Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

जेनोफस लेविस टैडपोल्स में स्पाइनल कॉर्ड ट्रांसेक्शन

Published: December 10, 2021 doi: 10.3791/63276
Automatic Translation
1, 1
1Center for Aging and Regeneration, Facultad de Ciencias Biológicas, P. Universidad Católica de Chile

Summary

जेनोफस लेविस टैडपोल स्पाइनल कॉर्ड ट्रांसेक्शन रीढ़ की हड्डी की चोट और पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक चोट विधि है जो एक अनुप्रस्थ कटौती करके है जो वक्षीय स्तर पर रीढ़ की हड्डी को पूरी तरह से अलग कर देता है।

Abstract

रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) एक स्थायी पीड़ा है, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) मोटर और संवेदी नसों को प्रभावित करती है, जिसके परिणामस्वरूप चोट स्थल के नीचे पक्षाघात होता है। आज तक, एससीआई के लिए कोई कार्यात्मक वसूली चिकित्सा नहीं है, और एससीआई के बाद होने वाली कई परिसरों और गतिशील घटनाओं के बारे में स्पष्टता की कमी है। कई गैर-स्तनधारी जीव गंभीर एससीआई के बाद पुनर्जीवित हो सकते हैं, जैसे कि टेलीओस्ट मछलियां, यूरोडेल उभयचर, और अनुरान उभयचरों के लार्वा चरण, जिनमें ज़ेनोफस लेविस टैडपोल शामिल हैं। ये एससीआई की प्रतिक्रिया और सफल पुनर्योजी प्रक्रियाओं के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने और समझने के लिए वास्तविक मॉडल जीव हैं। इस प्रकार के शोध से एससीआई चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए संभावित लक्ष्यों की पहचान हो सकती है। यह आलेख वर्णन करता है कि कैसे Xenopus laevis tadpole रीढ़ की हड्डी transection, पशुपालन, सर्जरी, posturgery देखभाल, और कार्यात्मक परीक्षण मूल्यांकन सहित प्रदर्शन करने के लिए। इस चोट विधि को सेलुलर, आणविक और आनुवंशिक तंत्र, साथ ही एससीआई के बाद और रीढ़ की हड्डी के पुनर्जनन के दौरान हिस्टोलॉजिकल और कार्यात्मक विकास का अध्ययन करके रीढ़ की हड्डी के उत्थान के विभिन्न चरणों को स्पष्ट करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) एक ऐसी पीड़ा है जो हर साल दुनिया भर में लगभग 250,000-500,000 लोगों को प्रभावित करती है। इस उच्च प्रसार के अलावा, एससीआई संवेदी और मोटर नसों को प्रभावित करता है, चोट साइट के नीचे पक्षाघात पैदा करता है और सीएनएस के नियंत्रण से कुछ आंतरिक अंगों का विच्छेदन करता है। रीढ़ की हड्डी, सीएनएस का एक हिस्सा, पुनर्जीवित नहीं हो सकता है, और पीड़ा की जटिलता और सभी शामिल प्रक्रियाओं की पूरी समझ की कमी के कारण, अभी भी कार्यात्मक वसूली की अनुमति देने वाले कोई कुशल उपचार नहीं हैं।

गैर-स्तनधारी जीव, जैसे कि टेलीओस्ट मछलियां, यूरोडेल उभयचर, और अनुरान उभयचरों के लार्वा चरण, जो गंभीर एससीआई 2,3,4 के बाद रीढ़ की हड्डी को पुनर्जीवित कर सकते हैं, उन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट मॉडल जीव हैं जो एक सफल पुनर्योजी घटना को नियंत्रित करते हैं और स्तनधारी पुनर्जनन की विफलता को समझते हैं। यह समझ बहुत रुचि की है क्योंकि यह एससीआई के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों और संभावित उपचारों को विकसित करने के लिए मूल अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है।

अनुरान मेंढक, ज़ेनोफस लेविस, एससीआई का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है। इसमें टैडपोल चरणों के दौरान उत्कृष्ट पुनर्योजी क्षमताएं होती हैं, जो कायापलट के दौरान उत्तरोत्तर खो जाती हैं, जिससे पुनर्योजी और गैर-नियामक चरणों में प्रयोग की अनुमति मिलती है3,5। जेनोफस लेविस टैडपोल में एससीआई का अध्ययन करने के लिए स्थापित चोट विधि में पूंछ विच्छेदन होता है, जहां पूरी पूंछ को हटा दिया जाता है, जिसमें मांसपेशियों, नोटोकोर्ड और रीढ़ की हड्डी जैसे ऊतक शामिल हैं। यह दृष्टिकोण पुनर्योजी प्रक्रियाओं के सामान्य तंत्र की समझ में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई गई है4,7,8,9,10।

चूंकि पूंछ विच्छेदन में रीढ़ की हड्डी के अलावा कई ऊतक शामिल होते हैं, जो मानव एससीआई के बाद क्या होता है, एससीआई के अध्ययन के लिए एक अधिक प्रासंगिक चोट प्रतिमान की आवश्यकता होती है। हमने चोट के प्रतिमान5,12,13,14 और SCI12,13,14,14,15,16,17,18 के अध्ययन के लिए विभिन्न तरीकों के व्यापक विवरण उत्पन्न करने के लिए पिछले 11 में उपयोग किए गए अध्ययनों पर भरोसा किया है . रीढ़ की हड्डी के ट्रांससेक्शन के बाद, रीढ़ की हड्डी के पुच्छल भाग को आरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति और उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण 14,19,20,21 के लिए अलग किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, दवाओं और छोटे अणुओं के इंट्रासेलोमिक इंजेक्शन, साथ ही साथ सीडीएनए, आरएनए, या मॉर्फोलिनोस के इलेक्ट्रोपोरेशन, रीढ़ की हड्डी के ट्रांससेक्शन से पहले या बाद में, एससीआई की रोकथाम या उपचार में इन अणुओं के प्रभावों के अध्ययन की अनुमति देते हैं या एससीआई और रीढ़ की हड्डी के पुनर्जनन के बाद होने वाली विशिष्ट घटनाओं के अध्ययन की अनुमति देते हैं13,14 . इसके अलावा, चोट के विकास और पुनर्योजी प्रक्रियाओं का अध्ययन जैव रासायनिक, आणविक, हिस्टोलॉजिकल और कार्यात्मक दृष्टिकोण 12,13,14,17,19,20,21,22,23 का उपयोग करके चोट के बाद अलग-अलग समय पर किया जा सकता है।

अंत में, सभी उपर्युक्त तकनीकों का उपयोग गैर-पुनर्योजी चरणों में किया जा सकता है, जो एससीआई का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में ज़ेनोफस लेविस का उपयोग करने के सबसे महत्वपूर्ण फायदों में से एक को उजागर करता है, एक ही प्रजाति में पुनर्योजी और गैर-पुनर्योजी तंत्र के तुलनात्मक अध्ययन13,19,20,21,22। यह पेपर जेनोफस लेविस टैडपोल स्पाइनल कॉर्ड ट्रांससेक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जो पुनर्योजी नियूवकूप और फेबर (एनएफ) चरण 50 टैडपोल के मंचन और चयन के साथ शुरू होता है। इसके बाद रीढ़ की हड्डी की सर्जरी के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया जाता है ताकि शाम और ट्रांसेक्टेड जानवरों का उत्पादन किया जा सके, पोस्टसर्जिकल देखभाल, और अंत में मुफ्त टैडपोल तैराकी दूरी के माप द्वारा कार्यात्मक वसूली का विश्लेषण किया जा सके।

Protocol

यह प्रोटोकॉल रीढ़ की हड्डी के ट्रांसेक्शन को सफलतापूर्वक करने के लिए पर्याप्त जानकारी प्रदान करता है। ध्यान दें, कहीं और प्रकाशित इन तकनीकों के उत्कृष्ट विस्तृत प्रोटोकॉल हैं14, जो यहां प्रस्तुत एक के पूरक हो सकते हैं। सभी पशु प्रक्रियाओं Bioethics और Biosafety पर समिति द्वारा जैविक विज्ञान संकाय, Pontificia Universidad Católica de चिली से अनुमोदित किया गया है।

1. मेंढकों के प्राकृतिक संभोग

  1. संभोग से तीन से पांच दिन पहले, मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी) की 50 इकाइयों के साथ चमड़े के नीचे पुरुष और मादा मेंढकों को प्रीइंजेक्ट करें। मेंढकों को रोकने के लिए "लोहे के पंजे" तकनीक का उपयोग करें; के रूप में मेंढक फिसलन रहे हैं, यदि आवश्यक हो तो मेंढक को घेरने के लिए एक जाल का उपयोग करें। पार्श्व रेखा के पीछे एक 26 जी x 1/2 "सुई की नोक डालें, इसे त्वचा और मांसपेशियों के बीच 1 सेमी की गहराई तक पृष्ठीय रूप से धक्का दें।
  2. संभोग से पहले, 300 इकाइयों के साथ पुरुष और एचसीजी की 700 इकाइयों के साथ महिला को इंजेक्ट करें।
  3. संभोग होने के लिए, पुरुष और मादा को वसंत की स्थिति के समान दिखने के लिए 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को ठंडा करने के तुरंत बाद 0.1x बार्थ समाधान के 2 एल में रखें और 18 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दें।
  4. सोलह घंटे बाद, ध्यान से एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट की मदद से भ्रूण को इकट्ठा करें, टिप को काट दिया गया है, और उन्हें 10 सेमी व्यास के पेट्री व्यंजनों में रखें। आसुत जल (पीएच 7.8; सुनिश्चित करें कि समाधान भ्रूण को कवर करता है) में 25 मिलीलीटर 2% सिस्टीन के साथ भ्रूण को इनक्यूबेट करके भ्रूण जेली कोट को हटा दें, मामूली आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए। आसुत पानी के साथ 3 बार और 0.1x बार्थ समाधान (8.9 mM NaCl; 102 μM KCl; 238.1 μM NaHCO3; 1 mM 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid (HEPES); 81.14 μM MgSO4; 33.88 μM Ca(NO3)2; 40.81 μM CaCl2, pH.6 के साथ 3 बार धोएं।
  5. स्वस्थ भ्रूण का चयन करें जिसमें एक भूरा रंग और सममित रूप से विभाजित ब्लास्टोमेरेस होता है। भ्रूण को 10 सेमी व्यास के पेट्री व्यंजनों में 50 मिलीलीटर 0.1x बार्थ समाधान के साथ प्रति डिश 100 से अधिक भ्रूण के घनत्व पर रखें।

2. पशुपालन

  1. पहले सप्ताह के दौरान, भ्रूण को 18 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें जब तक कि वे विटेलिन थैली से बाहर नहीं निकल जाते। इस समय के दौरान, हर दिन बार्थ समाधान बदलें, और किसी भी तैराकी आंदोलन के बिना किसी भी दृश्यमान शारीरिक परिवर्तन या टैडपोल को प्रस्तुत करने वाले सफेद मृत भ्रूण और टैडपोल को हटा दें।
  2. पहले सप्ताह के बाद, 10 जानवरों प्रति लीटर के घनत्व पर प्लास्टिक टैंकों में क्लोरीन मुक्त पानी में टैडपोल को स्थानांतरित करें। 12-h प्रकाश / 12-h अंधेरे चक्र के साथ 20-21 °C पर टैडपोल विकसित करें, जिसमें पानी को वातित करने के लिए प्रत्येक टैंक में ऑक्सीजन पत्थर उपलब्ध होते हैं और प्रति जानवर 0.5 मिलीग्राम के साथ दिन में एक बार खिलाया जाता है। सप्ताह में एक बार पानी बदलें और दैनिक रूप से संचित अपशिष्ट और मृत जानवरों की जांच करें।

3. स्टेजिंग

  1. निषेचन के तीन से चार सप्ताह बाद, जानवरों को पेट्री डिश में रखें; फिर, एक-एक करके, आकृति विज्ञान और forelimbs और hindlimbs की उपस्थिति की जांच करें। यदि आवश्यक हो, तो जानवरों को एक पेट्री डिश में 50 मिलीलीटर 0.02% ट्राइकेन मेसिलेट के साथ 0.1x बार्थ समाधान में बेहतर हेरफेर के लिए रखकर जानवरों को बेहोश करें। 2 मिनट से अधिक नहीं के बाद, संज्ञाहरण से वसूली के लिए जानवरों को 0.1x बार्थ समाधान में रखें।
  2. चरण 50 जानवरों की निम्नलिखित शारीरिक विशेषताओं की तलाश करें25: फोरलिम्ब्स जो अभी दिखाई दे रहे हैं और गोलाकार हैं (चित्रा 1); हिंडलिंब्स जो उभरे हुए हैं और गोलाकार हैं (चित्र 1)।
    नोट: इस प्रक्रिया के लिए चरण 49 से 51 तक के जानवरों का उपयोग किया जा सकता है (चित्र1); चरणों के बारे में अधिक जानकारी के लिए, Nieuwkoop और फेबर की जेनोफस laevis25 की सामान्य तालिका देखें।

4. सर्जरी: रीढ़ की हड्डी transection और शाम संचालित जानवरों

  1. 2 मिनट के लिए 0.1x बार्थ समाधान में 0.02% ट्राइकेन मेसिलेट के 50 मिलीलीटर के साथ एक पेट्री डिश में रखकर स्टेज 50 टैडपोल्स को एनेस्थेटिकाइज़ करें।
  2. एक चम्मच और संदंश की मदद से, टैडपोल, पृष्ठीय साइड-अप, एक ग्लास पेट्री डिश के ऊपरी आधे हिस्से में धुंध के गीले टुकड़े पर रखें।
  3. माइक्रोडिसेक्शन स्प्रिंग कैंची का उपयोग करके मध्य-वक्षीय स्तर (चित्रा 2 ए, बी) पर त्वचा और पृष्ठीय मांसपेशियों का एक चीरा करें।
    1. नियंत्रण शाम जानवरों के लिए, सुनिश्चित करें कि चीरा आकार केवल ~ 0.2 मिमी (चित्रा 2 सी) है; रीढ़ की हड्डी को नुकसान न पहुंचाएं (चित्रा 2 डी, डी')।
    2. transacted जानवरों के लिए, रीढ़ की हड्डी को पूरी तरह से ट्रांसेक्ट करने के लिए ~ 0.2 मिमी (चित्रा 2C) का दूसरा चीरा करें (चित्रा 2E, E')।

5. Posturgery देखभाल

  1. सर्जरी के बाद, टैडपोल को एक टैंक में स्थानांतरित करें जिसमें प्रति टैंक 10-12 जानवरों के घनत्व पर 1x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ 0.1x बार्थ समाधान के 0.5 एल शामिल हैं। अलग टैंकों में transacted और नियंत्रण शाम जानवरों को बनाए रखने.
    नोट: Tadpoles मिनटों की एक जोड़ी में संज्ञाहरण से ठीक हो जाएगा।
  2. 20-21 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर वातन के साथ टैडपोल बनाए रखें।
  3. प्रयोग के अंत तक हर दूसरे दिन एंटीबायोटिक दवाओं के साथ बार्थ समाधान बदलें।
  4. सर्जरी के एक दिन बाद जानवरों को खिलाना शुरू करें, प्रति दिन एक बार।
  5. मृत जानवरों को खत्म करें।

6. तैराकी परख

  1. अंदर से एलईडी रोशनी के साथ एक बॉक्स प्राप्त करें, जो एक पारदर्शी पॉलीस्टीरीन शीट के साथ कवर किया गया है, जो प्रकाश को पारित करने की अनुमति देता है।
  2. एलईडी बॉक्स पर एक कैमरा स्थापित करें।
  3. बॉक्स के शीर्ष पर एक 15 सेमी व्यास पेट्री डिश रखें, जो 0.1x बार्थ समाधान के 100 मिलीलीटर से भरा हुआ है।
  4. एक दिन के बाद ट्रांसेक्शन, पेट्री डिश में एक टैडपोल रखें और 5 मिनट की अनुकूलन अवधि के लिए छोड़ दें।
  5. अनुकूलन के बाद, 5 मिनट के लिए संदर्भित सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके मुक्त-तैराकी व्यवहार को वीडियो-ट्रैक करना शुरू करें।
  6. वीडियो पूरा होने के बाद, टैडपोल को वापस अपने टैंक में स्थानांतरित करें।
  7. वीडियो ट्रैकिंग 5, 10, 15, और 20 दिनों के बाद ट्रांससेक्शन (चित्रा 3) को दोहराएं।

7. Bioethical विचार

नोट: शाम सर्जरी और transection के बाद जानवरों की मृत्यु दर क्रमशः 13% और 30% है। इसके अतिरिक्त, सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रति समूह कम से कम 15-20 जानवर आवश्यक हैं। इसलिए, 23 शाम और 26 ट्रांसेक्टेड जानवरों के साथ शुरू करें।

  1. सर्जरी से पहले न्यूरोनल और मोटर गतिविधि और दर्द में कमी का आश्वासन देने के लिए 2 मिनट के लिए 0.02% ट्राइकेन मेसिलेट के साथ जानवरों को एनेस्थेटिक करें।
  2. सर्जरी के बाद, संज्ञाहरण से वसूली के लिए जानवरों की जांच करें। इसके अतिरिक्त, जानवरों को दैनिक रूप से खिलाएं और जांचें।
  3. तैराकी परख खत्म करने के बाद, tricaine mesylate की एक ओवरडोज के साथ जानवरों की बलि (1% tricaine mesylate 30 mM सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान में तैयार).

Representative Results

यहां वर्णित प्रोटोकॉल जेनोफस लेविस में रीढ़ की हड्डी के उत्थान के अध्ययन की अनुमति देता है। विशिष्ट औषधीय उपचारों के प्रभाव और रीढ़ की हड्डी के उत्थान में विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति के योगदान का मूल्यांकन तैराकी वसूली पर उनके प्रभावों को मापकर किया जा सकता है। कुल तैराकी दूरी को चोट के बाद के दिनों के खिलाफ एक विशिष्ट समय बिंदु पर या एक निर्दिष्ट अवधि में नियंत्रण और इलाज किए गए जानवरों की तुलना करने के लिए प्लॉट किया जाता है। समय के माध्यम से मोटर फ़ंक्शन की वसूली को चित्रा 3 में उदाहरण दिया गया है, जिसमें तैराकी की दूरी 5, 10, 15 और 20 दिनों के बाद ट्रांसेक्शन दिखाई देती है। ट्रांससेक्शन के बाद 5 दिनों में, जानवरों ने 5 मिनट में औसतन 0.7 मीटर तैराकी की, जो कम तैराकी क्षमता दिखाता है। यह क्षमता गुजरते दिनों के साथ बढ़ी, क्योंकि क्रमशः 10 और 15 दिनों के बाद 2.1 और 3.1 मीटर / 5 मिनट का औसत देखा गया था, और तैराकी क्षमताओं की पूरी वसूली 20 दिनों के बाद ट्रांससेक्शन के बाद देखी गई थी, जिसमें औसतन 5.7 मीटर / 5 मिनट था।

Figure 1
चित्रा 1: ज़ेनोफस टैडपोल स्टेजिंग। चरण49-51 की प्रतिनिधि छवियां, पशु मंचन संदर्भ के लिए अग्र-और हिंडलिंब्स दिखा रही हैं। स्केल सलाखों = 2 मिमी. बॉक्स्ड क्षेत्र के आवर्धन प्रत्येक छवि के निचले-दाएं में दिखाए जाते हैं। स्केल सलाखों = 1 मिमी. चरण 49 में, अग्रभाग नहीं देखे जाते हैं, जबकि हिंडलिम्ब्स सिर्फ दिखाई दे रहे हैं, एक गोलाकार आकार दिखा रहे हैं। स्टेज 50 फोरलिंब्स प्रस्तुत करता है जो अभी दिखाई दे रहे हैं, एक गोलाकार आकार दिखाते हैं और एक गोलाकार आकार के साथ उभरे हुए हिंडलिंब्स दिखाते हैं। चरण 51 में, अग्रभाग एक उभरे हुए गोलाकार आकार को प्रस्तुत करते हैं और एक उभरे हुए लम्बी आकृति को पीछे छोड़ देते हैं। धराशायी रूपरेखाएं अग्र-और हिंडलिंब्स दिखाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: रीढ़ की हड्डी transection. (ए) प्रतिनिधि छवि सर्जरी करने के लिए जानवर, पृष्ठीय पक्ष ऊपर की सही स्थिति को दर्शाती है। स्केल बार = 2 मिमी (बी) ए का आवर्धन चोट के स्थान और सीमा को दर्शाता है। लाल क्रॉस रीढ़ की हड्डी के वक्षीय स्तर पर चोट स्थल के सटीक स्थान को दर्शाता है, और धराशायी रेखा चोट की सीमा को दर्शाती है। स्केल बार = 1 मिमी (सी) प्रतिनिधि छवि रीढ़ की हड्डी के वक्षीय स्तर का एक पार्श्व दृश्य दिखाती है। शाम चीरा और transection के विस्तार को दिखाया गया है। डैश्ड लाइनें रीढ़ की हड्डी की सीमाओं को चित्रित करती हैं। स्केल बार = 1 मिमी (डी) प्रतिनिधि छवि एक बरकरार रीढ़ की हड्डी के साथ एक शाम जानवर दिखा रही है। स्केल सलाखों = 1 मिमी (ई) प्रतिनिधि छवि एक बाधित रीढ़ की हड्डी के साथ एक transacted जानवर दिखा रहा है। स्केल सलाखों = 1 मिमी. बॉक्स्ड क्षेत्र के आवर्धन प्रत्येक छवि (डी' और ई') के निचले-दाएं में दिखाए गए हैं। स्केल सलाखों = 1 मिमी संक्षेप: S = शाम चीरा; T = transection कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: तैराकी समारोह समय के साथ वसूली. तैराकी दूरी के प्रतिनिधि डॉट प्लॉट 5 मिनट में 5 मिनट में transacted जानवरों द्वारा कवर किया गया 5, 10, 15, और 20 दिनों के बाद transection. तैराकी प्रक्षेपवक्र के नमूने शीर्ष पर दिखाए गए हैं। डेटा 10 टैडपोल से SEM ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया गया। संक्षेप: dpT = दिन के बाद transection; SEM = माध्य की मानक त्रुटि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एससीआई करने और कार्यात्मक वसूली का मूल्यांकन करने के लिए एक उत्कृष्ट तरीका है। पुनरुत्पादन के लिए, स्वस्थ टैडपोल विकसित करना और उन जानवरों को चुनना आवश्यक है जो आकार में समान हैं। उचित भोजन की कमी पोषक तत्वों के तनाव को उत्पन्न करती है, जिसके परिणामस्वरूप खराब पुनर्योजी क्षमताएं होती हैं26; इसलिए, टैडपोल फीडिंग पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। जैसा कि टैडपोल 3-4 सप्ताह के बाद चरण 50 तक पहुंचते हैं, उन्हें विकास प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए उच्च तापमान पर पाला जा सकता है, 18-25 डिग्री सेल्सियस इष्टतम 27 है। पानी की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है, क्योंकि जानवर पानी की स्थिति और रासायनिक उत्पादों के प्रति संवेदनशील हैं। इष्टतम पानी की स्थिति में निम्नलिखित मापदंडों के साथ कार्बन फ़िल्टर किए गए, क्लोरीन मुक्त पानी का उपयोग करना शामिल है: पीएच (6.5-7.5), क्लोराइड (<0.02 मिलीग्राम / एल), पानी की चालकता (1.0 एमएस / सेमी ± 0.1 यूनिट), तांबा (<0.3 मिलीग्राम / एल); कार्बोनेट कठोरता (KH: 5-10 dKH); सामान्य कठोरता (GH: 6-16 dGH); नाइट्रेट (NO3: <20 मिलीग्राम / एल); और नाइट्राइट (NO2: <0.1 मिलीग्राम / एल) 14,27,28। इसके अतिरिक्त, संदूषण से बचने के लिए, प्लास्टिक टैंकों को सप्ताह में एक बार जानवरों के पालन के लिए या सर्जरी के बाद क्लोराइड मुक्त पानी और स्पंज के साथ अच्छी तरह से धोकर हर दूसरे दिन साफ किया जाना चाहिए; डिटर्जेंट से बचना चाहिए।

सर्जरी के बाद बेहतर जीवित रहने की दर के लिए, टैडपोल को लंबे समय तक संज्ञाहरण के संपर्क में नहीं आना चाहिए (2 मिनट से अधिक नहीं)। इसके अलावा, एक समय में एक टैडपोल को एनेस्थेटाइज़ करने की सिफारिश की जाती है। जैसा कि जानवरों को हाइड्रेटेड रहने की आवश्यकता होती है, सर्जरी से पहले और बाद में जानवरों को हर समय समाधान में डुबोए रखें, और सर्जरी शुरू करने से पहले टैडपोल के शीर्ष पर एक चम्मच के साथ समाधान डालें। सुनिश्चित करें कि क्षति पूरी रीढ़ की हड्डी को कवर करने के लिए पर्याप्त व्यापक है, लेकिन बहुत व्यापक नहीं है क्योंकि यह खराब कार्यात्मक वसूली या मृत्यु को प्रेरित कर सकती है। यदि notochord क्षतिग्रस्त हो जाता है, तो जानवर मुड़ा होगा, और कार्यात्मक वसूली प्रभावित होगी। यदि क्षति notochord से परे फैली हुई है, तो मृत्यु की संभावना बढ़ जाती है14। तैराकी परख के दौरान, रिकॉर्डिंग सही माना जाता है अगर सॉफ्टवेयर एक नीली छाया के साथ प्रत्येक जानवर की पहचान करता है; अन्यथा, रिकॉर्डिंग को दोहराया जाना चाहिए। रिकॉर्डिंग गलतियों को रोकने के लिए रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के दौरान आंदोलन और हवा या प्रकाश परिवर्तनों से बचना महत्वपूर्ण है।

रीढ़ की हड्डी की क्षति और पुनर्जनन के अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र के बारे में अभी भी कई खुले प्रश्न हैं। इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न सेलुलर घटनाओं, जीन अभिव्यक्ति और कार्यात्मक वसूली पर उपचार के योगदान का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जो तैराकी क्षमताओं को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है। इसके अतिरिक्त, कई अन्य तकनीकों को संचालित जानवरों पर लागू किया जा सकता है। रीढ़ की हड्डी को प्रोटीन और / या एमआरएनए निष्कर्षण करने के लिए अलग किया जा सकता है14 क्षति और उपचार के बाद प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए 19,20। यह सर्जरी रीढ़ की हड्डी की सेलुलर प्रतिक्रिया 22 और रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद तंत्रिका स्टेम पूर्वज कोशिकाओं के व्यवहार 12,13,22 के व्यवहार का अध्ययन करने का आधार भी रही है। रीढ़ की हड्डी के पुनर्जनन में शामिल सिग्नलिंग कैस्केड का भी अध्ययन किया गया है रीढ़ की हड्डी की क्षति प्रतिमान का उपयोग करके यहां वर्णित 23। संक्षेप में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल रीढ़ की हड्डी की चोट और पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है और इसका उपयोग कई अध्ययनों के लिए किया गया है जिन्होंने विषय के बारे में मौजूदा ज्ञान में योगदान दिया है।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम से अनुसंधान अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था: पीजी स्लेटर: FONDECYT N ° 3190820; जे Larraín: FONDECYT N° 1180429, केयर चिली यूसी-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air pump Regent CALM RC-006 For oxygen diffuser stones function
ANY-maze software Stoelting Swimming behavior test
Ca(NO3)2·4H2O Sigma-Aldrich 237124
CaCl2·2H2O Sigma-Aldrich 223506
Camera Stoelting 60528 Swimming behavior test
Computer Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk,
1 available USB port, 1,366 × 768 monitor)
Cysteine Sigma-Aldrich C7352
Dissecting stereomicroscope Nikon SMZ745T Surgery / staging
Glass Petri dishes 100 x 20 mm
HEPES Gibco 11344-041
Human chorionic gonadotropin It can be found in different formats in the pharmacy
KCl Merck Millipore 104936
LED light box custom made wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet)
MgSO4·7H2O Merck Millipore 105886
Microdissection scissors for transection Fine Science Tools 15003-08 Spring Scissors for surgery
MS-222 Sigma-Aldrich E10521 Anesthetic; tricaine mesylate
NaCl Merck Millipore 106404
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6014
Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus Nasco SB09480(LM)MX Food for Xenopus tadpoles stage  44 to 60
Oxygen diffuser stones Pentair AA1 Mantainance of animals
Pair of forceps Fine Science Tools Dumont n° 5 SF forceps For surgery
Penicillin Sigma-Aldrich P7794
pH meter
Plastic Pasteur pipette Sigma-Aldrich Z331740 For collecting embryos after mating
Plastic Petri dishes Sigma-Aldrich P5981 150 x 15 mm
Plastic tank/box with lid 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar
Sterilized gauze
Streptomycin Sigma-Aldrich S1277
Tablespoon
Xenopus laevis
specialized strains and lines		 National Xenopus Resource
European Xenopus Resource Centre
Xenopus laevis Research Resource Centre		 http://www.mbl.edu/xenopus
https://xenopusresource.org/
https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx
Xenopus laevis wild type Xenopus 1
Xenopus Express		 https://xenopus1.com
http://www.xenopus.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. International perspectives on spinal cord injury. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury (2013).
  2. Quiroz, J. F. D., Echeverri, K. Spinal cord regeneration: Where fish, frogs and salamanders lead the way, can we follow. Biochemical Journal. 451 (3), 353-364 (2013).
  3. Lee-Liu, D., Méndez-Olivos, E. E., Muñoz, R., Larraín, J. The African clawed frog Xenopus laevis: A model organism to study regeneration of the central nervous system. Neuroscience Letters. 652, 82-93 (2017).
  4. Phipps, L. S., Marshall, L., Dorey, K., Amaya, E. Model systems for regeneration: Xenopus. Development. 147 (6), (2020).
  5. Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larraín, J. Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates. Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).
  6. Beck, C. W., Christen, B., Slack, J. M. W. Molecular pathways needed for regeneration of spinal cord and muscle in a vertebrate. Developmental Cell. 5 (3), 429-439 (2003).
  7. Love, N. R., et al. Genome-wide analysis of gene expression during Xenopus tropicalis tadpole tail regeneration. BMC Developmental Biology. 11, 70 (2011).
  8. Love, N. R., et al. Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration. Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).
  9. Gargiolo, C., Slack, J. M. W. Cell lineage tracing during Xenopus tail regeneration. Development. 131 (11), 2669-2679 (2004).
  10. Lin, G., Chen, Y., Slack, J. M. W. Regeneration of neural crest derivatives in the Xenopus tadpole tail. BMC Developmental Biology. 7, 56 (2007).
  11. Filoni, S., Bosco, L., Cioni, C. Reconstitution of the spinal cord after ablation in larval Xenopus laevistle. Acta Embryologiae et Morphologiae Experimentalis. 5 (2), 109-129 (1984).
  12. Gaete, M., et al. Spinal cord regeneration in Xenopus tadpoles proceeds through activation of Sox2-positive cells. Neural Development. 7, 13 (2012).
  13. Muñoz, R., et al. Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells. Developmental Biology. 408 (2), 229-243 (2015).
  14. Edwards-Faret, G., et al. Spinal cord regeneration in Xenopus laevis. Nature Protocols. 12 (2), 372-389 (2017).
  15. Méndez-Olivos, E. E., Larraín, J. Cell transplantation as a method to investigate spinal cord regeneration in regenerative and nonregenerative xenopus stages. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (12), 943-947 (2018).
  16. Méndez-Olivos, E. E., Muñoz, R., Larraín, J. Spinal cord cells from pre-metamorphic stages differentiate into neurons and promote axon growth and regeneration after transplantation into the injured spinal cord of non-regenerative Xenopus laevis froglets. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 398 (2017).
  17. de Vidts, S., Méndez-Olivos, E., Palacios, M., Larraın, J., Mery, D. Characterization of spinal cord damage based on automatic video analysis of froglet swimming. Biology Open. 8 (12), 2-11 (2019).
  18. Slater, P. G., Palacios, M., Larraín, J. Xenopus, a model to study wound healing and regeneration: Experimental approaches. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (8), 100966 (2021).
  19. Lee-Liu, D., et al. Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages. Neural Development. 9, 12 (2014).
  20. Lee-Liu, D., Sun, L., Dovichi, N. J., Larraín, J. Quantitative proteomics after spinal cord injury (SCI) in a regenerative and a nonregenerative stage in the frog Xenopus laevis. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (4), 592-606 (2018).
  21. Peñailillo, J., et al. Analysis of the early response to spinal cord injury identi fi ed a key role for mTORC1 signaling in the activation of neural stem progenitor cells. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 68 (2021).
  22. Edwards-Faret, G., et al. Cellular response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages in Xenopus laevis. Neural Development. 16 (1), 2 (2021).
  23. Tapia, V. S., Herrera-Rojas, M., Larrain, J. JAK-STAT pathway activation in response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages of Xenopus laevis. Regeneration. 4 (1), 21-35 (2017).
  24. Ishibashi, S., Amaya, E. How to grow Xenopus laevis tadpole stages to adult. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (3), (2021).
  25. Normal table of Xenopus laevis (Daudin).: A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. (1994).
  26. Williams, M. C., Patel, J. H., Kakebeen, A. D., Wills, A. E. Nutrient availability contributes to a graded refractory period for regeneration in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 473, 59-70 (2021).
  27. Xenopus: Methods and protocols. Vleminckx, K. , Humana Press. New York, NY. (2018).
  28. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbory Laboratory Press. New York. (2000).

Tags

जीव विज्ञान अंक 178
<em>जेनोफस लेविस</em> टैडपोल्स में स्पाइनल कॉर्ड ट्रांसेक्शन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Slater, P. G., Larraín, J.… More

Slater, P. G., Larraín, J. Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles. J. Vis. Exp. (178), e63276, doi:10.3791/63276 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter