Summary
Höghastighetsvideomikroskopianalys är en relativt lätt att utföra, snabb, kostnadseffektiv och, i erfarna händer, ett betydligt tillförlitligt verktyg för första linjens diagnostik av primär ciliär dyskinesi, som bör finnas tillgänglig i alla centrum som är involverade i diagnostik och behandling av allvarliga lungsjukdomar.
Abstract
Primär ciliär dyskinesi (PCD) är en medfödd sjukdom som huvudsakligen ärvs i ett autosomalt recessivt drag. Störningen orsakar störningar i cilias rörelse, vilket leder till allvarlig försämring av mukociliär clearance (MCC). Om odiagnostiserad eller diagnostiserad för sent leder tillståndet till utveckling av bronkiektas och allvarlig skada på lungorna senare i livet. De flesta av metoderna för att diagnostisera PCD är tidskrävande och kräver omfattande ekonomiska resurser för att etablera dem. Höghastighetsvideomikroskopianalys (HSVMA) är det enda diagnostiska verktyget för att visualisera och analysera levande andningsceller med att slå cilia in vitro. Det är snabbt, kostnadseffektivt och, i erfarna händer, mycket pålitligt som ett diagnostiskt verktyg för PCD. Dessutom är klassiska diagnostiska åtgärder som transmissionselektronmikroskopi (TEM) inte tillämpliga för vissa mutationer eftersom morfologiska förändringar saknas.
Detta dokument beskriver processen att samla respiratoriska epitelceller, den fortsatta beredningen av provet och processen med HSVMA. Vi beskriver också hur borstade celler framgångsrikt kan hållas oskadda och slå genom att hålla dem i ett närande medium för lagring och transport till undersökningsstället i de fall en klinik inte har utrustning för att utföra HSVMA. Också visade är videor med patologiska slagmönster från patienter med en mutation i dyneinarmen tung kedja 11-genen (DNAH11), som inte kan diagnostiseras med TEM; resultatet av en ofullständig HSVMA på grund av infektion i de övre luftvägarna, liksom en misslyckad borstning med överlagring av röda blodkroppar. Med den här artikeln vill vi uppmuntra varje enhet som hanterar pulmonologipatienter och sällsynta lungsjukdomar att utföra HSVMA som en del av sin dagliga rutindiagnostik för PCD eller skicka proverna till ett centrum som specialiserat sig på att utföra HSVMA.
Introduction
Primär ciliär dyskinesi (PCD) är en sällsynt, ärftlig genetisk störning som orsakar störningar i rörelsen att slå cilia. Om det inte diagnostiseras leder det till allvarliga lungskador senare i livet på grund av allvarlig försämring av MCC. Tidigare har dess prevalens uppskattats ligga i intervallet 1: 4 000 till 50 000. På grund av stadigt förbättrad diagnostik och en växande medvetenhet om tillståndet tyder uppdateringar om förekomsten av PCD på att det kan vara mycket vanligare och förmodligen i intervallet 1: 4 000 till 20 000 istället 1,2. Patienter med PCD är dock fortfarande underdiagnostiserade eller diagnostiserade för sent 1,3. Därför bör spädbarn med antingen medfödd situs inversus och/eller heterotaxi eller perinatal rinorré, neonatal andningsbesvär, en blockerad näsa och matningssvårigheter misstänkas för PCD. Senare i livet är kronisk otit, återkommande lunginflammation, rhinosinusit och en kronisk, typisk våt hosta på grund av nedsatt MCC kännetecknet för PCD, som i kombination med bronkiektas och nedsatt lungfunktion fortsätter till vuxen ålder2.
Patienter som misstänks ha PCD kan diagnostiseras med hjälp av olika diagnostiska verktyg. TEM har tidigare ansetts vara guldstandarden för förstahandsdiagnostik. Upp till 30% av PCD-fallen visar emellertid inte onormal ultrastruktur 1,3,4,5,6, vilket kräver en annan diagnostisk metod. Därför föreslår ett växande antal centra och riktlinjerna från European Respiratory Society (ERS) en kombination av nasal kväveoxid (nNO) och HSVMA som första linjens diagnostik 1,7,9,10. HSVMA och nNO är också de mest kostnadseffektiva alternativen för att identifiera en patient med PCD11. Även om genetisk testning ingick i diagnostiken måste man dock komma ihåg att det för närvarande inte finns något fristående test eller kombination av tester som kan utesluta PCD med 100% säkerhet 8,9,10.
Av de tillgängliga diagnostiska alternativen är HSVMA det enda testet som fokuserar på levande, ciliabelagda andningsceller och utvärderar ciliary beat pattern (CBP) och ciliary beat frequency (CBF). Till skillnad från TEM är resultaten av HSVMA tillgängliga snabbt, vanligtvis på testdagen, medan resultaten av TEM kan komma månader efter att provet har tagits. HSVMA kan tillämpas för alla åldersgrupper, medan nNO kräver en hög grad av efterlevnad. försök att använda den under 5 år är vanligtvis misslyckade10. I erfarna händer har HSVMA utmärkt känslighet och specificitet för att diagnostisera PCD vid 100% respektive 96%12.
Detta dokument beskriver steg-för-steg-proceduren för att utföra HSVMA, inklusive skörd av ciliabelagda andningsceller från näsans underlägsna turbinat, bevarande av skördade celler i ett cellnärande medium för transport till undersökningsplatsen och processen för mikroskopisk videoanalys för att bestämma CBF och CBP. Dessutom visas några videoklipp från patienter som jämför normala CBP och CBF med onormal ciliafunktion (Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7 och Video 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiskt uttalande:
Studien godkändes av den lokala etikkommittén (69/2017) och genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen.
1. Insamling och transport av respiratoriska epitelceller
- Borsta
- Innan du borstar, administrera en två veckors kurs av oral amoxicillin-klavulansyra till patienten för att utrota biofilmer som stör ciliafunktionen. Se till att antibiotikumet avslutas 2 dagar före proceduren.
- För att minska ett överlägg av slemhinnor på de borstade epitelcellremsorna, be patienten att blåsa näsan noggrant. Be föräldrar att hjälpa sina små barn att blåsa näsan.
- För borstning, använd en interdentalborste med en storlek på 0,6 mm (se materialförteckningen). Håll patientens huvud fixerat med ena handen, och med den andra handen, borsta det underlägsna turbinatet i båda näsborrarna för att samla tillräckliga epitelcellremsor.
OBS: Ett litet motstånd upplevs vanligtvis när man sätter in den interdentala borsten djupt under det underlägsna turbinatet. Näsborstning utförs genom snabb vridning och plockning i ca 2 s. Längre och intensiv borstning kan annars orsaka allvarlig epitelskada och på varandra följande epistaxis. - Om bronkoskopi planeras av andra skäl än misstänkt PCD, samla in prover under bronkoskopi genom att borsta carina eller bronkialepitel eller genom biopsi13.
- Släpp de skördade cellremsorna i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller det cellnärande Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM).
OBS: Epitelcellremsor släpper vanligtvis borsten lättare genom att vrida och vrida borsten mot rörväggen. - Stäng locket på mikrocentrifugröret och håll röret mot en ljuskälla. Skaka röret för att upptäcka skördade cellremsor och konglomerat.
- Transport av provexemplaret
- Placera mikrocentrifugrören i en tätt sluten polystyrenlåda och se till att rörens lock är ordentligt stängt och rören är fixerade inuti lådan.
- Tillsätt ett kallt paket; Undvik dock att frysa provet.
OBS: Den optimala temperaturen för att bevara provexemplaret före undersökning är cirka 4–8 °C (39,2–46,4 °F). - Se till att de bevarade proverna analyseras under de närmaste 24 timmar.
OBS: I dessa experiment var den genomsnittliga tiden mellan borstningar och HSVMA 3 timmar.
2. Höghastighets videomikroskopianalys (HSVMA)
- Videomikroskopi av proverna
- Efter att ha mottagit mikrocentrifugrören som innehåller proverna, värm dem upp till 37 ° C (98,6 ° F) för att efterlikna en optimal, in vivo-liknande miljö.
- Om mikroskopet är utrustat med en värmeenhet, placera rören under huven och värm dem där uppe. Alternativt kan du använda en inkubator för att värma upp proverna.
- Starta kameran och programvaran för videoenheten på datorn.
- Använd en pipett, ta en liten mängd av provet och placera två droppar i en kyvett eller glasbottenskål (se materialtabellen). Täck kyvetten eller skålen med lock och placera den under mikroskopet.
- För utvärdering av proverna, använd ett differentialinterferensmikroskop utrustat med en kallljuskälla och en videokamera som kan spela in med hög hastighet (minst 200 bilder / s). Använd en oljenedsänkningslins med en 100x förstoring och lägg en droppe nedsänkningsolja på ytan av optiken.
OBS: Mikroskop med en lins som närmar sig underifrån rekommenderas. - Närma sig botten av skålen med mikroskoplinsen och sök efter cellkluster utan röda blodkroppar och med lågt sleminnehåll. Efter att ha hittat en representativ region av intresse (ROI), fokusera på en specifik grupp av slå cilia med de största cilia rörelserna och spela in en videosekvens. Spela in celler med att slå cilia i sidled och ovanifrån. Därefter söker du efter ett annat representativt kluster av celler och upprepar inspelningen.
OBS: De ciliabelagda cellerna måste undersökas under en 1000x förstoring, och slå cilia bör spelas in med en digital höghastighetsvideokamera (DHSV) inställd på en bildhastighet på 200 / s eller mer (256 / s i detta protokoll). Eftersom data som erhållits från de inspelade videoklippen kräver mycket utrymme på hårddisken rekommenderas en extern SSD-hårddisk.
- Analys av videosekvenser
- För att bestämma CBF och CBP, spela videoklippen tillbaka ram för ram.
- För att bestämma CBF, ställ in bildhastigheten i slow motion med 15 bilder / s och räkna 10 på varandra följande slag.
- Registrera antalet bilder som passerar under en enda cykel med 10 slag och sätt in resultatet i Eq (1). Bestäm frekvensen genom att beräkna medelvärdet av alla registrerade cilia beat-cykler och jämför resultatet med referensvärdena för ålder (se tabell 1)14.
(1)
Där X är antalet ramar som passerar under en cykel med 10 slag. - För att utvärdera CBP, se om rörelsen hos de slående cilia är i full räckvidd (se figur 1) och synkroniserad. Låt två oberoende aktörer utvärdera CBP för att förhindra urvalsbias.
- Rapportera att resultaten av HSVMA-analysen antingen är kompatibla, osannolika eller inte entydiga med PCD.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Video 1 och Video 2 visar en normal kontroll där CBF och CBP ligger inom det normala intervallet (se figur 1). Video 3, Video 4, Video 5 och Video 6 representerar två fall av PCD-patienter med en homozygot mutation i DNAH11-genen (c.2341G > A; s. Glu781Lys)3. Dessa representativa videor valdes eftersom fenotyper av mutationer i DNAH11-genen är anmärkningsvärda eftersom de inte kan diagnostiseras med TEM på grund av frånvaron av morfologiska förändringar 3,4,5.
Video 3 visar det klassiska styva, minimalt rörliga mönstret av ciliary beat kompatibelt med PCD. Det normala mönstret med full räckvidd som visas i video 1 och video 2 saknas (se figur 1). Video 4 visar en sekvens av samma patient (Video 3) men inspelad ovanifrån. Video 5 och Video 6 visar en hyperkinetisk, ineffektiv fenotyp av att slå cilia som också är kompatibel med PCD hos patienter som bär en mutation i DNAH11-genen . CBF var så högt att det inte kunde fastställas. Video 6 är från samma patient (Video 5) men inspelad ovanifrån. CBP är onormal och visar inte fullskaliga rörelser av friska cilia (se figur 1, video 1 och video 2).
Video 7 och video 8 visar en patologisk CBF och CBP i sidled (video 7) och ovanifrån (video 8) från en patient som har lidit av återkommande infektioner i övre luftvägarna; PCD kunde dock inte fastställas. Vid 10 Hz förblir CBF något under det normala åldersintervallet (se tabell 1), och CBP är onormalt jämfört med den normala CBP för kontrollvideosekvensen (Video 1, Video 2 och Figur 1), vilket visar en roterande ciliär rörelse. Fallet är inte avgörande, och ytterligare diagnostiska åtgärder, inklusive nNO, TEM och genetisk testning, måste övervägas, även om den kliniska bilden av patienten tyder på PCD.
Om borstningsproceduren utförs noggrant kan näsens epitel skadas och epistaxis kan uppstå. Om för många blodkroppar finns i provet kan HSVMA-analys inte utföras eftersom cilierade epitelceller är täckta med en beläggning av röda blodkroppar, vilket kan ses i video 9.
Figur 1: Normal ciliär stroke. Ciliär stroke av en frisk individ som visar hela intervallet av en normal framåt- och återhämtningsslag. Det effektiva slaget (mörkblått) rör sig från vänster till höger på ett whiplash-sätt. Återhämtningsslaget (ljusblått) flyttar cilia tillbaka från höger till vänster till startpositionen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Video 1: Normal ciliarörelse hos en patient utan PCD, sett i sidled. Förkortning: PCD = Primär ciliär dyskinesi. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Normal ciliarörelse hos en patient utan PCD, ovanifrån. Förkortning: PCD = Primär ciliär dyskinesi. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: Videosekvens i sidled av en PCD-patient med en mutation i DNAH11-genen (c.2341G > A s. Glu781Lys)3, som visar styva, nästan immotila cilier. Förkortningar: PCD = Primär ciliär dyskinesi; DNAH11 = dyneinarm tung kedja 11 gen. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 4: Videosekvens från samma PCD-patient (Video 3) inspelad ovanifrån. Förkortning: PCD = Primär ciliär dyskinesi. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 5: Videosekvens i sidled av en PCD-patient som visar ett helt annat, hyperkinetiskt men ineffektivt mönster av att slå cilia. Patienten var medlem i samma familj och med samma mutation som patienten i Video 3 och Video 4. Förkortning: PCD = Primär ciliär dyskinesi. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 6: Videosekvens från samma PCD-patient (Video 5), inspelad ovanifrån. Förkortning: PCD = Primär ciliär dyskinesi. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 7: Videosekvens av onormal, okoordinerad och långsam ciliarörelse hos en PCD-patient som lider av återkommande övre luftvägsinfektion. Förkortning: PCD = Primär ciliär dyskinesi. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 8: Videosekvens från samma PCD-patient (Video 7) ovanifrån. Förkortning: PCD = Primär ciliär dyskinesi. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 9: Videosekvens av ett prov, som inte kunde analyseras på grund av slarvig borstning, vilket ledde till epistaxis och överlagring av röda blodkroppar. Klicka här för att ladda ner den här videon.
| Ciliär slagfrekvens (Hz)* | ||||
| Ålder (år) | Betyda | SD | 5: e, 95: e centilerna | Dyskinetiskt slår kanter (%) † |
| 0-6 | 12.9 | 2.3 | 10.0, 18.1 | 10.4 (0.0, 36.8) |
| 7-12 | 12.9 | 1.4 | 10.9, 15.0 | 9.1 (0.0, 40.3) |
| 13-18 | 12.6 | 1.7 | 10.9, 15.3 | 24.8 (0.0, 56.9) |
| ≥19 | 11.5 | 2.8 | 7.7, 15.5 | 5.8 (0.0, 24.3) |
| *Genomsnittlig ciliär slagfrekvens, standardavvikelse (SD) och 5: e och 95: e percentilen | ||||
| †Mean (5: e, 95: e percentilerna) procentandel av kanter som uppvisar områden med ciliär dyskinesi | ||||
Tabell 1: Normala slagfrekvenser. Normal, åldersrelaterad, ciliär beatfrekvens. Denna tabell ändrades från Chilvers et al.14. *Genomsnittlig ciliär slagfrekvens, SD och 5: e och 95: e percentilen. †Mean (5: e, 95: e percentiler) procentandel av kanter som uppvisar områden av ciliär dyskinesi. Förkortning: SD = standardavvikelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrivs och diskuteras diagnosprocessen för PCD med HSVMA i ljuset av första linjens diagnostik. Trots att det är relativt enkelt att etablera,kostnadseffektivt 11 och en pålitlig metod i erfarna händer12, är HSVMA inte en diagnostisk åtgärd utan fallgropar. Onormal CBF och CBP kan bero på sekundär infektion, vilket leder till inflammation i bronko-respiratorisk epitel15, och av samma anledning kan rökande individer ha onormala slagfrekvenser16,17. Dessutom bör cystisk fibros uteslutas innan diagnosen PCD fastställs. Innan analysen av ett patientprov bedöms vara förenlig med PCD bör onormala resultat bekräftas med två oberoende insamlade prover, vilket kräver nya borstningar och en omanalys av CBF och CBP. Detta kan vara utmanande, särskilt med barn. Därför rekommenderar vissa utredare att odla epitelceller erhållna från den första borstningssessionen för att undvika upprepade borstningar 9,15.
Även om bronkoskopi inte är det föredragna valet för att diagnostisera PCD, om det utförs av andra skäl än PCD, kan prover alternativt erhållas under anestesi genom att borsta bronkialepitelet eller ta en biopsi13. Sekundär infektion kan förändra ciliär rörelse och slå frekvens. För att minska dessa oönskade effekter rekommenderas att administrera en två veckors kurs med ett bredspektrum oralt antibiotikum såsom amoxicillin plus klavulansyra eller en cefalosporin för att rikta in sig på vanliga luftvägspatogener. Trots att de har betydande fördelar vid behandling av PCD18 bör makrolider förmodligen undvikas för detta ändamål eftersom de kan förändra CBF på grund av en prokinetisk effekt på att slå cilia19. Vidare, oavsett bristen på bevis i litteraturen, bör antibiotika stoppas minst 48 timmar före borstning och analys för att undvika påverkan på CBF. Ingen väsentlig inverkan av antibiotika kunde observeras på CBF eller CBP i experiment där prover erhållna genom borstning eller biopsi odlades i vätskor innehållande antibiotika 20,21,22.
Även om HSVMA anses vara den mest exakta och reproducerbara tekniken i Europa, bär den risken för operatörsfel på grund av urvalsbias och de problem som nämns ovan15. Därför har flera grupper nyligen utvecklat mjukvarulösningar för att automatisera analys från digitala bilder för att övervinna detta problem 23,24,25. Eftersom denna automatisering fortfarande är under utveckling använder författarna två oberoende expertoperatörer för att analysera CBF och CBP manuellt och uppnå utmärkta och pålitliga resultat.
De representativa resultaten av detta papper visar videoklipp från patienter med en mutation i DNAH11-genen. Mutationer i denna gen visar en normal ultrastruktur, och patienter med denna mutation kan därför inte diagnostiseras med TEM. Den normala ultrastrukturen av cilia som demonstreras av TEM kan ses i upp till 30% av alla PCD-fall6. Dessutom kan nNO vara normalt med den hyperkinetiska fenotypen för denna mutation (Video 5 och Video 6), vilket gör HSVMA, tillsammans med genetisk testning, till det enda tillförlitliga diagnostiska verktyget 3,8. Dessutom utgör pediatriska patienter det primära målet för PCD-diagnostik. I många fall kan symtom som tyder på PCD observeras under neonatalperioden26, vilket gör HSVMA till en snabb, första linjens diagnostisk åtgärd att föredra framför andra alternativ.
I en nordamerikansk studie har nNO undersökts och föreslagits som ett första linjens diagnostiskt screeningtest för PCD27. Även om specificitet och känslighet rapporterades vara nära HSVMA (0,98/0,79), måste det noteras att den yngsta patienten var 5,1 år gammal och medelåldern var ännu mycket högre. Det måste också nämnas att flera utredare har rapporterat normala nNO-värden associerade med PCD15. Därför, medan en förbättring av den tekniska utrustningen för att utföra nNO i förskoleåldern fortfarande pågår, är HSVMA fortfarande den enda tillförlitliga första linjens diagnostik för PCD, och normala resultat utesluter PCD med nästan 100% säkerhet i alla åldersgrupper.
För att bli expert för att diagnostisera PCD med HSVMA behövs dock en hög genomströmning av normala och patologiska prover, vilket kräver korrekt utbildning och specialutrustning. Detta bör vara obligatoriskt och kommer att vara givande för en klinik som arbetar med diagnostik och behandling av sällsynta lungsjukdomar. Av någon anledning, om bearbetningen av proverna utgör ett hinder, kan ett centrum med specialiserad personal inom PCD-diagnostik med HSVMA användas istället. I sådana fall kan den behandlande läkaren utföra borstningen, och provet kan skickas över till diagnoscentret. I allmänhet bör proverna analyseras så snart som möjligt efter borstning. Men enligt vår erfarenhet, om proverna bearbetas korrekt (se protokoll steg 1.2), förblir epitelceller vitala och redo för analys i minst 24 timmar efter borstningav 20,22. De flesta centra som utför HSVMA själva utför vanligtvis analysen inom 4 timmar efter provtagning15. I vilket fall som helst, och före slutlig analys, bör proverna värmas upp till kroppstemperatur för att efterlikna optimala in vivo-förhållanden.
Som beskrivits tidigare i detta dokument finns det fallgropar i diagnosprocessen för PCD med HSVMA, särskilt med ofullständiga fall som de som har beskrivits i avsnittet representativa resultat (Video 7 och Video 8). För den slutliga diagnosen PCD finns riktlinjer tillgängliga som visar att ibland ett batteri med olika diagnostiska åtgärder är nödvändigt 9,10,15, och viktigast av allt, att det inte finns något enda test eller kombination av tester som diagnostiserar PCD med 100% säkerhet. Varje enhet som är involverad i diagnos och behandling av PCD bör dock uppmuntras att använda HSVMA som ett verktyg för förstahandsdiagnostik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill särskilt tacka barnsjuksköterskan Johanna Juvankoski för hennes utmärkta hjälp med borstningarna. Vi vill också uttrycka ett särskilt tack till professor Heymut Omran (University Clinic Münster, UKM) för att ha beviljat tillstånd att använda den schematiska figuren av normal ciliär rörelse från deras hemsida. Slutligen vill vi tacka Alan Brown BA (Hons), PGCE, för korrekturläsningen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amoxiciline-clavulanic acid | Orion Oyj | 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day | |
| Camera Software | Hamamatsu | HCI Image | |
| Cold pack | any | for preservation and transport | |
| Differential interference microscope | Carl Zeiss | Inverted, cell observer microscope | |
| Digitial High Speed Video Camera | Hamamatsu | Orca Flash 4.0, digital camera type C11440 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10565018 | basal cell culture medium |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL tube |
| Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | cuvette for microscopy |
| Heating Unit | Carl Zeiss/PeCon | 810-450001 | Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control |
| Interdental brush 0.6 mm | Doft | 872267 | Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag |
| Objective | Carl Zeiss | 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective | |
| Small polystyrene box with lid | any | for transport |
References
- Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2 (2015).
- Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135 (2017).
- Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237 (2020).
- Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
- Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11 (2014).
- Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
- Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
- Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
- Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090 (2017).
- Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066 (2019).
- Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142 (2019).
- Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
- Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
- Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
- Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
- Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
- Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
- Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
- Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
- Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
- Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675 (2014).
- Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78 (2012).
- Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14 (2012).
- Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792 (2021).
- Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
- Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).
