Summary
Højhastigheds videomikroskopianalyse er en relativt let at udføre, hurtig, omkostningseffektiv og i erfarne hænder et betydeligt pålideligt værktøj til førstelinjediagnostik af primær ciliær dyskinesi, som bør være tilgængelig i alle centre, der er involveret i diagnostik og behandling af alvorlige lungesygdomme.
Abstract
Primær ciliær dyskinesi (PCD) er en medfødt lidelse, der overvejende er arvet i et autosomalt recessivt træk. Lidelsen forårsager forstyrrelse i bevægelsen af cilier, hvilket fører til alvorlig svækkelse af mucociliær clearance (MCC). Hvis udiagnosticeret eller diagnosticeret for sent, fører tilstanden til udvikling af bronchiectasis og alvorlig skade på lungerne senere i livet. De fleste af metoderne til diagnosticering af PCD er tidskrævende og kræver omfattende økonomiske ressourcer for at etablere dem. Højhastigheds videomikroskopianalyse (HSVMA) er det eneste diagnostiske værktøj til at visualisere og analysere levende åndedrætsceller med slående cilier in vitro. Det er hurtigt, omkostningseffektivt og i erfarne hænder meget pålideligt som et diagnostisk værktøj til PCD. Derudover er klassiske diagnostiske foranstaltninger såsom transmissionselektronmikroskopi (TEM) ikke anvendelige for nogle mutationer, da morfologiske ændringer er fraværende.
Dette papir beskriver processen med at indsamle respiratoriske epitelceller, den videre forberedelse af prøven og processen med HSVMA. Vi beskriver også, hvordan børstede celler med succes kan holdes uskadte og slå ved at opbevare dem i et nærende medium til opbevaring og transport til undersøgelsesstedet i tilfælde, hvor en klinik ikke har udstyret til at udføre HSVMA. Der vises også videoer med patologiske slagmønstre fra patienter med en mutation i dyneinarmens tunge kæde 11-gen (DNAH11), som ikke kan diagnosticeres med TEM; resultatet af en ufattelig HSVMA på grund af infektion i de øvre luftveje samt en mislykket børstning med overlejring af røde blodlegemer. Med denne artikel vil vi gerne opfordre alle enheder, der beskæftiger sig med pulmonologiske patienter og sjældne lungesygdomme, til at udføre HSVMA som en del af deres daglige rutinediagnostik for PCD eller sende prøverne over til et center med speciale i at udføre HSVMA.
Introduction
Primær ciliær dyskinesi (PCD) er en sjælden, arvelig genetisk lidelse, som forårsager forstyrrelser i bevægelsen af at slå cilier. Hvis det ikke diagnosticeres, fører det til alvorlig lungeskade senere i livet på grund af alvorlig svækkelse af MCC. Tidligere er dens udbredelse blevet anslået til at ligge i intervallet 1: 4.000 til 50.000. På grund af støt forbedret diagnostik og en voksende bevidsthed om tilstanden tyder opdateringer om forekomsten af PCD på, at det kan være meget mere almindeligt og sandsynligvis i intervallet 1: 4.000 til 20.000 i stedet 1,2. Patienter med PCD er dog stadig underdiagnosticeret eller diagnosticeret for sent 1,3. Derfor bør spædbørn med enten medfødt situs inversus og/eller heterotaksi eller perinatal rhinoré, neonatal åndedrætsbesvær, en blokeret næse og fodringsvanskeligheder mistænkes for PCD. Senere i livet er kronisk otitis, tilbagevendende lungebetændelse, rhinosinusitis og en kronisk, typisk våd hoste på grund af nedsat MCC de kendetegnende symptomer på PCD, som i kombination med bronkiektase og nedsat lungefunktion fortsætter ind i voksenalderen2.
Patienter, der mistænkes for at have PCD, kan diagnosticeres ved hjælp af forskellige diagnostiske værktøjer. TEM er tidligere blevet betragtet som guldstandarden for førstelinjediagnostik. Imidlertid viser op til 30% af PCD-tilfælde ikke unormal ultrastruktur 1,3,4,5,6, hvilket kræver en anden diagnostisk tilgang. Derfor foreslår et stigende antal centre og retningslinjerne fra European Respiratory Society (ERS) en kombination af nasal nitrogenoxid (nNO) og HSVMA som førstelinjediagnostik 1,7,9,10. HSVMA og nNO er også de mest omkostningseffektive muligheder for at identificere en patient med PCD11. Men selv hvis genetisk testning var inkluderet i diagnosen, skal det huskes, at der i øjeblikket ikke er nogen selvstændig test eller kombination af tests, der kan udelukke PCD med 100% sikkerhed 8,9,10.
Ud af de tilgængelige diagnostiske muligheder er HSVMA den eneste test, der fokuserer på levende, ciliabelagte åndedrætsceller og evaluerer ciliary beat pattern (CBP) og ciliary beat frequency (CBF). I modsætning til TEM er resultaterne af HSVMA hurtigt tilgængelige, normalt på testdagen, mens resultaterne af TEM kan ankomme måneder efter, at prøven er taget. HSVMA kan anvendes til alle aldersgrupper, mens nNO kræver en høj grad af overholdelse; forsøg på at bruge det under 5 år er normalt mislykket10. I erfarne hænder har HSVMA fremragende følsomhed og specificitet til at diagnosticere PCD ved henholdsvis 100% og 96%12.
Dette papir beskriver den trinvise procedure til udførelse af HSVMA, herunder høst af ciliabelagte åndedrætsceller fra næsens ringere turbinat, bevarelse af høstede celler i et cellenærende medium til transport til undersøgelsesstedet og processen med mikroskopisk videoanalyse til bestemmelse af CBF og CBP. Derudover vises nogle videoklip fra patienter, der sammenligner normale CBP'er og CBF'er med unormal ciliafunktion (Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7 og Video 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk erklæring:
Denne undersøgelse blev godkendt af den lokale etiske komité (69/2017) og blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen.
1. Indsamling og transport af respiratoriske epitelceller
- Børstning
- Før børstning skal du administrere et to-ugers kursus af oral amoxicillin-clavulansyre til patienten for at udrydde biofilm, der forstyrrer ciliafunktionen. Sørg for, at antibiotika afsluttes 2 dage før proceduren.
- For at mindske et overlay af slimhindemateriale på de børstede epitelcellestrimler skal du bede patienten om at blæse næsen grundigt. Bed forældre om at hjælpe deres små børn med at blæse næse.
- Til børstning skal du bruge en interdental børste på 0,6 mm størrelse (se materialetabellen). Hold patientens hoved fastgjort med den ene hånd, og børst med den anden hånd det ringere turbinat i begge næsebor for at samle tilstrækkelige epitelcellestrimler.
BEMÆRK: En lille modstand opleves normalt, når du indsætter den interdentale børste dybt under det ringere turbinat. Nasal børstning udføres ved hurtig drejning og plukning i ca. 2 s. Længere og intens børstning kan ellers forårsage alvorlig epitelskade og på hinanden følgende epistaxis. - Hvis bronkoskopi er planlagt af andre årsager end mistanke om PCD, indsamles prøver under bronkoskopi ved børstning af carina eller bronchial epitel eller ved biopsi13.
- Slip de høstede cellestrimler i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, der indeholder det cellenærende Dulbeccos modified Eagle Medium (DMEM).
BEMÆRK: Epitelcellestrimler falder normalt lettere af børsten ved at kaste og dreje børsten mod rørvæggen. - Luk låget på mikrocentrifugerøret, og hold røret mod en lyskilde. Ryst røret for at opdage høstede cellestrimler og konglomerater.
- Transport af prøven
- Anbring mikrocentrifugerørene i en tæt lukket polystyrenkasse, og sørg for, at låget på rørene er korrekt lukket, og rørene er fastgjort inde i kassen.
- Tilsæt en kold pakke; Undgå dog at fryse prøven.
BEMÆRK: Den optimale temperatur til konservering af prøven inden undersøgelse er ca. 4-8 °C (39,2-46,4 °F). - Sørg for, at de konserverede prøver analyseres i løbet af de næste 24 timer.
BEMÆRK: I disse eksperimenter var den gennemsnitlige tid mellem børstninger og HSVMA 3 timer.
2. Højhastigheds videomikroskopianalyse (HSVMA)
- Videomikroskopi af prøverne
- Efter at have modtaget mikrocentrifugerørene, der indeholder prøverne, opvarmes de op til 37 ° C (98,6 ° F) for at efterligne et optimalt, in vivo-lignende miljø.
- Hvis mikroskopet er udstyret med en varmeenhed, skal du placere rørene under emhætten og varme dem op der. Alternativt kan du bruge en inkubator til at opvarme prøverne.
- Start kameraet og softwaren til videoenheden på pc'en.
- Brug en pipette til at tage en lille mængde af prøven og anbringe to dråber i en kuvette eller glasbundsskål (se materialetabellen). Dæk kuvetten eller fadet med et låg og læg det under mikroskopet.
- Til evaluering af prøverne skal du bruge et differentielt interferensmikroskop udstyret med en koldlyskilde og et videokamera, der er i stand til at optage ved høj hastighed (mindst 200 billeder / s). Brug en olienedsænkningslinse med en 100x forstørrelse og læg en dråbe nedsænkningsolie på overfladen af optikken.
BEMÆRK: Mikroskoper med et objektiv, der nærmer sig nedenfra, anbefales. - Gå til bunden af skålen med mikroskoplinsen og søg efter celleklynger uden røde blodlegemer og med lavt slimindhold. Efter at have fundet en repræsentativ interesseregion (ROI), skal du fokusere på en bestemt gruppe af slå cilier med de største ciliabevægelser og optage en videosekvens. Optag celler med at slå cilia sidevis og ovenfra. Derefter skal du søge efter en anden repræsentativ klynge af celler og gentage optagelsen.
BEMÆRK: De ciliabelagte celler skal undersøges under en 1.000x forstørrelse, og slå cilia skal optages med et digitalt højhastighedsvideokamera (DHSV) indstillet på en billedhastighed på 200 / s eller mere (256 / s i denne protokol). Fordi de data, der er opnået fra de optagede videoklip, kræver meget plads på harddisken, anbefales en ekstern SSD-harddisk.
- Analyse af videosekvenser
- For at bestemme CBF og CBP skal du afspille videoklippene tilbage ramme for ramme.
- For at bestemme CBF skal du indstille billedhastigheden til slowmotion med 15 billeder / s og tælle 10 på hinanden følgende slag.
- Optag antallet af billeder, der passerer i løbet af en enkelt cyklus på 10 slag, og indsæt resultatet i Eq (1). Bestem frekvensen ved at beregne gennemsnittet af alle registrerede cilia beat-cyklusser og sammenligne resultatet med referenceværdierne for alder (se tabel 1)14.
(1)
Hvor X er antallet af rammer, der passerer forbi i løbet af en cyklus på 10 slag. - For at evaluere CBP skal du holde øje med, om bevægelsen af de slående cilier er i fuldt interval (se figur 1) og synkroniseret. Få to uafhængige aktører til at evaluere CBP for at forhindre udvælgelsesbias.
- Rapporter resultaterne af HSVMA-analysen for at være enten kompatible, usandsynlige eller ufattelige med PCD.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Video 1 og video 2 viser en normal kontrol, hvor CBF og CBP ligger i normalområdet (se figur 1). Video 3, Video 4, Video 5 og Video 6 repræsenterer to tilfælde af PCD-patienter med en homozygot mutation i DNAH11-genet (c.2341G > A; s. Glu781Lys)3. Disse repræsentative videoer blev valgt, fordi fænotyper af mutationer i DNAH11-genet er bemærkelsesværdige, fordi de ikke kan diagnosticeres med TEM på grund af fraværet af morfologiske ændringer 3,4,5.
Video 3 viser det klassiske stive, minimalt bevægelige mønster af ciliary beat, der er kompatibelt med PCD. Det normale mønster i fuld rækkevidde, der vises i video 1 og video 2 , er fraværende (se figur 1). Video 4 viser en sekvens af den samme patient (Video 3), men optaget ovenfra. Video 5 og Video 6 viser en hyperkinetisk, ineffektiv fænotype af at slå cilier, der også er kompatible med PCD hos patienter, der bærer en mutation i DNAH11-genet . CBF var så høj, at den ikke kunne bestemmes. Video 6 er fra samme patient (Video 5), men optaget ovenfra. CBP er unormal og viser ikke fuld rækkevidde af sunde cilier (se figur 1, video 1 og video 2).
Video 7 og Video 8 viser en patologisk CBF og CBP sidevis (Video 7) og ovenfra (Video 8) fra en patient, der har lidt af tilbagevendende infektioner i de øvre luftveje; PCD kunne imidlertid ikke etableres. Ved 10 Hz forbliver CBF lidt under det normale aldersinterval (se tabel 1), og CBP er unormal sammenlignet med den normale CBP for kontrolvideosekvensen (Video 1, Video 2 og Figur 1), der viser en roterende ciliær bevægelse. Sagen er ikke entydig, og yderligere diagnostiske foranstaltninger, herunder nNO, TEM og genetisk testning, skal overvejes, selvom det kliniske billede af patienten tyder på PCD.
Hvis børstningsproceduren udføres strengt, kan næsens epitel blive såret, og epistaxis kan forekomme. Hvis der er for mange blodlegemer i prøven, kan HSVMA-analyse ikke udføres, fordi cilierede epitelceller er dækket af en belægning af røde blodlegemer, som det kan ses i video 9.
Figur 1: Normalt ciliært slagtilfælde. Ciliary slagtilfælde af et sundt individ, der viser hele spektret af et normalt fremad- og restitutionsslag. Det effektive slag (mørkeblå) bevæger sig fra venstre mod højre på en piskesmældsmåde. Genopretningsslaget (lyseblåt) flytter cilierne tilbage fra højre mod venstre til startpositionen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: Normal cilia bevægelse af en patient uden PCD, set sidevis. Forkortelse: PCD = Primær ciliær dyskinesi. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Normal cilia bevægelse af en patient uden PCD, ovenfra. Forkortelse: PCD = Primær ciliær dyskinesi. Klik her for at downloade denne video.
Video 3: Videosekvens sidevis af en PCD-patient med en mutation i DNAH11-genet (c.2341G > A s. Glu781Lys)3, der viser stive, næsten immotile cilier. Forkortelser: PCD = Primær ciliær dyskinesi; DNAH11 = dynein arm tung kæde 11 gen. Klik her for at downloade denne video.
Video 4: Videosekvens fra den samme PCD-patient (Video 3) optaget ovenfra. Forkortelse: PCD = Primær ciliær dyskinesi. Klik her for at downloade denne video.
Video 5: Videosekvens sidelæns af en PCD-patient, der viser et helt andet, hyperkinetisk, men ineffektivt mønster med at slå cilier. Patienten var medlem af samme familie og med samme mutation som patienten i Video 3 og Video 4. Forkortelse: PCD = Primær ciliær dyskinesi. Klik her for at downloade denne video.
Video 6: Videosekvens fra den samme PCD-patient (Video 5), optaget ovenfra. Forkortelse: PCD = Primær ciliær dyskinesi. Klik her for at downloade denne video.
Video 7: Videosekvens af unormal, ukoordineret og langsom ciliebevægelse hos en PCD-patient, der lider af tilbagevendende øvre luftvejsinfektion. Forkortelse: PCD = Primær ciliær dyskinesi. Klik her for at downloade denne video.
Video 8: Videosekvens fra den samme PCD-patient (Video 7) ovenfra. Forkortelse: PCD = Primær ciliær dyskinesi. Klik her for at downloade denne video.
Video 9: Videosekvens af en prøve, som ikke kunne analyseres på grund af skødesløs børstning, hvilket førte til epistaxis og overlejring af røde blodlegemer. Klik her for at downloade denne video.
| Ciliary beat frekvens (Hz)* | ||||
| Alder (år) | Betyde | SD | 5., 95. centiler | Dyskinetisk slående kanter (%) † |
| 0-6 | 12.9 | 2.3 | 10.0, 18.1 | 10.4 (0.0, 36.8) |
| 7-12 | 12.9 | 1.4 | 10.9, 15.0 | 9.1 (0.0, 40.3) |
| 13-18 | 12.6 | 1.7 | 10.9, 15.3 | 24.8 (0.0, 56.9) |
| ≥19 | 11.5 | 2.8 | 7.7, 15.5 | 5.8 (0.0, 24.3) |
| *Gennemsnitlig ciliary beat-frekvens, standardafvigelse (SD) og 5. og 95. percentiler | ||||
| †Mean (5., 95. percentiler) procentdel af kanter, der udviser områder med ciliær dyskinesi | ||||
Tabel 1: Normale beatfrekvenser. Normal, aldersrelateret, ciliary beat frekvens. Denne tabel blev modificeret fra Chilvers et al.14. *Gennemsnitlig ciliary beat-frekvens, SD og 5. og 95. percentil. †Mean (5., 95. percentiler) procentdel af kanter, der udviser områder med ciliær dyskinesi. Forkortelse: SD = standardafvigelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrives og diskuteres den diagnostiske proces for PCD ved hjælp af HSVMA i lyset af førstelinjediagnostik. På trods af at det er relativt let at etablere,omkostningseffektivt 11 og en pålidelig metode i erfarne hænder12, er HSVMA ikke en diagnostisk foranstaltning uden faldgruber. Unormal CBF og CBP kan skyldes sekundær infektion, hvilket fører til betændelse i broncho-respiratorisk epitel15, og af samme grund kan rygende individer have unormale beatfrekvenser 16,17. Desuden bør cystisk fibrose udelukkes, før diagnosen PCD stilles. Før analysen af en patientprøve vurderes at være kompatibel med PCD, skal unormale resultater bekræftes med to uafhængigt indsamlede prøver, der kræver nye børstninger og en reanalyse af CBF og CBP. Dette kan være udfordrende, især med børn. Derfor anbefaler nogle efterforskere dyrkning af epitelceller opnået fra den første børstningssession for at undgå gentagne børstninger 9,15.
Selvom bronkoskopi ikke er det foretrukne valg til diagnosticering af PCD, hvis det udføres af andre grunde end PCD, kan prøver alternativt opnås under anæstesi ved at børste bronkiepitelet eller tage en biopsi13. Sekundær infektion kan ændre ciliary bevægelse og slå frekvens. For at mindske disse uønskede virkninger anbefales det at administrere et to-ugers kursus med et bredspektret oralt antibiotikum, såsom amoxicillin plus clavulansyre eller et cephalosporin for at målrette mod almindelige respiratoriske patogener. På trods af at de har betydelige fordele ved behandlingen af PCD18, bør makrolider sandsynligvis undgås til dette formål, fordi de kan ændre CBF på grund af en prokinetisk virkning på at slå cilier19. Uanset manglen på dokumentation i litteraturen bør antibiotika desuden stoppes mindst 48 timer før børstning og analyse for at undgå enhver indvirkning på CBF. Der kunne ikke observeres nogen væsentlig indvirkning af antibiotika på CBF eller CBP i forsøg, hvor prøver opnået ved børstning eller biopsi blev dyrket i væsker indeholdende antibiotika 20,21,22.
Selv om HSVMA betragtes som den mest nøjagtige og reproducerbare teknik i Europa, indebærer den en risiko for operatørfejl på grund af udvælgelsesbias og de problemer, der er nævnt ovenfor15. Derfor har flere grupper for nylig udviklet softwareløsninger til automatisering af analyse fra digitale billeder for at overvinde dette problem 23,24,25. Fordi denne automatisering stadig er under udvikling, bruger forfatterne to uafhængige ekspertoperatører til at analysere CBF og CBP manuelt og opnå fremragende og pålidelige resultater.
De repræsentative resultater af dette papir viser videoklip fra patienter med en mutation i DNAH11-genet. Mutationer i dette gen viser en normal ultrastruktur, og patienter med denne mutation kan derfor ikke diagnosticeres med TEM. Den normale ultrastruktur af cilier påvist af TEM kan ses i op til 30 % af alle TILFÆLDE af pcD6. Derudover kan nNO være normal med den hyperkinetiske fænotype af denne mutation (Video 5 og Video 6), hvilket gør HSVMA sammen med genetisk testning til det eneste pålidelige diagnostiske værktøj 3,8. Derudover udgør pædiatriske patienter det primære mål for PCD-diagnostik. I mange tilfælde kan symptomer, der tyder på PCD, observeres i neonatalperioden26, hvilket gør HSVMA til en hurtig, førstelinjediagnostisk foranstaltning, der foretrækkes frem for andre alternativer.
I en nordamerikansk undersøgelse er nNO blevet undersøgt og foreslået som en førstelinje diagnostisk screeningstest for PCD27. Selvom specificitet og følsomhed blev rapporteret at være tæt på HSVMA (0,98 / 0,79), skal det bemærkes, at den yngste patient var 5,1 år gammel, og gennemsnitsalderen var endnu meget højere. Det skal også nævnes, at flere investigatorer har rapporteret normale nNO-værdier forbundet med PCD15. Mens en forbedring af det tekniske udstyr til at udføre nNO i førskolealderen stadig er i gang, er HSVMA derfor fortsat den eneste pålidelige førstelinjediagnostik for PCD, og normale resultater udelukker PCD med næsten 100% sikkerhed i alle aldersgrupper.
For at blive ekspert til diagnosticering af PCD ved hjælp af HSVMA er der imidlertid behov for en høj gennemstrømning af normale og patologiske prøver, hvilket kræver korrekt træning og specialudstyr. Dette bør være obligatorisk og vil være givende for en klinik, der beskæftiger sig med diagnostik og behandling af sjældne lungesygdomme. Af en eller anden grund, hvis behandlingen af prøverne udgør en hindring, kan et center med specialiseret personale inden for PCD-diagnostik ved hjælp af HSVMA anvendes i stedet. I sådanne tilfælde kan den behandlende læge udføre børstningen, og prøven kan sendes over til diagnosecentret. Generelt skal prøverne analyseres så hurtigt som muligt efter børstning. Det er imidlertid vores erfaring, at hvis prøverne behandles korrekt (se protokoltrin 1.2), forbliver epitelceller vitale og klar til analyse i mindst 24 timer efter børstningaf 20,22. De fleste centre, der udfører HSVMA selv, udfører normalt analysen inden for 4 timer efter prøveudtagning15. Under alle omstændigheder og inden endelig analyse skal prøverne opvarmes til kropstemperatur for at efterligne optimale in vivo-forhold.
Som beskrevet tidligere i dette papir er der faldgruber i den diagnostiske proces af PCD ved hjælp af HSVMA, især med ufattelige tilfælde som dem, der er beskrevet i afsnittet om repræsentative resultater (Video 7 og Video 8). For den endelige diagnose af PCD er der retningslinjer tilgængelige, der viser, at nogle gange er et batteri med forskellige diagnostiske foranstaltninger nødvendigt 9,10,15, og vigtigst af alt, at der ikke er nogen enkelt test eller kombination af tests, der diagnosticerer PCD med 100% sikkerhed. Ikke desto mindre bør alle enheder, der er involveret i diagnosticering og behandling af pcD, tilskyndes til at anvende HSVMA som et redskab til førstelinjediagnostik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne udtrykke en særlig tak til den pædiatriske sygeplejerske fru Johanna Juvankoski for hendes fremragende hjælp med børstningerne. Vi vil også gerne udtrykke særlig taknemmelighed til professor Heymut Omran (University Clinic Münster, UKM) for at have givet tilladelse til at bruge det skematiske tal for normal ciliary motion fra deres hjemmeside. Endelig vil vi gerne takke Alan Brown BA (Hons), PGCE, for korrekturlæsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amoxiciline-clavulanic acid | Orion Oyj | 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day | |
| Camera Software | Hamamatsu | HCI Image | |
| Cold pack | any | for preservation and transport | |
| Differential interference microscope | Carl Zeiss | Inverted, cell observer microscope | |
| Digitial High Speed Video Camera | Hamamatsu | Orca Flash 4.0, digital camera type C11440 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10565018 | basal cell culture medium |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL tube |
| Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | cuvette for microscopy |
| Heating Unit | Carl Zeiss/PeCon | 810-450001 | Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control |
| Interdental brush 0.6 mm | Doft | 872267 | Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag |
| Objective | Carl Zeiss | 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective | |
| Small polystyrene box with lid | any | for transport |
References
- Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2 (2015).
- Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135 (2017).
- Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237 (2020).
- Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
- Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11 (2014).
- Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
- Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
- Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
- Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090 (2017).
- Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066 (2019).
- Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142 (2019).
- Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
- Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
- Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
- Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
- Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
- Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
- Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
- Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
- Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
- Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675 (2014).
- Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78 (2012).
- Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14 (2012).
- Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792 (2021).
- Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
- Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).
