Summary
高速ビデオ顕微鏡分析は、比較的実行しやすく、高速で、費用対効果が高く、経験豊富な手で、原発性毛様体ジスキネジアの第一選択診断のためのかなり信頼性の高いツールであり、重度の肺疾患の診断および治療に関与するすべてのセンターで利用可能であるべきです。
Abstract
原発性毛様体ジスキネジア(PCD)は、常染色体劣性形質に主に遺伝する先天性障害である。この障害は繊毛運動の障害を引き起こし、粘液繊毛クリアランス(MCC)の重度の障害をもたらす。診断されていないか、診断が遅すぎると、気管支拡張症の発症と後の人生での肺への深刻な損傷につながります。PCDを診断するための方法のほとんどは時間がかかり、それらを確立するために広範な経済的資源を必要とする。高速ビデオ顕微鏡分析(HSVMA)は、 生体外で繊毛を鼓動させる生きた呼吸器細胞を視覚化および分析する唯一の診断ツールです。それは速く、費用効果が高く、そして、経験豊富な手で、PCDのための診断ツールとして非常に信頼できる。さらに、透過型電子顕微鏡(TEM)などの古典的な診断手段は、形態学的変化がないため、一部の変異には適用できません。
本稿では、呼吸器上皮細胞の採取プロセス、検体のさらなる調製、およびHSVMAのプロセスについて説明する。また、クリニックがHSVMAを実行するための機器を持っていない場合に、治療のために栄養培地に保管し、調査現場に輸送することによって、ブラシをかけられた細胞を無傷でうまく維持し、殴打する方法についても説明します。また、TEMと診断できないダイニンアーム重鎖11遺伝子(DNAH11)に変異を有する患者からの病理学的拍動パターンを有するビデオも示されている。上気道の感染による決定的でないHSVMAの結果、ならびに赤血球の重ね合わせによるブラッシングの失敗の結果。本稿では、肺疾患患者や希少肺疾患を扱うすべてのユニットに、PCDの日常的な診断の一環としてHSVMAを実行するか、HSVMAを専門とするセンターに検体を送ることを奨励したいと思います。
Introduction
原発性毛様体ジスキネジア(PCD)は、まれな遺伝性遺伝性疾患であり、これは、鼓動繊毛の動きに障害を引き起こす。診断されない場合、MCCの重度の障害のために後の人生で重度の肺損傷につながる。過去には、その有病率は1:4,000〜50,000の範囲にあると推定されています。着実に診断を改善し、状態の意識が高まっているため、PCDの有病率に関する最新情報は、PCDがはるかに一般的であり、おそらく1:4,000〜20,000の範囲にある可能性があることを示唆しています1,2。しかし、PCD患者は依然として過小診断または診断が遅すぎます1,3。したがって、先天性座位内および/またはヘテロタキシーまたは周産期鼻漏、新生児呼吸困難、鼻閉塞、および摂食困難のいずれかを有する乳児は、PCDの疑いがあるべきである。後の人生では、慢性中耳炎、再発性肺炎、鼻副鼻腔炎、およびMCC障害による慢性的で典型的な湿った咳は、気管支拡張症および肺機能障害と組み合わせて、成人期まで続くPCDの特徴的な症状である2。
PCDの疑いのある患者は、異なる診断ツールを使用して診断することができる。TEMは、過去に第一線診断のゴールドスタンダードと考えられてきました。しかし、PCD症例の最大30%は異常な超構造1,3,4,5,6を示さず、異なる診断アプローチを必要とする。したがって、ますます多くのセンターと欧州呼吸器学会(ERS)のガイドラインは、第一選択診断として鼻一酸化窒素(nNO)とHSVMAの組み合わせを示唆しています1,7,9,10。HSVMAおよびnNOは、PCD11の患者を特定する際に最も費用対効果の高い選択肢でもあります。しかし、遺伝子検査が診断に含まれていたとしても、現在、100%の確実性8、9、10でPCDを除外できるスタンドアロン検査または検査の組み合わせは存在しないことに留意する必要があります。
利用可能な診断オプションのうち、HSVMAは生きている繊毛被覆呼吸器細胞に焦点を当て、毛様体拍動パターン(CBP)および毛様体拍動頻度(CBF)を評価する唯一の検査です。TEMとは対照的に、HSVMAの結果は通常試験日に迅速に入手可能ですが、TEMの結果は試料が採取されてから数ヶ月後に届くことがあります。HSVMAはすべての年齢層に適用できますが、nNOは高度なコンプライアンスを必要とします。5歳未満でそれを使用する試みは、通常、失敗します 10.経験豊富な手において、HSVMAはPCDをそれぞれ100%および96%で診断するための優れた感度および特異性を有する12。
この論文では、鼻の下甲介から繊毛被覆呼吸器細胞を採取すること、採取した細胞を調査部位に輸送するための細胞栄養培地中での保存、CBFおよびCBPを決定するための顕微鏡ビデオ分析のプロセスなど、HSVMAを実行するための段階的な手順を説明する。さらに、正常なCBPとCBFを異常な繊毛機能と比較した患者からのビデオクリップがいくつか示されています(ビデオ3、ビデオ4、ビデオ5、ビデオ6、ビデオ7、およびビデオ8)。
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Protocol
倫理声明:
この研究は地元の倫理委員会(69/2017)によって承認され、ヘルシンキの宣言に準拠して実施されました。
1. 呼吸器上皮細胞の採取・輸送
- ブラッシング
- ブラッシングの前に、繊毛機能を妨害するバイオフィルムを根絶するために、患者に経口アモキシシリン - クラブラン酸の2週間コースを投与する。抗生物質が処置の2日前に終了していることを確認してください。
- ブラシをかけた上皮細胞ストリップ上の粘液のオーバーレイを減らすために、患者に鼻を徹底的に吹き飛ばすように頼む。両親に,幼い子供が鼻を吹くのを手伝ってもらいます。
- ブラッシングには、0.6mmサイズの歯間ブラシを使用してください( 材料表参照)。患者の頭を片手で固定したままにし、もう片方の手で両方の鼻孔の下甲介をブラッシングして、十分な上皮細胞ストリップを集める。
注:通常、歯間ブラシを下溝材の下に深く挿入すると、わずかな抵抗が発生します。鼻ブラッシングは、約2秒間素早く回してピッキングすることによって行われます。より長く激しいブラッシングは、そうでなければ重度の上皮損傷および連続した鼻出血を引き起こす可能性がある。 - 気管支鏡検査がPCDの疑い以外の理由で計画されている場合は、気管支鏡検査中にカリーナまたは気管支上皮をブラッシングするか、生検によってサンプルを採取する13。
- 回収した細胞ストリップを、細胞栄養価の高いダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む1.5mLの微量遠心チューブに落とします。
注:上皮細胞ストリップは、通常、ブラシをチューブ壁に投げたり回したりすることで、ブラシをより簡単に落とします。 - 微量遠心チューブの蓋を閉め、チューブを光源に押し付けます。チューブを振って、回収された細胞ストリップとコングロマリットを発見します。
- 試料の輸送
- マイクロ遠心チューブをしっかりと閉じたポリスチレン製の箱に入れ、チューブの蓋が正しく閉じられ、チューブがボックス内に固定されていることを確認します。
- コールドパックを追加します。ただし、試料の凍結は避けてください。
注:調査前に試料を保存するための最適温度は約4〜8°C(39.2〜46.4°F)です。 - 保存されたサンプルが次の 24 時間の間に分析されることを確認します。
注:これらの実験では、ブラッシングとHSVMAの間の平均時間は3時間であった。
2. 高速ビデオ顕微鏡分析(HSVMA)
- サンプルのビデオ顕微鏡
- サンプルを含む微量遠心チューブを受け取った後、それらを37°C(98.6°F)まで温めて、 最適なインビボ様環境を模倣します。
- 顕微鏡に加熱ユニットが装備されている場合は、チューブをフードの下に置き、そこで温めます。あるいは、インキュベーターを使用してサンプルを温めます。
- PC上でカメラとビデオユニットのソフトウェアを起動します。
- ピペットを使用して、少量のサンプルを採取し、キュベットまたはガラス底の皿に2滴を入れます( 材料表を参照)。キュベットまたは皿を蓋で覆い、顕微鏡の下に置きます。
- サンプルの評価には、低温光源と高速(200フレーム/秒以上)で記録できるビデオカメラを備えた差動干渉顕微鏡を使用してください。倍率100倍の油浸レンズを使用し、光学系の表面に液浸油を1滴入れます。
注:下からレンズが近づいている顕微鏡をお勧めします。 - 顕微鏡レンズで皿の底に近づき、赤血球がなく粘液含有量の低い細胞集塊を探します。代表的な関心領域(ROI)を見つけたら、最大の繊毛の動きで繊毛を打つ1つの特定のグループに焦点を当て、ビデオシーケンスを記録します。繊毛を横向きに、そして上から叩いて細胞を記録します。その後、別の代表的な細胞群を検索し、記録を繰り返します。
注:繊毛被覆細胞は1,000倍の倍率で調査する必要があり、繊毛の鼓動は200/秒以上(このプロトコルでは256/秒)のフレームレートで設定されたデジタル高速ビデオ(DHSV)カメラで記録する必要があります。録画されたビデオクリップから取得したデータはハードドライブに多くのスペースを必要とするため、外付けSSDハードドライブをお勧めします。
- ビデオシーケンスの分析
- CBF と CBP を決定するには、ビデオクリップをフレームごとに再生します。
- CBF を決定するには、フレームレートを 15 フレーム/秒のスローモーションに設定し、10 ビート連続でカウントします。
- 10ビートの1サイクルで通過するフレーム数を記録し、その結果をEq(1)に挿入します。記録されたすべての繊毛拍動サイクルの平均を計算して頻度を決定し、その結果を年齢の基準値と比較します( 表1参照)14。
(1)
ここで、X は 10 ビートのサイクル中に通過するフレームの数です。 - CBPを評価するには、拍動繊毛の動きがフルレンジにあり( 図1参照)、同期しているかどうかを確認します。2人の独立したオペレータにCBPを評価してもらい、選択バイアスを防止します。
- HSVMA分析の結果がPCDと互換性があるか、起こりそうにないか、または決定的ではないかのいずれかを報告する。
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Representative Results
ビデオ1とビデオ2は、CBFとCBPが正常範囲内にある正常なコントロールを示しています(図1参照)。ビデオ3、ビデオ4、ビデオ5、およびビデオ6は、DNAH11遺伝子にホモ接合型変異を有するPCD患者の2つの症例(c.2341G > A;p. Glu781Lys)3を表す。これらの代表的なビデオが選ばれたのは、DNAH11遺伝子の変異の表現型が、形態学的変化がないためTEMで診断できないため注目に値するからである3,4,5。
ビデオ3は 、PCDと互換性のある毛様体拍動の古典的な硬く、最小限の動きのパターンを示しています。ビデオ 1 と ビデオ 2 に示す通常のフルレンジ パターンはありません ( 図 1 参照)。ビデオ 4 は、同じ患者のシーケンス (ビデオ 3) を示していますが、上から記録されています。ビデオ 5 および ビデオ6 は、 DNAH11 遺伝子に変異を有する患者におけるPCDとも適合性のある拍動繊毛の過運動的で効果のない表現型を示す。CBFは非常に高かったので、決定することができませんでした。ビデオ 6 は同じ患者からのものですが(ビデオ5)、上から記録されています。CBPは異常であり、健康な繊毛の全範囲の動きを示していません( 図1、ビデオ 1、および ビデオ2を参照)。
ビデオ7およびビデオ8は、再発性の上気道感染症に罹患している患者からの病理学的CBFおよびCBPを横向き(ビデオ7)および上方(ビデオ8)から示す。しかし、PCDは確立できませんでした。10Hzでは、CBFは年齢の正常範囲をわずかに下回ったままであり(表1参照)、CBPは対照ビデオシーケンスの正常なCBP(ビデオ1、ビデオ2、および図1)と比較して異常であり、回転毛様体運動を示す。この症例は決定的ではなく、患者の臨床像はPCDを示唆するが、nNO、TEM、および遺伝子検査を含むさらなる診断措置を考慮する必要がある。
ブラッシング手順を厳密に行うと、鼻の上皮が傷つき、鼻出血が起こる可能性があります。検体中の血球が多すぎると、 ビデオ9に見られるように、繊毛上皮細胞が赤血球のコーティングで覆われているため、HSVMA分析を行うことができません。
図1:正常な毛様体脳卒中。 健康な個体の毛様体脳卒中は、正常な前方および回復性脳卒中の全範囲を示す。効果的なストローク(濃い青)は、鞭打ちのように左から右に移動します。回復ストローク(水色)は、繊毛を右から左に動かして開始位置に戻します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:PCDのない患者の正常な繊毛運動、横向きに見られる。 略語:PCD =原発性毛様体ジスキネジア。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ2:上からPCDのない患者の正常な繊毛運動。 略語:PCD =原発性毛様体ジスキネジア。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ3:DNAH11遺伝子に変異(c.2341G > A p. Glu781Lys)3を有するPCD患者の横向きのビデオ配列は、硬く、ほとんど不動の繊毛を示す。略語: PCD = 原発性毛様体ジスキネジア;DNAH11=ダイニンアーム重鎖11遺伝子。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ4:上から記録した同じPCD患者からのビデオシーケンス(ビデオ3)。略語:PCD =原発性毛様体ジスキネジア。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ5:PCD患者の横向きのビデオシーケンスは、繊毛を鼓動させる全く異なる、過運動的だが非効率的なパターンを示す。患者は、ビデオ3およびビデオ4の患者と同じ家族の一員であり、同じ変異を有していた。略語:PCD =原発性毛様体ジスキネジア。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ6:同じPCD患者からのビデオシーケンス(ビデオ5)、上から記録された。 略語:PCD =原発性毛様体ジスキネジア。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ7:再発性上気道感染に罹患しているPCD患者における異常、非協調、および遅い繊毛運動のビデオシーケンス。 略語:PCD =原発性毛様体ジスキネジア。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ8:同じPCD患者からのビデオシーケンス(ビデオ7)を上から。 略語:PCD =原発性毛様体ジスキネジア。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ9:不注意なブラッシングのために分析できなかった検体のビデオシーケンスは、赤血球の鼻出血および重ね合わせにつながる。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
| 毛様体拍数(Hz)* | ||||
| 年齢(年) | 意味する | ティッカー | 5番目、95番目の センチラ | ジスキネティックにエッジを打つ(%)† |
| 0-6 | 12.9 | 2.3 | 10.0, 18.1 | 10.4 (0.0, 36.8) |
| 7-12 | 12.9 | 1.4 | 10.9, 15.0 | 9.1 (0.0, 40.3) |
| 13-18 | 12.6 | 1.7 | 10.9, 15.3 | 24.8 (0.0, 56.9) |
| ≥19 | 11.5 | 2.8 | 7.7, 15.5 | 5.8 (0.0, 24.3) |
| *平均毛様体拍動頻度、標準偏差(SD)、および5番目 と95番目の 百分位数 | ||||
| †毛様体ジスキネジアの領域を示す辺の平均(5番目、95パー センタイル)の割合 | ||||
表1:通常のビート周波数正常、加齢に関連した毛様体拍動頻度。この表はChilvers et al.14から修正された。*平均毛様体拍動頻度、SD、および5番目 と95番目の 百分位数。†毛様体ジスキネジアの領域を示す辺の平均(5番目、95番目の 百分位数)の割合。省略形: SD = 標準偏差。
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Discussion
ここでは、HSVMAを用いたPCDの診断プロセスを、第一選択診断に照らして説明し、議論する。HSVMAは、比較的容易に確立でき、費用対効果が高く、11、および経験豊富な手12における信頼できる方法であるにもかかわらず、落とし穴のない診断尺度ではない。異常なCBFおよびCBPは、気管支呼吸器上皮15の炎症につながる二次感染に起因する可能性があり、同じ理由で、喫煙者は異常な拍動頻度16、17を有し得る。さらに、PCDの診断を確立する前に、嚢胞性線維症を排除すべきである。患者サンプルの分析がPCDと互換性があると判断される前に、新しいブラッシングとCBFとCBPの再分析を必要とする2つの独立して収集されたサンプルで異常な結果を確認する必要があります。これは、特に子供にとっては難しいかもしれません。したがって、一部の研究者は、ブラッシングの繰り返しを避けるために、最初のブラッシングセッションから得られた上皮細胞を培養することを推奨している9,15。
気管支鏡検査はPCDを診断するための好ましい選択ではないが、PCD以外の理由で実施される場合、気管支上皮をブラッシングするか、または生検を採取することによって、麻酔下でサンプルを代替的に得ることができる13。二次感染は毛様体の動きや拍動頻度を変化させる可能性があります。これらの望ましくない影響を軽減するために、一般的な呼吸器病原体を標的とするために、アモキシシリンとクラブラン酸またはセファロスポリンなどの広域スペクトル経口抗生物質を含む2週間のコースを投与することが推奨される。PCD18の治療に実質的な利益があるにもかかわらず、マクロライドは繊毛19の打倒に対する運動促進効果のためにCBFを変化させる可能性があるため、この目的のためにはおそらく避けるべきである。さらに、文献にエビデンスがないにもかかわらず、CBFへの影響を避けるために、抗生物質はブラッシングおよび分析の前に少なくとも48時間停止されるべきである。ブラッシングまたは生検によって得られたサンプルを抗生物質を含む液体中で培養した実験において、CBFまたはCBPに対する抗生物質の実質的な影響は観察できなかった20、21、22。
HSVMAはヨーロッパで最も正確で再現性のある技術と考えられていますが、選択バイアスと上記の問題によるオペレータエラーのリスクを負います15。したがって、いくつかのグループが最近、この問題を克服するためにデジタル画像からの分析を自動化するソフトウェアソリューションを開発しました23,24,25。この自動化はまだ開発中であるため、著者らは2人の独立した専門オペレータを使用してCBFとCBPを手動で分析し、優れた信頼性の高い結果を達成しました。
この論文の代表的な結果は、DNAH11遺伝子に変異を有する患者のビデオクリップを示す。この遺伝子の変異は正常な超構造を示し、したがってこの変異を有する患者はTEMによって診断することができない。TEMによって実証された繊毛の正常な超構造は、すべてのPCD症例の最大30%で見ることができる6。さらに、nNOはこの変異の運動亢進表現型(ビデオ5およびビデオ6)で正常である可能性があり、HSVMAを遺伝子検査とともに唯一の信頼できる診断ツール3,8にする。さらに、小児患者はPCD診断の主要な標的を構成する。多くの場合、PCDを示唆する症状は新生児期26に観察され得、HSVMAを他の選択肢よりも好ましい迅速で第一選択の診断手段とする。
北米の研究では、nNOがPCD27の第一選択診断スクリーニング検査として検討され、提案されています。特異度および感受性はHSVMAの特異度および感受性に近いことが報告されたが(0.98/0.79)、最年少の患者は5.1歳であり、平均年齢はさらに高かったことに留意しなければならない。また、何人かの研究者がPCD15に関連する正常なnNO値を報告していることにも言及しなければならない。したがって、就学前の被験者でnNOを実行するための技術機器の改善はまだ進行中ですが、HSVMAは依然としてPCDの唯一の信頼できる第一選択診断であり、正常な結果はすべての年齢層でほぼ100%の確実性でPCDを除外しています。
しかし、HSVMAを用いてPCDを診断するための専門家になるためには、正常および病理学的サンプルの高スループットが必要であり、適切なトレーニングと専門機器が必要です。これは必須であるべきであり、まれな肺疾患の診断と治療を扱う診療所にとってはやりがいのあることです。何らかの理由で、サンプルの処理が障害となる場合は、HSVMAを使用したPCD診断の専門スタッフがいるセンターを代わりに使用できます。そのような場合、治療する医師はブラッシングを行うことができ、サンプルを診断センターに送ることができる。一般に、サンプルはブラッシング後できるだけ早く分析する必要があります。しかし、我々の経験では、サンプルが適切に処理されれば(プロトコルステップ1.2を参照)、上皮細胞は生命力を維持し、ブラッシング後少なくとも24時間分析の準備ができている20,22。HSVMAを自ら行うほとんどのセンターは、通常、サンプリング15から4時間以内に分析を行います。いずれにせよ、最終的な分析の前に、サンプルを体温まで温めて、最適な生体内条件を模倣する必要があります。
本稿の前半で説明したように、HSVMAを用いたPCDの診断プロセスには、特に代表的な結果のセクション(ビデオ7およびビデオ 8)に記載されているような決定的でないケースでは、落とし穴があります。PCDの最終診断のためには、時には異なる診断手段のバッテリーが必要であることを示すガイドラインが利用可能である9,10,15、そして最も重要なのは、100%の確実性でPCDを診断する単一のテストまたはテストの組み合わせがないことである。それにもかかわらず、PCDの診断と治療に関与するすべてのユニットは、第一選択診断のツールとしてHSVMAを使用することを奨励されるべきである。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
小児科看護師のヨハンナ・ユヴァンコスキ夫人には、ブラッシングの素晴らしい助けに特別な感謝の意を表したいと思います。また、Heymut Omran教授(University Clinic Münster, UKM)が、彼らのウェブサイトから正常な毛様体運動の概略図を使用する許可を与えてくれたことに特別な感謝の意を表したいと思います。最後に、原稿の校正をしてくれたPGCEのアラン・ブラウンBA(Hons)氏に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amoxiciline-clavulanic acid | Orion Oyj | 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day | |
| Camera Software | Hamamatsu | HCI Image | |
| Cold pack | any | for preservation and transport | |
| Differential interference microscope | Carl Zeiss | Inverted, cell observer microscope | |
| Digitial High Speed Video Camera | Hamamatsu | Orca Flash 4.0, digital camera type C11440 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10565018 | basal cell culture medium |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL tube |
| Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | cuvette for microscopy |
| Heating Unit | Carl Zeiss/PeCon | 810-450001 | Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control |
| Interdental brush 0.6 mm | Doft | 872267 | Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag |
| Objective | Carl Zeiss | 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective | |
| Small polystyrene box with lid | any | for transport |
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