS-PAGE分析得到证实。所得的藻胆体组分适用于TEM的负染色和质谱分析。
Abstract
在蓝藻中，藻胆体是一种重要的天线蛋白复合物，它收集光并将能量转移到光系统I和II进行光化学。研究藻胆体的结构和组成对科学家来说非常有趣，因为它揭示了蓝藻中光合作用的进化和分化。该协议提供了一种详细且优化的方法，通过磁珠打浆机以低成本有效地破坏蓝藻细胞。然后，完整的藻胆体可以通过蔗糖梯度超速离心从细胞提取物中分离出来。该方法已被证明适用于具有不同细胞类型的模型和非模型蓝藻。还提供了分步程序，通过77K荧光光谱和SDS-PAGE用硫酸锌和考马斯蓝染色来确认藻胆蛋白的完整性和性质。分离出的藻胆体也可以进行进一步的结构和成分分析。总体而言，该协议提供了一个有用的入门指南，使不熟悉蓝藻的研究人员能够快速分离和表征完整的藻类化合物。
Introduction
藻胆体（PBS）是一种巨大的水溶性色素 - 蛋白质复合物，附着在蓝细菌的类囊体膜中光系统的细胞质侧1。PBS主要由有色藻胆蛋白和无色连接蛋白组成1，2。藻胆蛋白可分为四大类：藻红素、藻红蓝蛋白、藻蓝蛋白和异体花青素3。四大类吸收490-650nm范围内不同波长的光能，叶绿素吸收效率低下3。PBS可以用作光收集天线，用于收集光能并将其输送到光系统II和I4。
PBS的结构和组成因物种而异。总的来说，在不同的蓝藻物种中已经鉴定出三种形状的藻胆体（半盘状、束状和杆状）5。即使在同一物种中，PBS的组成也会随环境而变化，例如光质和营养消耗6，7，8，9，10，11。因此，从蓝藻中分离PBS的实验程序有助于研究PBS12。几十年来，许多不同的方案已经分离出PBS并分析了其结构，组成和功能6，7，8，12，13，14，15，16，17。PBS分离方法种类繁多，确实为使用不同的试剂和仪器分离不同物种中的复合物提供了灵活性。然而，这也使得不熟悉蓝藻和PBS的科学家更难选择合适的方案。因此，在这项工作中为那些有兴趣从蓝藻中开始PBS分离的人开发了一个通用且直接的方案。
此处总结了从以前的出版物中分离 PBS 的方法。由于PBS是一种水溶性蛋白质复合物并且容易解离，因此在提取过程中需要高离子强度的磷酸盐缓冲液来稳定PBS18。过去曾发表过几篇描述从蓝藻中分离PBS的方法的研究文章。大多数方法需要高浓度的磷酸盐缓冲液8，14，15，18，19。然而，机械破坏细胞的程序各不相同，例如玻璃珠辅助提取，超声处理20和法式压榨6，8，14。不同的藻胆蛋白可以通过用硫酸铵20 沉淀并通过HPLC21 或色谱柱22纯化来获得。另一方面，完整的PBS可以通过蔗糖密度梯度超速离心轻松分离6，8，15。
在该协议中，使用一种模型蓝藻和一种非模型蓝藻作为PBS分离的材料。它们是模型单细胞葡萄糖耐受 性Synechocystis sp. PCC 6803（以下简称Syn6803）和非模型丝状 Leptolyngbya sp. JSC-1（以下简称JSC-1），分别7，23，24。该协议首先在高离子强度磷酸盐缓冲液中破坏单细胞和丝状蓝藻。裂解后，通过离心收集上清液，然后用非离子洗涤剂（Triton X-100）处理，以溶解来自类囊体膜的水溶性蛋白质。将总水溶性蛋白施加到不连续的蔗糖密度梯度上以分馏PBS。该方案中不连续的蔗糖梯度由四种蔗糖溶液组成，并将完整的PBS分配在蔗糖层的最低部分25中。PBS的完整性可以通过SDS-PAGE，锌染色和77K荧光光谱分析6，7，8，26。这种方法适用于旨在从蓝藻中分离完整PBS并研究其光谱，结构和组成特性的科学家。
此协议有几个优点。（1）该方法是标准化的，可用于从单细胞和丝状蓝藻中分离完整的PBS。大多数文章描述了应用于任何一种类型的蓝藻4，7，8，12，13，14，16，18的方法。（2）该方法在室温下进行，因为PBS在低温下解离19，27。（3）该方法描述了使用珠状敲击剂来破坏细胞;因此，它比高压法国压力机更便宜，更安全，并且其他方法中超声波仪可能造成的听力损伤8，13，14，20。（4）该方法通过蔗糖梯度超速离心分离完整的PBS。通过这种方式，可以根据蔗糖浓度分离具有不同大小和部分解离PBS的完整PBS。
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Protocol
胞藻属PCC 6803，模型葡萄糖耐受菌株，从台湾中央研究院的Chu，Hsiu-An博士获得。Leptolyngbya sp. JSC-1，非模型丝状，是从美国宾夕法尼亚州立大学的Donald A. Bryant博士那里获得的。
1. 细胞培养和收获
- 使用金属接种回路将Syn6803或JSC-1细胞接种到含有50 mL B-HEPES培养基的100 mL锥形烧瓶中28。在30°C下，在50μmol光子m-2 s-1（白光LED）下在1%（v / v）CO2中培养细胞，并通过磁力搅拌器（120rpm）不断搅拌，直到培养物达到中等指数生长阶段（OD750 = 0.6-0.8）。
注意：当培养物在750nm处的光密度（OD750）达到0.6-0.8时，通过转移到新的烧瓶中收获细胞培养物。光密度通常用于估计液体培养物中的微生物细胞密度29。720-750 nm的波长用于各种研究，用于测量蓝藻生长30，31，32。在该协议中，使用OD750 是因为JSC-1可以产生吸收远红光的颜料7。或者，叶绿素浓度也用于测量蓝藻的生长33。 - 将细胞培养物（OD750 〜0.8）转移到1L锥形烧瓶中，并将其稀释至OD750 = 0.2在500mL B-HEPES培养基中。在上述相同条件下（步骤1.1）培养培养物直到指数生长阶段晚期（OD750 = 0.8-1.0），然后通过离心收获培养物。
- 在室温下以10，000 ×g 离心培养物20分钟，并完全丢弃上清液。
注意：细胞沉淀可以在-80°C下储存长达6个月。
2. 细胞裂解
- 悬浮细胞沉淀并用0.75M磷酸钾缓冲液洗涤两次，pH 7。
注意：要在pH 7下制备0.75 M磷酸钾缓冲液，请分别制备1.5 M K2HPO4和1.5 M KH2PO4。混合615 mL 1.5 M K2HPO4和385 ml 1.5M KH2PO4，在pH 7下获得1.5M K-磷酸盐缓冲液。只需用相同量的ddH 2 O稀释即可在pH 7下制成0.75M磷酸钾缓冲液。 - 通过在室温下以10，000 ×g 离心20分钟将细胞沉淀在50mL离心管中。弃去上清液并用0.75M磷酸钾缓冲液重悬细胞。通过电子天平测量沉淀的湿重，并将沉淀的1g湿重在5mL缓冲液中。
注意：通过从含有细胞沉淀的离心管的重量中减去空离心管的重量来测量沉淀的湿重。 - 将1mL细胞悬浮液和0.4-0.6g0.1mm玻璃珠（见 材料表）加入2mL螺旋盖小瓶中。
- 用打珠器将细胞破碎30秒（见 材料表）。让管子在室温水浴中冷却2分钟，并重复破碎循环5次。
- 裂解后，在室温下以500× g 离心小瓶10秒。用移液管将上清液收集到15 mL离心管中。用0.5mL的0.75M磷酸钾缓冲液洗涤珠子一次，然后转移到同一离心管中。
- 将Triton X-100（2%w / v，终浓度）加入裂解的细胞悬浮液中，并在室温下在摇摆振荡器（40rpm）上孵育，直到溶液变得均匀（〜20分钟）。
- 将管子以17，210g离心20分钟，以除去完整的细胞和大细胞碎片。将没有上部Triton胶束层的上清液在室温下储存长达1小时。
注意：上清液包含两个分离的层。上部疏水性Triton X层含有叶绿素结合蛋白和疏水性杆状藻糖体6。下层水层含有水溶性PBS。
3. 蔗糖梯度缓冲液的制备和PBS分离
- 在pH 7的0.75M K-磷酸盐缓冲液中制备四种浓度的蔗糖（2.0 M，1.0 M，0.75 M和0.5 M）。
注意：建议在pH 7下使用1.5M磷酸钾缓冲液来制备蔗糖梯度，因为添加蔗糖会稀释K-磷酸盐缓冲液的浓度。蔗糖完全溶解后，加入ddH2O，调节浓度至0.75M，pH 7。 - 将2.8mL 2.0 M蔗糖缓冲液置于40 mL离心管的底部，并用三层蔗糖溶液（8 mL 1.0 M;12 mL 0.75 M和11 mL 0.5 M用于40 mL离心管）覆盖，最后覆盖含有PBS的上清液部分（3.0 mL）（图1A）。
注意：小心地加入蔗糖溶液，让蔗糖在管内非常缓慢地滴落。在装入溶液时，将移液器吸头保持在管中溶液表面的正上方。蔗糖层在缓慢分层时可以观察到。 - 在25°C下以125，800× g 离心所得梯度约16h-20小时。注意：此步骤需要超速离心机（见 材料表）。
- 在超离心时，在层之间冷凝分馏的PBS和藻胆蛋白。在界面中观察到Syn6803中的蓝色条带（JSC-1中显示的紫色条带）（图1D）。
- 用移液管从蔗糖梯度的顶部慢慢收集馏分。通过反复浓缩（3，500× g 20分钟）并在膜离心过滤单元中用0.75M K-磷酸盐缓冲液稀释馏分来除去蔗糖（10K分子量边界，见 材料表）。
4. 77K时PBS荧光的测量
注：配备液氮容器的荧光计（见 材料表）用于测量77K的荧光光谱。
- 用0.75 M磷酸钾缓冲液稀释浓缩的PBS样品，以获得至少500μL。
注：样品的藻蓝蛋白浓度为~4.2μgmL-1，基于以下公式：（OD615 0.474 x OD652）/5.34 [mg/mL]34。 - 将500μLPBS样品加入透明玻璃管中，并将管子冷冻在液氮中直至完全冷冻。将冷冻管移动到预先充满液氮的透明杜瓦瓶容器（见 材料表）中。
注意：在本协议中，玻璃管的内径为3 mm。使用薄玻璃管来最小化样品中短波长发射的再吸收。 - 选择藻红素和藻蓝蛋白的激发波长分别为550nm和580nm。
注：荧光发射记录在560-800nm（550nm激发）或600-800nm（580nm激发）
5. PBS的SDS-PAGE分析
- 缓冲液在膜离心过滤装置中将0.75 M磷酸钾溶液中的浓缩PBS样品与50 mM Tris缓冲液（pH 8.0）交换（分子量截止值，见 材料表）。
- 将50μLPBS溶液与10μL6x SDS加载缓冲液[300mM Tris pH 6.8，12%（w / v）十二烷基硫酸钠，0.06%（w / v）溴酚蓝，50%（v / v）甘油，6%（v / v）β - 巯基乙醇]（见 材料表）混合在微量离心管中，并在95°C下在加热块中孵育10分钟。
- 通过SDS-PAGE（8%-20%（w / v）聚丙烯酰胺凝胶）分离蛋白质样品，并继续进行锌和考马斯染色。详细过程已在参考文献 8 中描述。
- 对于锌染色，在室温下将凝胶在50 mM ZnSO4溶液中孵育10分钟，用蒸馏水洗涤凝胶，并在紫外辐射（312nm）下可视化锌诱导的荧光。
- 对于考马斯蓝染色，将凝胶在考马斯蓝染色缓冲液[0.25%（w / v）的考马斯R-250，10%（v / v）乙酸，50%（v / v）甲醇中孵育凝胶，见 材料表]在室温下1小时。用蒸馏水洗涤凝胶两次以除去残留的染色缓冲液，并在室温下在摇摇摇杯（40rpm）上用脱色缓冲液[10%（v / v）乙酸，30%（v / v）甲醇]孵育凝胶过夜。使用数码相机或扫描仪可视化完全脱色的凝胶。
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Representative Results
将Syn6803和JSC-1细胞在锥形烧瓶中培养，在30°C的B-HEPES培养基中，在LED白光（50μmol光子m-2s-1）下在充满1%（v / v）CO2的生长室中持续搅拌。在指数生长阶段（OD750 = ~0.5），将细胞转培养到最终光密度为OD 750 = ~0.2的新鲜培养基中。在达到晚期指数生长阶段（OD750 = 0.6-0.8）后，收集培养物并离心（室温下10，000×g20分钟）。弃去上清液，并将细胞沉淀储存在-80°C直至下一步可用。
为了破坏细胞，首先在室温下解冻细胞。在0.75 M K-磷酸盐缓冲液中用0.1mm玻璃珠敲打细胞。完全细胞裂解显示离心前深蓝绿色的上清液（图1B）。通过Triton X-100溶解并离心除去不溶性膜和细胞碎片后，将上清液加载到蔗糖梯度溶液的顶部，置于40mL离心管中（图1C）。离心18小时后，完整的PBS移动到梯度的中心，作为Syn6803的透明蓝色条带和JSC-1的紫色条带。它们的颜色差异是由Syn6803和JSC-1中PBS的不同成分引起的。Syn6803的PBS携带藻蓝蛋白35，而JSC-1的PBS携带藻蓝蛋白和藻红素7。分离的PBS的蔗糖密度梯度分离结果显示了解离藻胆蛋白的几个部分，最低部分代表完整的PBS（图1D）。
图2A比较了从JSC-1和Syn6803分离出的不同PBS馏分的吸收光谱。吸收光谱的详细过程已在第7，8条中描述。JSC-1和Syn6803的解离PBS和完整PBS的吸收光谱在622 nm处具有相同的峰值，对应于藻蓝蛋白。在JSC-1的解离PBS和完整的PBS中都发现了571nm处的藻红素吸收峰。别癣菌蓝蛋白在JSC-1和Syn6803的完整PBS级分中显示出一个小峰，肩部在670nm处。光谱差异表明，解离PBS中的杆（藻蓝蛋白）与核心（别菌蓝蛋白）比高于完整PBS组分，因为藻胆蛋白的光谱性质之前已经确定5。由于解离的PBS和完整的PBS级分在室温下表现出相似的吸收光谱和荧光发射特征，因此使用77K荧光光谱分析从蔗糖梯度中分离出的不同组分。580 nm激发解离PBS和完整PBS级分的77K荧光发射光谱。解离PBS的发射光谱在Syn6803和JSC-1中具有约650nm处的强峰，代表藻蓝蛋白的发射（图2B）。完整PBS的荧光发射光谱显示两个荧光发射最大峰值：651nm处的弱荧光发射峰和684nm处的强峰，揭示了藻蓝蛋白收集的能量被有效地转移到core9中的别异体花青素和末端发射器（ApcD和ApcE）（图2C）。这些特征表明，蔗糖梯度中的最低部分含有完整的PBS。
解离的PBS和完整的PBS通过SDS-PAGE在8%-20%（w / v）SDS聚丙烯酰胺线性梯度凝胶上分离。α和β藻蓝蛋白和别癣菌蓝蛋白亚基在凝胶上可见，无需染色（图3A）。随后用10 mM ZnSO4染色凝胶10分钟。 在紫外照射过程中通过锌染色观察含发色团的藻胆蛋白8.藻胆蛋白亚基（14-21 kDa）具有强荧光，ApcE（箭头）显示弱荧光（图3B）。此外，考马斯蓝染色显示了解离的PBS级分和完整的PBS级分之间的不同蛋白质组成（图3C）。上部部分含有其他非PBS水溶性蛋白质，因为染色的蛋白质比完整的PBS级分更多。Syn6803中完整的PBS显示了一个突出的ApceE波段（箭头），缺少解离的PBS分数（图3C）。
PBS提取物和蔗糖梯度之间的体积比对于超速离心后蔗糖梯度中获得尖锐条带至关重要。建议的溶解PBS提取物与蔗糖梯度溶液的比例为1：10。根据以前的经验，在40 mL离心管中制造蔗糖梯度比在13 mL离心管中制备蔗糖梯度显示出更高的分辨率。由于工作台上的振动，不连续的蔗糖梯度会随着时间的推移而扩散。因此，13 mL 离心管是同时处理大量样品的不错选择。为了证明这一点，在Syn6803或JSC-1的粗提取物到蔗糖梯度溶液之间以1：3和1：10的比例在13mL离心管中制备蔗糖梯度（图4A）。超速离心后，以1：3的比例制备的蔗糖梯度比以1：10的比例制备的蔗糖梯度显示出更宽的条带（图4B）。每个梯度的最低部分含有完整的PBS，由77K荧光发射光谱证实。
图1：Syn6803和JSC-1细胞的破坏以及蔗糖梯度超速离心。 （A）在40 mL离心管中制备停产蔗糖梯度的示意图。（B）螺旋盖小瓶装有0.4g玻璃珠和1mLSyn6803或JSC-1细胞悬浮液，然后用珠状搅拌器裂解细胞。（C）将Triton X-100增溶提取物的上清液分层在蔗糖密度梯度的顶部。（D）离心18 h后，PBS级分在Syn6803的梯度中可视化为清晰的蓝色条带，在JSC-1中为紫色条带。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：蔗糖梯度不同组分的光谱表征。 （A）来自JSC-1和Syn6803的解离PBS和完整PBS馏分的吸收光谱。使用580 nm处的激发波长在77 K下测量荧光发射光谱，用于（B）解离的PBS级分和（C）Syn6803和JSC-1的完整PBS级分。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：从蔗糖梯度中分离出的PBS的SDS-PAGE分析。 将解离和完整的PBS级分定量（每泳道20μg蛋白质）并上样到8%-20%（w / v）梯度聚丙烯酰胺凝胶上。凝胶电泳后，随后通过锌染色和考马斯蓝染色对凝胶进行可视化。（A）藻胆蛋白的颜色在凝胶上可见，无需染色。（B）锌染色凝胶显示藻胆蛋白的荧光。（C）用考马斯蓝染色的凝胶显示藻胆蛋白和其他蛋白质。箭头指示 ApcE 的位置。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：在13mL离心管中制成的蔗糖梯度。 粗提取物和蔗糖梯度溶液之间的比率标记在图像的顶部。（A）将Syn6803和JSC-1的Triton X-100增溶提取物的上清液分层在蔗糖密度梯度上，溶解提取物与蔗糖梯度溶液的比例不同。（B）离心18 h后，在蔗糖梯度中观察到Syn6803和JSC-1中的PBS级分。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
该协议描述了一种简单而标准的方法，用于分离两种类型的蓝藻中的完整PBS，单细胞模型Syn6803和丝状非模型JSC-1。该方案的关键步骤是在蔗糖的不连续密度梯度上进行细胞均质化和超速离心。通常，丝状细胞的破坏比单细胞细胞更复杂。增加起始物质的量（细胞沉淀的湿重）和重复的磁珠打有助于提高丝状蓝藻细胞PBS的产量。对于丝状蓝藻JSC-1，使用的细胞是单细胞Syn6803的三倍。此外，要完全破坏丝状蓝藻，需要比单细胞蓝藻更多的珠子跳动才能观察提取缓冲液中的深蓝紫色。
建议打孔的持续时间不要超过30秒，因为样品在每个打珠循环期间都会被加热。建议在每个周期之间将管子在室温下在工作台上（或在水浴中）冷却，因为完整的PBS在低温下很容易解离25。因此，建议在室温下进行该协议中的每个程序。许多研究文章描述了不同的细胞破碎方法，包括高压均质器（法国出版社）或超声仪6，8，20。建议使用珠磨均质机，因为它更便宜，更安全，更易于处理，更快，更易于接近，并且更有效地同时处理多个样品。
藻类体有三种不同的形状，半盘状、束状和杆状5。图2中分离出的完整藻糖体属于早期出版物中讨论的半盘状体7，13，36。然而，代表解离PBS的上部也可以包含杆状PBS。Syn6803和JSC-1编码特定的杆芯连接器CpcL，这表明除了半盘PBS6，37之外还存在杆状PBS。棒状PBS已在Syn6803中直接鉴定，但在JSC-17，13，37中未被鉴定。另一方面，JSC-1通过在绿/红光下执行III型色度适应和在红/远红光下进行远红光光适应来重塑其PBS6，7。所有这些多样性表明，除了最低的完整半盘PBS分数外，蔗糖梯度中可能存在其他类型的PBS。例如，当Synechococcus sp. PCC 7335和JSC-1适应远红光8，13时，同时存在两种类型的PBS。建议从未表征的蓝藻菌株中分离PBS的人在分析蔗糖梯度中的每个组分时应更加谨慎，以确定任何可能的PBS类型。
总体而言，该协议为细胞破碎提供了一种廉价，简单和快速的方法。还证明，该方法从具有不同细胞类型和PBS组合物的不同蓝藻中分离PBS是可靠的。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
作者感谢国立台湾大学生命科学学院Technology Commons对超速离心机的方便使用。蓝藻菌株 Synechocystis sp. PCC 6803和 Leptolyngbya sp. JSC-1分别由台湾中央研究院的Chu，Hsiu-An博士和美国宾夕法尼亚州立大学的Donald A. Bryant博士赠送。这项工作由科学技术部（台湾）（109-2636-B-002-013-和110-2628-B-002-065-）和教育部（台湾）玉山青年学者计划（109V1102和110V1102）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectroscopy. |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
References
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