Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית

Published: January 19, 2022 doi: 10.3791/63292
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 2
1Allergy Centre, Tampere University Hospital, 2Department of Pediatrics, Turku University Hospital, 3Turku Bioscience Center, University of Turku and Åbo Akademi University

Summary

ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה הוא קל יחסית לביצוע, מהיר, חסכוני, ובידיים מנוסות, כלי אמין במידה ניכרת לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית, שאמורה להיות זמינה בכל מרכז המעורב באבחון ובטיפול במחלות ריאה קשות.

Abstract

דיסקינזיה סילארית ראשונית (PCD) היא הפרעה מולדת התורשתית בעיקר בתכונה אוטוזומלית רצסיבית. ההפרעה גורמת להפרעה בתנועת הריסונים, מה שמוביל לפגיעה חמורה בפינוי רירית (MCC). אם לא מאובחנים או מאובחנים מאוחר מדי, המצב מוביל להתפתחות ברונכיאקטזיס ונזק חמור לריאות בהמשך החיים. רוב השיטות לאבחון PCD גוזלות זמן רב ודורשות משאבים כלכליים נרחבים כדי לבסס אותן. ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה (HSVMA) הוא כלי האבחון היחיד להמחשה וניתוח של תאי נשימה חיים עם ריסונים פועמים במבחנה. זה מהיר, חסכוני, ובידיים מנוסות, אמין מאוד ככלי אבחון עבור PCD. בנוסף, אמצעי אבחון קלאסיים כגון מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM) אינם ישימים עבור מוטציות מסוימות מכיוון ששינויים מורפולוגיים נעדרים.

מאמר זה מתאר את תהליך איסוף תאי אפיתל נשימתיים, את ההכנה הנוספת של הדגימה ואת התהליך של HSVMA. כמו כן, אנו מתארים כיצד ניתן לשמור בהצלחה על תאים מוברשים ללא פגע ולהכות על ידי השארתם במדיום מזין לאחסון והובלה לאתר החקירה במקרים בהם למרפאה אין את הציוד לביצוע HSVMA. כמו כן מוצגים סרטונים עם דפוסי הכאה פתולוגיים מחולים עם מוטציה בגן שרשרת כבדה 11 של זרוע הדיינין (DNAH11), שלא ניתן לאבחן עם TEM; התוצאה של HSVMA לא חד משמעי עקב זיהום של דרכי הנשימה העליונות, כמו גם צחצוח לא מוצלח עם superimposition של תאי דם אדומים. במאמר זה, ברצוננו לעודד כל יחידה העוסקת בחולי ריאות ומחלות ריאה נדירות לבצע HSVMA כחלק מהאבחנה השגרתית היומית שלהם עבור PCD או לשלוח את הדגימות למרכז המתמחה בביצוע HSVMA.

Introduction

דיסקינזיה סילארית ראשונית (PCD) היא הפרעה גנטית תורשתית נדירה, הגורמת להפרעות בתנועת הריסונים המכים. אם לא מאובחנים, זה מוביל לנזק חמור לריאות בהמשך החיים עקב פגיעה חמורה של MCC. בעבר הוערך כי שכיחותו נעה בטווח של 1:4,000 עד 50,000. בשל שיפור מתמיד באבחון ומודעות גוברת למצב, עדכונים על שכיחות ה- PCD מצביעים על כך שהוא עשוי להיות נפוץ הרבה יותר וכנראה בטווח של 1:4,000 עד 20,000 במקום 1,2. עם זאת, חולים עם PCD עדיין מאובחנים בתת-אבחון או מאובחנים מאוחר מדי 1,3. לכן, תינוקות עם סיטוס אינברסוס מולד ו/או הטרוטקסיה או רינוריאה פרינטלית, מצוקה נשימתית בילודים, אף חסום וקשיי האכלה צריכים להיות חשודים ב-PCD. בהמשך החיים, דלקת אוזניים כרונית, דלקת ריאות חוזרת ונשנית, רינוזינוסיטיס ושיעול רטוב כרוני וטיפוסי עקב פגיעה ב-MCC הם הסימפטומים המוכרים של PCD, אשר בשילוב עם ברונכיאקטזיס ותפקוד ריאות לקוי, ממשיכים לתוךהבגרות 2.

ניתן לאבחן חולים החשודים כבעלי PCD באמצעות כלי אבחון שונים. TEM נחשב בעבר לתקן הזהב לאבחון קו ראשון. עם זאת, עד 30% ממקרי ה-PCD אינם מראים מבנה-על חריגשל 1,3,4,4,5,6, מה שדורש גישה אבחנתית שונה. לכן, מספר גדל והולך של מרכזים וההנחיות של החברה האירופית לנשימה (ERS) מציעים שילוב של תחמוצת החנקן באף (nNO) ו- HSVMA כאבחון קו ראשון 1,7,9,10. HSVMA ו-nNO הן גם האפשרויות החסכוניות ביותר בזיהוי מטופל עם PCD11. עם זאת, גם אם הבדיקות הגנטיות נכללו באבחון, יש לזכור כי אין כיום בדיקה עצמאית או שילוב של בדיקות שיכולות לכלול PCD בוודאות של 100% 8,9,10.

מבין אפשרויות האבחון הזמינות, HSVMA היא הבדיקה היחידה המתמקדת בתאי נשימה חיים, מצופים ריסונים ומעריכה את תבנית הפעימה הציליארית (CBP) ואת תדירות הפעימה הציליארית (CBF). בניגוד ל-TEM, התוצאות של HSVMA זמינות במהירות, בדרך כלל ביום הבדיקה, בעוד שתוצאות ה-TEM עשויות להגיע חודשים לאחר נטילת הדגימה. ניתן ליישם HSVMA עבור כל קבוצות הגיל, בעוד ש- nNO דורש רמה גבוהה של תאימות; ניסיונות להשתמש בו מתחת לגיל 5 שנים הם בדרך כלל לא מוצלחים10. בידיים מנוסות, HSVMA יש רגישות מעולה וספציפיות לאבחון PCD ב 100% ו 96%, בהתאמה12.

מאמר זה מתאר את ההליך שלב אחר שלב לביצוע HSVMA, כולל קצירת תאי נשימה מצופים ריסונים מהטורבינט הנחות של האף, שימור תאים שנקטפו במדיום המזין את התאים להובלה לאתר החקירה, ותהליך ניתוח וידאו מיקרוסקופי לקביעת CBF ו- CBP. בנוסף, מוצגים כמה קטעי וידאו של מטופלים, המשווה בין CBPs ו- CBFs רגילים לתפקוד ריסונים לא תקין (וידאו 3, וידאו 4, וידאו 5, וידאו 6, וידאו 7 ווידאו 8).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת האתיקה:

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (69/2017) ונערך בהתאם להצהרת הלסינקי.

1. איסוף והובלה של תאי אפיתל נשימתיים

  1. צחצוח
    1. לפני הצחצוח, תנו למטופל קורס של שבועיים של חומצה אמוקסיצילין-קלבולאנית פומית כדי למגר את הביופילמים המפריעים לתפקוד הריסונים. ודא שהאנטיביוטיקה מסתיימת יומיים לפני ההליך.
    2. כדי להפחית את שכבת העל של חומר רירי על רצועות תאי האפיתל המוברשים, בקשו מהמטופל לפוצץ את האף ביסודיות. בקשו מהורים לעזור לילדיהם הקטנים לפוצץ את האף.
    3. להברשה, השתמשו במברשת בין-דנטלית בגודל 0.6 מ"מ (ראו טבלת החומרים). שמור על ראשו של המטופל קבוע ביד אחת, וביד השנייה, לצחצח את הטורבינאט הנחות של שני הנחיריים כדי לאסוף מספיק רצועות תאי אפיתל.
      הערה: התנגדות קלה נחווית בדרך כלל בעת החדרת המברשת הבין-דנטלית עמוק מתחת לטורבינט הנחות. צחצוח האף מתבצע על ידי סיבוב מהיר וקטיף במשך כ 2 שניות. צחצוח ארוך ואינטנסיבי עלול לגרום לפגיעה חמורה באפיתל ולאפיסטקסיס רצופים.
    4. אם ברונכוסקופיה מתוכננת מסיבות שאינן חשד ל- PCD, לאסוף דגימות במהלך ברונכוסקופיה על ידי צחצוח אפיתל הקרינה או הסימפונות או על ידי ביופסיה13.
    5. שחררו את רצועות התאים שנקטפו לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל את מדיום הנשרים המהונדסים (DMEM) של דולבקו המזין את התאים.
      הערה: רצועות תאי אפיתל בדרך כלל מורידות את המברשת בקלות רבה יותר על ידי השלכה והפיכת המברשת על דופן הצינור.
    6. סגור את המכסה של צינור microcentrifuge והחזק את הצינור כנגד מקור אור. לנער את הצינור כדי לגלות רצועות תאים וקונגלומרטים שנקטפו.
  2. הובלת הדגימה
    1. מניחים את צינורות המיקרוצנטריפוגה בקופסת פוליסטירן סגורה היטב ומוודאים שמכסה הצינורות סגור כראוי והצינורות קבועים בתוך הקופסה.
    2. הוסף חבילה קרה; עם זאת, הימנע מהקפאת הדגימה.
      הערה: הטמפרטורה האופטימלית לשימור הדגימה לפני החקירה היא בערך 4-8 מעלות צלזיוס (39.2-46.4 מעלות פרנהייט).
    3. ודא שהדגימות שהשתמרו מנותחות במהלך 24 השעות הבאות.
      הערה: בניסויים אלה, הזמן הממוצע בין צחצוח ל-HSVMA היה 3 שעות.

2. ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה (HSVMA)

  1. מיקרוסקופ וידאו של הדגימות
    1. לאחר קבלת צינורות microcentrifuge המכילים את הדגימות, לחמם אותם עד 37 °C (98.6 °F) כדי לחקות סביבה אופטימלית, דמוית vivo.
    2. אם המיקרוסקופ מצויד ביחידת חימום, הניחו את הצינורות מתחת למכסה המנוע וחממו אותם שם למעלה. לחלופין, השתמשו באינקובטור כדי לחמם את הדגימות.
    3. הפעל את המצלמה ואת התוכנה של יחידת הווידאו במחשב.
    4. באמצעות פיפטה, קחו כמות קטנה מהדגימה והניחו שתי טיפות לתוך צלחת קובט או תחתית זכוכית (ראו את טבלת החומרים). מכסים את הקובט או את המנה במכסה ומניחים אותה מתחת למיקרוסקופ.
    5. להערכת הדגימות, השתמש במיקרוסקופ עם הפרעה דיפרנציאלית המצויד במקור אור קר ובמצלמת וידאו המסוגלת להקליט במהירות גבוהה (לפחות 200 פריימים לשנייה). השתמשו בעדשת טבילת שמן עם הגדלה של פי 100 והניחו טיפה של שמן טבילה על פני השטח של האופטיקה.
      הערה: מומלץ להשתמש במיקרוסקופים עם עדשה המתקרבת מלמטה.
    6. ניגשים לתחתית המנה עם עדשת המיקרוסקופ ומחפשים צבירי תאים ללא תאי דם אדומים ועם תכולת ריר נמוכה. לאחר מציאת אזור עניין מייצג (ROI), התמקדו בקבוצה ספציפית אחת של ריסונים מכים עם תנועות הריסונים הגדולות ביותר והקליטו רצף וידאו. הקלט תאים עם ריסונים פועמים בצד וממלמעלה. לאחר מכן, חפש אשכול מייצג אחר של תאים וחזור על ההקלטה.
      הערה: יש לחקור את התאים המצופים בריסונים תחת הגדלה של פי 1,000, ויש להקליט ריסונים מכות באמצעות מצלמת וידאו דיגיטלית במהירות גבוהה (DHSV) שנקבעה בקצב פריימים של 200 לשנייה או יותר (256/s בפרוטוקול זה). מכיוון שהנתונים המתקבלים מקטעי הווידאו המוקלטים דורשים הרבה מקום בכונן הקשיח, מומלץ כונן קשיח חיצוני של SSD.
  2. ניתוח רצפי וידאו
    1. כדי לקבוע CBF ו- CBP, הפעל את קטעי הווידאו בחזרה פריים אחר פריים.
    2. כדי לקבוע CBF, הגדר את קצב הפריימים להילוך איטי עם 15 פריימים לשנייה וספור 10 פעימות רצופות.
    3. רשום את מספר המסגרות העוברות על פני מחזור יחיד של 10 פעימות והכנס את התוצאה ל- Eq (1). קבע את התדירות על-ידי חישוב הממוצע של כל מחזורי פעימות הריסונים שנרשמו והשווה את התוצאה לערכי הייחוס עבור הגיל (ראה טבלה 1)14.
      Equation 1 (1)
      כאשר X הוא מספר המסגרות החולפות על פני מחזור של 10 פעימות.
    4. להערכת CBP, שימו לב אם תנועת הריסונים המכות נמצאת בטווח מלא (ראו איור 1) ומסונכרנת. בקש משני אופרטורים עצמאיים להעריך את ה- CBP כדי למנוע הטיית בחירה.
    5. דווח על התוצאות של ניתוח HSVMA כך שיהיו תואמות, לא סבירות או לא חד משמעיות עם PCD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

וידאו 1 ווידאו 2 מראים שליטה רגילה שבה CBF ו-CBP נמצאים בטווח הנורמלי (ראו איור 1). וידאו 3, וידאו 4, וידאו 5 ווידאו 6 מייצגים שני מקרים של חולי PCD עם מוטציה הומוזיגוטית בגן DNAH11 (c.2341G > A; p. Glu781Lys)3. סרטונים מייצגים אלה נבחרו מכיוון שפנוטיפים של מוטציות בגן DNAH11 ראויים לציון מכיוון שלא ניתן לאבחן אותם על ידי TEM בשל היעדר שינויים מורפולוגיים 3,4,5.

סרטון 3 מציג את התבנית הקלאסית הנוקשה, הנעה באופן מינימלי, של ביט סילארי התואם ל-PCD. תבנית הטווח המלא הרגילה המוצגת בווידאו 1 ובסרטון 2 נעדרת (ראו איור 1). סרטון 4 מציג רצף של אותו חולה (וידאו 3) אך מוקלט מלמעלה. וידאו 5 ווידאו 6 מראים פנוטיפ היפרקינטי ולא יעיל של ריסונים מכים התואם גם הוא ל- PCD בחולים הנושאים מוטציה בגן DNAH11 . ה-CBF היה כל כך גבוה שלא ניתן היה לקבוע אותו. סרטון 6 הוא מאותו חולה (וידאו 5) אך הוקלט מלמעלה. ה-CBP אינו תקין ואינו מראה את התנועה בטווח המלא של ריסונים בריאים (ראו איור 1, סרטון 1 ווידאו 2).

וידאו 7 וסרטון 8 מראים CBF ו-CBP פתולוגיים בצד (וידאו 7) וממלמעלה (וידאו 8) מחולה שסובל מזיהומים חוזרים ונשנים בדרכי הנשימה העליונות; עם זאת, לא ניתן היה להקים PCD. ב-10 הרץ, ה-CBF נשאר מעט מתחת לטווח הגיל הנורמלי (ראו טבלה 1), וה-CBP אינו תקין בהשוואה ל-CBP הרגיל של רצף סרטוני הבקרה (וידאו 1, וידאו 2 ואיור 1), ומראה תנועה סילארית סיבובית. המקרה אינו חד משמעי, ויש לקחת בחשבון אמצעי אבחון נוספים, כולל nNO, TEM ובדיקות גנטיות, אם כי התמונה הקלינית של המטופל מרמזת על PCD.

אם הליך הצחצוח מתבצע בקפדנות, האפיתל של האף עלול להיפגע, ואפיסטקסיס עלול להתרחש. אם יותר מדי תאי דם נמצאים בדגימה, לא ניתן לבצע ניתוח HSVMA מכיוון שתאי אפיתל סיליים מכוסים בציפוי של תאי דם אדומים, כפי שניתן לראות בסרטון 9.

Figure 1
איור 1: שבץ סילארי תקין. שבץ סילארי של אדם בריא המציג את כל הטווח של שבץ תקין קדימה והתאוששות. הקו האפקטיבי (כחול כהה) נע משמאל לימין באופן של צליפת שוט. מכת ההתאוששות (תכלת) מעבירה את הריסונים בחזרה מימין לשמאל למצב ההתחלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

סרטון 1: תנועת ריסונים תקינה של חולה ללא PCD, הנראית לצדדים. קיצור: PCD = דיסקינזיה סילארית ראשונית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

סרטון 2: תנועת ריסונים רגילה של מטופל ללא PCD, מלמעלה. קיצור: PCD = דיסקינזיה סילארית ראשונית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

וידאו 3: רצף וידאו צדדי של חולה PCD עם מוטציה בגן DNAH11 (c.2341G > A p. Glu781Lys)3, המציג ריסונים נוקשים, כמעט לא תנועתיים. קיצורים: PCD = דיסקינזיה סילארית ראשונית; DNAH11 = גן שרשרת כבדה של זרוע דיינין 11. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

וידאו 4: רצף וידאו מאותו חולה PCD (וידאו 3) שהוקלט מלמעלה. קיצור: PCD = דיסקינזיה סילארית ראשונית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

סרטון 5: רצף וידאו בצד של חולה PCD המציג תבנית שונה לחלוטין, היפרקינטית אך לא יעילה של הכאת ריסונים. החולה היה בן לאותה משפחה ועם אותה מוטציה כמו החולה בווידאו 3 ובווידאו 4. קיצור: PCD = דיסקינזיה סילארית ראשונית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

סרטון 6: רצף וידאו מאותו חולה PCD (וידאו 5), שהוקלט מלמעלה. קיצור: PCD = דיסקינזיה סילארית ראשונית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

וידאו 7: רצף וידאו של תנועת ריסונים לא תקינה, לא מתואמת ואיטית בחולה PCD הסובל מזיהום חוזר ונשנה בדרכי הנשימה העליונות. קיצור: PCD = דיסקינזיה סילארית ראשונית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

סרטון 8: רצף וידאו מאותו חולה PCD (וידאו 7) מלמעלה. קיצור: PCD = דיסקינזיה סילארית ראשונית.  אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

וידאו 9: רצף וידאו של דגימה, שלא ניתן היה לנתח אותה עקב צחצוח רשלני, מה שהוביל לאפיסטקסיס ולסופרימפוזיציה של תאי דם אדומים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

תדר פעימה סילארי (הרץ)*
גיל (שנים) התכוון SD המאהה-5, המאהה-95 קצוות מכות דיסקינטיות (%) †
0-6 12.9 2.3 10.0, 18.1 10.4 (0.0, 36.8)
7-12 12.9 1.4 10.9, 15.0 9.1 (0.0, 40.3)
13-18 12.6 1.7 10.9, 15.3 24.8 (0.0, 56.9)
≥19 11.5 2.8 7.7, 15.5 5.8 (0.0, 24.3)
*תדירות פעימה סילארית ממוצעת, סטיית תקן (SD) ואחוזונים5 ו-95
†אחוזונים5, 95) של קצוות המציגים אזורים של דיסקינזיה סילארית

טבלה 1: תדרי פעימות רגילים. תדירות פעימה רגילה, תלוית גיל, סילארית. טבלה זו שונתה מ- Chilvers et al.14. *תדירות פעימה סילארית ממוצעת, SD, ואחוזונים5 ו-95. †מיד(אחוזונים5, 95) אחוז מהקצוות המציגים אזורים של דיסקינזיה סילארית. קיצור: SD = סטיית תקן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, תהליך האבחון עבור PCD באמצעות HSVMA מתואר ונדון לאור אבחון קו ראשון. למרות היותו קל יחסית להקמה,חסכוני 11, ושיטה אמינה בידיים מנוסות12, HSVMA אינו אמצעי אבחון ללא מכשולים. CBF ו- CBP חריגים עשויים להיות תוצאה של זיהום משני, מה שמוביל לדלקת של אפיתליה ברונכו-נשימתית15, ומאותה סיבה, אנשים מעשנים עשויים להיות בעלי תדירות פעימה חריגה16,17. בנוסף, סיסטיק פיברוזיס יש לכלול לפני קביעת האבחנה של PCD. לפני ניתוח של מדגם חולה הוא נשפט להיות תואם PCD, תוצאות חריגות יש לאשר עם שתי דגימות שנאספו באופן עצמאי, הדורשים מברשות חדשות וניתוח מחדש של CBF ו- CBP. זה עשוי להיות מאתגר, במיוחד עם ילדים. לכן, חלק מהחוקרים ממליצים לגדל תאי אפיתל שהתקבלו מפגישת הצחצוח הראשונה כדי למנוע צחצוח חוזר 9,15.

למרות ברונכוסקופיה אינה הבחירה המועדפת לאבחון PCD, אם היא מתבצעת מסיבות שאינן PCD, דגימות ניתן לקבל לחלופין תחת הרדמה על ידי צחצוח אפיתל הסימפונות או נטילת ביופסיה13. זיהום משני עשוי לשנות את התנועה הסילארית ואת תדירות הפעימה. כדי להפחית את ההשפעות הלא רצויות הללו, מומלץ לתת קורס של שבועיים עם אנטיביוטיקה פומית רחבת טווח כגון אמוקסיצילין בתוספת חומצה קלבולנית או צפלוספורין כדי להתמקד בפתוגנים נשימתיים נפוצים. למרות שיש להם יתרונות משמעותיים בטיפול ב- PCD18, סביר להניח שיש להימנע ממקרוולידים למטרה זו מכיוון שהם עשויים לשנות את CBF עקב השפעה פרוקינטית על הכאת ריסונים19. יתר על כן, ללא קשר לחוסר הראיות בספרות, יש לעצור את האנטיביוטיקה לפחות 48 שעות לפני הצחצוח והניתוח כדי למנוע כל השפעה על CBF. לא ניתן היה לראות השפעה משמעותית של אנטיביוטיקה על CBF או CBP בניסויים שבהם דגימות שהתקבלו על ידי צחצוח או ביופסיה טופחו בנוזלים המכילים אנטיביוטיקה 20,21,22.

למרות ש- HSVMA נחשבת לטכניקה המדויקת והניתנת לשחזור ביותר באירופה, היא נושאת את הסיכון לטעות מפעיל עקב הטיית בחירה והבעיות שהוזכרו לעיל15. לכן, מספר קבוצות פיתחו לאחרונה פתרונות תוכנה כדי להפוך ניתוח מתמונות דיגיטליות לאוטומטי כדי להתגבר על בעיה זו 23,24,25. מכיוון שאוטומציה זו עדיין בפיתוח, המחברים משתמשים בשני מפעילים מומחים בלתי תלויים כדי לנתח את CBF ו- CBP באופן ידני, ולהשיג תוצאות מצוינות ואמינות.

התוצאות הייצוגיות של מאמר זה מראות קטעי וידאו של חולים עם מוטציה בגן DNAH11. מוטציות בגן זה מראות מבנה-על תקין, ולכן חולים עם מוטציה זו אינם יכולים להיות מאובחנים על ידי TEM. ניתן לראות את מבנה האולטרה-מבנה הרגיל של הריסונים המודגם על ידי TEM בעד 30% מכלל מקרי ה- PCD6. בנוסף, nNO עשוי להיות תקין עם הפנוטיפ ההיפרקינטי של מוטציה זו (וידאו 5 ווידאו 6), מה שהופך את HSVMA, יחד עם בדיקות גנטיות, לכלי האבחון האמין היחיד 3,8. בנוסף, מטופלים ילדים מהווים את היעד העיקרי לאבחון PCD. במקרים רבים, ניתן להבחין בתסמינים המרמזים על PCD בתקופתהיילודים 26, מה שהופך את HSVMA לאבחון מהיר וקו ראשון עדיף על פני חלופות אחרות.

במחקר שנערך בצפון אמריקה, nNO נבדק והוצע כבדיקת סינון אבחון קו ראשון עבור PCD27. למרות שדווח כי הספציפיות והרגישות קרובות לאלה של HSVMA (0.98/0.79), יש לציין כי החולה הצעיר ביותר היה בן 5.1, והגיל הממוצע היה אפילו גבוה בהרבה. יש לציין גם כי מספר חוקרים דיווחו על ערכי nNO רגילים הקשורים ל- PCD15. לכן, בעוד שיפור בציוד הטכני לביצוע nNO בנבדקים בגיל הגן עדיין בעיצומו, HSVMA נותר אבחון הקו הראשון האמין היחיד עבור PCD, ותוצאות נורמליות שוללות PCD עם כמעט 100% ודאות בכל קבוצות הגיל.

עם זאת, כדי להפוך למומחה לאבחון PCD באמצעות HSVMA, יש צורך בתפוקה גבוהה של דגימות נורמליות ופתולוגיות, הדורש הכשרה מתאימה וציוד מומחה. זה צריך להיות חובה ויהיה מתגמל עבור מרפאה העוסקת באבחון וטיפול במחלות ריאה נדירות. מכל סיבה שהיא, אם עיבוד הדגימות מהווה מכשול, ניתן להשתמש במקום זאת במרכז עם כוח אדם מיוחד באבחון PCD באמצעות HSVMA. במקרים כאלה, הרופא המטפל יכול לבצע את הצחצוח, ואת הדגימה ניתן לשלוח למרכז האבחון. באופן כללי, יש לנתח את הדגימות בהקדם האפשרי לאחר הצחצוח. עם זאת, מניסיוננו, אם הדגימות מעובדות כראוי (ראו פרוטוקול שלב 1.2), תאי אפיתל נשארים חיוניים ומוכנים לניתוח למשך 24 שעות לפחות לאחר צחצוח20,22. רוב המרכזים המבצעים HSVMA עצמם בדרך כלל מבצעים את הניתוח תוך 4 שעות מהדגימה15. בכל מקרה, ולפני הניתוח הסופי, יש לחמם את הדגימות לטמפרטורת הגוף כדי לחקות תנאים אופטימליים, in vivo.

כפי שתואר קודם לכן במאמר זה, ישנם מכשולים בתהליך האבחון של PCD באמצעות HSVMA, במיוחד עם מקרים לא חד משמעיים כגון אלה שתוארו בסעיף התוצאות המייצגות (וידאו 7 ווידאו 8). עבור האבחנה הסופית של PCD, קיימות הנחיות המראות כי לפעמים יש צורך בסוללה של אמצעי אבחון שונים 9,10,15, והכי חשוב, שאין בדיקה אחת או שילוב של בדיקות המאאבחנות PCD בוודאות של 100%. עם זאת, יש לעודד כל יחידה המעורבת באבחון וטיפול ב- PCD להשתמש ב- HSVMA ככלי באבחון קו ראשון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מבקשים להביע תודה מיוחדת לאחות הילדים גברת יוהנה יובנקוסקי על עזרתה המצוינת עם הצחצוחים. אנו רוצים גם להביע תודה מיוחדת לפרופסור היימוט עומרן (מרפאת האוניברסיטה מינסטר, UKM) על מתן רשות להשתמש בדמות הסכמטית של תנועה סילארית רגילה מאתר האינטרנט שלהם. לבסוף, ברצוננו להודות למר אלן בראון BA (Hons), PGCE, על הגהת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amoxiciline-clavulanic acid Orion Oyj 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day
Camera Software Hamamatsu HCI Image
Cold pack any for preservation and transport
Differential interference microscope Carl Zeiss Inverted, cell observer microscope
Digitial High Speed Video Camera Hamamatsu Orca Flash 4.0, digital camera type C11440
Dulbecco´s Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10565018 basal cell culture medium
Eppendorf tube Eppendorf 30120086 1.5 mL tube
Glass-bottom microwell dish MatTek P35G-1.5-14-C cuvette for microscopy
Heating Unit Carl Zeiss/PeCon 810-450001 Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control
Interdental brush 0.6 mm Doft 872267 Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag
Objective Carl Zeiss 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective
Small polystyrene box with lid any for transport

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2 (2015).
  2. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135 (2017).
  3. Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237 (2020).
  4. Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
  5. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11 (2014).
  6. Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
  7. Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
  8. Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  9. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090 (2017).
  10. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066 (2019).
  11. Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142 (2019).
  12. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
  13. Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
  14. Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  15. Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
  16. Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
  17. Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
  18. Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
  19. Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
  20. Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
  21. Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
  22. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675 (2014).
  23. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78 (2012).
  24. Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14 (2012).
  25. Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792 (2021).
  26. Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
  27. Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).

Tags

רפואה גיליון 179
ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schultz, R., Peromaa, T.,… More

Schultz, R., Peromaa, T., Lukkarinen, H., Elenius, V. High-speed Video Microscopy Analysis for First-line Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. J. Vis. Exp. (179), e63292, doi:10.3791/63292 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter