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Medicine

कई किडनी रोग माउस मॉडल में पॉलीइथाइलेनिमाइन नैनोकणों का उपयोग करके एक्सोजेनस कृत्रिम रूप से संश्लेषित एमआरएनए मिमिक का वितरण

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63302
Automatic Translation
*1, 1, 1, 1, *1
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम कई गुर्दे रोग माउस मॉडल में एक गैर-वायरल वेक्टर और पॉलीथाइलेनिमाइन नैनोकणों के पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से एक्सोजेनस कृत्रिम रूप से संश्लेषित माइआरएनए को किडनी की नकल करते हैं। इससे गुर्दे में लक्ष्य माइआरएनए की महत्वपूर्ण अतिवृद्धि हुई, जिसके परिणामस्वरूप कई माउस मॉडल में गुर्दे की बीमारी की प्रगति रुक गई।

Abstract

माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए), छोटे नॉनकोडिंग आरएनए (21-25 बेस) जो प्रोटीन में अनुवादित नहीं होते हैं, विभिन्न गुर्दे की बीमारियों में उनके अनुवाद को अस्थिर और बाधित करके बहुत सारे लक्ष्य मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) को रोकते हैं। इसलिए, बहिर्जात कृत्रिम रूप से संश्लेषित माइआरएनए मिमिक द्वारा एमआईआरएनए अभिव्यक्ति का परिवर्तन कई गुर्दे की बीमारियों के विकास को रोकने के लिए एक संभावित उपयोगी उपचार विकल्प है। हालांकि, क्योंकि सीरम आरएनएस तुरंत विवो में व्यवस्थित रूप से प्रशासित बहिर्जात मिआरएनए मिमिक को कम कर देता है, गुर्दे में एमआईआरएनए का वितरण एक चुनौती बनी हुई है। इसलिए, वैक्टर जो बहिर्जात मिआरएनए की रक्षा कर सकते हैं, आरएनएस द्वारा गिरावट से नकल करते हैं और उन्हें गुर्दे तक पहुंचाते हैं, आवश्यक हैं। कई अध्ययनों ने वायरल वैक्टर का उपयोग एक्सोजेनस माइआरएनए मिमिक या इनहिबिटर को किडनी तक पहुंचाने के लिए किया है। हालांकि, वायरल वैक्टर एक इंटरफेरॉन प्रतिक्रिया और / या आनुवंशिक अस्थिरता का कारण बन सकते हैं। इसलिए, वायरल वैक्टर का विकास बहिर्जात मिआरएनए मिमिक या इनहिबिटर के नैदानिक उपयोग के लिए भी एक बाधा है। वायरल वैक्टर के बारे में इन चिंताओं को दूर करने के लिए, हमने पॉलीइथाइलेनिमाइन नैनोकणों (पीईआई-एनपी) के पूंछ नस इंजेक्शन का उपयोग करके गुर्दे में एमआरएनए मिमिक्स देने के लिए एक नॉनवायरल वेक्टर विधि विकसित की, जिसके कारण गुर्दे की बीमारी के कई माउस मॉडल में लक्ष्य एमआईआरएनए का महत्वपूर्ण अतिवृद्धि हुआ।

Introduction

एमआईआरएनए, छोटे नॉनकोडिंग आरएनए (21-25 बेस) जो प्रोटीन में अनुवादित नहीं होते हैं, उन्हें अस्थिर करके और विभिन्न गुर्देकी बीमारियों में उनके अनुवाद को रोककर बहुत सारे लक्ष्य संदेशवाहक आरएनए (एमआरएनए) को रोकते हैं। इसलिए, बहिर्जात कृत्रिम रूप से संश्लेषित माइआरएनए मिमिक या इनहिबिटर को नियोजित करने वाली जीन थेरेपी कई गुर्दे की बीमारियोंके विकास को रोकने के लिए एक संभावित नया विकल्प है 3,4,5.

जीन थेरेपी के लिए एमआरएनए मिमिक या इनहिबिटर के वादे के बावजूद, लक्षित अंगों को डिलीवरी विवो प्रयोगों में उनकी नैदानिक क्षमता विकसित करने के लिए एक बड़ी बाधा बनी हुई है। चूंकि कृत्रिम रूप से संश्लेषित मिआरएनए मिमिक या इनहिबिटर सीरम आरएनएस द्वारा तत्काल गिरावट के अधीन हैं, इसलिए विवो6 में प्रणालीगत प्रशासन पर उनका आधा जीवन छोटा हो जाता है। इसके अतिरिक्त, प्लाज्मा झिल्ली को पार करने के लिए एमआरएनए मिमिक्स या इनहिबिटर की दक्षता और साइटोप्लाज्म को स्थानांतरित करना आम तौर पर उचित वैक्टर 7,8 के बिना बहुत कम होता है। साक्ष्य की इन पंक्तियों से पता चलता है कि गुर्दे के लिए एमआईआरएनए मिमिक्स या इनहिबिटर डिलीवरी सिस्टम के विकास की आवश्यकता होती है, ताकि नैदानिक सेटिंग्स में उनके उपयोग को सक्षम किया जा सके और उन्हें विभिन्न गुर्दे की बीमारियों वाले रोगियों के लिए एक नया उपचार विकल्प बनाया जा सके।

वायरल वैक्टर का उपयोग एक्सोजेनस माइआरएनए मिमिक या इनहिबिटर को किडनी 9,10 तक पहुंचाने के लिए वाहक के रूप में किया गया है। यद्यपि उन्हें जैव सुरक्षा और अभिकर्मक प्रभावकारिता के लिए विकसित किया गया है, वायरल वैक्टर अभी भी एक इंटरफेरॉन प्रतिक्रिया और / या आनुवंशिक अस्थिरता11,12 का कारण बन सकते हैं। इन चिंताओं को दूर करने के लिए, हमने गुर्दे की बीमारी13,14,15 के कई माउस मॉडल में पॉलीइथाइलेनिमाइन नैनोकणों (पीईआई-एनपी), एक गैर-वायरल वेक्टर का उपयोग करके गुर्दे के लिए एक एमआईआरएनए मिमिक डिलीवरी सिस्टम विकसित किया।

पीईआई-एनपी रैखिक बहुलक-आधारित एनपी हैं जो प्रभावी रूप से गुर्दे में मिआरएनए मिमिक सहित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स वितरित कर सकते हैं, और उनकी दीर्घकालिक सुरक्षा और जैव-रासायनिकता 13,16,17 के कारण गैर-वायरल वैक्टर तैयार करने के लिए बेहतर माना जाता है।

यह अध्ययन एकतरफा मूत्रवाहिनी रुकावट (यूयूओ) द्वारा उत्पादित गुर्दे फाइब्रोसिस मॉडल चूहों में पूंछ की नस इंजेक्शन के माध्यम से पीईआई-एनपी के साथ वितरण की नकल करता है। इसके अतिरिक्त, हम डायबिटिक किडनी रोग मॉडल चूहों (डीबी / डीबी चूहों: सी 57बीएलकेएस / जे आईएआर - + लेपर डीबी / + लेपर डीबी) और तीव्र गुर्दे की चोट मॉडल चूहों में पूंछकी नस इंजेक्शन के माध्यम से पीईआई-एनपी के साथ व्यवस्थित बहिर्जात मिआरएनए मिमिक डिलीवरी के प्रभावों को प्रदर्शित करते हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को जिची मेडिकल यूनिवर्सिटी की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों के लिए जिची मेडिकल यूनिवर्सिटी गाइड से प्रायोगिक जानवरों के उपयोग और देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था। यहां, हमने गुर्दे को एमआईआरएनए मिमिक डिलीवरी का प्रदर्शन किया, जिसके परिणामस्वरूप यूयूओ चूहों का उपयोग करके इसकी अधिकता हुई। इस अध्ययन को जिची मेडिकल यूनिवर्सिटी की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था [गुर्दे फाइब्रोसिस के लिए अनुमोदन संख्या 19-12, तीव्र गुर्दे के संक्रमण (एकेआई) के लिए 17-024, और मधुमेह नेफ्रोपैथी के लिए 19-11]।

1. पीईआई-एनपी-मिआरएनए-मिमिक कॉम्प्लेक्स की तैयारी

नोट: यहां, पीईआई-एनपी-मिआरएनए-मिमिक 13,14,15 और पीईआई-एनपी-कंट्रोल-एमआईआरएनए (नकारात्मक नियंत्रण के रूप में) की तैयारी एक माउस के लिए वर्णित है।

  1. निम्न आइटम तैयार करें:
    1. रैखिक पीईआई-एनपी के 10 μL तैयार करें।
    2. 100 μM की सांद्रता पर न्यूक्लियस मुक्त पानी में घुलने वाले कृत्रिम रूप से संश्लेषित एमआईआरएनए के 50 μL तैयार करें (5 nmol miRNA न्यूक्लियस मुक्त पानी के 50 μL में घुल जाता है)।
    3. 100 μM की सांद्रता पर न्यूक्लियस मुक्त पानी में घुलने वाले कृत्रिम रूप से संश्लेषित नियंत्रण (गैर-लक्ष्य) miRNA के 50 μL तैयार करें (5 nmol miRNA न्यूक्लियस मुक्त पानी के 50 μL में घुल जाता है)।
    4. 5% और 10% ग्लूकोज समाधान तैयार करें। 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब और एक भंवर मिक्सर की उपलब्धता सुनिश्चित करें।
  2. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 5% ग्लूकोज घोल के 90 μL में PEI-NPs के 10 μL को भंग करें। फिर, भंवर ट्यूब को धीरे से और नीचे घुमाता है।
  3. न्यूक्लियस मुक्त पानी (100 μM सांद्रता) में घुले कृत्रिम रूप से संश्लेषित miRNA (5 nmol) के 50 μL को 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 10% ग्लूकोज समाधान के 50 μM के साथ मिलाएं। फिर, भंवर ट्यूब को धीरे से और नीचे घुमाता है। यह प्रक्रिया 5% ग्लूकोज समाधान में घुले हुए एमआईआरएनए का उत्पादन करती है।
  4. 5% ग्लूकोज समाधान में 100 μL PEI-NPs और 5% ग्लूकोज समाधान में 100 μL miRNA मिमिक (5 nmol) मिलाएं। फिर, भंवर ट्यूब को धीरे से और नीचे घुमाता है।
  5. पीईआई-एनपी-मिआरएनए-मिमिक का एक स्थिर परिसर तैयार करने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर मिश्रण को 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इस समाधान में बहुलक में नाइट्रोजन (एन) और न्यूक्लिक एसिड (एन / पी अनुपात) में फॉस्फेट (पी) के अनुपात पर पीईआई-एनपी और एमआईआरएनए मिमिक (5 एनएमओएल) शामिल हैं ( चित्रा 1)।
    नोट: पीईआई-एनपी-कंट्रोल-एमआईआरएनए कॉम्प्लेक्स को इस पांडुलिपि (यूयूओ, डायबिटिक नेफ्रोपैथी और एकेआई) में वर्णित सभी किडनी रोग चूहों के मॉडल के लिए चरण 1.1-1.5 में वर्णित एक ही प्रक्रिया का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है। पीईआई-एनपी-एमआईआरएनए-मिमिक का एक इंजेक्शन वॉल्यूम 5 एनएमओएल के समान है- एन /पी अनुपात = 6 पर पीईआई-एनपी के साथ संयुग्मित एमआईआरएनए-मिमिक। प्रत्येक पीईआई-एनपी-एमआईआरएनए-मिमिक की इंजेक्शन अवधि और आवृत्ति रोग मॉडल पर निर्भर करती है जिसमें इसे लागू किया जाता है।

2. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से पीईआई-एनपी द्वारा यूयूओ चूहों में गुर्दे की नकल के लिए एमआईआरएनए की महत्वपूर्ण डिलीवरी की पुष्टि

नोट: यहां, गुर्दे की कृत्रिम रूप से शुद्ध मिआरएनए नकल की वितरण विधि को विस्तृत किया गया है, जो विभिन्न गुर्दे की बीमारियों के लिए चिकित्सीय तरीकों की स्थापना का संकेत देता है। संक्षेप में, यूयूओ चूहों को साइनिन 3 कार्बोक्जिलिक एसिड (Cy3) -लेबल माइआरएनए मिमिक दिया गया था, जिसे पूंछ की नस के माध्यम से पीईआई-एनपी के 100 μL में जोड़ा गया था। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ गुर्दे को डिलीवरी की पुष्टि की गई थी। एक माउस के लिए पीईआई-एनपी-साइनिन 3 कार्बोक्जिलिक एसिड (Cy3)-लेबल miRNA मिमिक (ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स) का वर्णन किया गया है। यह विधि कई माउस मॉडल, जैसे यूयूओ चूहों, मधुमेह गुर्दे की बीमारी चूहों और आईआरआई द्वारा निर्मित एकेआई चूहों में गुर्दे को एमआईआरएनए मिमिक प्रदान कर सकती है। यहां, हमने वीडियो प्रदर्शन के लिए एक यूयूओ माउस मॉडल का उपयोग किया। यूयूओ की प्रेरण विधि कोपहले कहीं और वर्णित किया गया था। यूयूओ सर्जरी के बाद छह दिनों के भीतर इन प्रोटोकॉल का पालन करें।

  1. निम्न आइटम तैयार करें:
    1. पीईआई-एनपी के 2 μL और Cy3-लेबल डबल-स्ट्रैंड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के 100 μL तैयार करें [Cy3-लेबल miRNA मिमिक (1 nmol; 10 μM)]।
    2. 5% और 10% ग्लूकोज समाधान तैयार करें। 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब और एक भंवर मिक्सर की उपलब्धता सुनिश्चित करें।
    3. यूयूओ चूहों की पूंछ नसों को अलग करने के लिए टोपी में एक छोटे से छेद के साथ 50 एमएल प्लास्टिक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग करें।
    4. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए, इष्टतम काटने का तापमान (ओसीटी) यौगिक, एक क्रायोस्टैट, तरल नाइट्रोजन, फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस), 27 जी सुई के साथ 1.0 एमएल सिरिंज और सिलेन-लेपित ग्लास तैयार करें।
      नोट: फ्लोरेसिन-लेबल लोटस टेट्रागोनोलोबस लेक्टिन (एक समीपस्थ नलिका मार्कर) और 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) समीपस्थ नलिकाओं और सेल नाभिक के वैकल्पिक धुंधलापन के लिए तैयार किया जा सकता है।
  2. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 10% ग्लूकोज घोल के 98 μL में PEI-NPs के 2 μL को भंग करें। फिर, भंवर ट्यूब को धीरे से और नीचे घुमाता है।
  3. 10% ग्लूकोज समाधान (चरण 2.2 में तैयार) में पीईआई-एनपी के 100 μL की तुलना में Cy3-लेबल वाले MIRNA के 100 μL जोड़ें। फिर, भंवर ट्यूब को धीरे से और नीचे घुमाता है।
  4. पीईआई-एनपी-साइ3-लेबल-मिआरएनए-मिमिक का एक स्थिर परिसर तैयार करने के लिए आरटी में 15 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
  5. यूयूओ माउस हेडफर्स्ट को एनेस्थीसिया के बिना 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें, और फिर पूंछ को टोपी में तैयार छेद के माध्यम से रखें।
  6. 1.0 एमएल सिरिंज को 27 ग्राम सुई के साथ 200 μL PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic कॉम्प्लेक्स के साथ भरें।
  7. 27 जी सुई के साथ 1.0 एमएल सिरिंज का उपयोग करके माउस की पूंछ की नस के माध्यम से पीईआई-एनपी-साइ 3-मिआरएनए-मिमिक (200 μL) इंजेक्ट करें।
    नोट: पूंछ की नस को पतला करने और इंजेक्शन क्षेत्र को कीटाणुरहित करने के लिए इथेनॉल (70% -80%) में संतृप्त कपास ऊन के साथ पूंछ की नस को पोंछें।
  8. पीईआई-एनपी-साइ3-मिआरएनए-मिमिक कॉम्प्लेक्स इंजेक्शन के 200 μL के एक घंटे बाद, छोटे जानवरों के लिए एक उपयुक्त एनेस्थेटिक डिवाइस का उपयोग करके माउस को आइसोफ्लुरेन (4% -5%) के साथ एनेस्थेटाइज करें। पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स की अनुपस्थिति के साथ संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। सर्जरी के दौरान आइसोफ्लुरेन (3%) के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें।
  9. इसके बाद, दिल को उजागर करने के लिए सर्जिकल कैंची और बल के साथ त्वचा, मांसपेशियों और पसलियों में एक चीरा लगाएं। दाहिने आलिंद में चीरा लगाने के बाद, पूरे शरीर में रक्त निकालने के लिए बाएं वेंट्रिकल में पीबीएस इंजेक्ट करें जब तक कि गुर्दे का रंग हल्के पीले रंग में बदल न जाए (यह दर्शाता है कि पूरे माउस शरीर को पीबीएस के साथ संक्रमित किया जाता है)।
    नोट: पूरे शरीर में रक्त को कुशलतापूर्वक हटाने के लिए कार्डियक छिड़काव किया जाता है।
  10. आइसोफ्लुरेन को रोकें और चूहों से गुर्दे निकालें और उन्हें पीबीएस से धोएं। उसके बाद, गुर्दे से गुर्दे के कैप्सूल निकालें और पीबीएस के साथ गुर्दे को दो बार धोएं।
  11. ओसीटी यौगिक में गुर्दे के ऊतकों के नमूनों को एम्बेड करें और तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें।
  12. अनुभाग (5 μm मोटी) तैयार करने के लिए क्रायोस्टेट का उपयोग करें। अनुभागों को सिलेन-लेपित ग्लास स्लाइड पर माउंट करें और उन्हें 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ठीक करें।
    नोट: गुर्दे के ऊतकों को वैकल्पिक रूप से समीपस्थ नलिकाओं के लिए 2 घंटे के लिए आरटी पर फ्लोरेसिन-लेबल लोटस टेट्रागोनोलोबस लेक्टिन (2 मिलीग्राम / एमएल) के साथ दाग दिया जा सकता है, इसके बाद सेल नाभिक के लिए 15 मिनट के लिए आरटी पर डीएपीआई (पीबीएस में 30 एनएम) होता है।
  13. धीरे से पीबीएस के साथ स्लाइड को दो बार धोएं।
  14. 100x और 400x आवर्धन और उपयुक्त इमेजिंग सॉफ्टवेयर पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रतिदीप्ति धुंधलापन की कल्पना करें।

3. टेल वेन इंजेक्शन के माध्यम से पीईआई-एनपी द्वारा किडनी की नकल करने के बाद लक्षित माइआरएनए परिवर्तनों की पुष्टि

  1. लक्ष्य माइआरएनए परिवर्तनों की पुष्टि करने के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) करें।
    नोट: क्यूआरटी-पीसीआर 18,19,20 के विवरण के लिए पहले प्रकाशित लेख देखें। नीचे दिए गए प्रतिनिधि परिणामों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली क्यूआरटी-पीसीआर प्रणाली को निर्माता द्वारा बदल दिया गया था। क्यूआरटी-पीसीआर नवीनतम निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किया जाना चाहिए।

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Representative Results

नीचे वर्णित गुर्दे फाइब्रोसिस, मधुमेह नेफ्रोपैथी और एकेआई के लिए लक्ष्य एमआईआरएनए को जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए माइक्रोएरे, क्यूआरटी-पीसीआर और / या डेटाबेस अनुसंधान के आधार पर चुना गया था। अधिक जानकारी के लिए, पिछलेप्रकाशनों 13,14,15 को देखें।

गुर्दे फाइब्रोसिस चूहों में पीईआई-एनपी का उपयोग करके MIRNA-146a-5p-मिमिक के वितरण और प्रभाव
फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी विश्लेषण से पता चला है कि पीईआई-एनपी के पूंछ नस इंजेक्शन माइआरएनए मिमिक को टुबुलोइंटरस्टिशियल स्पेस में पहुंचा सकता है। यूयूओ द्वारा उत्पादित गुर्दे फाइब्रोसिस चूहों में, इसमें गुर्दे की ट्यूबलर कोशिकाएं शामिल थीं, जिनका गुर्दे में नियमित रूप नहीं होता है (चित्रा 2 ए तीर), और ग्लोमेरुलस (चित्रा 2 ए)। क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण से पता चला है कि पीईआई-एनपी-एमआईआरएनए-146 ए-5 पी-मिमिक के इंजेक्शन ने गुर्दे में एमआईआरएनए -146 ए -5 पी के महत्वपूर्ण अतिवृद्धि को प्रेरित किया (चित्रा 2 बी)। इसके अलावा, इंजेक्शन ने यूयूओ द्वारा उत्पादित मॉडल चूहों में गुर्दे की फाइब्रोसिस की प्रगति को रोक दिया, जैसा कि विवो में सिरियस लाल धुंधलापन (लाल फाइब्रोटिक क्षेत्रों को इंगित करता है) के साथ अनुमान लगाया गया है। पीईआई-एनपी-माइआरएनए-146 ए-5 पी-मिमिक का इंजेक्शन यूयूओ उपचार के 1 दिन पहले, 1 दिन बाद और 3 दिन बाद आयोजित किया गया था (यूयूओ उपचार के 6 दिन बाद अनुमानित) (चित्रा 2 सी)। पीईआई-एनपी-नियंत्रण एमआईआरएनए के इंजेक्शन ने गुर्दे फाइब्रोसिस (चित्रा 2 बी, सी) पर निवारक प्रभाव नहीं दिखाया। PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic और PEI-NPs-miRNA-control-miRNA के प्रशासन ने IFN प्रतिक्रिया का कारण नहीं बनाया, जैसे कि चूहों में 5-ऑलिगोडेनिलेट सिंथेज़ और सिग्नल ट्रांसडक्शन और ट्रांसक्रिप्शन 1 के सक्रियकर्ता की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई (चित्रा 2D)।

मधुमेह गुर्दे की बीमारी मॉडल चूहों में पीईआई-एनपी का उपयोग करके MIRNA-181b-5p-नकल के वितरण और प्रभाव
मधुमेह गुर्दे की बीमारी के लिए MIRNA-181b-5p की चिकित्सीय क्षमता का आकलन करने के लिए, हमने MIRNA-181b-5p-PIE-NPs को इंजेक्ट किया या 10 सप्ताह के लिए साप्ताहिक रूप से 10 सप्ताह के डीबी / डीबी चूहों में MIRNA-PIE-NPs को नियंत्रित किया। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी विश्लेषण से पता चला है कि पीईआई-एनपी के पूंछ नस इंजेक्शन विवो में मधुमेह गुर्दे मॉडल (डीबी / डीबी) चूहों के गुर्दे में ग्लोमेरुलस और टुबुलोइंटरस्टिशियल स्पेस में एमआईआरएनए मिमिक प्रदान कर सकता है (चित्रा 3 ए)। इसके अलावा, क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण से पता चला है कि पीईआई-एनपी-माइआरएनए-181 बी-5 पी-मिमिक के इंजेक्शन ने गुर्दे में एमआईआरएनए -181 बी -5 पी के महत्वपूर्ण अतिवृद्धि को प्रेरित किया (चित्रा 3 बी)। आवधिक एसिड-शिफ स्टेनिंग के साथ हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से पता चला है कि 10-20 सप्ताह की उम्र से प्रति सप्ताह एक बार पीईआई-एनपी-एमआईआरएनए-181 बी-5 पी-मिमिक के इंजेक्शन ने विवो में डीबी / डीबी चूहों में मधुमेह गुर्दे की बीमारी की प्रगति को रोक दिया (चित्रा 3 सी)। इसके विपरीत, पीईआई-एनपी-नियंत्रण एमआईआरएनए के इंजेक्शन ने गुर्दे फाइब्रोसिस (चित्रा 3 बी, सी) पर निवारक प्रभाव नहीं दिया।

आईआरआई 15 द्वारा उत्पादित तीव्र गुर्दे की चोट मॉडल चूहों में पीईआई-एनपी-एमआईआरएनए-5100-मिमिक के वितरण और प्रभाव
फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी विश्लेषण से पता चला है कि पीईआई-एनपी के पूंछ की नस इंजेक्शन विवो में एकेआई मॉडल चूहों के गुर्दे के ग्लोमेरुलस और टुबुलोइंटरस्टियल स्पेस में मिआरएनए मिमिक प्रदान कर सकता है (चित्रा 4 ए)। क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण से पता चला है कि पीईआई-एनपी-एमआईआरएनए-5100-5पी-मिमिक के इंजेक्शन ने आईआरआई द्वारा उत्पादित एकेआई चूहों के गुर्दे में एमआईआरएनए -5100 के महत्वपूर्ण अतिवृद्धि को प्रेरित किया (चित्रा 3 बी)। हेमेटॉक्सिलिन-ईओसिन धुंधला होने के साथ हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से पता चला है कि पीईआई-एनपी-एमआईआरएनए -5100 के एक इंजेक्शन ने ट्यूबलर सेल एपोप्टोसिस (काला तीर) को कम कर दिया, जिसने आईआरआई द्वारा उत्पादित एकेआई चूहों के मॉडल में एकेआई विकास को रोका। पीईआई-एनपी-मिआरएनए-5100-मिमिक को आईआरआई प्रक्रिया (चित्रा 4 बी) से 2 दिन पहले पूंछ की नस के माध्यम से इंजेक्ट किया गया था। पीईआई-एनपी-नियंत्रण माइआरएनए के इंजेक्शन ने गुर्दे फाइब्रोसिस (चित्रा 4 बी, सी) पर निवारक प्रभाव नहीं दिखाया।

Figure 1
चित्र 1: PEI-NPs-miRNA-मिमिक कॉम्प्लेक्स की संरचना. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: गुर्दे फाइब्रोसिस चूहों में पीईआई-एनपी-मिआरएनए-146 ए-5 पी-मिमिक का वितरण और प्रभाव। स्केल बार = 200 μm. (B) प्रत्येक समूह में MIRNA-146a-5p अभिव्यक्ति स्तरों का QRT-PCR विश्लेषण (n = 6 प्रति समूह)। (सी) सिरियस लाल धुंधलापन के साथ हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण (लाल फाइब्रोटिक क्षेत्र को इंगित करता है, स्केल बार = 100 μm)। पीईआई-एनपी-मिआरएनए-146 ए-5 पी-मिमिक के इंजेक्शन 1 दिन पहले, 1 दिन बाद और यूयूओ उपचार के 3 दिन बाद विवो में चूहों में गुर्दे फाइब्रोसिस के विकास को रोकते हैं। (घ) यूयूओ चूहों (एन = 6 प्रति समूह) में पीईआई-एनपी-एमआईआरएनए-146ए-5पी के संभावित आईएफएन प्रतिक्रिया प्रभावों की जांच करने के लिए गुर्दे का क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण। संक्षेप: DAPI, 4,6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल; एफआईटीसी, फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; क्यूआरटी-पीसीआर, मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं; पीईआई-एनपी, पॉलीइथाइलेनिमाइन नैनोकणों; एमआईआरएनए, माइक्रोआरएनए; यूयूओ, एकतरफा मूत्रवाहिनी बाधा; ओएएस 1, 5'-ऑलिगोडेनीलेट सिंथेज़; एसटीएटी 1, सिग्नल ट्रांसडक्शन और ट्रांसक्रिप्शन के एक्टिवेटर 1. मान माध्य ± मानक त्रुटि (त्रुटि पट्टियाँ) का प्रतिनिधित्व करते हैं. * पी < 0.05. (इंटरनेशनल जर्नल ऑफ नैनोमेडिसिन 2015 10 3475-3488)। मूल रूप से डोव मेडिकल प्रेस लिमिटेड की अनुमति के साथ प्रकाशित और उपयोग किया जाता है)। 13. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: मधुमेह गुर्दे की बीमारी मॉडल चूहों में पीईआई-एनपी-एमआईआरएनए-181 बी-5 पी-मिमिक का वितरण और प्रभाव14. (ए) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी विश्लेषण। (बी) क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण पीईआई-एनपी-माइआरएनए-181बी-5पी-मिमिक (एन = 3 प्रति समूह) के इंजेक्शन के बाद एमआईआरएनए-181 बी-5 पी के ओवरएक्प्रेशन प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए। (ग) प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा फेनोटाइपिक परिवर्तन देखे गए। 12-20 सप्ताह की उम्र से प्रति सप्ताह एक बार पीईआई-एनपी-माइआरएनए-181 बी-5 पी-मिमिक के इंजेक्शन ने विवो में डीबी / डीबी चूहों में मधुमेह गुर्दे की बीमारी की प्रगति को रोक दिया। स्केल बार = 50 μm. हमने समूहों के बीच कई तुलना विश्लेषण परीक्षण के लिए विचरण (एनोवा) के विश्लेषण का उपयोग किया। यदि हमने एनोवा द्वारा सांख्यिकीय महत्व का पता लगाया, तो हमने एक पोस्ट हॉक विश्लेषण के रूप में दो समूहों के साधनों की तुलना करने के लिए तुर्की का परीक्षण किया। संक्षेप: पीईआई-एनपी, पॉलीइथाइलेनिमाइन नैनोकणों; क्यूआरटी-पीसीआर, मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; मिआरएनए, माइक्रोआरएनए। * पी < 0.05. इस आंकड़े को इशी एट अल से संशोधित किया गया है। 14. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: आईआरआई द्वारा निर्मित तीव्र गुर्दे की चोट मॉडल चूहों में पीईआई-एनपी-एमआईआरएनए -5100-मिमिक का वितरण और प्रभाव। (बी) क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण पीईआई-एनपी-एमआईआरएनए-5100-मिमिक के इंजेक्शन के बाद एमआरएनए -5100 के अतिवृद्धि प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए। (सी) हेमेटॉक्सिलिन-ईओसिन दाग वाले गुर्दे का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण। स्केल बार = 100 μm। आईआरआई प्रक्रिया से 2 दिन पहले पूंछ की नस के माध्यम से इंजेक्ट किए गए पीईआई-एनपी आईआरआई द्वारा प्रेरित एकेआई प्रगति को रोकते हैं। संक्षेप: पीईआई-एनपी, पॉलीइथाइलेनिमाइन नैनोकणों; क्यूआरटी-पीसीआर, मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; एमआईआरएनए, माइक्रोआरएनए; एकेआई, तीव्र गुर्दे की चोट; आईआरआई, इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट। ** पी < 0.01,* पी < 0.05। इस आंकड़े को Aomatsu et al.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करके, पीईआई-एनपी लक्ष्य एमआईआरएनए के ओवरएक्प्रेशन को प्रेरित करने के लिए किडनी में एमआईआरएनए मिमिक्स वितरित कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप गुर्दे फाइब्रोसिस, मधुमेह गुर्दे की बीमारी और एकेआई सहित कई गुर्दे की बीमारियों के विवो माउस मॉडल में उपचार प्रभाव पड़ता है।

पीईआई-एनपी और मिआरएनए मिमिक के परिसर को तैयार करने की विधि बहुत सरल है। पीईआई-एनपी की सकारात्मक रूप से चार्ज की गई सतह एमआईआरएनए नकल को घेरती है जब वे सिर्फ 13,14,15,16,17 (चित्रा 1) मिश्रित होते हैं। इसके अतिरिक्त, एक रैखिक पॉलीथाइलेनिमाइन-आधारित नॉनवायरल वेक्टर के रूप में, पीईआई-एनपी वायरल वैक्टर के उपयोग से जुड़े मुद्दों से बचते हैं, जैसे कि आईएफएन प्रतिक्रिया और आनुवंशिक अस्थिरता 11,15,16 से प्रेरित ऑन्कोजेनेसिस।

पूंछ की नस के माध्यम से पीईआई-एनपी-मिमिक के इंजेक्शन के लिए प्रशिक्षण की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि गुर्दे की बीमारी वाले चूहों की पूंछ नसों को कभी-कभी निर्जलीकरण के कारण पंचर करना मुश्किल होता है, खासकर एकेआई और मोटापे से ग्रस्त डीबी / डीबी चूहों में। इसके अतिरिक्त, कई चूहों के मॉडल के लिए पीईआई-एनपी-मिआरएनए-मिमिक के बार-बार इंजेक्शन की आवश्यकता हो सकती है। इंजेक्शन अंतराल को पूर्व-अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए कि प्रत्येक गुर्दे की बीमारी माउस मॉडल के संदर्भ में पीईआई-एनपी-एमआईआरएनए-मिमिक द्वारा ओवरएक्प्रेशन कैसे होता है।

वायरल वैक्टर का उपयोग अक्सर गुर्दे में एमआईआरएनए मिमिक के अभिकर्मक के लिए किया जाता है और इससे एमआईआरएनए 9,10 का महत्वपूर्ण अभिकर्मक हो सकता है। हालांकि, वायरल वैक्टर में संभावित समस्याएं होती हैं जैसे कि इंटरफेरॉन प्रतिक्रिया और / या आनुवंशिक अस्थिरता11,12। इसलिए, गैर-वायरल वैक्टर का उपयोग करके कई वैकल्पिक वितरण विधियां, जैसे जिलेटिन-एनपी21,22, इलेक्ट्रोपोरेशन23, हाइड्रोडायनामिक इंजेक्शन24,25, और अल्ट्रासाउंड 26 का उपयोग करके अभिकर्मक विकसित किए गए हैं। इस पांडुलिपि में, हमने पीईआई-एनपी को गुर्दे के लिए एक गैर-वायरल वेक्टर के रूप में पेश किया। कुछ गैर-वायरल वैक्टर अत्यधिक आक्रामक (इलेक्ट्रोपोरेशन और हाइड्रोडायनामिक इंजेक्शन) हैं, और इसलिए नैदानिक उपयोग के लिए लागू करना मुश्किल हो सकता है। हालांकि, लिपिड-आधारित नैनोकणों और जिलेटिन-एनपी जैसे अन्य गैर-वायरल वैक्टर के साथ पीईआई-एनपी की तुलना का मूल्यांकन आगे के अध्ययनों में किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल की निम्नलिखित सीमाएँ हैं. सबसे पहले, हालांकि PEI-NPs-miRNA माउस मॉडल (कम से कम पहले चरण के रूप में) के लिए उपयुक्त हैं, प्रीक्लिनिकल अनुसंधान के लिए उपयोग किए जाने वाले बड़े पशु मॉडल (जैसे चूहे, खरगोश, बंदर और कुत्ते) के लिए बड़ी मात्रा में PEI-NPs-miRNA की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पीईआई-एनपी ने विशेष रूप से गुर्दे को एमआईआरएनए मिमिक वितरित नहीं किया क्योंकि पीईआई-एनपी, वायरल वैक्टर की तरह, एक लक्षित वितरण प्रणाली नहीं हैं। इसलिए, अन्य अंगों के फेनोटाइप की जांच करने की आवश्यकता हो सकती है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह काम आंशिक रूप से JSPS KAKENHI (अनुदान संख्या 21K08233) द्वारा समर्थित था। हम इस पांडुलिपि के मसौदों को संपादित करने के लिए एडांज (https://jp.edanz.com/ac) को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus Thermo Fisher Scientific D-1306
Buffer RPE Qiagen 79216 Wash buffer 2
Buffer RWT Qiagen 1067933 Wash buffer 1
Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) Thermo Fisher Scientific Not assigned 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense)
5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense)
Cy3-labeled double-strand oligonucleotides Takara Bio Inc. MIR7900
Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin Vector Laboratories Inc FL-1321
In vivo-jetPEI Polyplus 101000021
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR Thermo Fisher Scientific 4316813 96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 Adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) Thermo Fisher Scientific Not assigned 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU
UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense)
miRNA-146a-5p primer Qiagen MS00001638 Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) Gene design Not assigned 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG
GUU-3’
miRNA-181b-5p primer Qiagen MS00006083 Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) Gene design Not assigned 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′
miRNA-5100-primer Qiagen MS00042952 Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube
miScript II RT kit Qiagen 218161 Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
miScript SYBR Green PCR kit Qiagen 218073 Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
QIA shredder Qiagen 79654 Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube
QIAzol Lysis Reagent Qiagen 79306 Phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system Thermo Fisher Scientific 4472380 Real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. Thermo Fisher Scientific 4472380 Real-time PCR instrument software
RNase-free water Qiagen 129112
RNU6-2 primer Qiagen MS00033740 Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)
Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. Not assigned

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References

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Yanai, K., Kaneko, S., Ishii, H., Aomatsu, A., Morishita, Y. Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models. J. Vis. Exp. (183), e63302, doi:10.3791/63302 (2022).

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