Summary
Denne protokol beskriver metoderne til subkultur og kryopræservering af esophageal adenocarcinom organoider med og uden enkeltcelle fordøjelse for at gøre det muligt for forskere at vælge passende strategier baseret på deres eksperimentelle design.
Abstract
Manglen på egnede translationelle forskningsmodeller, der afspejler primær sygdom til at udforske tumorgenese og terapeutiske strategier, er en stor hindring i esophageal adenocarcinom (EAC). Patientafledte organoider (PTO'er) har for nylig vist sig som en bemærkelsesværdig præklinisk model i en række kræftformer. Der er dog stadig begrænsede protokoller til rådighed til udvikling af ØK PPO'er. Når PPO'erne er etableret, er formering og kryopræservering afgørende for yderligere downstream-analyser. Her er to forskellige metoder blevet standardiseret for EAC PPO'er subkultur og kryopræservering, dvs. med og uden enkeltcellefordøjelse. Begge metoder kan pålideligt opnå passende cellelevedygtighed og kan anvendes til en forskelligartet forsøgsopstilling. Den nuværende undersøgelse viste, at subkulturering af EAC PPO'er med enkeltcellefordøjelse er velegnet til de fleste eksperimenter, der kræver cellenummerkontrol, ensartet tæthed og en hul struktur, der letter størrelsessporing. Den enkeltcellebaserede metode viser imidlertid langsommere vækst i kultur såvel som efter gendyrkning fra frosne bestande. Desuden er subkulturering med enkeltcellefordøjelse karakteriseret ved at danne hule strukturer med en hul kerne. I modsætning hertil er behandling af EAC PTO'er uden enkeltcellefordøjelse gunstig for kryokonservering, ekspansion og histologisk karakterisering. I denne protokol beskrives fordele og ulemper ved subkulturering og kryopræservering af EAC PTO'er med og uden enkeltcellefordøjelse for at gøre det muligt for forskere at vælge en passende metode til at behandle og undersøge deres organoider.
Introduction
Spiserørkræft (EC) er den tiende mest almindelige og den sjette største dødsårsag fra kræft på verdensplan1. Esophageal adenocarcinom (EAC) er en af de vigtigste histologiske undertyper af EF og forekommer hovedsageligt i vestlige lande2. I det seneste årti er forekomsten af forhåndsræk steget betydeligt i mange udviklede lande, herunder Tyskland3. På grund af kræftens aggressivitet og manglen på symptomer i det tidlige stadium af tumorudvikling er den samlede prognose hos EAC-patienter dårlig, hvilket viser en 5-årig overlevelsesrate på ca. 20%2,4,5.
Siden slutningen af det tyvende århundrede er der etableret flere modeller for den biomedicinske forskning i EAC. De klassiske humane EAC-cellelinjer, der blev etableret i 1990'erne6, udvider vores viden om EAC-tumorbiologi, tumorgenetik samt antitumorstrategier og bruges almindeligvis i EAC-forskning. Desuden har nogle forskergrupper med succes udviklet dyremodeller af EAC eller Barretts spiserør ved at udsætte dyrene for kendte risikofaktorer som gastroøsofageal refluks gennem kirurgiske eller inflammatoriske tilgange 7,8,9. Derudover blev patientafledte xenograft (PDX) modeller, der indpodet EAC primære kræftvæv subkutant eller ortotopisk i immundefekte mus, udviklet til at simulere human EAC tumor biologisk adfærd og tumormiljø 10,11,12. På trods af disse modeller, der forbedrer kliniske anvendelser og vores forståelse af molekylære mekanismer bag EAC tumorgenese og progression, er der dog stadig en stor udfordring at ekstrapolere resultater fra disse forskningsmodeller til mennesker.
Patientafledte tumororganoider (PPO'er) dyrkes i et 3D-kultursystem, der efterligner menneskelig udvikling og organregenerering in vitro. Genereret fra patienternes primære væv rekapitulerer PPO'er de molekylære og fænotypiske egenskaber ved den humane tumor og har vist lovende anvendelser inden for lægemiddeludvikling og personlig kræftbehandling13,14. Ved at sammenligne ti tilfælde af EAC PDO'er med deres parrede tumorvæv rapporteres EAC PDO'er at dele lignende histopatologiske træk og genomisk landskab med den primære tumor, bevare intratumorheterogenitet og lette effektiv lægemiddelscreening in vitro15. EAC PDO'er blev også brugt til at studere interaktionen mellem EAC-tumorceller og patientafledte kræftassocierede fibroblaster (CAF'er), hvilket indikerer en stærk anvendelse inden for tumormikromiljøforskning16. Desværre har der været begrænsede protokoller til rådighed til udvikling og udbredelse af ØK PPO'er. Her beskrives to forskellige metoder til at subkulturere og bevare EAC PPO'er i detaljer: med og uden enkeltcellefordøjelse. De standardiserede metoder til vedligeholdelse af EAC PDO'er og deres anvendelser kan støtte forskere i at vælge passende metoder til forskellige formål i deres EAC BOB-forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En etableret og velvoksende BOB-kultur udgør grundlaget for en vellykket subkultur og kryopræservering beskrevet i denne protokol. Her blev EAC PPO'er genereret fra EAC-patienters primære tumorvæv ved hjælp af protokollen beskrevet af Karakasheva T. A. et al17. EAC-væv blev indsamlet fra biobank under godkendelse af BioMaSOTA (godkendt af den etiske komité ved universitetet i Köln, ID: 13-091).
BEMÆRK: ØK-BOB'er er blevet dyrket i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 ved hjælp af et BOB-dyrkningsmedium (tabel 1). I de følgende trin beskrives to metoder i subkulturen detaljeret. En 12-brønds plade anbefales til subkulturering af PPO'erne med en såningstæthed på tre ekstracellulære matrix (ECM) gelkupler pr. Brønd, da det muliggør fleksibel brug af hver brønd og passende mængde PTO'er til forskellige formål. En aseptisk teknik er obligatorisk under håndtering af PPO'erne.
1. Forberedelser på forhånd
- Forvarm en plade med 12 brønde ved at placere den i en 37 °C CO2-inkubator natten over før subkultur for at sikre fuldstændig opvarmning af pladen. Hvis det er tilgængeligt, skal du bruge tomme brønde fra en plade med den nuværende BOB-kultur.
BEMÆRK: Kontinuerlig opbevaring af 1-2 friske tallerkener ved 37 °C anbefales til fleksibel subkulturplanlægning. - Forkøle spidser på 1.000 μL og 200 μL med en bred åbning ved -20 °C (kontinuerlig opbevaring anbefales). Forkøling centrifuge ved 4 °C.
- Opsætte temperaturen på den roterende inkubator til 37 °C (hvis enkeltcellefordøjelsen udføres).
- Inkuber et passende volumen ECM-gel i 1 time på is for at flyde. Placer cellegenvindingsopløsning på is.
2. Høstning af organoider
- Fjern pladen med voksende PPO'er fra CO2 -inkubatoren.
- Aspirer gammelt medium ved hjælp af en vakuumpumpe.
BEMÆRK: Undgå at røre ved kuplerne. - Tilsæt et passende volumen iskold cellegenvindingsopløsning (500 μL/kuppel) i brønden.
- EcM-gelen opløses ved at pipettere op og ned flere gange for at fragmentere ECM-gelkupler i små stykker ved hjælp af 1.000 μL spidser med en bred åbning.
- Kombiner blandingen af BOB, ECM-gel og cellegenvindingsopløsning fra højst to brønde (seks kupler) og overfør den til et 5 ml lavt bindingsrør (brug et andet rør, hvis der anvendes flere brønde til subkultur).
BEMÆRK: Eventuelt, hvis ECM-gel ikke blev opløst fuldstændigt, tilsættes yderligere 1,5 ml cellegenvindingsopløsning til blandingen af BOB, ECM-gel og cellegenvindingsopløsning. - Inkuber røret, der indeholder blandingen, i trin 2,5 på is i 20 minutter, bland hvert 5. minut ved at vende røret fem gange for at sikre fortætningen af ECM-gelen.
- Centrifuge ved 500 x g i 4 min ved 4° C.
- Hvis der er en synlig og stabil pellet efter centrifugering, skal du fortsætte med trin 2.10. Ellers skal du fortsætte med trin 2.9.
- Hvis der ikke er nogen synlig pellet, og BOB'erne stadig ser ud til at sidde fast i en gelfase, skal du forsigtigt fjerne supernatanten med en vakuumpumpe, indtil fasen indeholdende ECM gel-BOB-Solution er nået, og tilsæt 3 ml iskold cellegenvindingsopløsning.
- Omvendt røret et par gange og inkuber på is i yderligere 10 minutter. Bland ved at vende røret fra tid til anden.
- Centrifuge ved 500 x g i 4 minutter ved 4 °C og fortsæt med trin 2,10.
- Kassér supernatanten forsigtigt ved hjælp af en vakuumpumpe eller en 1.000 μL pipette. Prøv at fjerne supernatanten så meget som muligt.
BEMÆRK: På grund af rørets lave bindingsoverflade vil pillen ikke være så stabil som normalt. - Opbevar BOB-pelleten på is og fortsæt med trin 3 (uden fordøjelse) eller trin 4 (med enkeltcellefordøjelse) afhængigt af de forskellige formål.
3. Subkulturering uden fordøjelse
BEMÆRK: Denne metode har til formål at øge PPO'ernes størrelse og densitet. Den større størrelse og højere densitet letter indlejringsprocessen, histologisk karakterisering og BOB-ekspansion. Afhængigt af BOB-splitforholdet (baseret på massetætheden af BOB'er anbefales et forhold mellem 1:3 og 1:6), skal pelleten suspenderes fra trin 2,8 i et passende volumen flydende ECM-gel.
- Fjern forkølede 200 μL og 1.000 μL spidser med en bred åbning fra -20 °C fryseren og læg dem på en ren bænk.
- Resuspend pellet fra trin 2.11 i ECM gel ved hjælp af forkølede 1.000 μL spidser. Bland ved at pipettere op og ned ca. 10 gange for at sikre, at PTO'er ikke klumper sammen og fordeles jævnt i ECM-gelen.
BEMÆRK: Brug 50 μL ECM gel/kuppel. Beregn altid for en kuppel mere end krævet (f.eks. for ni kupler (dvs. tre brønde), resuspend pelleten i 500 μL flydende ECM gel (450 + 50 μL ekstra). Prøv at undgå at producere bobler under resuspension! - Fjern den forvarmede 12-brønds plade fra inkubatoren lige før såning af kuplerne.
- Frøkupler indeholdende 50 μL ECM gel i den varme plade (tre kupler/brønd). Undgå pipettering af bobler i ECM gelkuplerne.
- Sæt pladen tilbage i 37 °C og 5 % CO 2-inkubatoren og inkuber i 20-30 minutter for at størkne ECM-gelen.
- Tilsæt forvarmet BOB-medium (tabel 1) forsigtigt uden at forstyrre kuplerne.
- Kultur PPO'erne i 7-14 dage, indtil den krævede densitet og morfologi forekommer.
4. Subkulturering med enkeltcelle fordøjelse
BEMÆRK: Følgende trin sigter mod at øge antallet af PPO'er pr. Kuppel. Enkeltcellefordøjelsen letter cellenummerkontrol og BOB-ekspansion.
- Forbered fordøjelsesmedium ved at blande 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA og 20 μL DNase I (til fordøjelse af tre kupler).
- Brug pillen fra trin 2.11 igen med et passende volumen forvarmet 0,25% Trypsin-EDTA + DNase I og bland den ca. 10 gange ved at pipettere op og ned ved hjælp af en 1.000 μL pipette (brug normale 1.000 μL spidser).
- Inkuber i 10 minutter ved 37 °C i en roterende inkubator med en rotationshastighed på mindst 28 o/min.
- Forbered et 15 ml rør indeholdende 6 ml sojabønne trypsinhæmmer (STI, tabel 2) opløsning (pr. 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA).
- Efter fordøjelsen blandes de fordøjede PTO'er grundigt et par gange med en 1.000 μL pipette for at forstyrre PPO'erne.
- Overfør de fordøjede PPO'er til 15 ml-røret, der indeholder STI-opløsning, for at stoppe fordøjelsesprocessen.
- Centrifuge ved 500 x g i 4 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten forsigtigt ved hjælp af en vakuumpumpe eller en 1.000 μL pipette. Resuspend pelleten i 1 ml basalmedium (tabel 3).
- Bestem cellekoncentration og levedygtighed ved hjælp af en automatiseret celletæller eller et hæmocytometer.
- Frø fordøjede BOB i en 12-brønds plade med 2 x 104 celler pr. Kuppel.
- Beregn celletallet i henhold til de kupler, der er planlagt til såning, og overfør dem til et nyt 1,5 ml lavt bindingsrør.
BEMÆRK: Beregn for en kuppel mere (+ 2 x 104 celler ekstra). For eksempel til såning af tre kupler i en brønd, tag 8 x 104 (2 x 104 * 3 + 2 x 104 ekstra) celler. - Centrifuge ved 500 x g i 4 minutter ved 4 °C.
- Hvis der ikke er nogen synlig pellet, skal du huske orienteringen af røret inde i centrifugen for at vide, hvor pelleten er placeret.
- Kassér forsigtigt supernatanten ved hjælp af en pipette på 1.000 μL. Fjern supernatanten så meget som muligt uden at forstyrre pillen.
- Tilsæt passende volumen ECM-gel til pelleten ved hjælp af en 1.000 μL pipette med forkølet 1.000 μL bred åbningsspids (50 μL / kuppel + 50 μL ekstra).
- Følg trin 3.3-3.7.
- Beregn celletallet i henhold til de kupler, der er planlagt til såning, og overfør dem til et nyt 1,5 ml lavt bindingsrør.
5. Kryopræservering af de fordøjede og ufordøjede PPO'er
BEMÆRK: Enkeltcellefordøjede og ufordøjede PPO'er er egnede til fremstilling af frosne backuplagre. Bemærk, at genopdyrkede PPO'er fra de enkeltcellede frosne lagre kræver længere tid at komme sig og nå en vis størrelse.
- Kryopræservering af de ufordøjede PPO'er.
- Start kryopræserveringsprocessen med pelleten fra trin 2.8. Brug 500 μL koldfrysningsmedium til at suspendere pelleten igen og overføre den til et kryogent hætteglas.
BEMÆRK: Opbevar to kupler pr. hætteglas. - Frys PPO'er natten over i en -80 °C fryser ved hjælp af en passende cellefrysningsbeholder.
- Start kryopræserveringsprocessen med pelleten fra trin 2.8. Brug 500 μL koldfrysningsmedium til at suspendere pelleten igen og overføre den til et kryogent hætteglas.
- Kryopræservering af de enkeltcellefordøjede PPO'er
- Efter høst og fordøjelse af PPO'er skal du starte kryopræservering fra trin 4.8.
- Til opbevaring af et kryogent hætteglas overføres 4-5 x 105 celler til et nyt 1,5 ml lavt bindingsrør.
BEMÆRK: Opbevar tre kupler/hætteglas. - Centrifuge ved 500 x g i 4 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten forsigtigt ved hjælp af en 1.000 μL pipette. Fjern supernatanten så meget som muligt uden at forstyrre pillen.
- Pelleten suspenderes igen i et passende volumen frysemedium (500 μL/hætteglas), og den overføres til et kryogent hætteglas.
- Frys PPO'er natten over i en -80 °C fryser ved hjælp af en passende cellefrysningsbeholder, og overfør dem til en -150 °C fryser eller flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol præsenterer procedurerne, herunder subkultur og kryopræservering af EAC PPO'er med og uden enkeltcellefordøjelse.
Figur 1 viser repræsentative fasekontrastbilleder af de to forskellige subkulturstrategier. EAC PPO'er nåede passende tæthed til subkulturering (figur 1, til venstre). Subkulturering uden fordøjelse af en enkelt celle tager mindre tid at nå sammenlignelig densitet og fører hovedsageligt til kompakte strukturer (figur 1, øverste række). I modsætning hertil viser de enkeltcellefordøjede PPO'er hule strukturer med en hul kerne (figur 1, nederste række). Figur 2 viser Hematoxylin-Eosin (H&E) farvning og immunohistokemi (IHC) farvning af paraffinindlejrede EAC PDO'er med kompakte og hule strukturer. Pan-cytokeratin (Pan-CK) muliggør identifikation af epiteltumorceller18. Cytokeratin 7 (CK7) fremhæver de kirteldifferentierede tumorceller19. Den kompakte struktur (øverste række) findes overvejende i den ufordøjede kultur, mens den hule struktur (nederste række) er dominerende i den kultur, der gennemgik enkeltcellefordøjelsen.
Figur 3 viser immunofluorescens (IHC) farvning af parret EAC-væv og PPO'er med kompakt struktur og hul struktur. Ki67 fremhæver cellepopulationerne med højere cellulær proliferation20. Ki67 (rød) og Pan-CK (grøn) blev ligeledes fordelt mellem EAC primært væv, EAC BOB kompakt struktur og EAC BOB hul struktur. Figur 4 viser de morfologiske egenskaber ved EAC PDO'er på den første dag for genopretning fra frossen bestand med enkeltcellebaseret kryopræservering (venstre) og ufordøjet BOB-baseret kryopræservering (højre).
Figur 5 opsummerer et flowdiagram over subkulturprocessen for EAC PPO'er med og uden enkeltcellefordøjelse. Kort fortalt er en velvoksende EAC BOB klar til at blive passeret. EAC PPO'er blev høstet og pelleteret. Til fordøjelse af enkeltceller blev PTO'er enzymatisk fordøjet i 5-10 minutter for at få enkeltceller, som sandsynligvis ville vokse til hule strukturer, der letter eksperimenter, der kræver cellenummerkontrol, ensartet densitet og størrelsessporing. For ufordøjet subkultur blev PTO'er opdelt for at få mere voksende plads uden enzymatisk forstyrrende, som sandsynligvis ville vokse til kompakte strukturer, der letter histologiske analyser, hurtig ekspansion og hurtigere genopretning fra kryopræservering.
Figur 1: Morfologiske egenskaber ved EAC PPO'er subkultur med og uden enkeltcellefordøjelse under et fasekontrastmikroskop. EAC PPO'er vokser til en vis tæthed før subkultur (til venstre). Ved subkulturering af EAC PPO'er uden enkeltcellefordøjelse vokser PPO'er gradvist fra hule strukturer til kompakte strukturer (højre, øverste række), mens PPO'er dyrket fra enkeltceller viser overvejende hule strukturer (højre, nederste række). Billeder blev taget med omvendt lysmikroskop ved hjælp af et 5x mål. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Histologiske egenskaber ved EAC PTO'ers kompakte struktur og hule struktur. H&E-farvningen (venstre), Pan-CK-farvningen (midten) og CK7-farvningen (højre) af den kompakte struktur (øverste række) og den hule struktur (nederste række). Billeder blev taget med omvendt lysmikroskop ved hjælp af et 20x mål. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Immunohistokemifarvning af parret EAC-væv og PTO'er. Immunofluorescens (IF) farvning af parret EAC-væv (øverste række), kompakt struktur (midterste række) og hul struktur (nederste række) med Pan-CK (grøn), Ki67 (rød) og DAPI (blå). Billeder blev taget med omvendt automatiseret fluorescensmikroskop ved hjælp af et 20x mål. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Morfologiske egenskaber ved EAC PTO'er på den første dag for genopretning fra frossen lager. Fasekontrastbilleder af rekultivation fra enkeltcellebaseret kryopræservering (venstre) og ufordøjet BOB-baseret kryopræservering (højre) på den første genopretningsdag. Billeder blev taget med omvendt lysmikroskop ved hjælp af et 5x mål. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Flowdiagrammet for subkulturprocessen for EAC PPO'er med og uden enkeltcellefordøjelse.
| Lager | Endelig koncentration | 50 ml | |||
| Basalt medium (se tabel 3) | 24 ml | ||||
| Wnt-3A konditioneret medium | 12 ml | ||||
| R-Spondin1 betinget medium fra Cultrex R-Spondin celler | 12 ml | ||||
| N-2 | 100x | 1x | 500 μL | ||
| B-27 | 50x | 1x | 1 ml | ||
| N-acetylcystein | 0,5 m | 1 mM | 100 μL | ||
| Læs mere | 5 mM | 0,5 μM | 5 μL | ||
| Rekombinant human epidermal vækstfaktor (EGF) | 100 μg/ml | 250 ng/ml | 125 μL | ||
| A83-01 | 25 mM | 0,5 μM | 1 μL | ||
| SB202190 | 10 mM | 1 μM | 5 μL | ||
| Gastrin | 100 μM | 0,1 μM | 50 μL | ||
| Nicotinamid | 1 m | 20 μM | 1 ml | ||
| Gentamicin | 50 mg/ml | 10 μM | 5 μL | ||
| Penicillin/Streptomycin | 100x | 1x | 500 μL | ||
| Amfitericin B | 250 μg/ml | 0.60% | 300 μL | ||
| Tilsæt frisk i brønden: | |||||
| Noggin | 100 μg/ml | 50 μL | |||
| Y-27632 | 10,5 mM | 50 μL | |||
| Tilføj, når der etableres nye PD'er fra primært væv eller genvindes fra frosne lagre | |||||
| FGF-10a | 100 μg/ml | 100 ng/ml | 50 μL | ||
Tabel 1: Udarbejdelse af EAC BOB-kulturmedium.
| Sojabønne trypsinhæmmer (STI) | 12,5 mg |
| Juster til 50 ml med DPBS | |
| Filtrer gennem 0,2 μm sterilt filter |
Tabel 2: Fremstilling af sojabønne trypsinhæmmer (STI) opløsning.
| Reagens | Lydstyrke | Endelig koncentration |
| Avanceret DMEM/F-12 | 48,2 ml | |
| HEPES (1 M) | 500 μL | 10 mM |
| L-glutamin (100X) | 500 μL | 1X |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | 500 μL | 1X |
| Amfitericin B | 300 μL | 0.60% |
| Gentamicin (50 mg/ml) | 5 μL | 5 μg/ml |
Tabel 3: Fremstilling af basalt medium.
| Enkeltcelle fordøjelse | |
| Fordele | Ulemper |
| Kontrol af cellenummer | Skrøbelig under indlejring |
| Levedygtighedskontrol | Længere tid er nødvendig mellem passager |
| Gælder for f.eks. lægemiddelscreening, flowcytometri | Længere restitutionstid fra frosne lagre |
| Uden fordøjelse af en enkelt celle | |
| Fordele | Ulemper |
| Morfologi er gavnlig for histologiske analyser | Udvidelse af PPO'er mere i størrelse end i antal |
| Højere stabilitet i indlejringsprocessen | Ikke relevant for analyser, hvor enkeltcellesuspension er obligatorisk |
| Hurtig genopretning fra frosne lagre | Mangel på cellenummerkontrol og størrelsessporing |
Tabel 4: Fordele og ulemper ved at subkulturere EAC PPO'er med og uden fordøjelse af en enkelt celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol beskrives to forskellige subkultur- og kryopræserveringsmetoder for EAC PPO'er, dvs. med og uden enkeltcellefordøjelse. Flere undersøgelser anbefalede at videregive EAC PPO'er med enkeltcellefordøjelse15,17, hvilket er gavnligt for de fleste eksperimenter, der kræver cellenummerkontrol, ensartet tæthed og en hul struktur, der letter størrelsessporing. Den enkeltcellebaserede metode er imidlertid kendetegnet ved langsommere vækst efter rekultivering fra frosne lagre og mindre kompakt morfologi i kulturperioden. Erfaringen viser, at 2-3 uger for enkeltcellebaseret rekultivering for at nå den anvendelig densitet for subkulturprocessen. I modsætning hertil kan frosne EAC PPO'er uden enkeltcellefordøjelse nå samme størrelse i en kortere periode (ca. 1 uge) efter gendyrkning. En af grundene kan være den ekstra stress fra trypsinfordøjelsen i relativt lang tid (10 min). Derfor anbefales det at bevare ufordøjede EAC PPO'er i et forhold på 1:1,5 (frysning af to kupler af ufordøjede EAC PTO'er og såning tilbage i tre kupler til gendyrkning). Derudover anbefales det at bruge ufordøjede EAC PTO'er til hurtig ekspansion og histologisk karakterisering ved IHC eller IF farvning på grund af den kompakte struktur. Fordele og ulemper ved de to subkulturmetoder er opsummeret i tabel 4.
Flere kritiske trin kræver opmærksomhed i denne protokol. For det første skal pladerne til BOB-dyrkning forvarmes natten over i en 37 °C-inkubator for at sikre størkningsprocessen for nyfrøede ECM-gelkupler. Det anbefales at bruge en kogeplade til at holde pladen på 37 °C, mens der er tale om forlænget såningsvarighed. For det andet kræves der lavbindingsrør under subkulturprocessen for at undgå betydeligt BOB-tab. For at forhindre tab af ECM-gel kan spidser med en bred boreåbning forkøles i -20 °C-fryseren inden brug. Her undgår den brede åbning af spidserne beskadigelsen af BOB-strukturer under høsttrinnet. Dernæst anbefales det at inkubere PTO'er i 20 minutter på is før det første centrifugeringstrin for at sikre fuldstændig flydende ECM-gel. Bemærk, at centrifugen skal indstilles til 4 °C under centrifugeringstrin for at holde den resterende ECM-gel i flydende tilstand. Derudover anbefales det for enkeltcellemetoden at blande PTO'erne grundigt efter trypsininkubation ved hjælp af en normal 1.000 μL spids for at bryde celleklumper, før du tilføjer STI, snarere end direkte filtrering af cellesuspensionen med cellesiler for at undgå celletab.
Nogle ændringer kan foretages i denne protokol. Cellegenvindingsopløsningen kan erstattes af iskold DPBS til opløsning af ECM-gelen i høsttrinnet. Erfaringerne viste imidlertid en bedre evne til at opløse ECM-gelen ved hjælp af cellegenvindingsopløsningen. Derfor anbefales iskold DPBS kun som en alternativ backup-metode. Hvis laboratoriet ikke er udstyret med en roterende inkubator, kan ØK PDO'er inkuberes med trypsin i et 37 °C vandbad sammen med blanding ved at vende røret hver 2-3 min. 10 % DMSO med føtalt kvægserum (FBS) kan anvendes som et alternativ til frysemedium til fremstilling af frosne BOB-lagre. Et kommercielt frysemedium med lavere eller intet serum foretrækkes dog på grund af en bedre BOB-genvinding.
Nogle begrænsninger skal behandles i denne protokol. Da disse metoder kun er blevet testet i EAC PPO'er, er anvendelsen af denne protokol på andre typer PPO'er ikke klar. Selvom procedurer for passaging PTO'er med og uden enkeltcellefordøjelse er standardiseret for de fleste organoidtyper21,22, er der stadig behov for at forsøge nuværende protokoller om andre kræfttyper for at sikre reproducerbarhed. Derudover kan en 10 min 0,25% trypsin inkubation stresse cellerne under fordøjelsen; inkubationstiden kan derfor variere afhængigt af BOB-tilstanden før subkulturen og den individuelle BOB-mangfoldighed. Under tidlige forsøg foreslås det at indstille forskellige trypsininkubationstider for hver EAC BOB.
Afslutningsvis er dette den første protokol, der beskriver og diskuterer subkultur og kryopræservering af EAC PPO'er med og uden enkeltcellefordøjelse. Subkulturering af EAC PTO'er med enkeltcellefordøjelse er anvendelig til sammenligningseksperimenter mellem grupper, mens ufordøjede EAC PTO'er er gavnlige for histologisk karakterisering, kryopræservering og hurtig ekspansion. Her er den rutinemæssige vedligeholdelse af EAC PTO'er standardiseret, hvilket giver en vejledning til forskere til at vælge passende metoder til EAC organoidgenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter i dette arbejde.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Köln Fortune Program / Det Medicinske Fakultet, Köln Universitet. Vi takker for den tekniske assistance fra Susanne Neiss, Michaela Heitmann og Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan blev økonomisk støttet af Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC). Forfatterne takker Dr. Joshua D'Rozario for hans hjælp med sproglig redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Coleman, H. G., Xie, S. -H., Lagergren, J.
- Rumgay, H., et al. International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence. The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).
- Qian, H., et al. Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis. Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).
- Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P.
- Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization. British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).
- Hashimoto, N. Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents. ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).
- Quante, M., et al. Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia. Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).
- Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future. Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).
- Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers. Aging. 13 (8), Albany NY. 12273-12293 (2021).
- Liu, D. S. H., et al. APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma. Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).
- Ebbing, E. A., et al. Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition. Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Li, X., et al. Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics. Nature Communications. 9, 2983 (2018).
- Ebbing, E. A., et al. Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Ordóñez, N. G. Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review. Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).
- Maniar, K. P., Umpires, B.
- Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
