Summary
Bu protokol, araştırmacıların deneysel tasarımlarına dayanarak uygun stratejileri seçmelerini sağlamak için özofagus adenokarsinom organoidlerinin tek hücreli sindirimli ve tek hücreli sindirimsiz alt kültür ve kriyoprezervasyon yöntemlerini açıklamaktadır.
Abstract
Tümörigenezi ve tedavi stratejilerini araştırmak için primer hastalığı yansıtan uygun translasyonel araştırma modellerinin bulunmaması, özofagus adenokarsinomunda (EAC) önemli bir engeldir. Hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar) son zamanlarda çeşitli kanserlerde dikkate değer bir klinik öncesi model olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, EAC PDO'ları geliştirmek için hala sınırlı protokoller bulunmaktadır. PDO'lar kurulduktan sonra, yayılma ve kriyoprezervasyon, daha sonraki aşağı akış analizleri için gereklidir. Burada, EAC PDO'ların alt kültürü ve kriyoprezervasyonu, yani tek hücreli sindirimli ve sindirimsiz olmak üzere iki farklı yöntem standartlaştırılmıştır. Her iki yöntem de uygun hücre canlılığını güvenilir bir şekilde elde edebilir ve çeşitli deneysel kurulumlar için uygulanabilir. Mevcut çalışma, EAC PDO'ların tek hücreli sindirimle alt kültürlenmesinin, hücre numarası kontrolü, homojen yoğunluk ve boyut izlemeyi kolaylaştıran içi boş bir yapı gerektiren çoğu deney için uygun olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, tek hücreli yöntem, kültürde ve dondurulmuş stoklardan yeniden ekimden sonra daha yavaş büyüme göstermektedir. Ayrıca, tek hücreli sindirim ile alt kültürleme, içi boş bir çekirdeğe sahip içi boş yapılar oluşturarak karakterize edilir. Buna karşılık, EAC PDO'ların tek hücreli sindirim olmadan işlenmesi kriyoprezervasyon, genişleme ve histolojik karakterizasyon için elverişlidir. Bu protokolde, araştırmacıların organoidlerini işlemek ve araştırmak için uygun bir yöntem seçmelerini sağlamak için EAC PDO'ların tek hücreli sindirimli ve tek hücreli sindirimsiz alt kültürlenmesi ve kriyoprezervasyonunun avantajları ve dezavantajları açıklanmaktadır.
Introduction
Özofagus kanseri (EC), dünya çapında kanserden kaynaklanan ölümlerin onuncu en yaygın ve altıncı önde gelen nedenidir1. Özofagus adenokarsinomu (EAK) EK'nin başlıca histolojik alt tiplerinden biridir ve esas olarak batı ülkelerinde görülür2. Son on yılda, EAC insidansı, Almanya3 de dahil olmak üzere birçok gelişmiş ülkede önemli ölçüde artmıştır. Kanserin agresifliği ve tümör gelişiminin erken evresinde semptomların olmaması nedeniyle, EAC hastalarında genel prognoz kötüdür ve 5 yıllık sağkalım oranı yaklaşık% 20,4,5'tir.
Yirminci yüzyılın sonlarından bu yana, EAC'nin biyomedikal araştırmaları için çeşitli modeller oluşturulmuştur. 1990'larda kurulan klasik insan EAC hücre hatları6, EAC tümör biyolojisi, tümör genetiği ve anti-tümör stratejileri hakkındaki bilgimizi genişletir ve EAC araştırmalarında yaygın olarak kullanılır. Ayrıca, bazı araştırma grupları, cerrahi veya enflamatuar yaklaşımlarla hayvanları gastroözofageal reflü gibi bilinen risk faktörlerine maruz bırakarak EAC veya Barrett özofagusunun hayvan modellerini başarıyla geliştirmiştir 7,8,9. Ek olarak, EAC primer kanser dokularını deri altından veya ortopik olarak immün yetmezlikli farelere aşılayan hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri, insan EAC tümör biyolojik davranışını ve tümör ortamını simüle etmek için geliştirilmiştir10,11,12. Bununla birlikte, klinik uygulamaları geliştiren bu modellere ve EAC tümörigenezi ve progresyonunun arkasındaki moleküler mekanizmaları anlamamıza rağmen, bu araştırma modellerinden elde edilen sonuçları insanlara tahmin etmek için hala büyük bir zorluk vardır.
Hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDO'lar), in vitro olarak insan gelişimini ve organ yenilenmesini taklit eden bir 3D kültür sisteminde yetiştirilir. Hastaların birincil dokusundan üretilen PDO'lar, insan tümörünün moleküler ve fenotipik özelliklerini özetlemekte ve ilaç geliştirme ve kişiselleştirilmiş kanser tedavisinde umut verici uygulamalar göstermiştir13,14. On EAC PDO vakasını eşleştirilmiş tümör dokusu ile karşılaştırarak, EAC PDO'ların primer tümörle benzer histopatolojik özellikleri ve genomik manzarayı paylaştığı, tümör içi heterojeniteyi koruduğu ve in vitro15'te etkili ilaç taramasını kolaylaştırdığı bildirilmiştir. EAC PDO'lar, EAC tümör hücrelerinin hasta kaynaklı kanserle ilişkili fibroblastlarla (CAF'lar) etkileşimini incelemede de kullanılmıştır, bu da tümör mikroçevre araştırması alanında güçlü bir uygulamaya işaret etmektedir16. Ne yazık ki, EAC PDO'ları geliştirmek ve yaymak için sınırlı protokoller mevcuttur. Burada, EAC PDO'ların alt kültürlenmesi ve korunması için iki farklı yöntem ayrıntılı olarak açıklanmaktadır: tek hücreli sindirim ile ve sindirimsiz. EAC PDO'ların ve uygulamalarının bakımı için standartlaştırılmış yöntemler, araştırmacıların EAC PDO araştırmalarında farklı amaçlar için uygun yöntemleri seçmelerini destekleyebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yerleşik ve iyi büyüyen bir PDO kültürü, bu protokolde açıklanan başarılı bir alt kültür ve kriyoprezervasyonun temelini temsil eder. Burada, EAC PDO'ları, Karakasheva T. A. ve ark.17 tarafından tanımlanan protokol kullanılarak EAC hastalarının primer tümör dokusundan üretildi. EAC dokuları BioMaSOTA'nın onayı altında biyobankadan toplanmıştır (Köln Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır, ID: 13-091).
NOT: EAC PDO'lar, bir PDO kültür ortamı kullanılarak nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de ve% 5 CO2'de kültürlenmiştir (Tablo 1). Aşağıdaki adımlarda, alt kültürün iki yöntemi ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. PDO'ların kuyu başına üç hücre dışı matris (ECM) jel kubbesinin tohumlama yoğunluğuna sahip alt kültürlenmesi için 12 delikli bir plaka önerilir, çünkü her bir kuyucuğun esnek kullanımına ve farklı amaçlar için uygun miktarda PDO'ya izin verir. PDO'ları kullanırken aseptik bir teknik zorunludur.
1. Önceden hazırlıklar
- 12 delikli bir plakayı, plakanın tamamen ısınmasını sağlamak için alt kültürden önce gece boyunca 37 °C CO2 inkübatöre yerleştirerek önceden ısıtın. Varsa, mevcut PDO kültürüne sahip bir plakadan boş kuyucuklar kullanın.
NOT: Esnek alt kültür planlaması için 1-2 taze plakanın 37 °C'de sürekli depolanması önerilir. - -20 °C'de geniş bir deliğe sahip 1.000 μL ve 200 μL uçları önceden soğutun (sürekli depolama önerilir). 4 °C'de ön soğutma santrifüjü.
- Dönen inkübatörün sıcaklığını 37 ° C'ye ayarlayın (tek hücreli sindirim gerçekleştirilirse).
- Sıvılaştırmak için buz üzerinde 1 saat boyunca uygun miktarda ECM jeli inkübe edin. Hücre kurtarma solüsyonunu buzun üzerine yerleştirin.
2. Organoidlerin toplanması
- Büyüyen PDO'larla plakayı CO2inkübatöründen çıkarın.
- Bir vakum pompası kullanarak eski ortamı aspire edin.
NOT: Kubbelere dokunmaktan kaçının. - Kuyuya uygun miktarda buz gibi soğuk hücre geri kazanım çözeltisi (500 μL / kubbe) ekleyin.
- ECM jel kubbelerini geniş delikli 1.000 μL uçlar kullanarak küçük parçalara ayırmak için ECM jelini birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek parçalayın.
- PDO, ECM jel ve hücre geri kazanım çözeltisi karışımını maksimum iki kuyucuktan (altı kubbe) birleştirin ve 5 mL'lik düşük bağlamalı bir tüpe aktarın (alt kültür için daha fazla kuyu kullanılması durumunda ikinci bir tüp kullanın).
NOT: İsteğe bağlı olarak, ECM jeli tamamen çözülmemişse, PDO, ECM jeli ve hücre geri kazanım çözeltisi karışımına ilave 1,5 mL hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin. - Karışımı içeren tüpü 2.5. adımda buz üzerinde 20 dakika boyunca inkübe edin, ECM jelinin sıvılaşmasını sağlamak için tüpü beş kez ters çevirerek her 5 dakikada bir karıştırın.
- 4° C'de 4 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj
- Santrifüjlemeden sonra görünür ve kararlı bir pelet varsa, adım 2.10 ile devam edin. Aksi takdirde, adım 2.9 ile devam edin.
- Görünür bir pelet yoksa ve PDO'lar hala bir jel fazında sıkışmış gibi görünüyorsa, ECM jel-PDO-Çözeltisi içeren faza ulaşılana kadar süpernatantı bir vakum pompasıyla dikkatlice çıkarın ve 3 mL buz gibi soğuk hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin.
- Tüpü birkaç kez ters çevirin ve 10 dakika daha buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Zaman zaman tüpü ters çevirerek karıştırın.
- 4 °C'de 4 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve adım 2.10 ile devam edin.
- Süper natantı bir vakum pompası veya 1.000 μL pipet kullanarak dikkatlice atın. Süpernatantı mümkün olduğunca çıkarmaya çalışın.
NOT: Tüpün düşük bağlanma yüzeyi nedeniyle, pelet her zamanki gibi stabil olmayacaktır. - PDO peletini buz üzerinde saklayın ve farklı amaçlara bağlı olarak adım 3 (sindirim olmadan) veya adım 4 (tek hücreli sindirim ile) ile devam edin.
3. Sindirim olmadan alt kültürleme
NOT: Bu yöntem, PDO'ların boyutunu ve yoğunluğunu arttırmayı amaçlamaktadır. Daha büyük boyut ve daha yüksek yoğunluk, gömme işlemini, histolojik karakterizasyonu ve PDO genişlemesini kolaylaştırır. PDO bölünmüş oranlarına bağlı olarak (PDO'ların yoğunluğuna bağlı olarak, 1:3 ile 1:6 arasında bir oran önerilir), peleti uygun bir sıvı ECM jeli hacminde adım 2.8'den yeniden askıya alın.
- Önceden soğutulmuş 200 μL ve 1.000 μL uçları geniş bir delikle -20 °C dondurucudan çıkarın ve temiz bir tezgaha yerleştirin.
- Önceden soğutulmuş 1.000 μL uçlar kullanarak peleti ECM jelindeki adım 2.11'den yeniden askıya alın. PDO'ların kümelenmediğinden ve ECM jelinde eşit olarak dağıtıldığından emin olmak için yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın.
NOT: 50 μL ECM jel/kubbe kullanın. Her zaman gerekenden daha fazla bir kubbe için hesaplayın (örneğin, dokuz kubbe (yani üç kuyucuk) için, peleti 500 μL sıvı ECM jelinde (450 + 50 μL ekstra) yeniden askıya alın. Yeniden süspansiyon sırasında kabarcık üretmekten kaçınmaya çalışın! - Kubbeleri tohumlamadan hemen önce önceden ısıtılmış 12 delikli plakayı inkübatörden çıkarın.
- Sıcak plakaya 50 μL ECM jel içeren tohum kubbeleri (üç kubbe / kuyu). ECM jel kubbelerine pipetleme kabarcıkları sokmaktan kaçının.
- Plakayı tekrar 37 °C ve% 5 CO2inkübatöre koyun ve ECM jelini katılaştırmak için 20-30 dakika inkübe edin.
- Kubbeleri rahatsız etmeden önceden ısıtılmış PDO ortamını (Tablo 1) dikkatlice ekleyin.
- Kültür PDO'ları 7-14 gün boyunca gerekli yoğunluk ve morfoloji oluşana kadar kültüre alın.
4. Tek hücreli sindirim ile alt kültürleme
NOT: Aşağıdaki adımlar, kubbe başına PDO sayısını artırmayı amaçlamaktadır. Tek hücreli sindirim, hücre sayısı kontrolünü ve PDO genişlemesini kolaylaştırır.
- 2 mL% 0.25 Tripsin-EDTA ve 20 μL DNaz I (üç kubbenin sindirimi için) karıştırarak sindirim ortamı hazırlayın.
- Peleti adım 2.11'den uygun bir önceden ısıtılmış %0,25 Tripsin-EDTA + DNaz I hacmiyle yeniden askıya alın ve 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetle çekerek yaklaşık 10 kez karıştırın (normal 1.000 μL uçları kullanın).
- Minimum 28 rpm dönüş hızına sahip döner bir inkübatörde 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
- 6 mL Soya Tripsin İnhibitörü (STI, Tablo 2) çözeltisi içeren 15 mL'lik bir tüp hazırlayın (2 mL% 0.25 Tripsin-EDTA başına).
- Sindirimden sonra, PDO'ları bozmak için sindirilmiş PDO'ları 1.000 μL'lik bir pipetle birkaç kez iyice karıştırın.
- Sindirim sürecini durdurmak için sindirilmiş PDO'ları STI çözeltisi içeren 15 mL tüpe aktarın.
- 4 °C'de 4 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj. Süper natantı bir vakum pompası veya 1.000 μL pipet kullanarak dikkatlice atın. Peletin 1 mL bazal ortamda yeniden askıya alınması (Tablo 3).
- Otomatik bir hücre sayacı veya bir Hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu ve canlılığını belirleyin.
- Tohum, PDO'yu kubbe başına 2 x 104 hücreli 12 delikli bir plakaya sindirdi.
- Tohumlama için planlanan kubbelere göre hücre sayısını hesaplayın ve bunları taze bir 1,5 mL düşük bağlama tüpüne aktarın.
NOT: Bir kubbe daha (+ 2 x 104 hücre ekstra) için hesaplayın. Örneğin, üç kubbeyi bir kuyuya yerleştirmek için 8 x 10 4 (2 x 10 4 * 3 + 2 x 104 ekstra) hücre alın. - 4 °C'de 4 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj.
- Görünür bir pelet yoksa, peletin nerede olduğunu bilmek için santrifüjün içindeki tüpün yönünü unutmayın.
- 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice atın. Pelet'i rahatsız etmeden süpernatantı mümkün olduğunca çıkarın.
- Önceden soğutulmuş 1.000 μL geniş delik ucuna sahip 1.000 μL pipet kullanarak pelete uygun hacimde ECM jeli ekleyin (50 μL/kubbe + 50 μL ekstra).
- 3.3-3.7 arasındaki adımları izleyin.
- Tohumlama için planlanan kubbelere göre hücre sayısını hesaplayın ve bunları taze bir 1,5 mL düşük bağlama tüpüne aktarın.
5. Sindirilmiş ve sindirilmemiş PDO'ların kriyoprezervasyonu
NOT: Tek hücreli sindirilmiş ve sindirilmemiş PDO'lar, dondurulmuş yedek stokların hazırlanması için uygundur. Tek hücreli dondurulmuş stoklardan yeniden ekilen PDO'ların iyileşmesi ve belirli bir boyuta ulaşması için daha uzun bir süre gerektiğini unutmayın.
- Sindirilmemiş PDO'ların kriyoprezervasyonu.
- Adım 2.8'den itibaren pelet ile kriyoprezervasyon işlemine başlayın. Peleti yeniden askıya almak ve kriyojenik bir şişeye aktarmak için 500 μL soğuk dondurma ortamı kullanın.
NOT: Şişe başına iki kubbe saklayın. - Uygun bir hücre dondurma kabı kullanarak PDO'ları -80 °C'lik bir dondurucuda gece boyunca dondurun.
- Adım 2.8'den itibaren pelet ile kriyoprezervasyon işlemine başlayın. Peleti yeniden askıya almak ve kriyojenik bir şişeye aktarmak için 500 μL soğuk dondurma ortamı kullanın.
- Tek hücreli sindirilmiş PDO'ların kriyoprezervasyonu.
- PDO'ları hasat ettikten ve sindirdikten sonra, adım 4.8'den kriyoprezervasyona başlayın.
- Bir kriyojenik şişeyi saklamak için, 4-5 x 10 5 hücreyi taze bir1.5 mL düşük bağlanma tüpüne aktarın.
NOT: Üç kubbe/şişe saklayın. - 4 °C'de 4 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice atın. Pelet'i rahatsız etmeden süpernatantı mümkün olduğunca çıkarın.
- Peleti uygun hacimli bir dondurma ortamında (500 μL / şişe) yeniden askıya alın ve kriyojenik bir şişeye aktarın.
- Uygun bir hücre dondurma kabı kullanarak PDO'ları -80 °C'lik bir dondurucuda gece boyunca dondurun ve uzun süreli depolama için -150 °C'lik bir dondurucuya veya sıvı nitrojene aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, tek hücreli sindirimli ve tek hücreli sindirimsiz EAC PDO'ların alt kültürü ve kriyoprezervasyonunu içeren prosedürleri sunar.
Şekil 1 , iki farklı alt kültür stratejisinin temsili faz-kontrast resimlerini göstermektedir. EAC PDO'lar alt kültürleme için uygun yoğunluğa ulaşmıştır (Şekil 1, sol). Tek hücreli sindirim olmadan alt kültürleme, karşılaştırılabilir yoğunluğa ulaşmak için daha az zaman alır ve esas olarak kompakt yapılara yol açar (Şekil 1, üst sıra). Buna karşılık, tek hücreli sindirilmiş PDO'lar, içi boş bir çekirdeğe sahip içi boş yapılar gösterir (Şekil 1, alt sıra). Şekil 2, kompakt ve içi boş yapılara sahip parafin gömülü EAC PDO'ların Hematoksilin-Eozin (H & E) boyama ve immünohistokimya (IHC) boyamasını göstermektedir. Pan-sitokeratin (Pan-CK) epitel tümör hücrelerinin tanımlanmasını sağlar18. Sitokeratin 7 (CK7), glandüler diferansiye tümör hücrelerini vurgular19. Kompakt yapı (üst sıra) ağırlıklı olarak sindirilmemiş kültürde bulunurken, içi boş yapı (alt sıra) tek hücreli sindirime tabi tutulan kültürde baskındır.
Şekil 3'te eşleştirilmiş EAC dokusunun ve PDO'ların kompakt yapıya ve içi boş yapıya sahip immünofloresan (IHC) boyaması görülmektedir. Ki67, daha yüksek hücresel proliferasyona sahip hücre popülasyonlarını vurgulamaktadır20. Ki67 (kırmızı) ve Pan-CK (yeşil) benzer şekilde EAC birincil dokusu, EAC PDO kompakt yapısı ve EAC PDO içi boş yapısı arasında dağılmıştır. Şekil 4, tek hücre bazlı kriyoprezervasyon (solda) ve sindirilmemiş PDO bazlı kriyoprezervasyon (sağda) ile dondurulmuş stoktan iyileşmenin ilk gününde EAC PDO'ların morfolojik özelliklerini göstermektedir.
Şekil 5, tek hücre sindirimi olan ve olmayan EAC PDO'ların alt kültür sürecinin bir akış şemasını özetlemektedir. Kısaca, iyi büyüyen bir EAC PDO geçmeye hazır. EAC PDO'lar hasat edildi ve peletlendi. Tek hücreli sindirim için, PDO'lar, hücre numarası kontrolü, tekdüze yoğunluk ve boyut takibi gerektiren deneyleri kolaylaştıran içi boş yapılara dönüşmesi muhtemel olan tek hücreleri elde etmek için 5-10 dakika boyunca enzimatik olarak sindirildi. Sindirilmemiş alt kültür için, PDO'lar enzimatik olarak bozulmadan daha fazla büyüyen alan kazanmak için bölündü, bu da histolojik analizleri, hızlı genişlemeyi ve kriyoprezervasyondan daha hızlı iyileşmeyi kolaylaştıran kompakt yapılara dönüşmesi muhtemeldi.
Şekil 1: Bir faz-kontrast mikroskobu altında tek hücre sindirimi olan ve olmayan EAC PDO'ların alt kültürünün morfolojik özellikleri. EAC PDO'lar alt kültürden önce belirli bir yoğunluğa büyür (solda). EAC PDO'ları tek hücre sindirimi olmadan alt kültüre aldıktan sonra, PDO'lar yavaş yavaş içi boş yapılardan kompakt yapılara (sağ, üst sıra) büyürken, tek hücrelerden yetiştirilen PDO'lar ağırlıklı olarak içi boş yapılar (sağ, alt sıra) gösterir. Resimler ters ışık mikroskobu ile 5x objektif kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: EAC PDO'ların kompakt yapısının ve içi boş yapısının histolojik özellikleri. Kompakt yapının (üst sıra) ve içi boş yapının (alt sıra) H&E boyaması (solda), Pan-CK boyaması (orta) ve CK7 boyaması (sağda). Resimler ters ışık mikroskobu ile 20x objektif kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Eşleştirilmiş EAC dokusu ve PDO'ların immünohistokimya boyaması. Eşleştirilmiş EAC dokusunun (üst sıra), kompakt yapının (orta sıra) ve içi boş yapının (alt sıra) Pan-CK (yeşil), Ki67 (kırmızı) ve DAPI (mavi) ile immünofloresan (IF) boyanması. Resimler, 20x hedefi kullanılarak ters çevrilmiş otomatik floresan mikroskobu ile çekildi. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Dondurulmuş stoktan geri kazanımın ilk gününde EAC PDO'ların morfolojik özellikleri. İyileşmenin ilk gününde tek hücre bazlı kriyoprezervasyondan (solda) ve sindirilmemiş PDO bazlı kriyoprezervasyondan (sağda) recultivationasyonun faz-kontrast resimleri. Resimler ters ışık mikroskobu ile 5x objektif kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Tek hücreli sindirimli ve sindirimsiz EAC PDO'ların alt kültür sürecinin akış şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Stok | Son Konsantrasyon | 50 mL | |||
| Bazal ortam (bakınız Tablo 3) | 24 mL | ||||
| Wnt-3A şartlandırılmış ortam | 12 mL | ||||
| Cultrex R-Spondin Hücrelerinden R-Spondin1 şartlandırılmış ortam | 12 mL | ||||
| N-2 | 100x | 1 adet | 500 μL | ||
| B-27 | 50x | 1 adet | 1 mL | ||
| N-Asetilsistein | 0,5 milyon | 1 mM | 100 μL | ||
| CHIR-99021 | 5 mM | 0,5 μM | 5 μL | ||
| Rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (EGF) | 100 μg/mL | 250 ng/mL | 125 μL | ||
| A83-01 | 25 mM | 0,5 μM | 1 μL | ||
| SB202190 | 10 mM | 1 μM | 5 μL | ||
| Gastrin Dili | 100 μM | 0,1 μM | 50 μL | ||
| Nikotinamid | 1 milyon | 20 μM | 1 mL | ||
| Gentamisin | 50 mg/mL | 10 μM | 5 μL | ||
| Penisilin/Streptomisin | 100x | 1 adet | 500 μL | ||
| Amfoterisin B | 250 μg/mL | 0.60% | 300 μL | ||
| Kuyuya taze ekleyin: | |||||
| Kafa | 100 μg/mL | 50 μL | |||
| Y-27632 | 10,5 mM | 50 μL | |||
| Birincil dokudan yeni PDO'lar oluştururken veya donmuş stoklardan kurtulurken ekleyin | |||||
| FGF-10a | 100 μg/mL | 100 ng/mL | 50 μL | ||
Tablo 1: EAC PDO kültür ortamının hazırlanması.
| Soya Fasulyesi Tripsin İnhibitörü (CYBE) | 12,5 mg |
| DPBS ile 50 mL'ye ayarlayın | |
| 0,2 μm steril filtreden süzün |
Tablo 2: Soya Tripsin İnhibitörü (CYBE) çözeltisinin hazırlanması.
| Reaktif | Hacim | Son konsantrasyon |
| Gelişmiş DMEM/F-12 | 48,2 milyon L | |
| HEPES (1 M) | 500 μL | 10 mM |
| L-Glutamin (100X) | 500 μL | 1X |
| Penisilin-Streptomisin (100X) | 500 μL | 1X |
| Amfoterisin B | 300 μL | 0.60% |
| Gentamisin (50 mg/mL) | 5 μL | 5 μg/mL |
Tablo 3: Bazal ortamın hazırlanması.
| Tek hücreli sindirim | |
| Profesyonel | Eksi -lerini |
| Hücre numarası kontrolü | Gömme sırasında kırılgan |
| Canlılık kontrolü | Pasajlar arasında daha uzun süre gerekir |
| Örneğin, İlaç Taraması, Akış Sitometrisi için uygulanabilir | Dondurulmuş stoklardan daha uzun iyileşme süresi |
| Tek hücreli sindirim olmadan | |
| Profesyonel | Eksi -lerini |
| Morfoloji histolojik analizler için faydalıdır | PDO'ların sayıca daha fazla genişlemesi |
| Gömme işleminde daha yüksek stabilite | Tek hücreli süspansiyonun zorunlu olduğu analizler için geçerli değildir |
| Dondurulmuş stoklardan hızlı geri kazanım | Hücre numarası kontrolü ve boyut izleme eksikliği |
Tablo 4: EAC PDO'ları tek hücreli sindirim ile ve tek hücre sindirimi olmadan alt kültüre almanın artıları ve eksileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde EAC PDO'ların iki farklı alt kültür ve kriyoprezervasyon yöntemi, yani tek hücreli sindirimli ve sindirimsiz olarak tanımlanmıştır. Birçok çalışma, EAC PDO'ların tek hücreli sindirim15,17 ile geçişini önerdi; bu, hücre numarası kontrolü, tekdüze yoğunluk ve boyut izlemeyi kolaylaştıran içi boş bir yapı gerektiren çoğu deney için faydalıdır. Bununla birlikte, tek hücreli yöntem, dondurulmuş stoklardan yeniden ekimden sonra daha yavaş büyüme ve kültür döneminde daha az kompakt morfoloji ile karakterizedir. Deneyimler, tek hücre bazlı recultivation'ın alt kültür süreci için uygulanabilir yoğunluğa ulaşması için 2-3 hafta olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, tek hücreli sindirim olmadan dondurulmuş EAC PDO'lar, yeniden ekimden sonra daha kısa bir sürede (yaklaşık 1 hafta) aynı boyuta ulaşabilir. Bunun bir nedeni, tripsin sindiriminden nispeten uzun bir süre (10 dakika) kaynaklanan ekstra stres olabilir. Bu nedenle, sindirilmemiş EAC PDO'ların 1: 1.5 oranında korunması önerilir (sindirilmemiş EAC PDO'ların iki kubbesinin dondurulması ve yeniden yetiştirme için üç kubbeye geri ekilmesi). Ek olarak, kompakt yapı nedeniyle IHC veya IF boyama ile hızlı genişleme ve histolojik karakterizasyon için sindirilmemiş EAC PDO'ların kullanılması önerilir. İki alt kültür yönteminin artıları ve eksileri Tablo 4'te özetlenmiştir.
Bu protokolde dikkat edilmesi gereken birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, PDO kültürü plakalarının, taze tohumlanmış ECM jel kubbelerinin katılaşma işlemini sağlamak için 37 ° C'lik bir inkübatörde gece boyunca önceden ısıtılması gerekir. Uzun tohumlama süresiyle uğraşırken plakayı 37 ° C'de tutmak için sıcak bir plaka kullanılması önerilir. İkincisi, önemli PDO kaybını önlemek için alt kültür işlemi sırasında düşük bağlanmalı tüpler gereklidir. ECM jel kaybını önlemek için, geniş delikli açıklığa sahip uçlar, kullanımdan önce -20 °C dondurucuda önceden soğutulabilir. Burada, uçların geniş açılması, hasat adımı sırasında PDO yapılarının zarar görmesini önler. Daha sonra, ECM jelinin tamamen sıvılaşmasını sağlamak için PDO'ların ilk santrifüjleme adımından önce buz üzerinde 20 dakika boyunca inkübe edilmesi önerilir. Artık ECM jelini sıvı halde tutmak için santrifüjün santrifüjleme adımları sırasında 4 °C'ye ayarlanması gerektiğini unutmayın. Ek olarak, tek hücreli yöntem için, tripsin inkübasyonundan sonra, hücre kaybını önlemek için hücre süspansiyonunu hücre süzgeçleriyle doğrudan filtrelemek yerine, STI'yi eklemeden önce hücre kümelerini kırmak için normal bir 1.000 μL uç kullanarak PDO'ların iyice karıştırılması önerilir.
Bu protokolde bazı değişiklikler yapılabilir. Hücre geri kazanım çözeltisi, ECM jelinin hasat adımında çözülmesi için buz gibi soğuk DPBS ile değiştirilebilir. Bununla birlikte, deneyimler hücre geri kazanım çözeltisini kullanarak ECM jelini çözme konusunda daha iyi bir yetenek göstermiştir. Bu nedenle, buz gibi soğuk DPBS yalnızca alternatif bir yedekleme yöntemi olarak önerilir. Laboratuvarda dönen bir inkübatör yoksa, EAC PDO'lar 37 °C'lik bir su banyosunda tripsin ile inkübe edilebilir ve tüpü her 2-3 dakikada bir ters çevirerek karıştırılabilir. fetal sığır serumu (FBS) ile% 10 DMSO, dondurulmuş PDO stokları hazırlamak için donma ortamı için alternatif olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, daha iyi bir PDO geri kazanımı nedeniyle daha düşük serum içeren veya hiç serum içermeyen ticari bir dondurma ortamı tercih edilir.
Bu protokolde bazı sınırlamaların ele alınması gerekir. Bu yöntemler sadece EAC PDO'larda test edildiğinden, bu protokolün diğer PDO türlerine uygulanması açık değildir. Tek hücreli sindirimi olan ve olmayan PDO'ların geçişine yönelik prosedürler çoğu organoid tip21,22 için standartlaştırılmış olsa da, tekrarlanabilirliği sağlamak için diğer kanser tiplerinde mevcut protokollerin denenmesine hala ihtiyaç vardır. Ek olarak, 10 dakika% 0.25'lik bir tripsin inkübasyonu, sindirim sırasında hücreleri strese sokabilir; bu nedenle, inkübasyon süresi pre-subkültür PDO durumuna ve bireysel PDO çeşitliliğine bağlı olarak değişebilir. Erken denemelerde, her EAC PDO için farklı tripsin inkübasyon süreleri ayarlanması önerilmektedir.
Sonuç olarak, bu, tek hücreli sindirimli ve sindirimsiz EAC PDO'ların alt kültürünü ve kriyoprezervasyonunu tanımlayan ve tartışan ilk protokoldür. EAC PDO'ların tek hücreli sindirimle alt kültürlenmesi, gruplar arasındaki karşılaştırma deneyleri için uygulanabilirken, sindirilmemiş EAC PDO'lar histolojik karakterizasyon, kriyoprezervasyon ve hızlı genişleme için faydalıdır. Burada, EAC PDO'ların rutin bakımı standartlaştırılmıştır ve araştırmacıların EAC organoid üretimi için uygun yöntemleri seçmeleri için bir rehber sağlanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu çalışmada çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Köln Fortune Programı/Köln Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından desteklenmiştir. Susanne Neiss, Michaela Heitmann ve Anke Wienand-Dorweiler'in teknik yardımlarına teşekkür ederiz. Ningbo Fan, Guangzhou Elit Burs Konseyi (GESC) tarafından finansal olarak desteklendi. Yazarlar, dilbilimsel düzenlemedeki yardımları için Dr. Joshua D'Rozario'ya teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Coleman, H. G., Xie, S. -H., Lagergren, J.
- Rumgay, H., et al. International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence. The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).
- Qian, H., et al. Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis. Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).
- Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P.
- Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization. British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).
- Hashimoto, N. Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents. ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).
- Quante, M., et al. Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia. Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).
- Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future. Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).
- Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers. Aging. 13 (8), Albany NY. 12273-12293 (2021).
- Liu, D. S. H., et al. APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma. Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).
- Ebbing, E. A., et al. Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition. Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Li, X., et al. Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics. Nature Communications. 9, 2983 (2018).
- Ebbing, E. A., et al. Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Ordóñez, N. G. Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review. Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).
- Maniar, K. P., Umpires, B.
- Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
