Summary
アフリカツメガエル・ラエビス・ オタマジャクシ脊髄切断は、胸部レベルで脊髄を完全に切断する横方向切断を行うことによって脊髄損傷および再生を研究するための関連する傷害方法である。
Abstract
脊髄損傷(SCI)は永久的な苦痛であり、中枢神経系(CNS)運動および感覚神経に影響を及ぼし、損傷部位の下の麻痺をもたらす。今日まで、SCIに対する機能回復療法はなく、SCI後に起こる多くの複合体および動的事象に関する明確さに欠けている。多くの非哺乳類生物は、テレオスト魚類、ウロデレ両生類、およびアフリカツ メガエル・ラエビス・オ タマジャクシを含むアヌラン両生類の幼虫期など、重度のSCIの後に再生することができる。これらは、SCIに対する応答と成功した再生プロセスの根底にあるメカニズムを研究し、理解するための正真正銘のモデル生物です。この種の研究は、SCI治療介入の潜在的な標的の同定につながる可能性がある。この記事では、アフリカ ツメガエル・ラエビス ・オタマジャクシ脊髄切除(畜産、手術、術後ケア、機能テスト評価など)を行う方法について説明します。この傷害法は、細胞、分子、遺伝子のメカニズムを研究することによって脊髄再生のさまざまなステップを解明するために適用でき、SCI後および脊髄再生中の組織学的および機能的進化も可能である。
Introduction
脊髄損傷(SCI)は、世界中で毎年約250,000~500,000人が罹患している感染症です1。この高い有病率に加えて、SCIは感覚神経および運動神経に影響を及ぼし、損傷部位の下に麻痺を引き起こし、CNSの制御からいくつかの内臓を切断する。CNSの一部である脊髄は再生できず、苦痛の複雑さと関連するすべてのプロセスの完全な理解の欠如のために、機能回復を可能にする効率的な治療法はまだありません。
重度のSCI2,3,4の後に脊髄を再生することができるテレオスト魚類、ウロデレ両生類、およびアヌラン両生類の幼虫期などの非哺乳類生物は、成功した再生事象を支配するプロセスを研究し、哺乳類の再生の失敗を理解するための優れたモデル生物である。この理解は、SCIの新しい治療標的と可能な治療法を開発するための独自の洞察を提供できるため、非常に興味深いものです。
アヌランカエル、アフリカツメガエルは、SCIを研究するための優れたモデル生物です。それはオタマジャクシの段階で優れた再生能力を持ち、変態中に徐々に失われ、再生段階と非再生段階での実験を可能にします3,5。アフリカツメガエル・ラエビス・オタマジャクシのSCIを研究するための確立された傷害方法は、筋肉、脊索、脊髄などの組織を含む尾全体を除去した尾切断からなる6。このアプローチは、再生プロセスの一般的なメカニズムの理解に役立ってきました4,7,8,9,10。
尾部切断には脊髄に加えて複数の組織が関与し、ヒトSCI後に起こることとは異なるため、SCIの研究にはより関連性の高い傷害パラダイムが必要である。私たちは、傷害パラダイム5,12,13,14の包括的な記述を生成するために過去11で使用された研究と、SCI12,13,14,15,16,17,18の研究のためのさまざまな方法に頼ってきました。.脊髄切断後、脊髄の尾部を単離して、RNAおよびタンパク質発現およびハイスループット分析14、19、20、21を行うことができる。さらに、脊髄切除の前または後に、薬物および小分子のセロム内注射、ならびにcDNA、RNA、またはモルホリノのエレクトロポレーションは、SCIの予防または治療、またはSCIおよび脊髄再生後に起こる特定の事象におけるこれらの分子の効果の研究を可能にする13,14。.さらに、傷害の進化および再生過程は、生化学的、分子的、組織学的、および機能的アプローチ12,13,14,17,19,20,21,22,23を用いて、損傷後の異なるタイミングで研究することができる。
最後に、前述のすべての技術は非再生段階で使用でき、SCIを研究するためのモデル生物としてアフリカツメガエル・ラエビスを使用することの最も重要な利点の1つ、同じ種における再生および非再生メカニズムの比較研究13,19,20,21,22。この論文は、アフリカツメガエル・ラエビス・オタマジャクシ脊髄切断のためのプロトコルを提示し、再生ニュークープおよびフェイバー(NF)ステージ50オタマジャクシのステージングと選択から始まる。これに続いて、偽およびトランスエクト動物を産生するための脊髄手術、術後ケア、および最後に自由オタマジャクシ遊泳距離の測定による機能回復の分析の手順の説明が続く。
Protocol
このプロトコルは、脊髄切除を正常に行うのに十分な情報を提供します。注目すべきは、これらの技術の優れた詳細なプロトコルが他の場所で公開されており14、これはここで提示されたものを補完することができます。すべての動物処置は、ポンティフィシア・カトリカ・デ・チリ大学生物科学部の生命倫理およびバイオセーフティ委員会によって承認されています。
1.カエルの自然な交配
- 交配の3〜5日前に、雄および雌のカエルに50単位のヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を皮下注射する。カエルを拘束するために「鉄の爪」技術を使用してください。カエルは滑りやすいので、必要に応じてネットを使ってカエルを囲みます。26 G x 1/2インチの針の先端を横線に後方に挿入し、皮膚と筋肉の間にある1cmの深さまで背側に押し込みます。
- 交配する前に、男性に300単位、女性に700単位のhCGを注射する。
- 交配が起こるようにするには、4°Cで15分間スプリング条件に似せて溶液を冷却した直後に、雄と雌を0.1x Barth溶液2Lに入れ、18°Cで一晩放置する。
- 16時間後、先端を切り取ったプラスチック製のパスツールピペットの助けを借りて胚を慎重に収集し、直径10cmのペトリ皿に入れます。胚を25mLの2%システインと共に蒸留水(pH 7.8;溶液が胚を覆っていることを確認する)中で5分間わずかな攪拌でインキュベートすることによって、胚性ゼリーコートを除去する。蒸留水で3回、0.1x Barth溶液(8.9 mM NaCl; 102 μM KCl; 238.1 μM NaHCO3; 1 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES); 81.14 μM MgSO4; 33.88 μM Ca(NO3)2; 40.81 μM CaCl2, pH 7.6)で3回洗浄する。
- 茶色がかった色と対称的に分割ブラストメアを持つ健康な胚を選択します。直径10cmのペトリ皿に、50mLの0.1x Barth溶液を皿あたり100個以下の胚の密度で置く。
2. 畜産
- 最初の1週間は、胚をビテリン嚢から降りるまで18°Cに保ちます。この間、毎日Barth溶液を交換し、目に見える解剖学的変化または遊泳運動なしでオタマジャクシを示す白っぽい死んだ胚およびオタマジャクシを除去する。
- 最初の1週間後、オタマジャクシを1リットルあたり10匹の密度でプラスチックタンク内の塩素を含まない水に移します。オタマジャクシを20-21°Cで12時間の明暗サイクルで育て、各タンクに酸素石を用意して水を通気し、1匹あたり0.5mgを1日1回給餌します。週に一度水を入れ替え、毎日溜まった廃棄物や死んだ動物がいないかチェックしてください24。
3. ステージング
- 受精後3〜4週間で、動物をペトリ皿に入れます。次に、前肢と後肢の形態と外観を1つずつ確認します。必要に応じて、動物を0.1x Barth溶液中の0.02%トリカインメシル酸塩50mLを含むペトリ皿に入れて動物を麻酔し、より良い操作を行う。2分以内に、麻酔からの回復のために動物を0.1x Barth溶液に入れる。
- ステージ50の動物の次の解剖学的特徴を探してください25:ちょうど現れていて球形である前肢(図1)。突き出ていて球形の後肢(図1)。
注:ステージ49から51までの動物をこの手順に使用することができます(図1)。ステージの詳細については、NieuwkoopとFaberの アフリカツメガエルの正規表laevis25を参照してください。
4.手術:脊髄切除および偽手術動物
- ステージ50のオタマジャクシを、0.1x Barth溶液中のメシル酸トリカイン50mLを2分間含むペトリ皿に入れて麻酔する。
- 大さじ1杯と鉗子の助けを借りて、ガラスのペトリ皿の上半分にある濡れたガーゼの上に、背側のオタマジャクシを上向きに置きます。
- 微小解剖スプリングハサミを使用して、胸部中部レベルで皮膚および背筋の切開を行う(図2A、B)。
- 対照の偽物の場合、切開部サイズが〜0.2mmであることを確認してください(図2C)。脊髄を傷つけないでください(図2D、D')。
- トランスジェクトされた動物の場合、脊髄を完全にトランセクトするために、約0.2mmの第2切開(図2C)を行う(図2E、E ́)。
5. 術後ケア
- 手術後、オタマジャクシを1xペニシリン - ストレプトマイシンを含む0.5Lの0.1xバース溶液を含むタンクに、タンクあたり10〜12匹の密度で移す。トランスセクトされた動物を別々のタンクで維持し、制御する。
注:オタマジャクシは数分で麻酔から回復します。 - オタマジャクシを20〜21°Cの温度で曝気して維持する。
- 実験が終わるまで1日おきに抗生物質でバルト溶液を交換してください。
- 手術後1日、1日1回、動物に餌やりを始めます。
- 死んだ動物を排除します。
6. 水泳アッセイ
- 内側からLED照明が施された箱を、透明なポリスチレンシートで覆い、光が通過できるようにします。
- LEDボックスの上にカメラを取り付けます。
- 100mLの0.1x Barth溶液で満たされた箱の上に直径15cmのペトリ皿を置く。
- ある日、トランスセクションの後、ペトリ皿にオタマジャクシを置き、5分間の適応期間のために出発します。
- 適応後、参照されたソフトウェア( 材料表を参照)を使用して5分間、フリースイミング動作のビデオトラッキングを開始します。
- ビデオが完了したら、オタマジャクシをタンクに戻します。
- ビデオトラッキングを、切断後5日、10日、15日、および20日後に繰り返します(図3)。
7. 生命倫理的配慮
注:偽の手術および切除後の動物の死亡率は、それぞれ13%および30%である。さらに、統計分析には、1グループあたり最低15〜20匹の動物が必要です。したがって、23の偽物と26のトランスセクトされた動物から始めてください。
- 手術前のニューロンおよび運動活動および痛みの減少を確実にするために、0.02%メシル酸トリカインで動物を2分間麻酔する。
- 手術後、麻酔からの回復のために動物をチェックしてください。さらに、毎日動物に餌を与えてチェックしてください。
- 水泳アッセイを終えた後、メシル酸トリカイン(30mM重曹溶液中で調製した1%トリカインメシル酸塩)の過剰摂取で動物を屠殺する。
Representative Results
本明細書に記載のプロトコールは、 アフリカツメガエルのレービスにおける脊髄再生の研究を可能にする。脊髄再生における特定の薬理学的治療の効果および特定の遺伝子発現の寄与は、水泳回復に対するそれらの効果を測定することによって評価することができる。総遊泳距離は、特定の時点または指定された期間にわたって対照動物と治療動物を比較するために、傷害後の日数に対してプロットされる。経時的な運動機能の回復を 図3に例示し、切除後5、10、15、および20日における遊泳距離を示す。輪廻転生後5日目に、動物は5分間で平均0.7m泳ぎ、泳ぐ能力が低下した。この容量は、経時変化後10日と15日後にそれぞれ平均2.1m/5分と3.1m/5分が観察され、編入後20日で水泳能力の完全な回復が観察され、平均5.7m/5分で観察された。
図1:アフリカツメガエルオタマジャクシのステージング。 ステージ49〜51の代表的な画像は、動物ステージング参照のための前肢および後肢を示す。スケール バー = 2 mm。ボックス化された領域の倍率は、各画像の右下に表示されます。スケールバー = 1 mm。ステージ49では、前肢は観察されず、後肢は球形を示すだけで出現している。ステージ50は、ちょうど現れている前肢を球形に、後肢を球形で突出させて示す。ステージ51において、前肢は突出した球形を呈し、後肢は突出した細長い形状を示す。破線の輪郭は前肢と後肢を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:脊髄切除部 。 (A)動物の正しい位置を示す代表画像は、背側を上にして、手術を行うため。(B) A の倍率は、傷害の位置および程度を示す。赤十字は脊髄の胸部レベルでの損傷部位の正確な位置を示し、破線は傷害の程度を示す。(C) 脊髄の胸郭レベルの横方向図を示す代表的な画像。偽切開および切断の延長が示されている。破線は脊髄の限界を描いています。(D)無傷の脊髄を有する偽動物を示す代表的な画像。(E) 脊髄が中断されたトランスセクト動物を示す代表的な画像。スケールバー = 1 mm。ボックス化された領域の倍率は、各画像(D'およびE')の右下に示す。スケールバー = 1 mm. 略語: S = 偽切開;T = トランセクション。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:時間の経過に伴う水泳機能の回復 横断後5、10、15、および20日目における5分間のトランスセクト動物によってカバーされた水泳距離の代表的なドットプロット。遊泳軌道のサンプルが上に示されています。データは、10匹のオタマジャクシからSEM±平均として提示された。略語: dpT = トランスセクション後の日数;SEM = 平均の標準誤差。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
本明細書に記載されるプロトコルは、SCIを実行し、機能回復を評価するための優れた方法である。再現性のためには、健康なオタマジャクシを成長させ、サイズが似ている動物を選ぶことが不可欠です。適切な摂食の欠如は栄養ストレスを引き起こし、その結果、再生能力が低下します26。したがって、オタマジャクシの餌やりには特別な注意を払う必要があります。オタマジャクシは3〜4週間後にステージ50に達すると、成長プロセスを加速するためにより高い温度で飼育することができ、18〜25°Cが最適です27。動物は水の状態や化学製品に敏感であるため、水質は重要です。最適な水条件には、pH(6.5-7.5)、塩化物(<0.02 mg/L)、水の導電率(1.0 mS/cm ± 0.1 単位)、銅(<0.3 mg/L)の炭素ろ過された塩素を含まない水の使用が含まれます。炭酸塩硬度(KH:5-10dKH);一般的な硬度(GH:6-16 dGH);硝酸塩 (NO3: <20 ミリグラム/リットル);亜硝酸塩(NO2:<0.1 mg/L)14,27,28。さらに、汚染を避けるために、プラスチックタンクは、動物を飼育するために週に1回、または手術後1日おきに、塩化物を含まない水とスポンジで徹底的に洗浄する必要があります。洗剤は避けなければなりません。
手術後の生存率を向上させるために、オタマジャクシは長期間(2分以内)麻酔にさらしてはなりません。さらに、一度に1匹のオタマジャクシを麻酔することをお勧めします。動物は水分補給を続ける必要があるので、手術の前後に動物を常に溶液に浸したままにし、手術を始める前にオタマジャクシの上にスプーンで溶液を注ぎます。損傷が脊髄全体を覆うのに十分なほど広範囲であるが、機能回復不良または死を誘発する可能性があるため、広すぎないようにしてください。脊索が損傷すると、動物は曲がり、機能回復が影響を受けます。損傷が脊索を超えて広がると、死亡の確率が高まります14。水泳アッセイ中、ソフトウェアが青い影で各動物を識別する場合、記録は正しいと見なされます。それ以外の場合は、記録を繰り返す必要があります。記録ミスを防ぐために、記録プロセス中に動きや空気や光の変化を避けることが重要です。
脊髄の損傷と再生の根底にある細胞および分子のメカニズムについては、まだ多くの未解決の疑問があります。この研究で説明されているプロトコルは、水泳能力を測定することによって決定された、機能回復に対する異なる細胞事象、遺伝子発現、および治療の寄与を研究するために使用することができる。さらに、他の多くの技術を手術動物に適用することができる。脊髄を単離してタンパク質および/またはmRNA抽出14を行い、損傷および治療後のタンパク質および遺伝子発現プロファイルを研究することができます19,20。この手術はまた、脊髄細胞応答22と脊髄損傷後の神経幹前駆細胞12,13,22の挙動を研究するための基礎でもあった。脊髄再生に関与するシグナル伝達カスケードもまた、本明細書に記載の脊髄損傷パラダイムを用いて研究されている23。要約すると、ここで記載されるプロトコールは、脊髄損傷および再生を研究するための優れたモデルであり、主題に関する既存の知識に貢献してきた多くの研究に使用されてきた。
Disclosures
著者は宣言する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、PG Slater: FONDECYT N° 3190820からの研究助成金によって資金提供されました。J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
| ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
| Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
| Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
||
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
| Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
| HEPES | Gibco | 11344-041 | |
| Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
| KCl | Merck Millipore | 104936 | |
| LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
| MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
| Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
| NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
| Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
| Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
| pH meter | |||
| Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
| Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
| Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
| Sterilized gauze | |||
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
| Tablespoon | |||
| Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
|
| Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |
References
- International perspectives on spinal cord injury. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury (2013).
- Quiroz, J. F. D., Echeverri, K. Spinal cord regeneration: Where fish, frogs and salamanders lead the way, can we follow. Biochemical Journal. 451 (3), 353-364 (2013).
- Lee-Liu, D., Méndez-Olivos, E. E., Muñoz, R., Larraín, J. The African clawed frog Xenopus laevis: A model organism to study regeneration of the central nervous system. Neuroscience Letters. 652, 82-93 (2017).
- Phipps, L. S., Marshall, L., Dorey, K., Amaya, E. Model systems for regeneration: Xenopus. Development. 147 (6), (2020).
- Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larraín, J. Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates. Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).
- Beck, C. W., Christen, B., Slack, J. M. W. Molecular pathways needed for regeneration of spinal cord and muscle in a vertebrate. Developmental Cell. 5 (3), 429-439 (2003).
- Love, N. R., et al. Genome-wide analysis of gene expression during Xenopus tropicalis tadpole tail regeneration. BMC Developmental Biology. 11, 70 (2011).
- Love, N. R., et al. Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration. Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).
- Gargiolo, C., Slack, J. M. W. Cell lineage tracing during Xenopus tail regeneration. Development. 131 (11), 2669-2679 (2004).
- Lin, G., Chen, Y., Slack, J. M. W. Regeneration of neural crest derivatives in the Xenopus tadpole tail. BMC Developmental Biology. 7, 56 (2007).
- Filoni, S., Bosco, L., Cioni, C. Reconstitution of the spinal cord after ablation in larval Xenopus laevistle. Acta Embryologiae et Morphologiae Experimentalis. 5 (2), 109-129 (1984).
- Gaete, M., et al. Spinal cord regeneration in Xenopus tadpoles proceeds through activation of Sox2-positive cells. Neural Development. 7, 13 (2012).
- Muñoz, R., et al. Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells. Developmental Biology. 408 (2), 229-243 (2015).
- Edwards-Faret, G., et al. Spinal cord regeneration in Xenopus laevis. Nature Protocols. 12 (2), 372-389 (2017).
- Méndez-Olivos, E. E., Larraín, J. Cell transplantation as a method to investigate spinal cord regeneration in regenerative and nonregenerative xenopus stages. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (12), 943-947 (2018).
- Méndez-Olivos, E. E., Muñoz, R., Larraín, J. Spinal cord cells from pre-metamorphic stages differentiate into neurons and promote axon growth and regeneration after transplantation into the injured spinal cord of non-regenerative Xenopus laevis froglets. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 398 (2017).
- de Vidts, S., Méndez-Olivos, E., Palacios, M., Larraın, J., Mery, D. Characterization of spinal cord damage based on automatic video analysis of froglet swimming. Biology Open. 8 (12), 2-11 (2019).
- Slater, P. G., Palacios, M., Larraín, J. Xenopus, a model to study wound healing and regeneration: Experimental approaches. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (8), 100966 (2021).
- Lee-Liu, D., et al. Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages. Neural Development. 9, 12 (2014).
- Lee-Liu, D., Sun, L., Dovichi, N. J., Larraín, J. Quantitative proteomics after spinal cord injury (SCI) in a regenerative and a nonregenerative stage in the frog Xenopus laevis. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (4), 592-606 (2018).
- Peñailillo, J., et al. Analysis of the early response to spinal cord injury identi fi ed a key role for mTORC1 signaling in the activation of neural stem progenitor cells. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 68 (2021).
- Edwards-Faret, G., et al. Cellular response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages in Xenopus laevis. Neural Development. 16 (1), 2 (2021).
- Tapia, V. S., Herrera-Rojas, M., Larrain, J. JAK-STAT pathway activation in response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages of Xenopus laevis. Regeneration. 4 (1), 21-35 (2017).
- Ishibashi, S., Amaya, E. How to grow Xenopus laevis tadpole stages to adult. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (3), (2021).
- Normal table of Xenopus laevis (Daudin).: A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. (1994).
- Williams, M. C., Patel, J. H., Kakebeen, A. D., Wills, A. E. Nutrient availability contributes to a graded refractory period for regeneration in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 473, 59-70 (2021).
- Xenopus: Methods and protocols. Vleminckx, K. , Humana Press. New York, NY. (2018).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbory Laboratory Press. New York. (2000).
