Summary
כאן, אנו מספקים חיקויי miRNA אקסוגניים מסונתזים באופן מלאכותי לכליה באמצעות הזרקת וריד זנב של וקטור לא ויראלי וננו-חלקיקי פוליאתילנימין במספר מודלים של עכברים למחלות כליות. זה הוביל לביטוי יתר משמעותי של miRNA המטרה בכליה, וכתוצאה מכך עיכוב התקדמות של מחלת כליות במספר מודלים של עכברים.
Abstract
מיקרו-רנ"א (miRNAs), רנ"א קטן שאינו מקודד (21-25 בסיסים) שאינו מתורגם לחלבונים, מעכב הרבה רנ"א שליח מטרה (mRNAs) על ידי ערעור ועיכוב תרגומם במחלות כליות שונות. לכן, החלפה של ביטוי miRNA על ידי חיקוי miRNA אקסוגני מסונתז מלאכותית היא אפשרות טיפול שימושית פוטנציאלית לעיכוב התפתחות של מחלות כליות רבות. עם זאת, מכיוון ש-RNAase בסרום מתפרק באופן מיידי בחיקוי miRNA אקסוגני הניתן באופן שיטתי in vivo, אספקת miRNA לכליה נותרה אתגר. לכן, וקטורים שיכולים להגן על miRNA אקסוגני מחקה מפני פירוק על ידי RNAase ולהעביר אותם באופן משמעותי לכליה נחוצים. מחקרים רבים השתמשו בווקטורים נגיפיים כדי להעביר miRNA אקסוגני מחקה או מעכב לכליה. עם זאת, וקטורים נגיפיים עלולים לגרום לתגובת אינטרפרון ו / או חוסר יציבות גנטית. לכן, פיתוח וקטורים נגיפיים הוא גם מכשול לשימוש קליני של miRNA אקסוגני מחקה או מעכבים. כדי להתגבר על חששות אלה בנוגע לווקטורים נגיפיים, פיתחנו שיטה וקטורית לא-ויראלית להעברת חיקויי miRNA לכליה באמצעות הזרקת וריד זנב של ננו-חלקיקי פוליאתילנימין (PEI-NPs), מה שהוביל לביטוי יתר משמעותי של miRNA מטרה במספר מודלים עכבריים של מחלת כליות.
Introduction
miRNAs, רנ"א קטן שאינו מקודד (21-25 בסיסים) שאינו מתורגם לחלבונים, מעכב הרבה רנ"א שליח מטרה (mRNAs) על ידי ערעור יציבותם ועיכוב תרגומם במחלות כליות שונות 1,2. לכן, ריפוי גנטי המשתמש בחיקוי או מעכבי miRNA אקסוגניים מסונתזים באופן מלאכותי הוא אפשרות חדשה פוטנציאלית לעיכוב התפתחותן של מחלות כליות רבות 3,4,5.
למרות ההבטחה של miRNA מחקה או מעכבים עבור ריפוי גנטי, משלוח לאיברי המטרה נותר משוכה גדולה עבור ניסויים in vivo לפתח את הפוטנציאל הקליני שלהם. מכיוון שמירנ"א מסונתז באופן מלאכותי מחקה או מעכב נתונים לפירוק מיידי על ידי RNase בסרום, מחצית החיים שלהם מתקצרת עם מתן מערכתי in vivo6. בנוסף, היעילות של miRNA מחקה או מעכב לחצות את קרום הפלזמה ואת הציטופלסמה transfect הוא בדרך כלל הרבה יותר נמוך ללא וקטורים מתאימים 7,8. קווי ראיות אלה מצביעים על כך שנדרש פיתוח מערכת חיקוי או מעכבי miRNA לכלייה, כדי לאפשר את השימוש בהם במסגרות קליניות ולהפוך אותם לאפשרות טיפול חדשה בחולים עם מחלות כליה שונות.
וקטורים נגיפיים שימשו כנשאים להעברת miRNA אקסוגני מחקה או מעכב לכליה 9,10. למרות שהם פותחו עבור בטיחות ביולוגית ויעילות transfection, וקטורים נגיפיים עדיין עלולים לגרום לתגובת אינטרפרון ו / או חוסר יציבות גנטית11,12. כדי להתגבר על חששות אלה, פיתחנו מערכת miRNA המחקה את העברת הכליה באמצעות ננו-חלקיקי פוליאתילנימין (PEI-NPs), וקטור לא ויראלי, במספר מודלים עכבריים של מחלת כליות13,14,15.
PEI-NPs הם NPs ליניאריים מבוססי פולימר שיכולים להעביר ביעילות אוליגונוקלאוטידים, כולל חיקויי miRNA, לכליה, ונחשבים עדיפים להכנת וקטורים לא נגיפיים בגלל בטיחותם לטווח ארוך ותאימות ביולוגית13,16,17.
מחקר זה מדגים את ההשפעות של miRNA אקסוגני שיטתי המחקה העברה עם PEI-NPs באמצעות הזרקת ורידים בזנב בעכברי מודל פיברוזיס כלייתי המיוצרים על ידי חסימת שופכן חד צדדית (UUO). בנוסף, אנו מדגימים את ההשפעות של miRNA אקסוגני שיטתי המחקה העברה עם PEI-NPs באמצעות הזרקת ורידים בזנב בעכברי מודל של מחלת כליות סוכרתית (עכברי db/db: C57BLKS/J Iar -+Lepr db/+Leprdb) ובעכברי מודל של פגיעה חריפה בכליות המיוצרים על ידי פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה כלייתית (IRI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים לניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י ובוצעו בהתאם להנחיות השימוש והטיפול בחיות ניסוי של מדריך האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י לחיות מעבדה. כאן, הדגמנו miRNA המחקה העברה לכליה וכתוצאה מכך ביטוי יתר שלה באמצעות עכברי UUO. מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י [אישור מס '19-12 עבור פיברוזיס כליות, 17-024 עבור זיהום כליות חריף (AKI), ו 19-11 עבור נפרופתיה סוכרתית].
1. הכנת קומפלקס PEI-NPs-miRNA-mimic
הערה: כאן, הכנה של PEI-NPs-miRNA-mimic13,14,15 ו- PEI-NPs-control-miRNA (כבקרה שלילית) מתוארים עבור עכבר אחד.
- הכינו את הפריטים הבאים:
- הכינו 10 μL של PEI-NPs ליניאריים.
- הכינו 50 מיקרוליטר של miRNA מסונתז באופן מלאכותי המומס במים נטולי נוקלאז בריכוז של 100 מיקרומטר (5 nmol miRNA מומס ב-50 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז).
- הכינו 50 μL של miRNA מבוקרים מסונתזים באופן מלאכותי (ללא מטרה) המומסים במים נטולי נוקלאז בריכוז של 100 מיקרומטר (5 nmol miRNA מומס ב-50 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז).
- הכינו תמיסות גלוקוז של 5% ו-10%. ודא את זמינותם של צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל ומערבל מערבולת.
- להמיס 10 μL של PEI-NPs ב 90 μL של תמיסת גלוקוז 5% בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. לאחר מכן, מערבלים את הצינור בעדינות ומסתובבים כלפי מטה.
- ערבבו 50 μL של miRNA מסונתז באופן מלאכותי (5 nmol) מומס במים נטולי נוקלאז (ריכוז 100 μM) עם 50 μM של תמיסת גלוקוז 10% בצינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל. לאחר מכן, מערבלים את הצינור בעדינות ומסתובבים כלפי מטה. תהליך זה מניב miRNA מומס בתמיסת גלוקוז 5%.
- ערבבו 100 μL של PEI-NPs בתמיסת גלוקוז 5% ו-100 μL של miRNA מחקה (5 nmol) בתמיסת גלוקוז 5%. לאחר מכן, מערבלים את הצינור בעדינות ומסתובבים כלפי מטה.
- דגרו על התערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי להכין קומפלקס יציב של PEI-NPs-miRNA-mimimi. תמיסה זו מכילה PEI-NPs ו-miRNA מחקה (5nmol) ביחס של חנקנים (N) בפולימר לפוספט (P) בחומצות גרעין (יחס N/P) = 6 (איור 1).
הערה: ניתן להכין קומפלקס PEI-NPs-control-miRNA באמצעות אותו תהליך המתואר בשלבים 1.1-1.5 עבור כל המודלים של עכברי מחלות כליות המתוארים בכתב יד זה (UUO, נפרופתיה סוכרתית ו- AKI). נפח הזרקה אחד של PEI-NP-miRNAs-mimic זהה ל-5nmol של miRNAs-mimic מצומד עם PEI-NPs ביחס N/P = 6. משך ההזרקה ותדירות ההזרקה של כל חיקוי PEI-NP-miRNAs-תלוי במודל המחלה שבו הוא מיושם.
2. אישור על העברה משמעותית של miRNA mimic לכליה בעכברי UUO על ידי PEI-NP באמצעות הזרקת ורידים בזנב באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי
הערה: כאן, שיטת המסירה של miRNA מטוהר באופן מלאכותי לחקות את הכליה משוכללת, המציין הקמת שיטות טיפוליות למחלות כליות שונות. בקצרה, עכברי UUO קיבלו חיקוי miRNA עם תווית ציאנין3 חומצה קרבוקסילית (Cy3) בתוספת 100 μL של PEI-NPs דרך וריד הזנב. המסירה לכליות אושרה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. מתואר PEI-NPs-cyanine3 חומצה קרבוקסילית (Cy3)-חיקוי miRNA (אוליגונוקלאוטידים) עבור עכבר אחד. שיטה זו יכולה לספק באופן משמעותי חיקוי miRNA לכליה במספר מודלים של עכברים, כגון עכברי UUO, עכברים חולי כליות סוכרתיים ועכברי AKI המיוצרים על ידי IRI. כאן, השתמשנו במודל עכבר UUO להדגמת הווידאו. שיטת האינדוקציה של UUO תוארה בעבר במקום אחר13. עקוב אחר פרוטוקולים אלה תוך שישה ימים לאחר ניתוח UUO.
- הכינו את הפריטים הבאים:
- הכינו 2 μL של PEI-NPs ו-100 μL של אוליגונוקלאוטידים דו-גדיליים בעלי תווית Cy3 [חיקוי miRNA עם תווית Cy3 (1 nmol; 10 μM)].
- הכינו תמיסות גלוקוז של 5% ו-10%. ודא את זמינותם של צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל ומערבל מערבולת.
- השתמש בצינור צנטריפוגה פלסטיק 50 מ"ל עם חור קטן בכובע כדי לבודד את ורידי הזנב של עכברי UUO.
- עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הכינו תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), קריוסטט, חנקן נוזלי, מלח חוצץ פוספט (PBS), מזרקים 1.0 מ"ל עם מחט 27 גרם, וזכוכית מצופה סילאן.
הערה: ניתן להכין לוטוס טטרגונולובוס לקטין (סמן צינורית פרוקסימלי) ו- 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לצביעה אופציונלית של צינוריות פרוקסימליות וגרעיני תאים.
- להמיס 2 μL של PEI-NPs ב 98 μL של 10% תמיסת גלוקוז בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. לאחר מכן, מערבלים את הצינור בעדינות ומסתובבים כלפי מטה.
- הוסף 100 μL של miRNA מסומן Cy3 לחקות 100 μL של PEI-NPs בתמיסת גלוקוז 10% (מוכן בשלב 2.2). לאחר מכן, מערבלים את הצינור בעדינות ומסתובבים כלפי מטה.
- דגרו על התערובת במשך 15 דקות ב-RT כדי להכין קומפלקס יציב של PEI-NPs-Cy3-labeled-miRNA-mimi.
- הניחו את עכבר ה-UUO בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ללא הרדמה, ולאחר מכן הניחו את הזנב דרך החור המוכן בפקק.
- מלא מזרק 1.0 מ"ל עם מחט 27 G עם 200 μL של קומפלקס PEI-NPs-Cy3-miRNA-לחקות.
- הזריקו PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) דרך וריד הזנב של העכבר באמצעות מזרק 1.0 מ"ל עם מחט 27 גרם.
הערה: נגבו את וריד הזנב בצמר גפן רווי אתנול (70%-80%) כדי להרחיב את וריד הזנב ולחטא את אזור ההזרקה. - שעה לאחר הזרקה של 200 μL של PEI-NPs-Cy3-miRNA-מחקה מורכבות, מרדימים את העכבר עם איזופלורן (4%-5%) באמצעות מכשיר הרדמה מתאים לבעלי חיים קטנים. אשר את עומק ההרדמה עם היעדר רפלקס צביטת בוהן. לשמור על ההרדמה עם איזופלורן (3%) לאורך כל הניתוח.
- לאחר מכן, בצע חתך לתוך העור, השרירים והצלעות עם מספריים כירורגיים ומלקחיים כדי לחשוף את הלב. לאחר ביצוע חתך באטריום הימני, יש להזריק PBS לחדר השמאלי כדי לשאוב דם בכל הגוף עד שצבע הכליה משתנה לצהוב בהיר (מה שמעיד על כך שכל גוף העכבר מחורר עם PBS).
הערה: זילוח הלב מבוצע כדי להסיר ביעילות את הדם בכל הגוף . - עצור isoflurane ולהסיר את הכליות מן העכברים ולשטוף אותם עם PBS. לאחר מכן, להסיר כמוסות כליות מן הכליות ולשטוף את הכליות פעמיים עם PBS.
- יש להטמיע את דגימות רקמת הכליה בתרכובת OCT ולהקפיא בחנקן נוזלי.
- השתמש cryostat להכנת חלקים (5 מיקרומטר עובי). הרכיבו את המקטעים על מגלשות זכוכית מצופות סילאן וקיבעו אותם עם 4% פרפורמלדהיד.
הערה: רקמות כליות יכולות להיות מוכתמות באופן אופציונלי בלקטין לוטוס טטרגונולובוס (2 מ"ג/מ"ל) ב-RT למשך שעתיים עבור צינוריות פרוקסימליות, ולאחר מכן DAPI (30 ננומטר ב-PBS) ב-RT למשך 15 דקות עבור גרעיני תאים. - שטפו בעדינות את המגלשות פעמיים עם PBS.
- דמיינו את הצביעה הפלואורסצנטית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 100x ו-400x ותוכנת הדמיה מתאימה.
3. אישור על שינויי miRNA מטרה לאחר העברת miRNA mimic לכליה על ידי PEI-NP באמצעות הזרקת וריד הזנב
- בצע תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR) כדי לאשר את שינויי miRNA המטרה.
הערה: עיין במאמר שפורסם בעבר לקבלת הפרטים של qRT-PCR18,19,20. מערכת qRT-PCR המשמשת ליצירת התוצאות המייצגות המפורטות להלן שונתה על ידי היצרן. qRT-PCR צריך להתבצע בהתאם לפרוטוקול היצרן העדכני ביותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
miRNA המטרה עבור פיברוזיס כליות, נפרופתיה סוכרתית, ו AKI המתוארים להלן נבחרו על בסיס מיקרו-מערך, qRT-PCR, ו / או מסד נתונים מחקר עבור יישומי ריפוי גנטי. לפרטים נוספים ראו פרסומים קודמים13,14,15.
העברה והשפעות של miRNA-146a-5p-mimic באמצעות PEI-NPs בעכברי פיברוזיס כליות13
ניתוח מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הראה כי הזרקת וריד הזנב של PEI-NPs יכולה להעביר את חיקוי miRNA לחלל tubulointerstitial. בעכברי פיברוזיס כלייתי המיוצרים על-ידי UUO, זה כלל תאים צינוריים כלייתיים, שאין להם צורה סדירה בכליה (חץ איור 2A), והגלומרולוס (איור 2A). ניתוח qRT-PCR הראה כי הזרקה של PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic גרמה לביטוי יתר משמעותי של miRNA-146a-5p בכליה (איור 2B). יתר על כן, הזרקה עיכבה את התקדמות הפיברוזיס הכליתי בעכברי המודל המיוצרים על ידי UUO, כפי שהוערך עם צביעה אדומה של סיריוס (אדום מציין אזורים פיברוטיים ) in vivo. הזרקת PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic בוצעה יום אחד לפני, יום אחד אחרי, ו-3 ימים לאחר הטיפול ב-UUO (כ-6 ימים לאחר הטיפול ב-UUO) (איור 2C). הזרקה של miRNA בקרת PEI-NPs לא הראתה השפעות מונעות על פיברוזיס כלייתי (איור 2B,C). מתן PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic ו-PEI-NPs-miRNA-control-miRNA לא גרם לתגובת IFN, כגון ביטוי מוגבר של סינתאז 5-oligoadenylate והעברת אותות ומפעיל של שעתוק 1 בעכברים (איור 2D).
העברה והשפעות של miRNA-181b-5p-חיקוי באמצעות PEI-NPs בעכברי מודל של מחלת כליות סוכרתית14
כדי להעריך את הפוטנציאל הטיפולי של miRNA-181b-5p לטיפול במחלת כליות סוכרתית, הזרקנו miRNA-181b-5p-PIE-NPs או miRNA-PIE-NPs בקרה לעכברי db/db בני 10 שבועות מדי שבוע במשך 10 שבועות. ניתוח מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הראה שהזרקת ורידים בזנב של PEI-NPs יכולה לספק חיקוי miRNA לחלל הגלומרולוס והטובולואינטרסטיציאלי בכליות של עכברי מודל כליות סוכרתיים (db/db) in vivo (איור 3A). בנוסף, ניתוח qRT-PCR הראה כי הזרקה של PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic גרמה לביטוי יתר משמעותי של miRNA-181b-5p בכליה (איור 3B). ניתוח היסטולוגי עם צביעת חומצה-שיף תקופתית הראה כי הזרקה של PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic פעם בשבוע מגיל 10-20 שבועות עיכבה את התקדמות מחלת כליות סוכרתית בעכברי db/db in vivo (איור 3C). לעומת זאת, הזרקה של miRNA מבוקר PEI-NPs לא הניבה השפעות מונעות על פיברוזיס כלייתי (איור 3B,C).
העברה והשפעות של PEI-NPs-miRNA-5100-חיקוי בעכברי מודל של פגיעה חריפה בכליות המיוצרים על ידי IRI15
ניתוח מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הראה שהזרקת וריד הזנב של PEI-NPs יכולה לספק חיקוי miRNA לחלל הגלומרולוס והטובולואינטרסטיציאלי של עכברי מודל AKI, כליות in vivo (איור 4A). ניתוח qRT-PCR הראה כי הזרקת PEI-NPs-miRNA-5100-5p-mimic גרמה לביטוי יתר משמעותי של miRNA-5100 בכליות של עכברי AKI המיוצרים על-ידי IRI (איור 3B). ניתוח היסטולוגי עם צביעת המטוקסילין-אאוסין הראה כי זריקה אחת של PEI-NPs-miRNA-5100 הפחיתה אפופטוזיס של תאים צינוריים (חץ שחור), מה שמנע התפתחות AKI במודל עכברי AKI המיוצר על ידי IRI. PEI-NPs-miRNA-5100-mimic הוזרק דרך וריד הזנב יומיים לפני הליך IRI (איור 4B). הזרקה של miRNA בקרת PEI-NPs לא הראתה השפעות מונעות על פיברוזיס כלייתי (איור 4B,C).
איור 1: מבנה קומפלקס PEI-NPs-miRNA-mimi. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: העברה והשפעות של PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic בעכברי פיברוזיס כלייתיים . (A) ניתוח מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) ניתוח qRT-PCR של רמות ביטוי miRNA-146a-5p בכל קבוצה (n = 6 לכל קבוצה). (C) ניתוח היסטולוגי עם צביעה אדומה של סיריוס (אדום מציין את האזור הפיברוטי, סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). הזרקה של PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic יום לפני, יום אחד אחרי, ו 3 ימים לאחר טיפול UUO עיכב את התפתחות פיברוזיס הכליה בעכברים in vivo. (D) ניתוח qRT-PCR של כליות כדי לחקור השפעות אפשריות של תגובת IFN ל- PEI-NPs-miRNA-146a-5p בעכברי UUO (n = 6 לקבוצה). קיצורים: DAPI, 4,6-diamidino-2-phenylindole; FITC, isothiocyanate fluorescein; qRT-PCR, תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת; NS, לא משמעותי; PEI-NPs, ננו-חלקיקי פוליאתילנימין; miRNA, microRNA; UUO, חסימת שופכן חד צדדית; OAS1, 5′-oligoadenylate synthase; STAT1, העברת אותות ומפעיל של תמלול 1. ערכים מייצגים ממוצע ± שגיאת תקן (קווי שגיאה). *P < 0.05. Morishita et al. (כתב העת הבינלאומי לננו-רפואה, 2015, 10: 3475-3488. פורסם במקור על ידי דאב מדיקל פרס בע"מ ונעשה בו שימוש באישורה). 13. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: העברה והשפעות של PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic בעכברי מודל של מחלת כליות סוכרתית14. (A) ניתוח מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) ניתוח qRT-PCR להערכת השפעות ביטוי יתר של miRNA-181b-5p לאחר הזרקת PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic (n = 3 לכל קבוצה). (C) שינויים פנוטיפיים נצפו במיקרוסקופ אור. הזרקה של PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic פעם בשבוע מגיל 12-20 שבועות עיכבה את התקדמות מחלת כליות סוכרתית בעכברי db/db in vivo. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. השתמשנו בניתוח שונות (ANOVA) לבדיקות ניתוח השוואה מרובות בין קבוצות. אם זיהינו מובהקות סטטיסטית על ידי ANOVA, ביצענו את הבדיקה של טורקיה כדי להשוות את האמצעים של שתי קבוצות כניתוח פוסט-הוק. קיצורים: PEI-NPs, ננו-חלקיקי פוליאתילנימין; qRT-PCR, תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת; miRNA, מיקרו-רנ"א. *P < 0.05. נתון זה שונה מ- Ishii et al. 14. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: העברה והשפעות של PEI-NPs-miRNA-5100-mimic בעכברי מודל של פגיעה חריפה בכליות המיוצרים על-ידי IRI . (A) ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) ניתוח qRT-PCR להערכת השפעות ביטוי היתר של miRNA-5100 לאחר הזרקת PEI-NPs-miRNA-5100-mimi. (C) ניתוח היסטולוגי של כליה מוכתמת בהמטוקסילין-אאוזין. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. PEI-NPs המוזרקים דרך וריד הזנב יומיים לפני הליך IRI מונעים התקדמות AKI הנגרמת על ידי IRI. קיצורים: PEI-NPs, ננו-חלקיקי פוליאתילנימין; qRT-PCR, תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת; miRNA, microRNA; AKI, פגיעה חריפה בכליות; IRI, פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה. **P < 0.01,*P < 0.05. נתון זה שונה מ Aomatsu et al.15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באמצעות הפרוטוקול המוצג בכתב יד זה, PEI-NPs יכולים לספק חיקויי miRNA לכליה כדי לגרום לביטוי יתר של miRNA מטרה, וכתוצאה מכך השפעות טיפול במודלים עכברי in vivo של מספר מחלות כליות, כולל פיברוזיס כליות, מחלת כליות סוכרתית ו- AKI.
השיטה להכנת קומפלקס של PEI-NPs וחיקוי miRNA היא פשוטה מאוד. פני השטח הטעונים חיובית של PEI-NPs לוכדים את חיקוי ה-miRNA כאשר הם רק מעורבבים 13,14,15,16,17 (איור 1). בנוסף, כווקטור לא ויראלי ליניארי מבוסס פוליאתילנימין, PEI-NPs נמנעים מבעיות הקשורות לשימוש בווקטורים נגיפיים, כגון תגובת IFN ואונקוגנזה הנגרמת על ידי חוסר יציבות גנטית11,15,16.
הזרקה של PEI-NPs-mimic דרך וריד הזנב עשויה לדרוש אימון מכיוון שלפעמים קשה לנקב את ורידי הזנב של עכברים עם מחלת כליות בגלל התייבשות, במיוחד בעכברי AKI ועכברי db/db שמנים. בנוסף, הזרקה חוזרת ונשנית של PEI-NPs-miRNA-mimic עשויה להידרש עבור מספר מודלים של עכברים. מרווחי ההזרקה צריכים להיקבע על ידי ניסיון מקדים של האופן שבו ביטוי יתר על ידי PEI-NPs-miRNA-mimic מתרחש בהקשר של כל מודל עכבר למחלת כליות.
וקטורים נגיפיים משמשים לעתים קרובות לטרנספקציה של חיקוי miRNA בכליות ויכולים להוביל לטרנספקציה משמעותית של miRNA 9,10. עם זאת, לווקטורים נגיפיים יש בעיות פוטנציאליות כגון גרימת תגובת אינטרפרון ו / או חוסר יציבות גנטית11,12. לכן, פותחו מספר שיטות העברה חלופיות באמצעות וקטורים לא ויראליים, כגון ג'לטין-NPs 21,22, אלקטרופורציה 23, הזרקה הידרודינמית 24,25, וטרנספקציה באמצעות אולטרסאונד 26. בכתב היד הזה הצגנו את PEI-NPs כווקטור לא ויראלי לכליה. חלק מהווקטורים הלא-ויראליים הם פולשניים מאוד (אלקטרופורציה והזרקה הידרודינמית), ולכן עשויים להיות קשים ליישום לשימוש קליני. עם זאת, השוואה של PEI-NPs עם וקטורים לא נגיפיים אחרים, כגון ננו-חלקיקים מבוססי שומנים וג'לטין-NPs, צריכה להיות מוערכת במחקרים נוספים.
פרוטוקול זה כולל את המגבלות הבאות. ראשית, למרות ש-PEI-NPs-miRNA מתאימים למודלים של עכברים (לפחות כשלב ראשון), כמויות גדולות של PEI-NPs-miRNA נדרשות עבור מודלים של בעלי חיים גדולים (כגון חולדות, ארנבות, קופים וכלבים) המשמשים למחקר פרה-קליני. בנוסף, יש לציין כי PEI-NPs לא העבירו miRNA חיקוי ספציפי לכליה מכיוון ש- PEI-NPs, כמו וקטורים נגיפיים, אינם מערכת העברה ממוקדת. לכן, ייתכן שיהיה צורך לחקור את הפנוטיפ של איברים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה חלקית על ידי JSPS KAKENHI (מענק מס' 21K08233). אנו מודים לאדנץ (https://jp.edanz.com/ac) על עריכת טיוטות כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
References
- Mohr, A. M., Mott, J. L. Overview of microRNA biology. Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).
- Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
- Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy. Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).
- Yheskel, M., Patel, V. Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic. Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Deng, M., et al. Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).
- Zhou, Y., et al. Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy. Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).
- Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives. Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).
- Morishita, Y., et al. Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo. International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).
- Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).
- Aomatsu, A., et al. MicroRNA expression profiling in acute kidney injury. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems. European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Swami, A., et al. A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).
- Kaneko, S., et al. Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).
- Yanai, K., et al. Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).
- Aomatsu, A., et al. A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).
- Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).
- Xia, Z., et al. Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47. American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).
- Tanaka, T., et al. In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy. American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).
- Hamar, P., et al. Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).
- Ma, D., et al. Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).
- Wei, S., et al. Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).
