Summary
Denne protokollen beskriver metodene for subkultur og kryopreservering av esophageal adenokarcinoma organoider med og uten enkeltcellet fordøyelse for å gjøre det mulig for forskere å velge passende strategier basert på deres eksperimentelle design.
Abstract
Mangelen på egnede translasjonelle forskningsmodeller som reflekterer primærsykdom for å utforske tumorigenese og terapeutiske strategier er et stort hinder i esophageal adenokarsinom (EAC). Pasientavledede organoider (PUD) har nylig dukket opp som en bemerkelsesverdig preklinisk modell i en rekke kreftformer. Det er imidlertid fortsatt begrensede protokoller tilgjengelig for utvikling av EAC-PDA-er. Når PUD-ene er etablert, er forplantning og kryopreservering avgjørende for ytterligere nedstrømsanalyser. Her har to forskjellige metoder blitt standardisert for EAC PDOer subkultur og kryopreservering, det vil si med og uten enkeltcelle fordøyelse. Begge metodene kan på en pålitelig måte oppnå passende celle levedyktighet og gjelder for et mangfoldig eksperimentelt oppsett. Den nåværende studien viste at subkulturerende EAC-PUD-er med enkeltcellet fordøyelse er egnet for de fleste eksperimenter som krever cellenummerkontroll, jevn tetthet og en hul struktur som letter størrelsessporing. Den encellede metoden viser imidlertid lavere vekst i kulturen så vel som etter re-dyrking fra frosne aksjer. Dessuten er subkulturering med encellet fordøyelse preget av å danne hule strukturer med en hul kjerne. I motsetning er behandling av EAC-PUD-er uten enkeltcelle fordøyelse gunstig for kryopreservering, ekspansjon og histologisk karakterisering. I denne protokollen beskrives fordelene og ulempene ved subkulturering og kryopreservering av EAC-PUD-er med og uten enkeltcellet fordøyelse for å gjøre det mulig for forskere å velge en passende metode for å behandle og undersøke organoidene sine.
Introduction
Esophageal cancer (EC) er den tiende vanligste og den sjette ledende dødsårsaken fra kreft over hele verden1. Esophageal adenocarcinoma (EAC) er en av de viktigste histologiske undertypene av EC og forekommer hovedsakelig i vestlige land2. I løpet av det siste tiåret har EAC-forekomsten økt betydelig i mange utviklede land, inkludert Tyskland3. På grunn av aggressiviteten til kreft og mangel på symptomer i den tidlige fasen av tumorutviklingen, er den generelle prognosen hos EAC-pasienter dårlig, og viser en 5-års overlevelsesrate på ca. 20%2,4,5.
Siden slutten av det tjuende århundre har det blitt etablert flere modeller for biomedisinsk forskning av EAC. De klassiske menneskelige EAC-cellelinjene som ble etablert på 1990-tallet6, utvider vår kunnskap om EAC tumorbiologi, tumorgenetikk samt anti-tumorstrategier, og brukes ofte i EAC-forskning. Dessuten har noen forskningsgrupper vellykket utviklet dyremodeller av EAC eller Barretts spiserøret ved å utsette dyrene for kjente risikofaktorer som gastroøsofageal refluks gjennom kirurgiske eller inflammatoriske tilnærminger 7,8,9. I tillegg ble pasientavledede xenograft (PDX) modeller som engraft EAC primærkreftvev subkutant eller ortopisk til immunodeficient mus, utviklet for å simulere menneskelig EAC tumor biologisk oppførsel og tumormiljø 10,11,12. Til tross for at disse modellene forbedrer kliniske anvendelser og vår forståelse av molekylære mekanismer bak EAC tumorigenesis og progresjon, er det imidlertid fortsatt en stor utfordring å ekstrapolere resultater fra disse forskningsmodellene til mennesker.
Pasientavledede tumororganoider (PUD) dyrkes i et 3D-kultursystem som etterligner menneskelig utvikling og organregenerering in vitro. Pdoer er generert fra pasientenes primærvev, og rekapitulerer de molekylære og fenotypiske egenskapene til den menneskelige svulsten og har vist lovende anvendelser innen legemiddelutvikling og personlig kreftbehandling13,14. Ved å sammenligne ti tilfeller av EAC-PUD-er med deres parrede tumorvev, rapporteres EAC-PUD-er å dele lignende histopatologiske egenskaper og genomisk landskap med den primære svulsten, beholde intrasvulst heterogenitet og legge til rette for effektiv legemiddelscreening in vitro15. EAC-PUD-er ble også brukt til å studere samspillet mellom EAC-tumorceller og pasientavledede kreftrelaterte fibroblaster (CAF-er), noe som indikerer en kraftig anvendelse innen tumormikromiljøforskning16. Dessverre har det vært begrensede protokoller tilgjengelig for utvikling og forplantning av EAC-P PUD-er. Her er to forskjellige metoder beskrevet for subkulturering og bevaring av EAC-PUD i detalj: med og uten enkeltcelle fordøyelse. Standardiserte metoder for vedlikehold av EAC-PUD-er og deres anvendelser kan støtte forskere til å velge passende metoder for ulike formål i sin EAC PUD-forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En etablert og velvoksende PUD-kultur representerer grunnlaget for en vellykket subkultur og kryopreservering beskrevet i denne protokollen. Her ble EAC-PUD generert fra EAC-pasienters primære tumorvev ved hjelp av protokollen beskrevet av Karakasheva T. A. et al17. EAC vev ble samlet inn fra biobank under godkjenning av BioMaSOTA (godkjent av Etikkkomiteen ved Universitetet i Köln, ID: 13-091).
MERK: EAC-PUD-er har blitt dyrket i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 ved hjelp av et PUD-kulturmedium (tabell 1). I de følgende trinnene er to metoder for subkulturen beskrevet i detalj. En 12-brønns plate anbefales for subkulturering av PUD-ene med en såddtetthet på tre ekstracellulære matrise (ECM) gelkupler per brønn, da det tillater fleksibel bruk av hver brønn og passende mengde PUD-er til forskjellige formål. En aseptisk teknikk er obligatorisk under håndtering av PUD-ene.
1. Forberedelser på forhånd
- Forvarm en 12-brønns plate ved å plassere den i en 37 °C CO2 inkubator over natten før subkultur for å sikre fullstendig oppvarming av platen. Bruk eventuelt tomme brønner fra en plate med dagens PUD-kultur.
MERK: Kontinuerlig lagring av 1-2 ferske plater ved 37 °C anbefales for fleksibel subkulturplanlegging. - Forkjøl 1000 μL og 200 μL spisser med en bred åpning ved -20 °C (kontinuerlig lagring anbefales). Forkjøl sentrifugen ved 4 °C.
- Sett opp temperaturen på den roterende inkubatoren til 37 °C (hvis enkeltcellet fordøyelse utføres).
- Inkuber et passende volum av ECM gel i 1 time på is for å flytende. Plasser cellegjenvinningsløsning på is.
2. Høsting av organoider
- Fjern platen med voksende PUD-er fra CO 2-inkubatoren.
- Aspirer gammelt medium ved hjelp av en vakuumpumpe.
MERK: Unngå å berøre kuplene. - Tilsett et passende volum av iskald cellegjenvinningsløsning (500 μL/kuppel) i brønnen.
- Oppløs ECM-gelen ved å pipettere opp og ned flere ganger for å fragmentere ECM gelkupler i små biter ved hjelp av 1000 μL-spisser med et bredt byggverk.
- Kombiner blandingen av PUD, ECM gel og cellegjenvinningsløsning fra maksimalt to brønner (seks kupler) og overfør den til et 5 ml lavt bindingsrør (bruk et annet rør i tilfelle flere brønner brukes til subkultur).
MERK: Eventuelt, hvis ECM gel ikke ble oppløst helt, legg til ytterligere 1,5 ml cellegjenopprettingsløsning til blandingen av PUD, ECM gel og cellegjenopprettingsløsning. - Inkuber røret som inneholder blandingen i trinn 2.5 på is i 20 min, bland hver 5 min ved å invertere røret fem ganger for å sikre flytende ECM gel.
- Sentrifuge ved 500 x g i 4 min ved 4° C.
- Hvis det er en synlig og stabil pellets etter sentrifugering, fortsett med trinn 2.10. Ellers fortsetter du med trinn 2.9.
- Hvis det ikke er synlig pellets og PUD-ene fortsatt ser ut til å sitte fast i en gelfase, fjern forsiktig supernatanten med en vakuumpumpe til fasen som inneholder ECM gel-PUD-løsning er nådd og tilsett 3 ml iskald cellegjenvinningsløsning.
- Snu røret et par ganger og inkuber på is i ytterligere 10 minutter. Bland ved å invertere røret fra tid til annen.
- Sentrifuge ved 500 x g i 4 min ved 4 °C og fortsett med trinn 2.10.
- Kast supernatanten forsiktig med en vakuumpumpe eller en 1000 μL pipette. Prøv å fjerne supernatanten så mye som mulig.
MERK: På grunn av den lave bindingsflaten på røret, vil pelletsen ikke være så stabil som vanlig. - Oppbevar PUD-pelletsen på is og fortsett med trinn 3 (uten fordøyelse) eller trinn 4 (med encellet fordøyelse) avhengig av de forskjellige formålene.
3. Subkultur uten fordøyelse
MERK: Denne metoden tar sikte på å øke PUD-ens størrelse og tetthet. Jo større størrelse og høyere tetthet som letter innebyggingsprosessen, histologisk karakterisering og PUD-utvidelse. Avhengig av PDO-delingsforholdene (basert på tettheten til PUD-er, anbefales et forhold mellom 1:3 og 1:6), resuspender pellet fra trinn 2.8 i et passende volum flytende ECM gel.
- Fjern forkjølte 200 μL og 1000 μL spisser med en bred åpning fra -20 °C fryseren og legg dem på en ren benk.
- Resuspend pellet fra trinn 2.11 i ECM gel ved hjelp av forkjølte 1000 μL tips. Bland ved å pipettere opp og ned omtrent 10 ganger for å sikre at PUD-er ikke klumper seg og er jevnt fordelt i ECM-gelen.
MERK: Bruk 50 μL ECM gel/kuppel. Beregn alltid for en kuppel mer enn nødvendig (f.eks. for ni kupler (dvs. tre brønner), resuspend pellet i 500 μL flytende ECM gel (450 + 50 μL ekstra). Prøv å unngå å produsere bobler under resuspension! - Fjern den forvarmede 12-brønnsplaten fra inkubatoren rett før du sår kuplene.
- Frøkupler som inneholder 50 μL ECM gel i den varme platen (tre kupler / brønn). Unngå pipetteringsbobler i ECM gelkuplene.
- Sett platen tilbake i 37 °C og 5 % CO 2-inkubator og inkuber i 20–30 minutter for å størkne ECM-gelen.
- Tilsett forvarmet PUD-medium (tabell 1) forsiktig uten å forstyrre kuplene.
- Kultur PUD-ene i 7-14 dager til den nødvendige tettheten og morfologien oppstår.
4. Subkulturering med enkeltcellet fordøyelse
MERK: Følgende trinn tar sikte på å øke antall PUD-er per kuppel. Enkeltcellefordøyelsen forenkler cellenummerkontroll og PUD-utvidelse.
- Forbered fordøyelsesmediet ved å blande 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA og 20 μL DNase I (for fordøyelsen av tre kupler).
- Resuspend pellet fra trinn 2.11 med et passende volum av forhåndsvarmet 0,25% Trypsin-EDTA + DNase I og bland den ca 10 ganger ved pipettering opp og ned ved hjelp av en 1000 μL pipette (bruk normale 1000 μL spisser).
- Inkuber i 10 min ved 37 °C i en roterende inkubator med en rotasjonshastighet på minimum 28 o/min.
- Forbered et 15 ml rør som inneholder 6 ml Soyabønner Trypsin Inhibitor (STI, tabell 2) oppløsning (per 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA).
- Etter fordøyelsen blander du de fordøyde PUD-ene grundig noen ganger med en 1000 μL pipette for å forstyrre PUD-ene.
- Overfør de fordøyde PUD-ene til 15 ml-røret som inneholder STI-løsning for å stoppe fordøyelsesprosessen.
- Sentrifuge ved 500 x g i 4 min ved 4 °C. Kast supernatanten forsiktig med en vakuumpumpe eller en 1000 μL pipette. Resuspend pelletsen i 1 ml basalmedium (tabell 3).
- Bestemme cellekonsentrasjon og levedyktighet ved hjelp av en automatisert celleteller eller et hemocytometer.
- Frø fordøyd PUD i en 12-brønns plate med 2 x 104 celler per kuppel.
- Beregn cellenummeret i henhold til kuplene som er planlagt for såing og overfør dem til et friskt 1,5 ml lavt bindingsrør.
MERK: Beregn for én kuppel mer (+ 2 x 104 celler ekstra). For eksempel, for såing tre kupler i en brønn, ta 8 x 104 (2 x 104 * 3 + 2 x 104 ekstra) celler. - Sentrifuge ved 500 x g i 4 min ved 4 °C.
- I tilfelle det ikke er synlig pellet, husk retningen på røret inne i sentrifugen for å vite hvor pelletsen ligger.
- Kast forsiktig supernatanten med en 1000 μL pipette. Fjern supernatanten så mye som mulig uten å forstyrre pelletsen.
- Tilsett riktig volum ECM gel til pelletsen ved hjelp av en 1000 μL pipette med forhåndskjølt 1000 μL bred åpningspiss (50 μL / kuppel + 50 μL ekstra).
- Følg trinn 3.3-3.7.
- Beregn cellenummeret i henhold til kuplene som er planlagt for såing og overfør dem til et friskt 1,5 ml lavt bindingsrør.
5. Kryopreservering av de fordøyde og ufordøyde PUD-ene
MERK: Enkeltcellede og ufordøyde PUD-er er egnet for fremstilling av frosne backup-lagre. Vær oppmerksom på at re-kultiverte PUD-er fra enkeltcelle frosne aksjer krever lengre tid å gjenopprette og for å nå en viss størrelse.
- Kryopreservering av de ufordøyde PUD-ene.
- Start kryopreserveringsprosessen med pellets fra trinn 2.8. Bruk 500 μL kaldt frysemedium for å resuspendere pellet og overføre det til et kryogent hetteglass.
MERK: Oppbevar to kupler per hetteglass. - Frys PUD-er over natten i en -80 °C fryser ved hjelp av en passende cellefrysingsbeholder.
- Start kryopreserveringsprosessen med pellets fra trinn 2.8. Bruk 500 μL kaldt frysemedium for å resuspendere pellet og overføre det til et kryogent hetteglass.
- Kryopreservering av enkeltcellede PUD-er
- Etter høsting og fordøyd PUD, start kryopreservering fra trinn 4.8.
- For lagring av ett kryogent hetteglass, overfør 4-5 x 105 celler til et friskt 1,5 ml lavt bindingsrør.
MERK: Oppbevar tre kupler/hetteglass. - Sentrifuge ved 500 x g i 4 min ved 4 °C. Kast supernatanten forsiktig med en 1000 μL pipette. Fjern supernatanten så mye som mulig uten å forstyrre pelletsen.
- Resuspend pellet i et passende volum av frysemedium (500 μL / hetteglass) og overfør det til et kryogent hetteglass.
- Frys PUD-er over natten i en -80 °C fryser ved hjelp av en passende cellefrysingsbeholder og overfør dem til en -150 °C fryser eller flytende nitrogen for langvarig lagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen presenterer prosedyrene inkludert subkultur og kryopreservering av EAC-PUD-er med og uten fordøyelse av enkeltceller.
Figur 1 viser representative fasekontrastbilder av de to ulike subkulturstrategiene. EAC-PDI-er nådde riktig tetthet for subkulturering (figur 1, venstre). Subkulturering uten enkeltcellet fordøyelse tar mindre tid å nå sammenlignbar tetthet og fører hovedsakelig til kompakte strukturer (figur 1, øverste rad). I motsetning til dette viser de enkeltcellede PDA-ene hule strukturer med en hul kjerne (figur 1, nederste rad). Figur 2 viser hematoksylin-eosin (H&E) farging og immunhiistokjemi (IHC) farging av parafinin innebygde EAC-PUD-er med kompakte og hule strukturer. Pan-cytokeratin (Pan-CK) muliggjør identifisering av epitel tumorceller18. Cytokeratin 7 (CK7) fremhever kjerteldifferensierte tumorceller19. Den kompakte strukturen (øverste rad) eksisterer hovedsakelig i den ufordøyde kulturen, mens den hule strukturen (nederste rad) er dominerende i kulturen som gjennomgikk encellet fordøyelse.
Figur 3 viser immunfluorescens (IHC) farging av parret EAC vev og PUD med kompakt struktur og hul struktur. Ki67 fremhever cellepopulasjonene med høyere cellulær spredning20. Ki67 (rød) og Pan-CK (grønn) ble tilsvarende fordelt mellom EAC primærvev, EAC PDO kompakt struktur og EAC PUD hul struktur. Figur 4 viser de morfologiske egenskapene til EAC-PUD på den første dagen av utvinning fra frossen bestand med enkeltcellebasert kryopreservering (venstre) og ufordøyd PUD-basert kryopreservering (høyre).
Figur 5 oppsummerer et flytskjema over subkulturprosessen til EAC-PDA-er med og uten fordøyelse av enkeltceller. Kort sagt, en godt voksende EAC PUD er klar til å bli passeret. EAC-PUD-er ble høstet og pelletert. For fordøyelsen av enkeltceller ble PUD-er enzymatisk fordøyd i 5-10 minutter for å få enkeltceller, som sannsynligvis ville vokse til hule strukturer som letter eksperimenter som krever cellenummerkontroll, jevn tetthet og størrelsessporing. For ufordøyd subkultur ble PUD-er delt for å få mer voksende plass uten enzymatisk forstyrrende, noe som sannsynligvis ville vokse til kompakte strukturer som letter histologiske analyser, rask ekspansjon og raskere utvinning fra kryopreservering.
Figur 1: Morfologiske egenskaper ved EAC PUD-subkultur med og uten encellet fordøyelse under et fasekontrastmikroskop. EAC-PDA-er vokser til en viss tetthet før subkultur (venstre). Ved subkulturering av EAC-PUD-er uten fordøyelse av enkeltceller vokser PUD-er gradvis fra hule strukturer til kompakte strukturer (høyre, øverste rad), mens PUD-er dyrket fra enkeltceller viser overveiende hule strukturer (høyre, nederste rad). Bilder ble tatt med invertert lysmikroskop ved hjelp av et 5x mål. Skalalinje: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Histologiske egenskaper ved EAC-PUD-enes kompakte struktur og hule struktur. H&E-fargingen (venstre), Pan-CK-farging (midten) og CK7-farging (høyre) av den kompakte strukturen (øverste rad) og hul struktur (nederste rad). Bilder ble tatt med invertert lysmikroskop ved hjelp av et 20x mål. Skalalinje: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Immunhiistokjemifarging av parret EAC-vev og PUD-er. Immunfluorescens (IF) farging av parret EAC vev (øverste rad), kompakt struktur (midtre rad) og hul struktur (nederste rad) med Pan-CK (grønn), Ki67 (rød) og DAPI (blå). Bilder ble tatt med invertert automatisert fluorescensmikroskop ved hjelp av et 20x mål. Skalalinje: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Morfologiske egenskaper ved EAC-PUD på den første dagen av utvinning fra frossen bestand. Fasekontrastbilder av fordring fra enkeltcellebasert kryopreservering (venstre) og ufordøyd PUD-basert kryopreservering (høyre) på den første dagen av utvinning. Bilder ble tatt med invertert lysmikroskop ved hjelp av et 5x mål. Skalalinje: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Flytskjemaet for subkulturprosessen til EAC-PUD-er med og uten fordøyelse av enkeltceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Lager | Endelig konsentrasjon | 50 ml | |||
| Basal medium (se tabell 3) | 24 ml | ||||
| Wnt-3A betinget medium | 12 ml | ||||
| R-Spondin1 betinget medium fra Cultrex R-Spondin Cells | 12 ml | ||||
| N-2 | 100x | 1x | 500 μL | ||
| B-27 | 50x | 1x | 1 ml | ||
| N-Acetylcysteine | 0,5 M | 1 mM | 100 μL | ||
| CHIR-99021 | 5 mM | 0,5 μM | 5 μL | ||
| Rekombinant menneskelig epidermal vekstfaktor (EGF) | 100 μg/ml | 250 ng/ml | 125 μL | ||
| A83-01 | 25 mM | 0,5 μM | 1 μL | ||
| SB202190 | 10 mM | 1 μM | 5 μL | ||
| Gasstrin | 100 μM | 0,1 μM | 50 μL | ||
| Nikotinamid | 1 M | 20 μM | 1 ml | ||
| Gentamicin | 50 mg/ml | 10 μM | 5 μL | ||
| Penicillin/Streptomycin | 100x | 1x | 500 μL | ||
| Amfotericin B | 250 μg/ml | 0.60% | 300 μL | ||
| Legg til ferskt i brønn: | |||||
| Noggin | 100 μg/ml | 50 μL | |||
| Å-27632 | 10,5 mM | 50 μL | |||
| Legg til når du etablerer nye PUD-er fra primærvev eller gjenoppretter fra frosne lagre | |||||
| FGF-10a | 100 μg/ml | 100 ng/ml | 50 μL | ||
Tabell 1: Utarbeidelse av EAC PUD kulturmedium.
| Soyabønner trypsinhemmer (STI) | 12,5 mg |
| Juster til 50 ml med DPBS | |
| Filtrer gjennom 0,2 μm sterilt filter |
Tabell 2: Fremstilling av Soyabønner Trypsin Inhibitor (STI)-oppløsning.
| Reagent | Volum | Endelig konsentrasjon |
| Avansert DMEM/F-12 | 48,2 ml | |
| HEPES (1 M) | 500 μL | 10 mM |
| L-glutamin (100x) | 500 μL | 1X |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | 500 μL | 1X |
| Amfotericin B | 300 μL | 0.60% |
| Gentamicin (50 mg/ml) | 5 μL | 5 μg/ml |
Tabell 3: Fremstilling av basalmedium.
| Fordøyelse med én celle | |
| Proffene | Ulemper |
| Cellenummerkontroll | Skjør under innebygging |
| Kontroll av levedyktighet | Lengre tid som trengs mellom passeringer |
| Gjelder for eksempel legemiddelscreening, flowcytometri | Lengre utvinningstid fra frosne aksjer |
| Uten fordøyelse med én celle | |
| Proffene | Ulemper |
| Morfologi er gunstig for histologiske analyser | Utvidelse av PUD-er mer i størrelse enn i antall |
| Høyere stabilitet i innebyggingsprosessen | Gjelder ikke for analyser der enkeltcellesuspensjon er obligatorisk |
| Rask gjenoppretting fra frosne aksjer | Mangel på cellenummerkontroll og størrelsessporing |
Tabell 4: Fordeler og ulemper ved subkulturering av EAC-PUD-er med og uten enkeltcellet fordøyelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen beskrives to forskjellige subkultur- og kryopreserveringsmetoder for EAC-PUD-er, det vil si med og uten fordøyelse av enkeltceller. Flere studier anbefalte å passere EAC-PUD-er med encellet fordøyelse15,17, noe som er gunstig for de fleste eksperimenter som krever cellenummerkontroll, jevn tetthet og en hul struktur som letter størrelsessporing. Imidlertid er den encellebaserte metoden preget av langsommere vekst etter fordring fra frosne lagre og mindre kompakt morfologi i kulturperioden. Erfaring indikerer 2-3 uker for encellet fordring for å nå gjeldende tetthet for subkulturprosessen. I motsetning til dette kan frosne EAC-P PUD-er uten fordøyelse av enkeltceller nå samme størrelse i en kortere periode (ca. 1 uke) etter fordring. En grunn kan være det ekstra stresset fra trypsin fordøyelsen i relativt lang tid (10 min). Derfor anbefales det å bevare ufordøyde EAC-PUD-er i forholdet 1:1.5 (frysing av to kupler av ufordøyde EAC-P PUD-er og sådd tilbake i tre kupler for fordring). I tillegg anbefales bruk av ufordøyde EAC-PUD-er for rask utvidelse og histologisk karakterisering av IHC- eller IF-farging på grunn av den kompakte strukturen. Fordeler og ulemper ved de to subkulturmetodene er oppsummert i tabell 4.
Flere kritiske trinn krever oppmerksomhet i denne protokollen. For det første må platene for PUD-kultur forhåndsvarmes over natten i en 37 ° C inkubator for å sikre størkningsprosessen av nysåede ECM gelkupler. Det anbefales å bruke en kokeplate for å holde platen ved 37 °C mens du håndterer forlenget såingsvarighet. For det andre er det nødvendig med lave bindingsrør under subkulturprosessen for å unngå betydelig PUD-tap. For å forhindre tap av ECM gel, kan spisser med en bred boreåpning forkjøles i -20 °C fryseren før bruk. Her unngår den brede åpningen av spissene skade på PUD-strukturer under høstingstrinnet. Deretter anbefales det å inkubere PUD-er i 20 min på is før det første sentrifugeringstrinnet, for å sikre fullstendig flytende ECM gel. Vær oppmerksom på at sentrifugen må stilles inn ved 4 °C under sentrifugeringstrinn for å holde gjenværende ECM gel i flytende tilstand. I tillegg, for encellet metode, anbefales det å blande PDOene grundig etter trypsininkubasjon ved hjelp av en normal 1000 μL-spiss for å bryte celleklumper før du legger til STI, i stedet for å filtrere celleopphenget direkte med cellesiler, for å unngå celletap.
Noen endringer kan gjøres i denne protokollen. Cellegjenvinningsløsningen kan erstattes av iskald DPBS for oppløsning av ECM-gelen i høsttrinnet. Imidlertid viste erfaringer en bedre evne til å oppløse ECM gel ved hjelp av cellegjenopprettingsløsningen. Derfor anbefales iskald DPBS ganske bare som en alternativ sikkerhetskopieringsmetode. Hvis laboratoriet ikke er utstyrt med en roterende inkubator, kan EAC-PUD-er inkuberes med trypsin i et 37 ° C vannbad sammen med blanding ved å invertere røret hver 2-3 min. 10% DMSO med føtal bovin serum (FBS) kan brukes som et alternativ for frysemiddel for å forberede frosne PUD-lagre. Imidlertid foretrekkes et kommersielt frysemedium med lavere eller ingen serum på grunn av en bedre PUD-utvinning.
Noen begrensninger må løses i denne protokollen. Siden disse metodene bare er testet i EAC-PDA-er, er ikke bruken av denne protokollen på andre typer PDOer klar. Selv om prosedyrer for passivisering av PUD-er med og uten enkeltcellet fordøyelse er standardisert for de fleste organoidtyper21,22, er det fortsatt behov for å forsøke nåværende protokoller på andre krefttyper for å sikre reproduserbarhet. I tillegg kan en 10 min 0,25% trypsininkubasjon stresse cellene under fordøyelsen; Inkubasjonstiden kan derfor variere basert på pre-subkultur PUD-tilstanden og det enkelte PUD-mangfoldet. Under tidlige forsøk foreslås det å angi forskjellige trypsininkubasjonstider for hver EAC PUD.
Til slutt er dette den første protokollen som beskriver og diskuterer subkultur og kryopreservering av EAC-PUD-er med og uten enkeltcellet fordøyelse. Subkulturerende EAC-P PUD-er med enkeltcellefordøyelse gjelder for sammenligningseksperimenter mellom grupper, mens ufordøyde EAC-PUD-er er gunstige for histologisk karakterisering, kryopreservering og rask ekspansjon. Her er rutinemessig vedlikehold av EAC-PUD-er standardisert, og gir en veiledning for forskere å velge passende metoder for EAC organoidgenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter i dette arbeidet.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Köln Fortune Program/Det medisinske fakultet, Universitetet i Köln. Vi takker teknisk assistanse fra Susanne Neiss, Michaela Heitmann og Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan ble økonomisk støttet av Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC). Forfatterne takker Dr. Joshua D'Rozario for hans hjelp til språklig redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Coleman, H. G., Xie, S. -H., Lagergren, J.
- Rumgay, H., et al. International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence. The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).
- Qian, H., et al. Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis. Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).
- Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P.
- Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization. British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).
- Hashimoto, N. Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents. ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).
- Quante, M., et al. Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia. Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).
- Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future. Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).
- Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers. Aging. 13 (8), Albany NY. 12273-12293 (2021).
- Liu, D. S. H., et al. APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma. Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).
- Ebbing, E. A., et al. Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition. Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Li, X., et al. Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics. Nature Communications. 9, 2983 (2018).
- Ebbing, E. A., et al. Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Ordóñez, N. G. Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review. Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).
- Maniar, K. P., Umpires, B.
- Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
