Summary
이 프로토콜은 단일 세포 소화가 있거나없는 식도 선암종 오가노이드의 계대 배양 및 냉동 보존 방법을 설명하여 연구자가 실험 설계에 따라 적절한 전략을 선택할 수 있도록합니다.
Abstract
종양 발생 및 치료 전략을 탐구하기 위해 원발성 질병을 반영하는 적절한 번역 연구 모델의 부족은 식도 선암종 (EAC)의 주요 장애물입니다. 환자 유래 오가노이드(PDOs)는 최근 다양한 암에서 주목할만한 전임상 모델로 부상하고 있다. 그러나 EAC PDO를 개발하는 데 사용할 수 있는 프로토콜은 여전히 제한적입니다. PDO가 확립되면 전파 및 냉동 보존은 추가 다운스트림 분석에 필수적입니다. 여기서, EAC PDOs 계대 배양 및 냉동 보존, 즉 단일 세포 소화 유무에 관계없이 두 가지 상이한 방법이 표준화되었다. 두 방법 모두 적절한 세포 생존력을 안정적으로 얻을 수 있으며 다양한 실험 설정에 적용 할 수 있습니다. 현재의 연구는 단일 세포 소화로 EAC PDO를 계대배양하는 것이 세포 수 조절, 균일 한 밀도 및 크기 추적을 용이하게하는 중공 구조를 필요로하는 대부분의 실험에 적합하다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 단일 세포 기반 방법은 냉동 스톡으로부터 재배양 후뿐만 아니라 배양에서 느린 성장을 보여준다. 게다가, 단일 세포 소화로 계대 배양하는 것은 중공 코어로 중공 구조를 형성하는 것이 특징입니다. 대조적으로, 단일 세포 소화 없이 EAC PDO를 처리하는 것은 동결보존, 확장 및 조직학적 특성화에 유리하다. 이 프로토콜에서는 단일 세포 소화가 있거나없는 EAC PDO의 계대 배양 및 냉동 보존의 장단점을 설명하여 연구자가 오가노이드를 처리하고 조사하는 적절한 방법을 선택할 수 있도록합니다.
Introduction
식도암 (EC)은 전 세계적으로 암으로 인한 사망의 열 번째이자 여섯 번째 주요 원인입니다1. 식도 선암종 (EAC)은 EC의 주요 조직 학적 아형 중 하나이며 주로 서구 국가2에서 발생합니다. 최근 십 년 동안 EAC 발생률은 독일3을 포함한 많은 선진국에서 크게 증가했습니다. 암의 공격성과 종양 발달 초기 단계 동안의 증상 부족으로 인해 EAC 환자의 전반적인 예후는 좋지 않아 약 20 % 2,4,5의 5 년 생존율을 보여줍니다.
이십 세기 후반부터 EAC의 생물 의학 연구를 위해 몇 가지 모델이 수립되었습니다. 1990 년대6에 설립 된 고전적인 인간 EAC 세포주는 EAC 종양 생물학, 종양 유전학 및 항 종양 전략에 대한 지식을 확장하며 EAC 연구에 일반적으로 사용됩니다. 게다가, 일부 연구 그룹은 외과 적 또는 염증성 접근법 7,8,9을 통해 위식도 역류와 같은 알려진 위험 인자에 동물을 노출시킴으로써 EAC 또는 Barrett의 식도의 동물 모델을 성공적으로 개발했습니다. 또한, EAC 원발성 암 조직을 면역결핍 마우스에 피하 또는 직교적으로 이식하는 환자 유래 이종이식편(PDX) 모델은, 인간 EAC 종양 생물학적 거동 및 종양 환경을 시뮬레이션하기 위해 개발되었다(10,11,12). 그러나 이러한 모델이 임상 적용을 개선하고 EAC 종양 발생 및 진행의 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해에도 불구하고 이러한 연구 모델의 결과를 인간으로 추정하는 데는 여전히 중요한 과제가 있습니다.
환자 유래 종양 오가노이드(PDO)는 시험관내에서 인간 발달 및 장기 재생을 모방하는 3D 배양 시스템에서 성장한다. 환자의 원발성 조직으로부터 생성된 PDO는 인간 종양의 분자 및 표현형 특성을 재해석하고 약물 개발 및 개인화된 암 치료에서 유망한 응용을 보여주었다(13,14). EAC PDO의 열 가지 사례를 쌍을 이룬 종양 조직과 비교함으로써, EAC PDO는 원발성 종양과 유사한 조직병리학적 특징 및 게놈 풍경을 공유하고, 종양 내 이질성을 유지하며, 시험관내15에서 효율적인 약물 스크리닝을 용이하게 하는 것으로 보고된다. EAC PDO는 또한 EAC 종양 세포와 환자 유래 암 관련 섬유아세포 (CAFs)의 상호작용을 연구하는데 사용되었으며, 이는 종양 미세환경 연구16 분야에서 강력한 응용을 나타낸다. 안타깝게도 EAC PDO를 개발하고 전파하는 데 사용할 수 있는 프로토콜은 제한적이었습니다. 여기에서, EAC PDO를 계대배양하고 보존하기 위한 두 가지 상이한 방법이 상세히 기술된다: 단일 세포 소화 유무에 관계없이. EAC PDO의 유지 보수를위한 표준화 된 방법 및 응용 프로그램은 연구자가 EAC PDO 연구에서 다양한 목적에 적합한 방법을 선택할 수 있도록 지원할 수 있습니다.
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Protocol
확립되고 잘 성장하는 PDO 배양은 이 프로토콜에 기술된 성공적인 하위배양 및 냉동 보존을 위한 기초를 나타낸다. 여기서, EAC PDO는 Karakasheva T. A. et al.17에 의해 기술된 프로토콜을 사용하여 EAC 환자의 원발성 종양 조직으로부터 생성되었다. EAC 조직은 BioMaSOTA의 승인하에 바이오 뱅크로부터 수집되었다 (쾰른 대학의 윤리위원회에 의해 승인, ID : 13-091).
참고: EAC PDOs는 PDO 배지를 사용하여 37°C 및 5%CO2의 가습 인큐베이터에서 배양되었다(표 1). 다음 단계에서, 계대 배양의 두 가지 방법이 상세히 설명된다. 12웰 플레이트는 웰 당 세 개의 세포외 매트릭스(ECM) 젤 돔의 시딩 밀도로 PDO를 계대배양하는 데 권장되며, 이는 각 웰을 유연하게 사용하고 다양한 목적을 위해 적절한 양의 PDO를 사용할 수 있기 때문입니다. 무균 기술은 PDO를 처리하는 동안 의무적입니다.
1. 사전 준비
- 12-웰 플레이트를 계대 배양 전에 하룻밤 동안 37°CCO2 인큐베이터에 위치시켜 플레이트의 완전한 온열을 보장함으로써 예열시킨다. 사용 가능한 경우 현재 PDO 배양물을 사용한 플레이트에서 빈 웰을 사용하십시오.
참고: 37°C에서 1-2개의 신선한 플레이트를 지속적으로 보관하는 것은 유연한 계대 배양 계획을 위해 권장됩니다. - -20°C에서 넓은 오리피스로 1,000μL 및 200μL 팁을 미리 냉각합니다(연속 보관 권장). 4°C에서 미리 냉각된 원심분리기.
- 회전 인큐베이터의 온도를 37°C로 설정하십시오(단일 세포 소화가 수행되는 경우).
- 적절한 부피의 ECM 겔을 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하여 액화시킨다. 세포 회수 용액을 얼음 위에 놓습니다.
2. 오가노이드 수확
- 성장하는 PDO로 플레이트를CO2인큐베이터로부터 제거한다.
- 진공 펌프를 사용하여 오래된 매체를 흡인하십시오.
참고 : 돔을 만지지 마십시오. - 적절한 부피의 얼음 차가운 세포 회수 용액 (500 μL / 돔)을 웰에 첨가하십시오.
- ECM 겔을 여러 번 위아래로 피펫팅하여 ECM 겔 돔을 넓은 오리피스가있는 1,000 μL 팁을 사용하여 작은 조각으로 분해합니다.
- PDO, ECM 겔 및 세포 회수 용액의 혼합물을 최대 두 개의 웰 (여섯 개의 돔)에서 결합하고 5 mL의 낮은 결합 튜브로 옮깁니다 (더 많은 웰이 계대 배양에 사용되는 경우 두 번째 튜브를 사용하십시오).
참고: 임의로, ECM 겔이 완전히 용해되지 않은 경우, PDO, ECM 겔 및 세포 회수 용액의 혼합물에 1.5 mL의 세포 회수 용액을 첨가한다. - 단계 2.5에서 혼합물을 함유하는 튜브를 20분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하고, 튜브를 5회 반전시켜 5분마다 혼합하여 ECM 겔의 액화를 보장한다.
- 4°C에서 4분 동안 500 x g 에서 원심분리한다.
- 원심분리 후 가시적이고 안정한 펠렛이 있으면 단계 2.10으로 진행하십시오. 그렇지 않으면 2.9단계를 계속하십시오.
- 눈에 보이는 펠릿이 없고 PDO가 여전히 겔상에 갇혀 있는 것처럼 보이면, ECM 겔-PDO-용액을 포함하는 상에 도달할 때까지 진공 펌프로 상층액을 조심스럽게 제거하고 빙냉 세포 회수 용액 3 mL를 첨가한다.
- 튜브를 몇 번 뒤집고 얼음 위에서 10 분 동안 배양하십시오. 때때로 튜브를 반전시켜 혼합하십시오.
- 4°C에서 4분 동안 500 x g 에서 원심분리하고, 단계 2.10으로 계속한다.
- 진공 펌프 또는 1,000 μL 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 폐기하십시오. 가능한 한 상청액을 제거하십시오.
참고 : 튜브의 바인딩 표면이 낮기 때문에 펠렛은 평소처럼 안정적이지 않습니다. - PDO 펠릿을 얼음 위에 보관하고 다른 목적에 따라 단계 3 (소화 없이) 또는 단계 4 (단일 세포 소화 포함)로 진행하십시오.
3. 소화없이 계대 배양
참고: 이 방법은 PDO의 크기와 밀도를 높이는 것을 목표로 합니다. 더 큰 크기 및 더 높은 밀도는 임베딩 공정, 조직학적 특성화, 및 PDO 확장을 촉진한다. PDO 분할 비율(PDO의 밀도에 기초하여, 1:3과 1:6 사이의 비가 권장됨)에 따라, 단계 2.8로부터의 펠렛을 액체 ECM 겔의 적절한 부피로 재현탁시킨다.
- -20°C 냉동고에서 넓은 오리피스로 미리 냉각된 200μL 및 1,000μL 팁을 제거하고 깨끗한 벤치에 놓습니다.
- 단계 2.11로부터의 펠렛을 예비냉각된 1,000 μL 팁을 사용하여 ECM 겔에 재현탁시킨다. PDO가 뭉치지 않고 ECM 겔에 고르게 분포되어 있는지 확인하기 위해 약 10 번 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오.
참고: 50μL ECM 젤/돔을 사용하십시오. 항상 필요한 것보다 더 많은 하나의 돔을 계산하십시오 (예를 들어, 아홉 개의 돔 (즉, 세 개의 웰)의 경우, 펠렛을 500 μL의 액체 ECM 겔 (450 + 50 μL 여분)에 재현탁하십시오. 재현탁 중에 거품이 생기지 않도록하십시오! - 돔을 파종하기 직전에 인큐베이터에서 미리 가온된 12웰 플레이트를 제거하십시오.
- 따뜻한 접시에 50 μL ECM 젤을 함유 한 종자 돔 (세 개의 돔 / 우물). ECM 젤 돔에 거품이 피펫팅되지 않도록하십시오.
- 플레이트를 다시 37°C 및 5%CO2인큐베이터에 넣고 20-30분 동안 인큐베이션하여 ECM 겔을 고화시켰다.
- 돔을 방해하지 않고 미리 예열된 PDO 배지(표 1)를 조심스럽게 첨가하십시오.
- 필요한 밀도 및 형태학이 발생할 때까지 7-14일 동안 PDOs를 배양한다.
4. 단세포 소화로 계대배양
참고: 다음 단계는 돔당 PDO 수를 늘리는 것을 목표로 합니다. 단일 세포 소화는 세포 수 조절 및 PDO 확장을 용이하게 한다.
- 0.25% 트립신-EDTA 2mL와 20 μL DNase I(세 돔의 소화를 위해)을 혼합하여 소화 배지를 제조하였다.
- 단계 2.11로부터의 펠렛을 사전 가온된 0.25% 트립신-EDTA + DNase I의 적절한 부피로 재현탁시키고, 1,000 μL 피펫을 사용하여 상하로 피펫팅함으로써 약 10회 혼합한다(통상 1,000 μL 팁 사용).
- 최소 28 rpm의 회전 속도를 갖는 회전 인큐베이터에서 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
- 6 mL의 대두 트립신 억제제 (STI, 표 2) 용액 ( 0.25% 트립신-EDTA의 2 mL 당)을 함유하는 15 mL 튜브를 준비한다.
- 소화 후, 소화된 PDO를 1,000 μL 피펫과 몇 번 완전히 혼합하여 PDO를 교란시킨다.
- 소화된 PDO를 STI 용액이 들어있는 15 mL 튜브로 옮겨 소화 과정을 중단시킨다.
- 4°C에서 4분 동안 500 x g 에서 원심분리한다. 진공 펌프 또는 1,000 μL 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 폐기하십시오. 펠렛을 1 mL의 기초 배지에 재현탁시킨다(표 3).
- 자동화된 세포 계수기 또는 혈구측정기를 사용하여 세포 농도와 생존율을 결정하십시오.
- PDO를 돔 당 2 x 104 세포로 분해한 12-웰 플레이트로 종자화시켰다.
- 시딩을 위해 계획된 돔에 따라 세포 수를 계산하고 신선한 1.5 mL 낮은 결합 튜브로 옮깁니다.
참고 : 하나의 돔을 더 계산하십시오 (+ 2 x 104 셀 추가). 예를 들어, 하나의 우물에 3개의 돔을 파종하려면 8 x 10 4 (2 x 10 4* 3 + 2 x 104 추가) 셀을 채취하십시오. - 4°C에서 4분 동안 500 x g 에서 원심분리한다.
- 눈에 보이는 펠릿이없는 경우 원심 분리기 내부의 튜브 방향을 기억하여 펠렛이 어디에 있는지 확인하십시오.
- 1,000 μL 피펫을 사용하여 상청액을 조심스럽게 버린다. 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 상층액을 제거하십시오.
- 사전 냉각된 1,000μL 와이드 오리피스 팁(50μL/돔 + 50μL 추가)이 있는 1,000μL 피펫을 사용하여 펠렛에 적절한 부피의 ECM 겔을 첨가한다.
- 3.3-3.7단계를 수행합니다.
- 시딩을 위해 계획된 돔에 따라 세포 수를 계산하고 신선한 1.5 mL 낮은 결합 튜브로 옮깁니다.
5. 소화되고 소화되지 않은 PDO의 동결 보존
참고: 단일 세포 소화 및 소화되지 않은 PDO는 냉동 백업 스톡의 준비에 적합합니다. 단일 세포 냉동 스톡으로부터 재배된 PDO는 회복하고 특정 크기에 도달하는 데 더 오랜 시간이 필요하다는 점에 유의한다.
- 소화되지 않은 PDO의 동결보존.
- 단계 2.8에서 펠릿으로 동결보존 공정을 시작하십시오. 500 μL의 냉간 동결 배지를 사용하여 펠렛을 재현탁시키고 극저온 바이알로 옮깁니다.
참고: 바이알당 두 개의 돔을 보관하십시오. - 적절한 세포 동결 용기를 사용하여 -80°C 냉동고에서 하룻밤 동안 PDO를 동결시킨다.
- 단계 2.8에서 펠릿으로 동결보존 공정을 시작하십시오. 500 μL의 냉간 동결 배지를 사용하여 펠렛을 재현탁시키고 극저온 바이알로 옮깁니다.
- 소화된 단일 세포 PDO의 동결보존
- PDO를 수확하고 소화한 후, 단계 4.8부터 냉동 보존을 시작한다.
- 하나의 극저온 바이알을 저장하기 위해, 4-5 x 10 5 세포를 신선한1.5 mL 낮은 결합 튜브로 옮긴다.
참고: 세 개의 돔/바이알을 보관하십시오. - 4°C에서 4분 동안 500 x g 에서 원심분리한다. 상층액을 1,000 μL 피펫을 사용하여 조심스럽게 버리십시오. 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 상층액을 제거하십시오.
- 펠렛을 적절한 부피의 동결 배지 (500 μL / 바이알)에 재현탁시키고 극저온 바이알로 옮깁니다.
- 적절한 세포 동결 용기를 사용하여 -80°C 냉동고에서 하룻밤 동안 PDO를 동결시키고 이를 -150°C 냉동고 또는 액체 질소로 옮겨 장기간 보관한다.
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Representative Results
이 프로토콜은 단일 세포 소화 유무에 관계없이 EAC PDO의 계대 배양 및 냉동 보존을 포함하는 절차를 제시합니다.
도 1은 두 개의 상이한 하위배양 전략의 대표적인 위상차 사진을 도시한다. EAC PDO는 계대배양을 위한 적절한 밀도에 도달했습니다(그림 1, 왼쪽). 단일 세포 소화 없이 계대배양하는 것은 유사한 밀도에 도달하는 데 더 적은 시간이 걸리고 주로 조밀한 구조로 이어집니다(그림 1, 맨 위 행). 대조적으로, 소화된 단일 셀 PDO는 중공 코어를 갖는 중공 구조를 보여준다(그림 1, 하단 행). 도 2는 콤팩트하고 중공 구조인 파라핀 포매된 EAC PDO의 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색 및 면역조직화학(IHC) 염색을 보여준다. 범시토케라틴(Pan-CK)은 상피 종양 세포(18)의 확인을 가능하게 한다. 시토케라틴 7(CK7)은 선 분화된 종양 세포(19)를 강조한다. 조밀한 구조 (맨 위 행)는 소화되지 않은 배양물에 주로 존재하는 반면, 중공 구조 (하단 행)는 단일 세포 소화를 겪은 배양물에서 우세합니다.
도 3은 콤팩트한 구조 및 중공 구조를 갖는 짝을 이룬 EAC 조직 및 PDOs의 면역형광(IHC) 염색을 보여준다. Ki67은 더 높은 세포 증식을 갖는 세포 집단을 강조한다20. Ki67 (적색) 및 Pan-CK (녹색)는 EAC 일차 조직, EAC PDO 컴팩트 구조 및 EAC PDO 중공 구조 사이에 유사하게 분포되었다. 도 4는 단일 세포 기반 냉동 보존(왼쪽) 및 소화되지 않은 PDO 기반 냉동 보존(오른쪽)을 사용한 냉동 스톡으로부터 회복 첫날에 EAC PDOs의 형태학적 특성을 보여준다.
도 5 는 단일 세포 소화가 있거나없는 EAC PDOs의 계대 배양 과정의 흐름도를 요약한다. 간단히 말해서, 잘 성장하는 EAC PDO는 통과 될 준비가되었습니다. EAC PDO를 수확하고 펠릿화하였다. 단일 세포 소화를 위해, PDO는 단일 세포를 얻기 위해 5-10분 동안 효소적으로 소화되었으며, 이는 세포 수 조절, 균일한 밀도 및 크기 추적이 필요한 실험을 용이하게 하는 중공 구조로 성장할 가능성이 높았다. 소화되지 않은 하위 배양의 경우, PDO는 효소적으로 방해받지 않고 더 많은 성장 공간을 확보하기 위해 분할되었으며, 이는 조직 학적 분석, 빠른 확장 및 냉동 보존으로부터의 빠른 회복을 용이하게하는 소형 구조로 성장할 가능성이 큽니다.
그림 1: 위상차 현미경 하에서 단일 세포 소화 유무에 관계없이 계대배양된 EAC PDO의 형태학적 특성. EAC PDO는 계대 배양 전에 특정 밀도로 성장합니다 (왼쪽). 단일 세포 소화없이 EAC PDO를 계대 배양하면 PDO는 중공 구조에서 컴팩트 한 구조 (오른쪽, 맨 위 행)로 점차 성장하지만 단일 세포에서 자란 PDO는 주로 중공 구조 (오른쪽, 맨 아래 행)를 보여줍니다. 사진은 5x 조준물을 사용하여 거꾸로 된 광학 현미경으로 촬영되었습니다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: EAC PDO의 콤팩트한 구조와 중공 구조의 조직학적 특성. H&E 염색(왼쪽), Pan-CK 염색(중간), 및 CK7 염색(오른쪽)이 조밀한 구조(윗줄) 및 중공 구조(하단 행)이다. 사진은 20x 대물렌즈를 사용하여 거꾸로 된 광학 현미경으로 촬영되었습니다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 쌍을 이룬 EAC 조직 및 PDO의 면역조직화학 염색. 쌍을 이룬 EAC 조직(윗줄), 콤팩트한 구조(중간 행) 및 중공 구조(하단 행)를 Pan-CK(녹색), Ki67(적색) 및 DAPI(파란색)로 염색한 면역형광(IF) 염색을 하였다. 사진은 20x 목표를 사용하여 반전된 자동 형광 현미경으로 촬영되었다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 동결된 재고에서 회복 첫날 EAC PDO의 형태학적 특성. 회복 첫날 단일 세포 기반 냉동 보존 (왼쪽)과 소화되지 않은 PDO 기반 냉동 보존 (오른쪽)에서 재배하는 위상차 사진. 사진은 5x 조준물을 사용하여 거꾸로 된 광학 현미경으로 촬영되었습니다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 단일 세포 소화 유무에 관계없이 EAC PDO의 계대 배양 과정의 흐름도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 주식 | 최종 집중 | 50 mL | |||
| 기초 배지(표 3 참조) | 24 mL | ||||
| Wnt-3A 컨디셔닝 매체 | 12 mL | ||||
| Cultrex R-Spondin Cells의 R-Spondin1 컨디셔닝 배지 | 12 mL | ||||
| N-2 | 100배 | 1배 | 500 μL | ||
| B-27 | 50배 | 1배 | 1 mL | ||
| N- 아세틸 시스테인 | 0.5 엠 | 1 밀리지미터 | 100 μL | ||
| CHIR-99021 | 5 밀리지미터 | 0.5 μM | 5 μL | ||
| 재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF) | 100 μg/mL | 250 ng/mL | 125 μL | ||
| A83-01 | 25 밀리지미터 | 0.5 μM | 1 μL | ||
| SB202190 | 10 밀리지미터 | 1 μM | 5 μL | ||
| 개스트린 | 100 μM | 0.1 μM | 50 μL | ||
| 니코틴아미드 | 1 엠 | 20 μM | 1 mL | ||
| 겐타미신 | 50 밀리그램/mL | 10 μM | 5 μL | ||
| 페니실린/스트렙토마이신 | 100배 | 1배 | 500 μL | ||
| 암포테리신 B | 250 μg/mL | 0.60% | 300 μL | ||
| 새로 새로 추가하십시오. | |||||
| 머리 | 100 μg/mL | 50 μL | |||
| Y-27632 | 10.5 밀리지미터 | 50 μL | |||
| 일차 조직에서 새로운 PDO를 설정하거나 동결 된 주식에서 회복 할 때 추가하십시오. | |||||
| FGF-10a | 100 μg/mL | 100 ng/mL | 50 μL | ||
표 1: EAC PDO 배양 배지의 제조.
| 대두 트립신 억제제 (STI) | 12.5 밀리그램 |
| DPBS로 50mL로 조정 | |
| 0.2 μm 멸균 필터를 통한 필터 |
표 2: 대두 트립신 억제제(STI) 용액의 제조.
| 시약 | 음량 | 최종 농도 |
| 고급 DMEM/F-12 | 48.2 mL | |
| 헤페스 (1 M) | 500 μL | 10 밀리지미터 |
| L- 글루타민 (100X) | 500 μL | 1배 |
| 페니실린-스트렙토마이신 (100X) | 500 μL | 1배 |
| 암포테리신 B | 300 μL | 0.60% |
| 겐타미신 (50 mg/mL) | 5 μL | 5 μg/mL |
표 3: 기초 배지의 제조.
| 단일 세포 소화 | |
| 프로 | 죄수 |
| 셀 번호 제어 | 임베딩 중 깨지기 쉬운 |
| 생존력 검사 | 구절 사이에 더 긴 시간이 필요합니다. |
| 예를 들어, 약물 스크리닝, 유세포 측정에 적용 가능 | 동결 된 주식에서 더 긴 회복 시간 |
| 단일 세포 소화없이 | |
| 프로 | 죄수 |
| 형태학은 조직학적 분석에 유익하다. | 숫자보다 더 큰 PDO의 확장 |
| 임베딩 공정의 높은 안정성 | 단일 세포 정지가 의무적 인 분석에는 적용되지 않습니다. |
| 동결 된 주식에서 빠른 회복 | 셀 번호 제어 및 크기 추적 부족 |
표 4: 단일 세포 소화 유무에 관계없이 EAC PDO를 계대배양하기 위한 장단점.
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Discussion
이 프로토콜에서, EAC PDOs의 두 가지 상이한 계대 배양 및 냉동 보존 방법, 즉 단일 세포 소화의 유무에 관계없이 설명된다. 여러 연구에서 단일 세포 소화15,17을 가진 EAC PDO를 통과 할 것을 권장했는데, 이는 세포 수 제어, 균일 한 밀도 및 크기 추적을 용이하게하는 중공 구조가 필요한 대부분의 실험에 유용합니다. 그러나, 단일 세포-기반 방법은 냉동 스톡으로부터 재재배 후 성장이 느려지고 배양 기간 동안 덜 컴팩트한 형태학을 특징으로 한다. 경험은 단일 세포 기반 재배양이 계대 배양 과정에 적용 가능한 밀도에 도달하는 데 2-3 주를 나타냅니다. 대조적으로, 단일 세포 소화가 없는 냉동 EAC PDO는 재배 후 더 짧은 기간(약 1주일)에 동일한 크기에 도달할 수 있다. 한 가지 이유는 비교적 오랜 시간 (10 분) 동안 트립신 소화로 인한 추가 스트레스 일 수 있습니다. 따라서 소화되지 않은 EAC PDO를 1:1.5의 비율로 보존하는 것이 좋습니다 (소화되지 않은 EAC PDO의 두 돔을 동결하고 재배를 위해 세 개의 돔으로 다시 시드). 또한, 소화되지 않은 EAC PDO를 사용하는 것은 콤팩트한 구조로 인한 IHC 또는 IF 염색에 의한 빠른 확장 및 조직학적 특성화를 위해 권장된다. 두 계대 배양 방법의 장단점은 표 4에 요약되어 있다.
이 프로토콜에서 몇 가지 중요한 단계를 수행해야 합니다. 첫째, PDO 배양을 위한 플레이트는 갓 시딩된 ECM 겔 돔의 응고 과정을 보장하기 위해 37°C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 예열될 필요가 있다. 연장된 시딩 기간을 다루면서 플레이트를 37°C로 유지하기 위해 핫플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 둘째, 상당한 PDO 손실을 피하기 위해 계대 배양 과정 동안 낮은 결합 튜브가 필요합니다. ECM 겔 손실을 방지하기 위해, 넓은 보어 개구부를 갖는 팁은 사용 전에 -20°C 냉동고에서 사전 냉각될 수 있다. 여기서, 팁의 넓은 개구부는 수확 단계 동안 PDO 구조물의 손상을 피한다. 다음으로, ECM 겔의 완전한 액화를 보장하기 위해 첫 번째 원심분리 단계 전에 얼음 위에서 20 분 동안 PDO를 인큐베이션하는 것이 좋습니다. 원심분리기는 잔류 ECM 겔을 액체 상태로 유지하기 위해 원심분리 단계 동안 4°C에서 설정될 필요가 있다는 점에 유의한다. 또한, 단일 세포 방법의 경우, 세포 손실을 피하기 위해 세포 현탁액을 직접 여과하기보다는 STI를 첨가하기 전에 세포 덩어리를 깨기 위해 정상 1,000 μL 팁을 사용하여 트립신 인큐베이션 후 PDO를 철저히 혼합하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜에서 일부 수정을 할 수 있습니다. 세포 회수 용액은 수확 단계에서 ECM 겔을 용해시키기 위한 빙냉 DPBS로 대체될 수 있다. 그러나, 경험은 세포 회수 용액을 사용하여 ECM 겔을 용해시키는 더 나은 능력을 나타냈다. 따라서 얼음처럼 차가운 DPBS는 대체 백업 방법으로만 권장됩니다. 실험실에 회전 인큐베이터가 장착되지 않은 경우, EAC PDO는 37°C 수조에서 트립신과 함께 인큐베이션될 수 있으며, 2-3분마다 튜브를 뒤집어 혼합할 수 있으며, 10% DMSO와 태아 소 혈청(FBS)을 사용하여 동결 PDO 스톡을 제조하기 위한 동결 배지의 대안으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 혈청이 낮거나 없는 상업적 동결 배지는 더 나은 PDO 회수로 인해 바람직하다.
이 프로토콜에서 몇 가지 제한 사항을 해결해야 합니다. 이러한 방법은 EAC PDO에서만 테스트되었기 때문에 다른 유형의 PDO에 이 프로토콜을 적용하는 것은 명확하지 않습니다. 단일 세포 소화가 있거나없는 PDO를 통과시키는 절차가 대부분의 오가노이드 유형21,22에 대해 표준화되었지만 재현성을 보장하기 위해 다른 암 유형에 대한 현재의 프로토콜을 시도 할 필요가 여전히 있습니다. 또한, 10분 동안 0.25% 트립신 인큐베이션은 소화 동안 세포를 스트레스할 수 있고; 따라서, 배양 시간은 PDO 계대 전 조건 및 개별 PDO 다양성에 따라 달라질 수 있다. 초기 시도 동안, 각 EAC PDO에 대해 상이한 트립신 인큐베이션 시간을 설정하는 것이 제안된다.
결론적으로, 이것은 단일 세포 소화 유무에 관계없이 EAC PDO의 계대 배양 및 냉동 보존을 설명하고 논의하는 첫 번째 프로토콜입니다. 단일 세포 소화로 EAC PDO를 계대배양하는 것은 그룹 간의 비교 실험에 적용 가능한 반면, 소화되지 않은 EAC PDO는 조직학적 특성화, 동결보존 및 빠른 확장에 유익하다. 여기서 EAC PDO의 일상적인 유지 보수가 표준화되어 연구자가 EAC 오가노이드 생성에 적합한 방법을 선택할 수있는 안내서를 제공합니다.
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Disclosures
저자는이 작품에 대한 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 쾰른 대학 (University of Cologne)의 Köln Fortune Program / Faculty of Medicine의 지원을 받았습니다. Susanne Neiss, Michaela Heitmann 및 Anke Wienand-Dorweiler의 기술 지원에 감사드립니다. 닝보 팬은 광저우 엘리트 장학금위원회 (GESC)의 재정 지원을 받았다. 저자들은 Joshua D'Rozario 박사가 언어 편집에 도움을 준 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
References
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