Summary
يعد التحليل المجهري بالفيديو عالي السرعة أداة سهلة الأداء نسبيا وسريعة وفعالة من حيث التكلفة ، وفي أيدي ذوي الخبرة ، أداة موثوقة إلى حد كبير لتشخيص الخط الأول لخلل الحركة الهدبي الأولي ، والتي يجب أن تكون متاحة في كل مركز يشارك في التشخيص وعلاج أمراض الرئة الشديدة.
Abstract
خلل الحركة الهدبي الأولي (PCD) هو اضطراب خلقي موروث في الغالب في سمة جسمية متنحية. يسبب هذا الاضطراب اضطرابا في حركة الأهداب ، مما يؤدي إلى ضعف شديد في إزالة الغشاء المخاطي الهدبي (MCC). إذا لم يتم تشخيصها أو تشخيصها بعد فوات الأوان ، فإن الحالة تؤدي إلى تطور توسع الشعب الهوائية وأضرار جسيمة للرئتين في وقت لاحق من الحياة. معظم طرق تشخيص PCD تستغرق وقتا طويلا وتتطلب موارد اقتصادية واسعة النطاق لإنشائها. تحليل الفيديو المجهري عالي السرعة (HSVMA) هو الأداة التشخيصية الوحيدة لتصور وتحليل خلايا الجهاز التنفسي الحية مع ضرب الأهداب في المختبر. إنه سريع وفعال من حيث التكلفة ، وفي أيدي ذوي الخبرة ، موثوق به للغاية كأداة تشخيصية ل PCD. بالإضافة إلى ذلك ، لا تنطبق التدابير التشخيصية الكلاسيكية مثل المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) على بعض الطفرات لأن التغيرات المورفولوجية غائبة.
تصف هذه الورقة عملية جمع الخلايا الظهارية التنفسية ، ومزيد من التحضير للعينة ، وعملية HSVMA. كما نصف كيف يمكن الحفاظ على الخلايا المصقولة بنجاح دون أذى أو ضرب عن طريق الاحتفاظ بها في وسط مغذي للتخزين والنقل إلى موقع التحقيق في الحالات التي لا تمتلك فيها العيادة المعدات اللازمة لإجراء HSVMA. كما تظهر مقاطع فيديو تحتوي على أنماط ضرب مرضية من المرضى الذين يعانون من طفرة في جين سلسلة ذراع الداينين الثقيلة 11 (DNAH11) ، والتي لا يمكن تشخيصها ب TEM. نتيجة ل HSVMA غير حاسم بسبب عدوى الشعب الهوائية العليا ، وكذلك تنظيف الأسنان بالفرشاة غير الناجحة مع تراكب خلايا الدم الحمراء. مع هذه المقالة ، نود أن نشجع كل وحدة تتعامل مع مرضى أمراض الرئة وأمراض الرئة النادرة على إجراء HSVMA كجزء من تشخيصاتهم الروتينية اليومية ل PCD أو إرسال العينات إلى مركز متخصص في أداء HSVMA.
Introduction
خلل الحركة الهدبي الأولي (PCD) هو اضطراب وراثي وراثي نادر ، والذي يسبب اضطرابات في حركة أهداب الضرب. إذا لم يتم تشخيصه ، فإنه يؤدي إلى تلف شديد في الرئة في وقت لاحق من الحياة بسبب ضعف شديد في MCC. في الماضي ، قدر انتشاره في حدود 1: 4000 إلى 50000. نظرا للتحسن المطرد في التشخيص والوعي المتزايد بالحالة ، تشير التحديثات حول انتشار PCD إلى أنه قد يكون أكثر شيوعا وربما يتراوح بين 1: 4000 إلى 20000 بدلا من1.2. ومع ذلك ، لا يزال المرضى الذين يعانون من PCD يعانون من نقص التشخيص أو التشخيص في وقت متأخر جدا 1,3. لذلك ، يجب أن يكون الرضع الذين يعانون من أي من السيتوس الخلقي في مقابل و / أو سيلان الأنف في الفترة المحيطة بالولادة ، والضائقة التنفسية لحديثي الولادة ، وانسداد الأنف ، وصعوبات التغذية مشتبها بهم في PCD. في وقت لاحق من الحياة ، التهاب الأذن الوسطى المزمن ، والالتهاب الرئوي المتكرر ، والتهاب الجيوب الأنفية الأنفية ، والسعال الرطب المزمن النموذجي بسبب ضعف MCC هي الأعراض المميزة ل PCD ، والتي في تركيبة مع توسع الشعب الهوائية وضعف وظائف الرئة ، تستمر في مرحلة البلوغ2.
يمكن تشخيص المرضى المشتبه في إصابتهم ب PCD باستخدام أدوات تشخيصية مختلفة. وقد اعتبر TEM المعيار الذهبي لتشخيص الخط الأول في الماضي. ومع ذلك ، فإن ما يصل إلى 30٪ من حالات PCD لا تظهر بنية فائقة غير طبيعية1،3،4،5،6 ، مما يتطلب نهجا تشخيصيا مختلفا. لذلك ، يقترح عدد متزايد من المراكز والمبادئ التوجيهية للجمعية الأوروبية للجهاز التنفسي (ERS) مزيجا من أكسيد النيتريك الأنفي (nNO) و HSVMA كتشخيص الخط الأول1،7،9،10. HSVMA و nNO هي أيضا الخيارات الأكثر فعالية من حيث التكلفة في تحديد المريض المصاب ب PCD11. ومع ذلك ، حتى لو تم تضمين الاختبارات الجينية في التشخيص ، يجب أن يؤخذ في الاعتبار أنه لا يوجد حاليا اختبار قائم بذاته أو مجموعة من الاختبارات التي يمكن أن تستبعد PCD مع اليقين بنسبة 100٪ 8,9,10.
من بين خيارات التشخيص المتاحة ، يعد HSVMA هو الاختبار الوحيد الذي يركز على الخلايا التنفسية الحية المغلفة بالأهداب ويقيم نمط الضربات الهدبية (CBP) وتردد الضربات الهدبية (CBF). على النقيض من TEM ، تتوفر نتائج HSVMA بسرعة ، عادة في يوم الاختبار ، في حين أن نتائج TEM قد تصل بعد أشهر من أخذ العينة. يمكن تطبيق HSVMA لجميع الفئات العمرية ، في حين أن nNO يتطلب درجة عالية من الامتثال ؛ عادة ما تكون محاولات استخدامه تحت سن 5 سنوات غير ناجحة10. في أيدي ذوي الخبرة ، HSVMA لديه حساسية ممتازة وخصوصية لتشخيص PCD بنسبة 100 ٪ و 96 ٪ ، على التوالي12.
تصف هذه الورقة الإجراء خطوة بخطوة لأداء HSVMA ، بما في ذلك حصاد خلايا الجهاز التنفسي المغلفة بالأهداب من التوربينات السفلية للأنف ، والحفاظ على الخلايا المحصودة في وسط مغذي للخلايا لنقلها إلى موقع التحقيق ، وعملية تحليل الفيديو المجهري لتحديد CBF و CBP. بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض بعض مقاطع الفيديو من المرضى ، مقارنة CBPs العادية و CBFs مع وظيفة الأهداب غير الطبيعية (الفيديو 3 ، الفيديو 4 ، الفيديو 5 ، الفيديو 6 ، الفيديو 7 ، والفيديو 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاقيات:
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية (69/2017) وأجريت وفقا لإعلان هلسنكي.
1. جمع ونقل الخلايا الظهارية التنفسية
- الفرشاه
- قبل تنظيف الأسنان بالفرشاة ، قم بإعطاء دورة لمدة أسبوعين من حمض الأموكسيسيلين كلافولانيك الفموي للمريض للقضاء على الأغشية الحيوية التي تتداخل مع وظيفة الأهداب. تأكد من إنهاء المضاد الحيوي قبل 2 أيام من الإجراء.
- لتقليل تراكب المواد المخاطية على شرائط الخلايا الظهارية المصقولة ، اطلب من المريض أن ينفخ أنفه جيدا. اطلب من الآباء مساعدة أطفالهم الصغار على نفخ أنوفهم.
- للتنظيف بالفرشاة، استخدم فرشاة بين الأسنان بحجم 0.6 مم (انظر جدول المواد). حافظ على رأس المريض ثابتا بيد واحدة ، وباليد الأخرى ، قم بتنظيف التوربينات السفلية لكلا الخياشيم لجمع شرائط الخلايا الظهارية الكافية.
ملاحظة: عادة ما تحدث مقاومة طفيفة عند إدخال الفرشاة بين الأسنان بعمق تحت التوربينات السفلية. يتم تنظيف الأنف بالفرشاة عن طريق الدوران السريع والانتقاء لمدة 2 ثانية تقريبا. قد يؤدي التنظيف بالفرشاة لفترة أطول ومكثفة إلى إصابة ظهارية شديدة ورعاف متتالي. - إذا تم التخطيط لتنظير القصبات لأسباب أخرى غير PCD المشتبه به ، فقم بجمع عينات أثناء تنظير القصبات عن طريق تنظيف الكارينا أو ظهارة الشعب الهوائية أو عن طريق الخزعة13.
- قم بإسقاط شرائط الخلايا التي تم حصادها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على وسيط النسر المعدل من دولبيكو المغذي للخلايا (DMEM).
ملاحظة: عادة ما تسقط شرائط الخلايا الظهارية من الفرشاة بسهولة أكبر عن طريق قذف الفرشاة وقلبها على جدار الأنبوب. - أغلق غطاء أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق وأمسك الأنبوب بمصدر ضوء. هز الأنبوب لاكتشاف شرائط الخلايا والتكتلات التي تم حصادها.
- نقل العينة
- ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيق في صندوق بوليسترين مغلق بإحكام وتأكد من إغلاق غطاء الأنابيب بشكل صحيح وتثبيت الأنابيب داخل الصندوق.
- إضافة حزمة باردة. ومع ذلك ، تجنب تجميد العينة.
ملاحظة: درجة الحرارة المثلى للحفاظ على العينة قبل التحقيق هي حوالي 4-8 درجة مئوية (39.2-46.4 درجة فهرنهايت). - تأكد من تحليل العينات المحفوظة خلال ال 24 ساعة القادمة.
ملاحظة: في هذه التجارب، كان متوسط الوقت بين التنظيف بالفرشاة وHSVMA 3 ساعات.
2. تحليل مجهري فيديو عالي السرعة (HSVMA)
- الفحص المجهري بالفيديو للعينات
- بعد استلام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على العينات، قم بتسخينها حتى 37 درجة مئوية (98.6 درجة فهرنهايت) لمحاكاة مثالية في بيئة تشبه الجسم الحي.
- إذا كان المجهر مجهزا بوحدة تسخين ، فضع الأنابيب تحت غطاء المحرك وقم بتسخينها هناك. بدلا من ذلك ، استخدم حاضنة لتسخين العينات.
- ابدأ تشغيل الكاميرا وبرنامج وحدة الفيديو على جهاز الكمبيوتر.
- باستخدام ماصة ، خذ كمية صغيرة من العينة وضع قطرتين في طبق كوفيت أو طبق زجاجي (انظر جدول المواد). قم بتغطية الكوفيت أو الطبق بغطاء وضعه تحت المجهر.
- لتقييم العينات، استخدم مجهرا للتداخل التفاضلي مزودا بمصدر ضوء بارد وكاميرا فيديو قادرة على التسجيل بسرعة عالية (200 إطار/ثانية على الأقل). استخدم عدسة غمر الزيت مع تكبير 100x ووضع قطرة من زيت الغمر على سطح البصرية.
ملاحظة: يوصى باستخدام المجاهر ذات العدسة التي تقترب من الأسفل. - اقترب من الجزء السفلي من الطبق باستخدام عدسة المجهر وابحث عن مجموعات الخلايا بدون خلايا دم حمراء وذات محتوى مخاط منخفض. بعد العثور على منطقة تمثيلية ذات أهمية (ROI) ، ركز على مجموعة محددة من أهداب الضرب مع أكبر حركات الأهداب وسجل تسلسل فيديو. سجل الخلايا مع ضرب الأهداب جانبيا ومن الأعلى. بعد ذلك ، ابحث عن مجموعة تمثيلية أخرى من الخلايا وكرر التسجيل.
ملاحظة: يجب التحقيق في الخلايا المغلفة بالأهداب تحت تكبير 1000x ، ويجب تسجيل أهداب الضرب باستخدام كاميرا فيديو رقمية عالية السرعة (DHSV) تم ضبطها على معدل إطارات 200 / ثانية أو أكثر (256 / ثانية في هذا البروتوكول). نظرا لأن البيانات التي تم الحصول عليها من مقاطع الفيديو المسجلة تتطلب مساحة كبيرة على محرك الأقراص الثابتة ، يوصى باستخدام محرك أقراص ثابت SSD خارجي.
- تحليل تسلسلات الفيديو
- لتحديد CBF و CBP ، قم بتشغيل مقاطع الفيديو مرة أخرى إطارا تلو الآخر.
- لتحديد CBF ، اضبط معدل الإطارات على حركة بطيئة مع 15 إطارا / ثانية وعد 10 نبضات متتالية.
- سجل عدد الإطارات التي تمر خلال دورة واحدة من 10 دقات وأدخل النتيجة في Eq (1). تحديد التردد عن طريق حساب متوسط جميع دورات ضرب الأهداب المسجلة ومقارنة النتيجة بالقيم المرجعية للعمر (انظر الجدول 1)14.
(1)
حيث X هو عدد الإطارات التي تمر خلال دورة من 10 نبضات. - لتقييم CBP ، راقب ما إذا كانت حركة أهداب الضرب في نطاق كامل (انظر الشكل 1) ومتزامنة. اطلب من اثنين من المشغلين المستقلين تقييم CBP لمنع التحيز في الاختيار.
- الإبلاغ عن نتائج تحليل HSVMA لتكون إما متوافقة أو غير مرجحة أو غير حاسمة مع PCD.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر الفيديو 1 والفيديو 2 تحكما طبيعيا حيث يكون CBF و CBP في النطاق الطبيعي (انظر الشكل 1). يمثل الفيديو 3 والفيديو 4 والفيديو 5 والفيديو 6 حالتين من مرضى PCD الذين يعانون من طفرة متماثلة الزيجوت في جين DNAH11 (c.2341G > A ؛ p. Glu781Lys)3. تم اختيار مقاطع الفيديو التمثيلية هذه لأن الأنماط الظاهرية للطفرات في جين DNAH11 جديرة بالملاحظة لأنه لا يمكن تشخيصها بواسطة TEM بسبب عدم وجود تغييرات مورفولوجية3،4،5.
يظهر الفيديو 3 النمط الكلاسيكي القاسي والمتحرك بالحد الأدنى من الإيقاع الهدبي المتوافق مع PCD. النمط العادي كامل النطاق الموضح في الفيديو 1 والفيديو 2 غائب (انظر الشكل 1). يعرض الفيديو 4 تسلسلا لنفس المريض (فيديو 3) ولكنه مسجل من الأعلى. يظهر الفيديو 5 والفيديو 6 نمطا ظاهريا مفرط الحركة وغير فعال لأهداب الضرب متوافق أيضا مع PCD في المرضى الذين يحملون طفرة في جين DNAH11. كان CBF مرتفعا لدرجة أنه لا يمكن تحديده. الفيديو 6 من نفس المريض (فيديو 5) ولكنه مسجل من الأعلى. CBP غير طبيعي ولا يظهر الحركة الكاملة للأهداب الصحية (انظر الشكل 1 والفيديو 1 والفيديو 2).
يظهر الفيديو 7 والفيديو 8 CBF و CBP المرضية بشكل جانبي (الفيديو 7) ومن الأعلى (الفيديو 8) من مريض يعاني من التهابات متكررة في مجرى الهواء العلوي. ومع ذلك ، تعذر إنشاء PCD. عند 10 هرتز ، يظل CBF أقل قليلا من المعدل الطبيعي للعمر (انظر الجدول 1) ، و CBP غير طبيعي مقارنة ب CBP العادي لتسلسل فيديو التحكم (الفيديو 1 والفيديو 2 والشكل 1) ، مما يدل على حركة هدبية دوارة. الحالة غير حاسمة ، ويجب النظر في مزيد من التدابير التشخيصية ، بما في ذلك nNO و TEM والاختبارات الجينية ، على الرغم من أن الصورة السريرية للمريض توحي ب PCD.
إذا تم تنفيذ عملية تنظيف الأسنان بالفرشاة بدقة ، فقد تصاب ظهارة الأنف ، ويمكن أن يحدث الرعف. إذا كان هناك الكثير من خلايا الدم في العينة ، فلا يمكن إجراء تحليل HSVMA لأن الخلايا الظهارية الهدبية مغطاة بطبقة من خلايا الدم الحمراء ، كما يمكن رؤيته في الفيديو 9.
الشكل 1: السكتة الدماغية الهدبية الطبيعية. السكتة الدماغية الهلبية للفرد السليم تظهر النطاق الكامل للسكتة الدماغية الطبيعية إلى الأمام والتعافي. تتحرك السكتة الدماغية الفعالة (الأزرق الداكن) من اليسار إلى اليمين بطريقة المصاعب. تحرك شوط الاسترداد (الأزرق الفاتح) الأهداب مرة أخرى من اليمين إلى اليسار إلى وضع البداية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: حركة الأهداب الطبيعية للمريض بدون PCD ، ينظر إليها جانبيا. اختصار: PCD = خلل الحركة الحرقفي الأولي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 2: حركة الأهداب الطبيعية لمريض بدون PCD ، من الأعلى. اختصار: PCD = خلل الحركة الحرقفي الأولي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
الفيديو 3: تسلسل الفيديو جانبيا لمريض PCD مع طفرة في جين DNAH11 (c.2341G > A p. Glu781Lys)3 ، يظهر أهداب قاسية وغير متحركة تقريبا. الاختصارات: PCD = خلل الحركة الهدب الأولي; DNAH11 = ذراع الداينين سلسلة ثقيلة 11 جين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
الفيديو 4: تسلسل فيديو من نفس مريض PCD (فيديو 3) مسجل من الأعلى. اختصار: PCD = خلل الحركة الحرقفي الأولي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 5: تسلسل فيديو جانبي لمريض PCD يظهر نمطا مختلفا تماما ومفرط الحركة ولكنه غير فعال لضرب الأهداب. كان المريض عضوا في نفس العائلة ولديه نفس الطفرة التي تعرض لها المريض في الفيديو 3 والفيديو 4. اختصار: PCD = خلل الحركة الحرقفي الأولي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
الفيديو 6: تسلسل فيديو من نفس مريض PCD (فيديو 5) ، مسجل من الأعلى. اختصار: PCD = خلل الحركة الحرقفي الأولي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 7: تسلسل فيديو لحركة أهداب غير طبيعية وغير منسقة وبطيئة في مريض PCD يعاني من عدوى متكررة في مجرى الهواء العلوي. اختصار: PCD = خلل الحركة الحرقفي الأولي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
الفيديو 8: تسلسل الفيديو من نفس مريض PCD (فيديو 7) من الأعلى. اختصار: PCD = خلل الحركة الحرقفي الأولي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 9: تسلسل فيديو لعينة ، والتي لا يمكن تحليلها بسبب تنظيف الأسنان بالفرشاة بلا مبالاة ، مما يؤدي إلى الرعاف وتراكب خلايا الدم الحمراء. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
| تردد النبض الهدبي (هرتز)* | ||||
| العمر (سنوات) | دني | اس دي | 5، 95المائة | ضربات الحواف بخلل الحركة (٪) † |
| 0-6 | 12.9 | 2.3 | 10.0, 18.1 | 10.4 (0.0, 36.8) |
| 7-12 | 12.9 | 1.4 | 10.9, 15.0 | 9.1 (0.0, 40.3) |
| 13-18 | 12.6 | 1.7 | 10.9, 15.3 | 24.8 (0.0, 56.9) |
| ≥19 | 11.5 | 2.8 | 7.7, 15.5 | 5.8 (0.0, 24.3) |
| * متوسط تردد الضرب الهدبي ، والانحراف المعياري (SD) ،والنسب المئوية 5و 95 | ||||
| †المتوسط (5 ، 95 النسب المئوية) النسبة المئوية للحواف التي تظهر مناطق خلل الحركةالهدبية | ||||
الجدول 1: ترددات الإيقاع العادية. معدل ضربات هدبي طبيعي مرتبط بالعمر. عدل هذا الجدول من Chilvers et al.14. * متوسط تردد الإيقاع الهدبي ، SD ،والنسب المئوية 5 و 95. †المتوسط (5 ، 95في المئة) النسبة المئوية للحواف التي تظهر مناطق خلل الحركة الهدبية. اختصار: SD = الانحراف المعياري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، يتم وصف عملية تشخيص PCD باستخدام HSVMA ومناقشتها في ضوء تشخيص الخط الأول. على الرغم من سهولة إنشائها نسبيا ، وفعالة من حيث التكلفة11 ، وطريقة موثوقة في أيدي ذوي الخبرة12 ، فإن HSVMA ليس مقياسا تشخيصيا بدون مزالق. قد يكون CBF و CBP غير الطبيعيين ناتجين عن عدوى ثانوية ، مما يؤدي إلى التهاب الظهارة القصبية التنفسية15 ، وللسبب نفسه ، قد يكون لدى الأفراد المدخنين ترددات ضرب غير طبيعية16,17. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي استبعاد التليف الكيسي قبل تحديد تشخيص PCD. قبل الحكم على تحليل عينة المريض على أنه متوافق مع PCD ، يجب تأكيد النتائج غير الطبيعية مع عينتين تم جمعهما بشكل مستقل ، مما يتطلب تنظيف الأسنان بالفرشاة وإعادة تحليل CBF و CBP. قد يكون هذا تحديا ، خاصة مع الأطفال. لذلك ، يوصي بعض الباحثين بزراعة الخلايا الظهارية التي تم الحصول عليها من جلسة التنظيف الأولى بالفرشاة لتجنب تكرار تنظيف الأسنان بالفرشاة 9,15.
على الرغم من أن تنظير القصبات ليس الخيار المفضل لتشخيص PCD ، إذا تم إجراؤه لأسباب أخرى غير PCD ، يمكن الحصول على عينات بدلا من ذلك تحت التخدير عن طريق تنظيف ظهارة الشعب الهوائية بالفرشاة أو أخذ خزعة13. العدوى الثانوية قد تغير الحركة الهدبية وتضرب التردد. لتقليل هذه الآثار غير المرغوب فيها ، يوصى بإدارة دورة مدتها أسبوعان مع مضاد حيوي فموي واسع الطيف مثل أموكسيسيلين بالإضافة إلى حمض clavulanic أو سيفالوسبورين لاستهداف مسببات الأمراض التنفسية الشائعة. على الرغم من وجود فوائد كبيرة في علاج PCD18 ، ربما ينبغي تجنب الماكروليدات لهذا الغرض لأنها قد تغير CBF بسبب تأثير حركي على ضرب الأهداب19. علاوة على ذلك ، بغض النظر عن عدم وجود أدلة في الأدبيات ، يجب إيقاف المضادات الحيوية لمدة 48 ساعة على الأقل قبل تنظيف الأسنان بالفرشاة والتحليل لتجنب أي تأثير على CBF. لا يمكن ملاحظة أي تأثير كبير للمضادات الحيوية على CBF أو CBP في التجارب التي تم فيها زراعة العينات التي تم الحصول عليها عن طريق تنظيف الأسنان بالفرشاة أو الخزعة في سوائل تحتوي على مضادات حيوية20،21،22.
على الرغم من أن HSVMA تعتبر التقنية الأكثر دقة وقابلية للتكرار في أوروبا ، إلا أنها تتحمل خطر خطأ المشغل بسبب تحيز الاختيار والمشاكل المذكورة أعلاه15. لذلك ، طورت عدة مجموعات مؤخرا حلولا برمجية لأتمتة التحليل من الصور الرقمية للتغلب على هذه المشكلة23،24،25. نظرا لأن هذه الأتمتة لا تزال قيد التطوير ، يستخدم المؤلفون مشغلين مستقلين وخبراء لتحليل CBF و CBP يدويا ، مما يحقق نتائج ممتازة وموثوقة.
تظهر النتائج التمثيلية لهذه الورقة مقاطع فيديو من المرضى الذين يعانون من طفرة في جين DNAH11. تظهر الطفرات في هذا الجين بنية فائقة طبيعية ، وبالتالي لا يمكن تشخيص المرضى الذين يعانون من هذه الطفرة بواسطة TEM. يمكن رؤية البنية الفائقة الطبيعية للأهداب التي أظهرتها TEM في ما يصل إلى 30٪ من جميع حالات PCD6. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون nNO طبيعيا مع النمط الظاهري المفرط الحركة لهذه الطفرة (الفيديو 5 والفيديو 6) ، مما يجعل HSVMA ، إلى جانب الاختبارات الجينية ، الأداة التشخيصية الوحيدة الموثوقة 3,8. بالإضافة إلى ذلك ، يشكل المرضى الأطفال الهدف الأساسي لتشخيص PCD. في كثير من الحالات ، يمكن ملاحظة الأعراض التي توحي ب PCD في فترة حديثي الولادة26 ، مما يجعل HSVMA إجراء تشخيصيا سريعا من الخط الأول أفضل من البدائل الأخرى.
في دراسة أجريت في أمريكا الشمالية ، تم فحص nNO واقتراحه كاختبار فحص تشخيصي من الخط الأول ل PCD27. على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن أن الخصوصية والحساسية قريبتان من تلك الخاصة ب HSVMA (0.98 / 0.79) ، تجدر الإشارة إلى أن أصغر مريض كان يبلغ من العمر 5.1 سنوات ، وكان متوسط العمر أعلى من ذلك بكثير. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن العديد من المحققين قد أبلغوا عن قيم nNO العادية المرتبطة ب PCD15. لذلك ، في حين أن التحسن في المعدات التقنية لأداء nNO في المواد الدراسية في سن ما قبل المدرسة لا يزال جاريا ، فإن HSVMA لا يزال التشخيص الوحيد الموثوق به للخط الأول ل PCD ، والنتائج الطبيعية تستبعد PCD مع ما يقرب من 100 ٪ من اليقين في جميع الفئات العمرية.
ومع ذلك ، لتصبح خبيرا في تشخيص PCD باستخدام HSVMA ، هناك حاجة إلى إنتاجية عالية من العينات العادية والمرضية ، الأمر الذي يتطلب التدريب المناسب والمعدات المتخصصة. يجب أن يكون هذا إلزاميا وسيكون مجزيا للعيادة التي تتعامل مع تشخيص وعلاج أمراض الرئة النادرة. لأي سبب من الأسباب ، إذا كانت معالجة العينات تشكل عقبة ، فيمكن استخدام مركز يضم موظفين متخصصين في تشخيص PCD باستخدام HSVMA بدلا من ذلك. في مثل هذه الحالات ، يمكن للطبيب المعالج إجراء التنظيف بالفرشاة ، ويمكن إرسال العينة إلى مركز التشخيص. بشكل عام ، يجب تحليل العينات في أقرب وقت ممكن بعد تنظيف الأسنان بالفرشاة. ومع ذلك ، في تجربتنا ، إذا تمت معالجة العينات بشكل صحيح (انظر خطوة البروتوكول 1.2) ، تظل الخلايا الظهارية حيوية وجاهزة للتحليل لمدة 24 ساعة على الأقل بعد تنظيف 20,22 بالفرشاة. معظم المراكز التي تؤدي HSVMA نفسها عادة ما تقوم بإجراء التحليل في غضون 4 ساعات من أخذ العينات15. على أي حال ، وقبل التحليل النهائي ، يجب تسخين العينات حتى درجة حرارة الجسم لتقليد الأمثل ، في ظروف الجسم الحي.
كما هو موضح سابقا في هذه الورقة ، هناك مزالق في عملية تشخيص PCD باستخدام HSVMA ، خاصة مع الحالات غير الحاسمة مثل تلك التي تم وصفها في قسم النتائج التمثيلية (الفيديو 7 والفيديو 8). للتشخيص النهائي ل PCD ، تتوفر إرشادات توضح أنه في بعض الأحيان تكون مجموعة من التدابير التشخيصية المختلفة ضرورية9،10،15 ، والأهم من ذلك ، أنه لا يوجد اختبار واحد أو مجموعة من الاختبارات التي تشخص PCD بنسبة 100٪ من اليقين. ومع ذلك ، ينبغي تشجيع كل وحدة تشارك في تشخيص وعلاج PCD على استخدام HSVMA كأداة في تشخيص الخط الأول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نود أن نعرب عن شكرنا الخاص لممرضة الأطفال السيدة يوهانا جوفانكوسكي على مساعدتها الممتازة في تنظيف الأسنان بالفرشاة. نود أيضا أن نعرب عن امتناننا الخاص للبروفيسور هيموت عمران (جامعة عيادة مونستر، المملكة المتحدة) لمنحه الإذن باستخدام الشكل التخطيطي للحركة الهدبية العادية من موقعه على الويب. وأخيرا، نود أن نشكر السيد آلان براون بكالوريوس (مع مرتبة الشرف)، PGCE، على التدقيق اللغوي للمخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amoxiciline-clavulanic acid | Orion Oyj | 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day | |
| Camera Software | Hamamatsu | HCI Image | |
| Cold pack | any | for preservation and transport | |
| Differential interference microscope | Carl Zeiss | Inverted, cell observer microscope | |
| Digitial High Speed Video Camera | Hamamatsu | Orca Flash 4.0, digital camera type C11440 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10565018 | basal cell culture medium |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL tube |
| Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | cuvette for microscopy |
| Heating Unit | Carl Zeiss/PeCon | 810-450001 | Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control |
| Interdental brush 0.6 mm | Doft | 872267 | Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag |
| Objective | Carl Zeiss | 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective | |
| Small polystyrene box with lid | any | for transport |
References
- Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2 (2015).
- Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135 (2017).
- Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237 (2020).
- Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
- Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11 (2014).
- Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
- Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
- Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
- Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090 (2017).
- Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066 (2019).
- Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142 (2019).
- Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
- Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
- Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
- Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
- Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
- Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
- Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
- Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
- Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
- Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675 (2014).
- Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78 (2012).
- Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14 (2012).
- Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792 (2021).
- Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
- Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).
