Summary
טרנספורמציה של חוט השדרה קסנופוס לאביס ראשן היא שיטת פגיעה רלוונטית לחקר פגיעה בחוט השדרה והתחדשות על ידי ביצוע חתך רוחבי שמנתק לחלוטין את חוט השדרה ברמת בית החזה.
Abstract
פגיעה בחוט השדרה (SCI) היא מחלה קבועה, המשפיעה על מערכת העצבים המרכזית (CNS) על העצבים המוטוריים והחשיים, וכתוצאה מכך שיתוק מתחת לאתר הפציעה. עד כה, אין טיפול התאוששות פונקציונלי עבור SCI, ויש חוסר בהירות לגבי מתחמים רבים ואירועים דינמיים המתרחשים לאחר SCI. אורגניזמים רבים שאינם יונקים יכולים להתחדש לאחר SCI חמור, כגון דגי טלוסט, דו-חיים אורודלים ושלבי זחל של דו-חיים אנורים, כולל ראשי קסנופוס לאביס . אלה הם אורגניזמים מודל בתום לב ללמוד ולהבין את התגובה SCI ואת המנגנונים שבבסיס תהליכי התחדשות מוצלחים. סוג זה של מחקר יכול להוביל לזיהוי של מטרות פוטנציאליות להתערבות טיפולית SCI. מאמר זה מתאר כיצד לבצע העברת ראשן ראשן קסנופוס laevis חוט השדרה, כולל גידול, ניתוח, טיפול לאחר המוות, והערכה מבחן פונקציונלי. שיטת פגיעה זו יכולה להיות מיושמת להבהרת השלבים השונים של התחדשות חוט השדרה על ידי לימוד המנגנונים התאיים, המולקולריים והגנטיים, כמו גם אבולוציה היסטולוגית ותפקודית לאחר SCI ובמהלך התחדשות חוט השדרה.
Introduction
פגיעה בחוט השדרה (SCI) היא מחלה המשפיעה על כ -250,000-500,000 אנשים ברחבי העולם מדי שנה1. בנוסף לשכיחות גבוהה זו, SCI משפיע על עצבים חושיים ומוטוריים, יצירת שיתוק מתחת לאתר הפציעה וניתוק של כמה איברים פנימיים משליטת מערכת העצבים המרכזית. חוט השדרה, המהווה חלק ממערכת העצבים המרכזית, אינו יכול להתחדש, ובשל מורכבות הסבל וחוסר הבנה מלאה של כל התהליכים המעורבים, עדיין אין טיפולים יעילים המאפשרים התאוששות תפקודית.
אורגניזמים שאינם יונקים, כגון דגי טלוסט, דו-חיים אורודל ושלבי זחל של דו-חיים אנורים, שיכולים לחדש את חוט השדרה לאחר SCI2,3,4 חמור, הם אורגניזמים מודל מצוינים לחקר התהליכים השולטים באירוע התחדשות מוצלח והבנת כישלון התחדשות היונקים. הבנה זו היא עניין רב כפי שהוא יכול לספק תובנות מקוריות לפתח יעדים טיפוליים חדשים וטיפולים אפשריים עבור SCI.
הצפרדע האנאורנית, קסנופוס לאביס, היא אורגניזם מודל מצוין לחקור SCI. יש לו יכולות התחדשות מצוינות בשלבי הראשן, אשר הולכים לאיבוד בהדרגה במהלך מטמורפוזה, המאפשר ניסויים בשלבים הרגנרטיביים והלא-דורניים 3,5. שיטת הפציעה שנקבעה לחקר SCI בראשני קסנופוס לאביס מורכבת מקטיעה של הזנב, שם מוסר הזנב כולו, כולל רקמות כגון שריר, נוטוקורד וחוט השדרה6. גישה זו סייעה להבנת מנגנונים כלליים של תהליכי התחדשות4,7,8,9,10.
כמו כריתת זנב כרוך רקמות מרובות בנוסף לחוט השדרה, אשר שונה ממה שקורה לאחר SCI אנושי, פרדיגמת פגיעה רלוונטית יותר נדרש לחקר SCI. הסתמכנו על מחקרים ששימשו ב-11 האחרונים ליצירת תיאורים מקיפים של פרדיגמות פציעה5,12,13,14 ושיטות שונות לחקר SCI12,13,14,14,15,16,17,18 . לאחר העברת חוט השדרה, החלק caudal של חוט השדרה יכול להיות מבודד עבור RNA וביטוי חלבון וניתוחים תפוקה גבוהה14,19,20,21. בנוסף, זריקות אינטרקלומיות של תרופות ומולקולות קטנות, כמו גם אלקטרופורציה של cDNA, RNA, או morpholinos, לפני או אחרי העברת חוט השדרה, לאפשר את המחקר של ההשפעות של מולקולות אלה במניעה או בטיפול של SCI או של אירועים ספציפיים המתרחשים לאחר SCI והתחדשות חוט השדרה13,14 . יתר על כן, ניתן ללמוד את התפתחות הפציעות ואת תהליכי ההתחדשות בתזמונים שונים לאחר פציעה באמצעות גישות ביוכימיות, מולקולריות, היסטולוגיות ותפקודיות12,13,14,17,17,19,20,20,21,22,23.
לבסוף, ניתן להשתמש בכל הטכניקות הנ"ל בשלבים שאינם מתחדשים, תוך הדגשת אחד היתרונות החשובים ביותר של שימוש בקסנופוס לאביס כאורגניזם מודל לחקר SCI, המחקרים ההשוואתיים של מנגנונים רגנרטיביים ולא מתחדשים באותו מין13,19,20,20,21,22. מאמר זה מציג פרוטוקול עבור קסנופוס laevis ראשן ראשן חוט השדרה טרנסקציה, החל בימוי ובחירה של ניווקופ רגנרטיבי ופייבר (NF) שלב 50 ראשנים. זה ואחריו תיאור של ההליכים לניתוחי חוט השדרה כדי לייצר בעלי חיים מזויפים ו transected, טיפול פוסט כירורגי, ולבסוף ניתוח של התאוששות תפקודית על ידי מדידת מרחק שחייה ראשן חינם.
Protocol
פרוטוקול זה מספק מספיק מידע כדי לבצע בהצלחה העברת חוט השדרה. שימו לב, ישנם פרוטוקולים מפורטים מצוינים של טכניקות אלה שפורסמו במקום אחר14, אשר יכול להשלים את זה המוצג כאן. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לביואתיקה וביו-בטיחות מהפקולטה למדעי הביולוגיה, אוניברסיטת פונטיפיציה קטוליקה דה צ'ילה.
1. הזדווגות טבעית של צפרדעים
- שלושה עד חמישה ימים לפני ההזדווגות, הצפרדעים הזכריות והנקבות התת עוריות עם 50 יחידות של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG). השתמש בטכניקת "טופר הברזל" לריסון הצפרדעים; מכיוון שהצפרדעים חלקלקות, השתמשו ברשת כדי להקיף את הצפרדע במידת הצורך. הכנס את הקצה של מחט 26 G x 1/2 " אחורי לקו לרוחב, דוחף אותו הגב אל עומק של 1 ס"מ, בין העור לשריר.
- לפני ההזדווגות, להזריק את הזכר עם 300 יחידות ואת הנקבה עם 700 יחידות של hCG.
- להזדווגות להתרחש, למקם את הזכר ואת הנקבה ב 2 L של 0.1x פתרון בארת מיד לאחר צינון הפתרון ב 4 °C (65 °F) במשך 15 דקות כדי להידמות לתנאי האביב ולהשאיר לילה ב 18 °C (60 °F).
- 16 שעות לאחר מכן, לאסוף בזהירות את העוברים בעזרת פיפטה פסטר פלסטיק, עם הקצה מנותק, ומניחים אותם בצלחות פטרי בקוטר 10 ס"מ. הסר את מעיל הג'לי העוברי על ידי דגירה של העוברים עם 25 מ"ל של 2% ציסטאין במים מזוקקים (pH 7.8; להבטיח את הפתרון מכסה את העוברים) במשך 5 דקות עם תסיסה קלה. לשטוף 3 פעמים עם מים מזוקקים ו 3 פעמים עם פתרון 0.1x Barth (8.9 מ"מ NaCl; 102 מיקרומטר KCl; 238.1 μM NaHCO3; 1 מ"מ 4-(2- הידרוקסיאתיל)-1-1-פיפרזין אתנסולפוניק (HEPES); 81.14 מיקרומטר MgSO4; 33.88 μM Ca(NO3)2; 40.81 μM CaCl2, pH 7.6).
- בחרו עוברים בריאים בעלי צבע חום וחלוקה סימטרית של בלסטומרים. מניחים את העוברים במנות פטרי בקוטר 10 ס"מ עם 50 מ"ל של תמיסת בארת 0.1x בצפיפות של לא יותר מ -100 עוברים למנה.
2. גידול
- במהלך השבוע הראשון, לשמור על העוברים ב 18 °C (50 °F) עד שהם מקבלים את שק vitelline. במהלך תקופה זו, לשנות את פתרון Barth מדי יום, ולהסיר עוברים מתים לבנבנים וראשנים המציגים כל שינוי אנטומי גלוי או ראשנים ללא כל תנועת שחייה.
- לאחר השבוע הראשון, להעביר ראשנים למים ללא כלור במיכלי פלסטיק בצפיפות של 10 בעלי חיים לליטר. לגדל ראשנים ב 20-21 °C (50 °F) עם מחזור כהה 12 שעות / 12 שעות כהה, עם אבני חמצן זמין בכל טנק כדי לאוורר את המים וניזון פעם ביום עם 0.5 מ"ג לכל בעל חיים. החליפו מים פעם בשבוע ובדקו אם יש פסולת מצטברת ובעלי חיים מתים מדי יום24.
3. היערכות
- שלושה עד ארבעה שבועות לאחר ההפריה, מניחים את החיות בצלחת פטרי; לאחר מכן, בזה אחר זה, בדוק את המורפולוגיה ואת המראה של forelimbs ו hindlimbs. במידת הצורך, להרדים את בעלי החיים על ידי הצבת בעלי החיים בצלחת פטרי עם 50 מ"ל של 0.02% tricaine mesylate ב 0.1x בארת פתרון למניפולציה טובה יותר. לאחר לא יותר מ 2 דקות, למקם את בעלי החיים בתמיסת 0.1x Barth להתאוששות מההרדמה.
- חפשו את המאפיינים האנטומיים הבאים של שלב 50 בעלי חיים25: forelimbs שמופיעים זה עתה והם כדוריים (איור 1); אחוריים בולטים וכדוריים (איור 1).
הערה: בעלי חיים משלבים 49 עד 51 יכולים לשמש להליך זה (איור 1); לקבלת מידע נוסף על שלבים, עיין בטבלת קסנופוס laevis25 של Nieuwkoop ו- Faber.
4. ניתוח: מעבר חוט השדרה ובעלי חיים המופעלים בזיוף
- מרדים שלב 50 ראשנים על ידי הצבתם בצלחת פטרי עם 50 מ"ל של 0.02% tricaine mesylate ב 0.1x בארת פתרון במשך 2 דקות.
- בעזרת כף ומלקחיים, מניחים את הראשן, צד הגב למעלה, על חתיכת גזה רטובה בחצי העליון של צלחת פטרי.
- בצעו חתך של העור ושרירי הגב ברמה האמצעית של בית החזה (איור 2A, B) באמצעות מספריים קפיץ מיקרודיסקציה.
- לשליטה בבעלי חיים מזויפים, ודאו שגודל החתך הוא כ-0.2 מ"מ בלבד (איור 2C); אין לפגוע בחוט השדרה (איור 2D, D').
- עבור בעלי חיים שעברו טרנסצ'ן, בצעו חתך שני של כ-0.2 מ"מ (איור 2C) כדי לעבור באופן מלא את חוט השדרה (איור 2E, E').
5. טיפול לאחר המוות
- לאחר הניתוח, להעביר את הראשנים למיכל המכיל 0.5 L של 0.1x פתרון Barth עם 1x פניצילין-סטרפטומיצין, בצפיפות של 10-12 בעלי חיים לכל טנק. לשמור על בעלי החיים transected ולשלוט מזויף במיכלים נפרדים.
הערה: הראשנים יחלימו מההרדמה בעוד כמה דקות. - לשמור על הראשנים עם אוויר בטמפרטורה של 20-21 °C (50 °F).
- לשנות את הפתרון בארת עם אנטיביוטיקה כל יומיים עד סוף הניסוי.
- התחל להאכיל את החיות יום אחד לאחר הניתוח, פעם ביום.
- לחסל חיות מתות.
6. בדיקת שחייה
- קבל תיבה עם תאורת LED מבפנים, מכוסה גיליון פוליסטירן שקוף, המאפשר לאור לעבור.
- התקן מצלמה מעל תיבת ה-LED.
- מניחים צלחת פטרי בקוטר 15 ס"מ על גבי הקופסה, מלאה 100 מ"ל של פתרון 0.1x Barth.
- יום אחד לאחר המעבר, מניחים ראשן בצלחת פטרי ומשאירים לתקופת הסתגלות של 5 דקות.
- לאחר ההסתגלות, התחל לעקוב אחר התנהגות השחייה החופשית באמצעות התוכנה שאליה בוצעה הפניה (ראה טבלת החומרים) למשך 5 דקות.
- לאחר השלמת הסרטון, העבר את הראשן בחזרה למיכל שלו.
- חזור על מעקב הווידאו 5, 10, 15 ו- 20 יום לאחר ההעברה (איור 3).
7. שיקולים ביואתיים
הערה: התמותה של בעלי חיים לאחר ניתוח מזויף והעברה היא 13% ו -30%, בהתאמה. בנוסף, מינימום של 15-20 בעלי חיים לכל קבוצה נחוץ לניתוח סטטיסטי. לכן, התחל עם 23 זיוף ו -26 בעלי חיים transected.
- להרדים את בעלי החיים עם 0.02% tricaine mesylate במשך 2 דקות כדי להבטיח ירידה בפעילות העצבית והמוטורית וכאב לפני הניתוח.
- לאחר הניתוח, בדוק את בעלי החיים להחלמה מהרדמה. בנוסף, להאכיל ולבדוק את בעלי החיים מדי יום.
- לאחר סיום בדיקת השחייה, להקריב את החיות עם מנת יתר של tricaine mesylate (1% tricaine mesylate מוכן בתמיסת 30 mM נתרן ביקרבונט).
Representative Results
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לחקור את התחדשות חוט השדרה בקסנופוס לאביס. ניתן להעריך את ההשפעות של טיפולים תרופתיים ספציפיים ואת תרומתו של ביטוי גנים ספציפי בהתחדשות חוט השדרה על ידי מדידת השפעתם על התאוששות השחייה. מרחק השחייה הכולל מתווה כנגד הימים שלאחר הפציעה כדי להשוות שליטה ומטפלים בבעלי חיים בנקודת זמן ספציפית או על פני תקופה מוגדרת. ההתאוששות של התפקוד המוטורי לאורך זמן באה לידי ביטוי באיור 3, ומציגה את מרחק השחייה ב-5, 10, 15 ו-20 יום לאחר המעבר. ב 5 ימים לאחר המעבר, בעלי חיים שחו בממוצע של 0.7 מ 'ב 5 דקות, מראה קיבולת שחייה מופחתת. קיבולת זו גדלה עם הימים החולפים, כמו ממוצע של 2.1 ו 3.1 מ '/ 5 דקות נצפתה לאחר 10 ו 15 ימים לאחר המעבר, בהתאמה, והתאוששות מלאה של יכולות השחייה נצפתה ב 20 ימים לאחר המעבר, עם ממוצע של 5.7 מ '/ 5 דקות.
איור 1: היערכות ראשן קסנופוס. תמונות מייצגות של שלבים 49-51, המציגות קדמת הבמה וההיערכות להתייחסות לבימוי בעלי חיים. סרגלי קנה מידה = 2 מ"מ. הגדלות של האזור בקופסה מוצגות בפינה השמאלית התחתונה של כל תמונה. סרגלי קנה מידה = 1 מ"מ. בשלב 49, forelimbs אינם נצפים, בעוד אחוריים רק מופיעים, מראה צורה כדורית. שלב 50 מציג את הרגליים הקדמיות שרק מופיעות, ומציגות צורה כדורית ואחוריים בולטים בצורה כדורית. בשלב 51, הקדמיים מציגים צורה כדורית בולטת ומאחורים צורה מוארכת בולטת. קווי מתאר מקווקווים מראים קדמת הבמה והישענות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: העברת חוט השדרה. (A) תמונה מייצגת המציגה את המיקום הנכון של החיה, צד הגב למעלה, לביצוע הניתוח. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. (ב) הגדלה של A מציגה את המיקום והיקף הפגיעה. הצלב האדום מראה את המיקום המדויק של אתר הפציעה ברמת בית החזה של חוט השדרה, והקו המקווקו מראה את היקף הפציעה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (C) תמונה מייצגת המציגה תצוגה לרוחב של רמת בית החזה של חוט השדרה. ההרחבה של החתך המזויף וההעברה מוצגים. קווים מקווקווים מתארים את גבולות חוט השדרה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (ד) תמונה מייצגת המציגה חיה מזויפת עם חוט שדרה שלם. סרגלי קנה מידה = 1 מ"מ. (ה) תמונה מייצגת המציגה חיה חוצה עם חוט שדרה מופרע. סרגלי קנה מידה = 1 מ"מ. הגדלות של האזור בקופסה מוצגות בפינה השמאלית התחתונה של כל תמונה (D' ו- E'). סרגלי קנה מידה = 1 מ"מ. קיצורים: S = חתך מזויף; T = החלפה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שחזור תפקודי שחייה לאורך זמן. חלקת נקודה מייצגת של מרחק השחייה המכוסה על ידי בעלי חיים חוצה ב 5 דקות ב 5, 10, 15, ו 20 ימים לאחר המעבר. דגימות של מסלולי שחייה מוצגים על גבי. נתונים המוצגים כממוצע ± SEM מ-10 ראשנים. קיצורים: dpT = ימים לאחר טרנספורמציה; SEM = שגיאה סטנדרטית של הממוצע. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
הפרוטוקול המתואר בזאת הוא שיטה מצוינת לביצוע SCI ולהעריך התאוששות פונקציונלית. עבור רבייה, זה חיוני כדי לגדל ראשנים בריאים ולבחור בעלי חיים דומים בגודלם. חוסר האכלה נכונה מייצר מתח תזונתי, אשר גורם קיבולות התחדשות ירודות26; לכן, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת להאכלת ראשנים. כאשר הראשנים מגיעים לשלב 50 לאחר 3-4 שבועות, ניתן לגדל אותם בטמפרטורות גבוהות יותר כדי להאיץ את תהליך הצמיחה, 18-25 °C להיות אופטימלי27. איכות המים חשובה, שכן בעלי חיים רגישים לתנאי מים ומוצרים כימיים. תנאי המים האופטימליים כוללים שימוש במים מסוננים בפחמן וללא כלור עם הפרמטרים הבאים: pH (6.5-7.5), כלוריד (<0.02 מ"ג/ל'), מוליכות מים (1.0 מ"ק/ס"מ ± 0.1 יחידות), נחושת (<0.3 מ"ג/ליטר); קשיות פחמתית (KH: 5-10 dKH); קשיות כללית (GH: 6-16 dGH); חנקתי (NO3: <20 מ"ג /L); וניטריט (NO2: <0.1 מ"ג /L)14,27,28. בנוסף, כדי למנוע זיהום, מיכלי פלסטיק יש לנקות פעם בשבוע לגידול בעלי חיים או כל יומיים לאחר הניתוח על ידי כביסה יסודית עם מים ללא כלוריד וספוג; יש להימנע מחומר ניקוי.
עבור שיעור הישרדות טוב יותר לאחר הניתוח, ראשנים לא חייבים להיות חשופים להרדמה לתקופות ארוכות (לא יותר מ 2 דקות). יתר על כן, מומלץ להרדים ראשן אחד בכל פעם. כמו בעלי החיים צריכים להישאר hydrated, לשמור על בעלי החיים שקועים בתמיסה כל הזמן לפני ואחרי הניתוח, ויוצקים את הפתרון עם כפית על הראשן לפני תחילת הניתוח. ודא כי הנזק הוא נרחב מספיק כדי לכסות את חוט השדרה כולו אבל לא נרחב מדי כפי שהוא יכול לגרום התאוששות תפקודית לקויה או מוות. אם נוטוקורד ניזוק, החיה תהיה כפופה, וההתאוששות התפקודית תושפע. אם הנזק משתרע מעבר לנוטוקורד, ההסתברות למוות עולה 14. במהלך בדיקת השחייה, ההקלטה נחשבת נכונה אם התוכנה מזהה כל בעל חיים עם צל כחול; אחרת, יש לחזור על ההקלטה. חשוב להימנע משינויי תנועה ואוויר או אור במהלך תהליך ההקלטה כדי למנוע טעויות הקלטה.
יש עדיין שאלות פתוחות רבות על המנגנונים התאיים והמולקולריים שבבסיס הנזק לחוט השדרה והתחדשות. הפרוטוקול המתואר בעבודה זו יכול לשמש לחקר תרומתם של אירועים תאיים שונים, ביטוי גנים וטיפולים על התאוששות תפקודית, שנקבעו על ידי מדידת יכולות שחייה. בנוסף, טכניקות רבות אחרות ניתן ליישם על בעלי החיים המופעלים. ניתן לבודד את חוט השדרה כדי לבצע מיצוי חלבון ו/או mRNA14 כדי לחקור פרופילי חלבון וביטוי גנים לאחר נזק וטיפול19,20. ניתוח זה היה גם הבסיס לחקר התגובה התאית של חוט השדרה22 ואת ההתנהגות של תאי אב גזע עצביים12,13,22 לאחר פגיעה בחוט השדרה. מפלי איתות המעורבים בהתחדשות חוט השדרה נחקרו גם באמצעות פרדיגמת הנזק לחוט השדרה המתוארת כאן ב-23. לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן הוא מודל מצוין לחקר פגיעה בחוט השדרה והתחדשות ושימש למחקרים רבים שתרמו לידע הקיים בנושא.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענקי מחקר מ: PG סלייטר: FONDECYT N ° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
| ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
| Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
| Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
||
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
| Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
| HEPES | Gibco | 11344-041 | |
| Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
| KCl | Merck Millipore | 104936 | |
| LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
| MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
| Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
| NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
| Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
| Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
| pH meter | |||
| Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
| Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
| Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
| Sterilized gauze | |||
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
| Tablespoon | |||
| Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
|
| Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |
References
- International perspectives on spinal cord injury. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury (2013).
- Quiroz, J. F. D., Echeverri, K. Spinal cord regeneration: Where fish, frogs and salamanders lead the way, can we follow. Biochemical Journal. 451 (3), 353-364 (2013).
- Lee-Liu, D., Méndez-Olivos, E. E., Muñoz, R., Larraín, J. The African clawed frog Xenopus laevis: A model organism to study regeneration of the central nervous system. Neuroscience Letters. 652, 82-93 (2017).
- Phipps, L. S., Marshall, L., Dorey, K., Amaya, E. Model systems for regeneration: Xenopus. Development. 147 (6), (2020).
- Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larraín, J. Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates. Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).
- Beck, C. W., Christen, B., Slack, J. M. W. Molecular pathways needed for regeneration of spinal cord and muscle in a vertebrate. Developmental Cell. 5 (3), 429-439 (2003).
- Love, N. R., et al. Genome-wide analysis of gene expression during Xenopus tropicalis tadpole tail regeneration. BMC Developmental Biology. 11, 70 (2011).
- Love, N. R., et al. Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration. Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).
- Gargiolo, C., Slack, J. M. W. Cell lineage tracing during Xenopus tail regeneration. Development. 131 (11), 2669-2679 (2004).
- Lin, G., Chen, Y., Slack, J. M. W. Regeneration of neural crest derivatives in the Xenopus tadpole tail. BMC Developmental Biology. 7, 56 (2007).
- Filoni, S., Bosco, L., Cioni, C. Reconstitution of the spinal cord after ablation in larval Xenopus laevistle. Acta Embryologiae et Morphologiae Experimentalis. 5 (2), 109-129 (1984).
- Gaete, M., et al. Spinal cord regeneration in Xenopus tadpoles proceeds through activation of Sox2-positive cells. Neural Development. 7, 13 (2012).
- Muñoz, R., et al. Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells. Developmental Biology. 408 (2), 229-243 (2015).
- Edwards-Faret, G., et al. Spinal cord regeneration in Xenopus laevis. Nature Protocols. 12 (2), 372-389 (2017).
- Méndez-Olivos, E. E., Larraín, J. Cell transplantation as a method to investigate spinal cord regeneration in regenerative and nonregenerative xenopus stages. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (12), 943-947 (2018).
- Méndez-Olivos, E. E., Muñoz, R., Larraín, J. Spinal cord cells from pre-metamorphic stages differentiate into neurons and promote axon growth and regeneration after transplantation into the injured spinal cord of non-regenerative Xenopus laevis froglets. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 398 (2017).
- de Vidts, S., Méndez-Olivos, E., Palacios, M., Larraın, J., Mery, D. Characterization of spinal cord damage based on automatic video analysis of froglet swimming. Biology Open. 8 (12), 2-11 (2019).
- Slater, P. G., Palacios, M., Larraín, J. Xenopus, a model to study wound healing and regeneration: Experimental approaches. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (8), 100966 (2021).
- Lee-Liu, D., et al. Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages. Neural Development. 9, 12 (2014).
- Lee-Liu, D., Sun, L., Dovichi, N. J., Larraín, J. Quantitative proteomics after spinal cord injury (SCI) in a regenerative and a nonregenerative stage in the frog Xenopus laevis. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (4), 592-606 (2018).
- Peñailillo, J., et al. Analysis of the early response to spinal cord injury identi fi ed a key role for mTORC1 signaling in the activation of neural stem progenitor cells. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 68 (2021).
- Edwards-Faret, G., et al. Cellular response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages in Xenopus laevis. Neural Development. 16 (1), 2 (2021).
- Tapia, V. S., Herrera-Rojas, M., Larrain, J. JAK-STAT pathway activation in response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages of Xenopus laevis. Regeneration. 4 (1), 21-35 (2017).
- Ishibashi, S., Amaya, E. How to grow Xenopus laevis tadpole stages to adult. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (3), (2021).
- Normal table of Xenopus laevis (Daudin).: A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. (1994).
- Williams, M. C., Patel, J. H., Kakebeen, A. D., Wills, A. E. Nutrient availability contributes to a graded refractory period for regeneration in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 473, 59-70 (2021).
- Xenopus: Methods and protocols. Vleminckx, K. , Humana Press. New York, NY. (2018).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbory Laboratory Press. New York. (2000).
