Summary
Snelle videomicroscopie-analyse is een relatief eenvoudig uit te voeren, snel, kosteneffectief en, in ervaren handen, een aanzienlijk betrouwbaar hulpmiddel voor eerstelijnsdiagnostiek van primaire ciliaire dyskinesie, dat beschikbaar zou moeten zijn in elk centrum dat betrokken is bij diagnostiek en de behandeling van ernstige longziekten.
Abstract
Primaire ciliaire dyskinesie (PCD) is een aangeboren aandoening die voornamelijk wordt overgeërfd in een autosomaal recessieve eigenschap. De aandoening veroorzaakt verstoring in de beweging van trilharen, wat leidt tot ernstige verslechtering van de mucociliaire klaring (MCC). Als niet gediagnosticeerd of te laat gediagnosticeerd, leidt de aandoening tot de ontwikkeling van bronchiëctasieën en ernstige schade aan de longen op latere leeftijd. De meeste methoden voor het diagnosticeren van PCD zijn tijdrovend en vereisen uitgebreide economische middelen om ze vast te stellen. High-speed videomicroscopie-analyse (HSVMA) is het enige diagnostische hulpmiddel om levende ademhalingscellen met kloppende trilharen in vitro te visualiseren en te analyseren. Het is snel, kosteneffectief en, in ervaren handen, zeer betrouwbaar als diagnostisch hulpmiddel voor PCD. Bovendien zijn klassieke diagnostische maatregelen zoals transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) niet van toepassing op sommige mutaties, omdat morfologische veranderingen afwezig zijn.
Dit artikel beschrijft het proces van het verzamelen van respiratoire epitheelcellen, de verdere voorbereiding van het monster en het proces van HSVMA. We beschrijven ook hoe geborstelde cellen met succes ongedeerd en kloppend kunnen worden gehouden door ze in een voedend medium te houden voor opslag en transport naar de onderzoekslocatie in gevallen waarin een kliniek niet over de apparatuur beschikt om HSVMA uit te voeren. Ook worden video's getoond met pathologische slagpatronen van patiënten met een mutatie in het dyneïnearm zware keten 11-gen (DNAH11), dat niet kan worden gediagnosticeerd met TEM; het resultaat van een niet-overtuigende HSVMA als gevolg van infectie van de bovenste luchtwegen, evenals een mislukt poetsen met superpositie van rode bloedcellen. Met dit artikel willen we elke eenheid die zich bezighoudt met pulmonologiepatiënten en zeldzame longziekten aanmoedigen om HSVMA uit te voeren als onderdeel van hun dagelijkse routinediagnostiek voor PCD of de monsters naar een centrum te sturen dat gespecialiseerd is in het uitvoeren van HSVMA.
Introduction
Primaire ciliaire dyskinesie (PCD) is een zeldzame, erfelijke genetische aandoening, die verstoringen veroorzaakt in de beweging van kloppende trilharen. Als het niet wordt gediagnosticeerd, leidt dit tot ernstige longschade op latere leeftijd als gevolg van ernstige stoornissen van MCC. In het verleden werd de prevalentie geschat op 1:4.000 tot 50.000. Vanwege de gestaag verbeterende diagnostiek en een groeiend bewustzijn van de aandoening, suggereren updates over de prevalentie van PCD dat het veel vaker voorkomt en waarschijnlijk in het bereik van 1: 4.000 tot 20.000 in plaats van 1,2. Patiënten met PCD worden echter nog steeds ondergediagnosticeerd of te laat gediagnosticeerd 1,3. Daarom moeten zuigelingen met congenitale situs inversus en/of heterotaxie of perinatale rhinorrhea, neonatale ademnood, een verstopte neus en voedingsproblemen verdacht worden voor PCD. Op latere leeftijd zijn chronische otitis, terugkerende longontsteking, rhinosinusitis en een chronische, typische natte hoest als gevolg van verminderde MCC de kenmerkende symptomen van PCD, die in combinatie met bronchiëctasieën en verminderde longfunctie doorgaan tot in de volwassenheid2.
Patiënten waarvan wordt vermoed dat ze PCD hebben, kunnen worden gediagnosticeerd met behulp van verschillende diagnostische hulpmiddelen. TEM is in het verleden beschouwd als de gouden standaard voor eerstelijns diagnostiek. Tot 30% van de PCD-gevallen vertoont echter geen abnormale ultrastructuur 1,3,4,5,6, wat een andere diagnostische aanpak vereist. Daarom suggereren een groeiend aantal centra en de richtlijnen van de European Respiratory Society (ERS) een combinatie van nasaal stikstofmonoxide (nNO) en HSVMA als eerstelijnsdiagnostiek 1,7,9,10. HSVMA en nNO zijn ook de meest kosteneffectieve opties bij het identificeren van een patiënt met PCD11. Maar zelfs als genetische tests in de diagnostiek zouden worden opgenomen, moet er rekening mee worden gehouden dat er momenteel geen op zichzelf staande test of combinatie van tests is die PCD met 100% zekerheid kan uitsluiten 8,9,10.
Van de beschikbare diagnostische opties is HSVMA de enige test die zich richt op levende, met trilharen bedekte ademhalingscellen en het ciliaire slagpatroon (CBP) en de ciliaire slagfrequentie (CBF) evalueert. In tegenstelling tot TEM zijn de resultaten van HSVMA snel beschikbaar, meestal op de dag van testen, terwijl de resultaten van TEM maanden nadat het monster is genomen, kunnen aankomen. HSVMA kan voor alle leeftijdsgroepen worden toegepast, terwijl nNO een hoge mate van naleving vereist; pogingen om het te gebruiken onder de leeftijd van 5 jaar zijn meestal niet succesvol10. In ervaren handen heeft HSVMA een uitstekende gevoeligheid en specificiteit om PCD te diagnosticeren bij respectievelijk 100% en 96%,12.
Dit artikel beschrijft de stapsgewijze procedure om HSVMA uit te voeren, inclusief het oogsten van met trilharen bedekte ademhalingscellen uit het inferieure turbinaat van de neus, het behoud van geoogste cellen in een celvoederend medium voor transport naar de plaats van onderzoek en het proces van microscopische video-analyse om CBF en CBP te bepalen. Daarnaast worden enkele videoclips van patiënten getoond, waarin normale CCP's en CBF's worden vergeleken met abnormale trilharenfunctie (Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7 en Video 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische verklaring:
Deze studie werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie (69/2017) en werd uitgevoerd in overeenstemming met de verklaring van Helsinki.
1. Verzameling en transport van respiratoire epitheelcellen
- Borstelen
- Dien vóór het poetsen een twee weken durende kuur oraal amoxicilline-clavulaanzuur toe aan de patiënt om biofilms uit te roeien die de trilharenfunctie verstoren. Zorg ervoor dat het antibioticum 2 dagen voor de procedure wordt beëindigd.
- Om een overlay van slijmmateriaal op de geborstelde epitheelcelstroken te verminderen, vraagt u de patiënt om zijn neus grondig te snuiten. Vraag ouders om hun kleine kinderen te helpen hun neus te snuiten.
- Gebruik voor het borstelen een interdentale borstel van 0,6 mm (zie de tabel met materialen). Houd het hoofd van de patiënt met één hand gefixeerd en borstel met de andere hand het inferieure turbinaat van beide neusgaten om voldoende epitheelcelstrips te verzamelen.
OPMERKING: Een lichte weerstand wordt meestal ervaren bij het inbrengen van de interdentale borstel diep onder het inferieure turbinaat. Nasaal borstelen wordt uitgevoerd door snel draaien en plukken gedurende ongeveer 2 s. Langer en intens poetsen kan anders ernstige epitheliale letsel en opeenvolgende epistaxis veroorzaken. - Als bronchoscopie is gepland om andere redenen dan vermoedelijke PCD, verzamel dan monsters tijdens bronchoscopie door het carina of bronchiale epitheel te poetsen of door biopsie13.
- Laat de geoogste celreepjes vallen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met daarin het celvoedende Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
OPMERKING: Epitheelcelstrips laten de borstel meestal gemakkelijker vallen door de borstel tegen de buiswand te gooien en te draaien. - Sluit het deksel van de microcentrifugebuis en houd de buis tegen een lichtbron. Schud de buis om geoogste celstroken en conglomeraten te ontdekken.
- Transport van het specimen
- Plaats de microcentrifugebuizen in een goed gesloten polystyreendoos en zorg ervoor dat het deksel van de buizen goed gesloten is en de buizen in de doos worden bevestigd.
- Voeg een cold pack toe; vermijd echter het bevriezen van het monster.
OPMERKING: De optimale temperatuur voor het bewaren van het monster vóór onderzoek is ongeveer 4-8 °C (39,2-46,4 °F). - Zorg ervoor dat de bewaarde monsters gedurende de volgende 24 uur worden geanalyseerd.
OPMERKING: In deze experimenten was de gemiddelde tijd tussen borstelen en HSVMA 3 uur.
2. High-speed video microscopie analyse (HSVMA)
- Videomicroscopie van de monsters
- Na ontvangst van de microcentrifugebuizen met de monsters, verwarmt u ze tot 37 °C (98,6 °F) om een optimale, in vivo-achtige omgeving na te bootsen.
- Als de microscoop is uitgerust met een verwarmingseenheid, plaatst u de buizen onder de motorkap en warmt u ze daar op. U kunt ook een incubator gebruiken om de monsters op te warmen.
- Start de camera en de software van de video-eenheid op de pc.
- Neem met behulp van een pipet een kleine hoeveelheid van het monster en plaats twee druppels in een cuvette of glazen schaal (zie de tabel met materialen). Bedek de cuvette of schaal met een deksel en leg deze onder de microscoop.
- Gebruik voor de evaluatie van de monsters een differentiële interferentiemicroscoop die is uitgerust met een koudlichtbron en een videocamera die met hoge snelheid (ten minste 200 frames / s) kan opnemen. Gebruik een olie-onderdompelingslens met een vergroting van 100x en breng een druppel onderdompelingsolie op het oppervlak van de optiek.
OPMERKING: Microscopen met een lens die van onderaf nadert, worden aanbevolen. - Benader de bodem van de schaal met de microscooplens en zoek naar celclusters zonder rode bloedcellen en met een laag slijmgehalte. Nadat je een representatieve interesseregio (ROI) hebt gevonden, richt je je op één specifieke groep kloppende trilharen met de grootste trilharenbewegingen en neem je een videosequentie op. Registreer cellen met kloppende trilharen zijwaarts en van bovenaf. Zoek daarna naar een ander representatief cluster van cellen en herhaal de opname.
OPMERKING: De met trilharen gecoate cellen moeten worden onderzocht onder een vergroting van 1.000x en kloppende trilharen moeten worden opgenomen met een digitale high-speed video (DHSV) camera ingesteld op een framesnelheid van 200/s of meer (256/s in dit protocol). Omdat de gegevens verkregen uit de opgenomen videoclips veel ruimte op de harde schijf vereisen, wordt een externe SSD-harde schijf aanbevolen.
- Analyse van videosequenties
- Als u CBF en CBP wilt bepalen, speelt u de videoclips frame voor frame af.
- Om CBF te bepalen, stelt u de framesnelheid in slow motion in met 15 frames/s en telt u 10 opeenvolgende beats.
- Noteer het aantal frames dat voorbijgaat tijdens een enkele cyclus van 10 slagen en voeg het resultaat in Eq (1) in. Bepaal de frequentie door het gemiddelde van alle geregistreerde trilharenslagcycli te berekenen en vergelijk het resultaat met de referentiewaarden voor leeftijd (zie tabel 1)14.
(1)
Waarbij X het aantal frames is dat voorbij komt tijdens een cyclus van 10 slagen. - Voor het evalueren van CBP, kijk of de beweging van de kloppende trilharen in het volledige bereik is (zie figuur 1) en gesynchroniseerd. Laat twee onafhankelijke operatoren het CBP evalueren om selectiebias te voorkomen.
- Rapporteer de resultaten van de HSVMA-analyse als compatibel, onwaarschijnlijk of niet overtuigend met PCD.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Video 1 en Video 2 tonen een normale controle waarbij CBF en CBP zich in het normale bereik bevinden (zie figuur 1). Video 3, Video 4, Video 5 en Video 6 vertegenwoordigen twee gevallen van PCD-patiënten met een homozygote mutatie in het DNAH11-gen (c.2341G > A; p. Glu781Lys)3. Deze representatieve video's werden gekozen omdat fenotypen van mutaties in het DNAH11-gen opmerkelijk zijn omdat ze niet door TEM kunnen worden gediagnosticeerd vanwege de afwezigheid van morfologische veranderingen 3,4,5.
Video 3 toont het klassieke stijve, minimaal bewegende patroon van ciliaire beat compatibel met PCD. Het normale, full-range patroon dat in Video 1 en Video 2 wordt getoond, ontbreekt (zie figuur 1). Video 4 toont een sequentie van dezelfde patiënt (Video 3) maar dan van bovenaf opgenomen. Video 5 en Video 6 tonen een hyperkinetisch, ineffectief fenotype van kloppende trilharen die ook compatibel zijn met PCD bij patiënten die een mutatie in het DNAH11-gen dragen. Het CBF was zo hoog dat het niet kon worden vastgesteld. Video 6 is van dezelfde patiënt (Video 5) maar van bovenaf opgenomen. Het CBP is abnormaal en vertoont niet de volledige beweging van gezonde trilharen (zie figuur 1, video 1 en video 2).
Video 7 en Video 8 tonen een pathologisch CBF en CBP zijwaarts (Video 7) en van bovenaf (Video 8) van een patiënt die lijdt aan terugkerende, bovenste luchtweginfecties; PCD kon echter niet worden vastgesteld. Bij 10 Hz blijft het CBF iets onder het normale leeftijdsbereik (zie tabel 1) en het CBP is abnormaal in vergelijking met het normale CBP van de controlevideosequentie (video 1, video 2 en figuur 1), met een roterende ciliaire beweging. De zaak is niet overtuigend en verdere diagnostische maatregelen, waaronder nNO, TEM en genetische tests, moeten worden overwogen, hoewel het klinische beeld van de patiënt suggestief is voor PCD.
Als de poetsprocedure rigoureus wordt uitgevoerd, kan het epitheel van de neus gewond raken en kan epistaxis optreden. Als er te veel bloedcellen in het monster zitten, kan geen HSVMA-analyse worden uitgevoerd omdat trilhaarepitheelcellen bedekt zijn met een coating van rode bloedcellen, zoals te zien is in video 9.
Figuur 1: Normale ciliaire beroerte. Ciliaire beroerte van een gezond individu met het volledige bereik van een normale voorwaartse- en herstelslag. De effectieve slag (donkerblauw) beweegt op een whiplash-manier van links naar rechts. De herstelslag (lichtblauw) verplaatst de trilharen van rechts naar links terug naar de startpositie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Normale trilharenbeweging van een patiënt zonder PCD, zijdelings gezien. Afkorting: PCD = Primaire Ciliaire Dyskinesie. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Normale trilharenbeweging van een patiënt zonder PCD, van bovenaf. Afkorting: PCD = Primaire Ciliaire Dyskinesie. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 3: Videosequentie zijwaarts van een PCD-patiënt met een mutatie in het DNAH11-gen (c.2341G > A p. Glu781Lys)3, met stijve, bijna immotiele trilharen. Afkortingen: PCD = Primaire Ciliaire Dyskinesie; DNAH11 = dyneïne arm zware keten 11 gen. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 4: Videosequentie van dezelfde PCD-patiënt (Video 3) van bovenaf opgenomen. Afkorting: PCD = Primaire Ciliaire Dyskinesie. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 5: Videosequentie zijwaarts van een PCD-patiënt met een totaal ander, hyperkinetisch maar inefficiënt patroon van kloppende trilharen. De patiënt was lid van dezelfde familie en met dezelfde mutatie als de patiënt in video 3 en video 4. Afkorting: PCD = Primaire Ciliaire Dyskinesie. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 6: Videosequentie van dezelfde PCD-patiënt (Video 5), van bovenaf opgenomen. Afkorting: PCD = Primaire Ciliaire Dyskinesie. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 7: Videosequentie van abnormale, ongecoördineerde en langzame trilharenbeweging bij een PCD-patiënt die lijdt aan een recidiverende bovensteweginfectie. Afkorting: PCD = Primaire Ciliaire Dyskinesie. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 8: Videosequentie van dezelfde PCD-patiënt (Video 7) van bovenaf. Afkorting: PCD = Primaire Ciliaire Dyskinesie. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 9: Videosequentie van een monster, dat niet kon worden geanalyseerd vanwege onzorgvuldig poetsen, wat leidde tot epistaxis en superpositie van rode bloedcellen. Klik hier om deze video te downloaden.
| Ciliaire beatfrequentie (Hz)* | ||||
| Leeftijd (jaren) | Bedoelen | SD | 5e, 95e centielen | Dyskinetisch kloppende randen (%) † |
| 0-6 | 12.9 | 2.3 | 10.0, 18.1 | 10.4 (0.0, 36.8) |
| 7-12 | 12.9 | 1.4 | 10.9, 15.0 | 9.1 (0.0, 40.3) |
| 13-18 | 12.6 | 1.7 | 10.9, 15.3 | 24.8 (0.0, 56.9) |
| ≥19 | 11.5 | 2.8 | 7.7, 15.5 | 5.8 (0.0, 24.3) |
| * Gemiddelde ciliaire slagfrequentie, standaarddeviatie (SD) en5e en95e percentiel | ||||
| †Gemiddelde (5e, 95e percentielen) percentage randen met gebieden van ciliaire dyskinesie vertonen | ||||
Tabel 1: Normale beatfrequenties. Normale, leeftijdsgebonden, ciliaire slagfrequentie. Deze tabel is aangepast van Chilvers et al.14. * Gemiddelde ciliaire slagfrequentie, SD en5e en95e percentielen. †Mean (5e, 95e percentielen) percentage van de randen vertonen gebieden van ciliaire dyskinesie. Afkorting: SD = standaarddeviatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt het diagnostische proces voor PCD met behulp van HSVMA beschreven en besproken in het licht van de eerstelijns diagnostiek. Ondanks dat het relatief eenvoudig vast te stellen is,kosteneffectief 11 en een betrouwbare methode in ervaren handen12, is HSVMA geen diagnostische maatregel zonder valkuilen. Abnormale CBF en CBP kunnen te wijten zijn aan secundaire infectie, wat leidt tot ontsteking van de broncho-respiratoire epithelia15, en om dezelfde reden kunnen rokende personen abnormale beatfrequenties hebben16,17. Bovendien moet cystische fibrose worden uitgesloten voordat de diagnose PCD wordt vastgesteld. Voordat de analyse van een patiëntenmonster compatibel wordt geacht met PCD, moeten abnormale resultaten worden bevestigd met twee onafhankelijk verzamelde monsters, waarvoor nieuwe borstelingen en een heranalyse van CBF en CBP nodig zijn. Dit kan een uitdaging zijn, vooral met kinderen. Daarom raden sommige onderzoekers aan om epitheelcellen te kweken die zijn verkregen uit de eerste poetssessie om herhaalde borstelingen te voorkomen 9,15.
Hoewel bronchoscopie niet de voorkeur heeft voor het diagnosticeren van PCD, kunnen monsters, als deze om andere redenen dan PCD wordt uitgevoerd, ook onder anesthesie worden verkregen door het bronchiale epitheel te poetsen of een biopsiete nemen 13. Secundaire infectie kan de ciliaire beweging en slagfrequentie veranderen. Om deze ongewenste effecten te verminderen, wordt aanbevolen om een kuur van twee weken toe te dienen met een breedspectrum oraal antibioticum zoals amoxicilline plus clavulaanzuur of een cefalosporine om zich te richten op veel voorkomende respiratoire pathogenen. Ondanks het feit dat ze aanzienlijke voordelen hebben bij de behandeling van PCD18, moeten macroliden waarschijnlijk voor dit doel worden vermeden, omdat ze CBF kunnen veranderen als gevolg van een prokinetisch effect op het kloppen van trilharen19. Verder, ongeacht het gebrek aan bewijs in de literatuur, moeten antibiotica ten minste 48 uur vóór het poetsen en analyseren worden gestopt om enige impact op CBF te voorkomen. Er kon geen substantiële impact van antibiotica worden waargenomen op CBF of CBP in experimenten waarbij monsters verkregen door borstelen of biopsie werden gekweekt in vloeistoffen die antibiotica bevatten 20,21,22.
Hoewel HSVMA wordt beschouwd als de meest nauwkeurige en reproduceerbare techniek in Europa, draagt het het risico van bedieningsfouten als gevolg van selectiebias en de hierboven genoemde problemen15. Daarom hebben verschillende groepen onlangs softwareoplossingen ontwikkeld om de analyse van digitale afbeeldingen te automatiseren om dit probleem op telossen 23,24,25. Omdat deze automatisering nog in ontwikkeling is, gebruiken de auteurs twee onafhankelijke, deskundige operators om CBF en CBP handmatig te analyseren, waardoor uitstekende en betrouwbare resultaten worden bereikt.
De representatieve resultaten van dit artikel tonen videoclips van patiënten met een mutatie in het DNAH11-gen. Mutaties in dit gen vertonen een normale ultrastructuur en patiënten met deze mutatie kunnen daarom niet door TEM worden gediagnosticeerd. De normale ultrastructuur van trilharen gedemonstreerd door TEM kan worden gezien in maximaal 30% van alle PCD-gevallen6. Bovendien kan nNO normaal zijn met het hyperkinetische fenotype van deze mutatie (Video 5 en Video 6), waardoor HSVMA, samen met genetische tests, het enige betrouwbare diagnostische hulpmiddelis 3,8. Bovendien vormen pediatrische patiënten het primaire doelwit voor PCD-diagnostiek. In veel gevallen kunnen symptomen die wijzen op PCD worden waargenomen in de neonatale periode26, waardoor HSVMA een snelle, eerstelijns diagnostische maatregel is die de voorkeur verdient boven andere alternatieven.
In een Noord-Amerikaanse studie is nNO onderzocht en voorgesteld als een eerstelijns diagnostische screeningstest voor PCD27. Hoewel specificiteit en sensitiviteit dicht bij die van HSVMA (0,98/0,79) lagen, moet worden opgemerkt dat de jongste patiënt 5,1 jaar oud was en de gemiddelde leeftijd zelfs veel hoger was. Er moet ook worden vermeld dat verschillende onderzoekers normale nNO-waarden hebben gemeld die verband houden met PCD15. Daarom, terwijl een verbetering van de technische apparatuur om nNO uit te voeren bij kleuters nog steeds aan de gang is, blijft HSVMA de enige betrouwbare eerstelijnsdiagnose voor PCD, en normale resultaten sluiten PCD uit met bijna 100% zekerheid in alle leeftijdsgroepen.
Om echter een expert te worden voor het diagnosticeren van PCD met behulp van HSVMA, is een hoge doorvoer van normale en pathologische monsters nodig, wat de juiste training en specialistische apparatuur vereist. Dit zou verplicht moeten zijn en zal lonend zijn voor een kliniek die zich bezighoudt met diagnostiek en behandeling van zeldzame longziekten. Om welke reden dan ook, als de verwerking van de monsters een obstakel vormt, kan in plaats daarvan een centrum met gespecialiseerd personeel in PCD-diagnostiek met behulp van HSVMA worden gebruikt. In dergelijke gevallen kan de behandelend arts het poetsen uitvoeren en kan het monster naar het diagnosecentrum worden gestuurd. Over het algemeen moeten de monsters zo snel mogelijk na het poetsen worden geanalyseerd. Onze ervaring is echter dat als de monsters op de juiste manier worden verwerkt (zie protocolstap 1.2), epitheelcellen vitaal blijven en klaar voor analyse gedurende ten minste 24 uur na het poetsenvan 20,22. De meeste centra die HSVMA zelf uitvoeren, voeren de analyse meestal uit binnen 4 uur na bemonstering15. In ieder geval, en vóór de definitieve analyse, moeten de monsters worden opgewarmd tot lichaamstemperatuur om optimale, in vivo omstandigheden na te bootsen.
Zoals eerder in dit artikel beschreven, zijn er valkuilen in het diagnostische proces van PCD met behulp van HSVMA, vooral met niet-overtuigende gevallen zoals die zijn beschreven in de sectie representatieve resultaten (Video 7 en Video 8). Voor de uiteindelijke diagnose van PCD zijn richtlijnen beschikbaar die aantonen dat soms een batterij verschillende diagnostische maatregelen nodig is 9,10,15, en vooral dat er geen enkele test of combinatie van tests is die PCD met 100% zekerheid diagnosticeren. Niettemin moet elke eenheid die betrokken is bij de diagnose en behandeling van PCD worden aangemoedigd om HSVMA te gebruiken als een hulpmiddel bij eerstelijnsdiagnostiek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen in het bijzonder de kinderverpleegkundige mevrouw Johanna Juvankoski bedanken voor haar uitstekende hulp bij het poetsen. We willen ook professor Heymut Omran (Universiteitskliniek Münster, UKM) speciaal bedanken voor het verlenen van toestemming om de schematische figuur van normale ciliaire beweging van hun website te gebruiken. Tot slot willen we de heer Alan Brown BA (Hons), PGCE, bedanken voor het proeflezen van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amoxiciline-clavulanic acid | Orion Oyj | 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day | |
| Camera Software | Hamamatsu | HCI Image | |
| Cold pack | any | for preservation and transport | |
| Differential interference microscope | Carl Zeiss | Inverted, cell observer microscope | |
| Digitial High Speed Video Camera | Hamamatsu | Orca Flash 4.0, digital camera type C11440 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10565018 | basal cell culture medium |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL tube |
| Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | cuvette for microscopy |
| Heating Unit | Carl Zeiss/PeCon | 810-450001 | Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control |
| Interdental brush 0.6 mm | Doft | 872267 | Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag |
| Objective | Carl Zeiss | 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective | |
| Small polystyrene box with lid | any | for transport |
References
- Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2 (2015).
- Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135 (2017).
- Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237 (2020).
- Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
- Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11 (2014).
- Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
- Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
- Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
- Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090 (2017).
- Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066 (2019).
- Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142 (2019).
- Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
- Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
- Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
- Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
- Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
- Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
- Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
- Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
- Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
- Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675 (2014).
- Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78 (2012).
- Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14 (2012).
- Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792 (2021).
- Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
- Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).
