Summary
Här levererar vi exogent artificiellt syntetiserade miRNA-efterlikningar till njurarna via svansveninjektion av en icke-viral vektor och polyetyleniminnanopartiklar i flera musmodeller för njursjukdom. Detta ledde till signifikant överuttryck av mål-miRNA i njurarna, vilket resulterade i hämmad progression av njursjukdom i flera musmodeller.
Abstract
mikroRNA (miRNA), små icke-kodande RNA (21-25 baser) som inte översätts till proteiner, hämmar massor av målbudbärar-RNA (mRNA) genom att destabilisera och hämma deras översättning vid olika njursjukdomar. Därför är växling av miRNA-uttryck genom exogent artificiellt syntetiserat miRNA-härmningar ett potentiellt användbart behandlingsalternativ för att hämma utvecklingen av många njursjukdomar. Men eftersom serum-RNAas omedelbart bryts ned systematiskt administrerade exogena miRNA-härmar in vivo, är leverans av miRNA till njurarna fortfarande en utmaning. Därför är vektorer som kan skydda exogena miRNA-efterlikningar från nedbrytning av RNAas och signifikant leverera dem till njurarna nödvändiga. Många studier har använt virala vektorer för att leverera exogena miRNA-härmningar eller hämmare till njurarna. Virala vektorer kan dock orsaka interferonrespons och/eller genetisk instabilitet. Därför är utvecklingen av virala vektorer också ett hinder för klinisk användning av exogena miRNA-härmningar eller hämmare. För att övervinna dessa problem med virala vektorer utvecklade vi en icke-viral vektormetod för att leverera miRNA-efterlikningar till njurarna med hjälp av svansveninjektion av polyetyleniminnanopartiklar (PEI-NP), vilket ledde till signifikant överuttryck av målmiRNA i flera musmodeller av njursjukdom.
Introduction
miRNA, små icke-kodande RNA (21-25 baser) som inte översätts till proteiner, hämmar massor av målbudbärar-RNA (mRNA) genom att destabilisera dem och hämma deras översättning vid olika njursjukdomar 1,2. Därför är genterapi som använder exogena artificiellt syntetiserade miRNA-härmningar eller hämmare ett potentiellt nytt alternativ för att hämma utvecklingen av många njursjukdomar 3,4,5.
Trots löftet om miRNA-efterlikningar eller hämmare för genterapi är leverans till målorgan fortfarande ett stort hinder för in vivo-experiment att utveckla sin kliniska potential. Eftersom artificiellt syntetiserade miRNA-härmningar eller hämmare utsätts för omedelbar nedbrytning av serum-RNas, förkortas deras halveringstid vid systemisk administrering in vivo6. Dessutom är effektiviteten hos miRNA-härmningar eller hämmare att passera plasmamembranet och transfekt cytoplasma i allmänhet mycket lägre utan lämpliga vektorer 7,8. Dessa bevislinjer tyder på att utvecklingen av miRNA-efterlikningar eller inhibitorer leveranssystem för njuren krävs för att möjliggöra deras användning i kliniska miljöer och göra dem till ett nytt behandlingsalternativ för patienter med olika njursjukdomar.
Virala vektorer har använts som bärare för att leverera exogena miRNA-härmar eller hämmare till njuren 9,10. Även om de har utvecklats för biosäkerhet och transfektionseffekt kan virala vektorer fortfarande orsaka interferonrespons och/eller genetisk instabilitet11,12. För att övervinna dessa problem utvecklade vi ett miRNA-efterliknande leveranssystem för njurarna med hjälp av polyetyleniminnanopartiklar (PEI-NP), en icke-viral vektor, i flera musmodeller av njursjukdom13,14,15.
PEI-NP är linjära polymerbaserade NP som effektivt kan leverera oligonukleotider, inklusive miRNA-efterlikningar, till njurarna och anses vara att föredra för framställning av icke-virala vektorer på grund av deras långsiktiga säkerhet och biokompatibilitet13,16,17.
Denna studie visar effekterna av systematiska exogena miRNA-efterliknar leverans med PEI-NPs via svansveninjektion hos njurfibrosmodellmöss producerade av ensidig urinledarobstruktion (UUO). Dessutom demonstrerar vi effekterna av systematisk exogen miRNA-mimisk leverans med PEI-NPs via svansveninjektion hos diabetiska njursjukdomsmodellmöss (db / db-möss: C57BLKS / J Iar -+Lepr db / + Leprdb) och akuta njurskademodellmöss producerade av njurischemi-reperfusionsskada (IRI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsöksprotokoll godkändes av djuretikkommittén vid Jichi Medical University och utfördes i enlighet med riktlinjer för användning och vård av försöksdjur från Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals. Här demonstrerade vi miRNA-efterlikning leverans till njuren vilket resulterade i dess överuttryck med UUO-möss. Denna studie godkändes av etikkommittén vid Jichi Medical University [godkännande nr 19-12 för njurfibros, 17-024 för akut njurinfektion (AKI) och 19-11 för diabetisk nefropati].
1. Framställning av PEI-NPs-miRNA-mimic-komplex
OBS: Här beskrivs beredning av PEI-NPs-miRNA-mimic13,14,15 och PEI-NPs-control-miRNA (som en negativ kontroll) för en mus.
- Förbered följande objekt:
- Bered 10 μL linjära PEI-NP.
- Bered 50 μL artificiellt syntetiserade miRNA upplösta i nukleasfritt vatten i en koncentration av 100 μM (5 nmol miRNA upplöst i 50 μL nukleasfritt vatten).
- Bered 50 μL artificiellt syntetiserade kontrollmiRNA (icke-mål) upplösta i nukleasfritt vatten i en koncentration av 100 μM (5 nmol miRNA upplöst i 50 μL nukleasfritt vatten).
- Förbered 5% och 10% glukoslösningar. Se till att det finns 1,5 ml mikrocentrifugrör och en virvelblandare.
- Lös 10 μL PEI-NP i 90 μL 5% glukoslösning i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Virvla sedan röret försiktigt och snurra ner.
- Blanda 50 μL artificiellt syntetiserade miRNA (5 nmol) upplöst i nukleasfritt vatten (100 μM koncentration) med 50 μM 10% glukoslösning i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Virvla sedan röret försiktigt och snurra ner. Denna process ger miRNA upplöst i 5% glukoslösning.
- Blanda 100 μL PEI-NP i 5% glukoslösning och 100 μL miRNA mimic (5 nmol) i 5% glukoslösning. Virvla sedan röret försiktigt och snurra ner.
- Inkubera blandningen i 15 minuter vid rumstemperatur (RT) för att framställa ett stabilt komplex av PEI-NPs-miRNA-mimic. Denna lösning innehåller PEI-NP och miRNA-efterlikna (5 nmol) vid ett förhållande av kväve (N) i polymeren till fosfat (P) i nukleinsyror (N / P-förhållande) = 6 (figur 1).
OBS: PEI-NPs-control-miRNA-komplexet kan framställas med samma process som beskrivs i steg 1.1-1.5 för alla modeller av njursjukdomsmöss som beskrivs i detta manuskript (UUO, diabetesnefropati och AKI). En injektionsvolym av PEI-NP-miRNAs-mimic är densamma som 5 nmol miRNAs-mimic konjugerad med PEI-NPs vid N / P-förhållande = 6. Injektionstiden och frekvensen för varje PEI-NP-miRNAs-mimic beror på sjukdomsmodellen där den appliceras.
2. Bekräftelse av signifikant leverans av miRNA-efterlikning till njurarna hos UUO-möss genom PEI-NP via svansveninjektion med fluorescerande mikroskopi
OBS: Här utarbetas leveransmetoden för artificiellt renat miRNA till njurarna, vilket indikerar upprättandet av terapeutiska metoder för olika njursjukdomar. I korthet administrerades UUO-möss cyanin3-karboxylsyra (Cy3)-märkt miRNA-efterlikning tillsatt till 100 μL PEI-NP via svansvenen. Leveransen till njurarna bekräftades med fluorescensmikroskopi. PEI-NPs-cyanin3 karboxylsyra (Cy3)-märkt miRNA mimic (oligonukleotider) för en mus beskrivs. Denna metod kan signifikant leverera miRNA-efterlikning till njurarna i flera musmodeller, såsom UUO-möss, diabetiska njursjukdomsmöss och AKI-möss producerade av IRI. Här använde vi en UUO-musmodell för videodemonstrationen. Induktionsmetoden för UUO har tidigare beskrivits på annan plats13. Följ dessa protokoll inom sex dagar efter UUO-operationen.
- Förbered följande objekt:
- Bered 2 μL PEI-NP och 100 μL Cy3-märkta dubbelsträngade oligonukleotider [Cy3-märkt miRNA-efterlikning (1 nmol; 10 μM)].
- Förbered 5% och 10% glukoslösningar. Se till att det finns 1,5 ml mikrocentrifugrör och en virvelblandare.
- Använd ett 50 ml plastcentrifugrör med ett litet hål i locket för att isolera svansvenerna hos UUO-möss.
- För fluorescensmikroskopi, förbered optimal skärtemperatur (OCT) förening, en kryostat, flytande kväve, fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 1,0 ml sprutor med en 27 G nål och silanbelagt glas.
OBS: Fluoresceinmärkt Lotus tetragonolobus lektin (en proximal tubuli markör) och 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) kan beredas för valfri färgning av proximala tubuli och cellkärnor.
- Lös 2 μl PEI-NP i 98 μl 10% glukoslösning i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Virvla sedan röret försiktigt och snurra ner.
- Tillsätt 100 μL Cy3-märkt miRNA-efterlikning till 100 μL PEI-NPs i 10% glukoslösning (beredd i steg 2.2). Virvla sedan röret försiktigt och snurra ner.
- Inkubera blandningen i 15 minuter vid rumstemperatur för att framställa ett stabilt komplex av PEI-NPs-Cy3-märkt-miRNA-mimic.
- Placera UUO-mushuvudet först i ett 50 ml centrifugrör utan anestesi och placera sedan svansen genom det förberedda hålet i locket.
- Fyll en 1,0 ml spruta med en 27 G nål med 200 μL PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic complex.
- Injicera PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) via musens svansven med 1,0 ml spruta med 27 G nål.
OBS: Torka av svansvenen med bomullsull mättad i etanol (70% -80%) för att utvidga svansvenen och desinficera injektionsområdet. - En timme efter 200 μL PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic complex injection, bedöva musen med isofluran (4% -5%) med hjälp av en lämplig bedövningsanordning för små djur. Bekräfta anestesidjupet med frånvaro av tåklämningsreflex. Behåll bedövningen med isofluran (3%) under hela operationen.
- Gör sedan ett snitt i huden, musklerna och revbenen med kirurgisk sax och pincett för att exponera hjärtat. Efter att ha gjort ett snitt i höger förmak, injicera PBS i vänster kammare för att dra ut blod i hela kroppen tills njurfärgen ändras till blekgul (vilket indikerar att hela muskroppen är perfuserad med PBS).
OBS: Hjärtperfusion utförs för att effektivt ta bort blodet i hela kroppen. - Stoppa isofluran och ta bort njurarna från mössen och tvätta dem med PBS. Därefter ta bort njurkapslar från njurarna och tvätta njurarna två gånger med PBS.
- Bädda in njurvävnadsproverna i OCT-förening och frys i flytande kväve.
- Använd en kryostat för att förbereda sektioner (5 μm tjocka). Montera sektionerna på silanbelagda glasskivor och fixera dem med 4% paraformaldehyd.
OBS: Njurvävnader kan valfritt färgas med fluoresceinmärkt Lotus tetragonolobus lektin (2 mg / ml) vid RT i 2 timmar för proximala tubuli, följt av DAPI (30 nM i PBS) vid RT i 15 minuter för cellkärnor. - Tvätta försiktigt bilderna två gånger med PBS.
- Visualisera fluorescensfärgningen genom fluorescensmikroskopi vid 100x och 400x förstoring och lämplig bildprogramvara.
3. Bekräftelse av mål-miRNA-förändringar efter leverans av miRNA-efterlikning till njure genom PEI-NP via svansveninjektion
- Utför kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (qRT-PCR) för att bekräfta mål-miRNA-växlingarna.
OBS: Se den tidigare publicerade artikeln för detaljer om qRT-PCR18,19,20. qRT-PCR-systemet som används för att generera de representativa resultaten nedan har ändrats av tillverkaren. qRT-PCR ska utföras i enlighet med det senaste tillverkarens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mål-miRNA för njurfibros, diabetesnefropati och AKI som beskrivs nedan valdes baserat på mikroarray, qRT-PCR och / eller databasforskning för genterapiapplikationer. För ytterligare detaljer, se tidigare publikationer13,14,15.
Leverans och effekter av miRNA-146a-5p-mimic med PEI-NPs i njurfibrosmöss13
Fluorescerande mikroskopianalys visade att svansveninjektion av PEI-NPs kunde leverera miRNA-efterlikningen till tubulointerstitiellt utrymme. Hos njurfibrosmöss producerade av UUUO inkluderade detta renala tubulära celler, som inte har en regelbunden form i njurarna (figur 2A-pil) och glomerulus (figur 2A). qRT-PCR-analys visade att injektion av PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic inducerade signifikant överuttryck av miRNA-146a-5p i njuren (figur 2B). Dessutom hämmade injektionen progressionen av njurfibros hos modellmöss producerade av UUO, vilket uppskattades med Sirius röd färgning (rött indikerar fibrotiska områden) in vivo. Injektion av PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic utfördes 1 dag före, 1 dag efter och 3 dagar efter UUO-behandling (uppskattad 6 dagar efter UUO-behandling) (figur 2C). Injektion av PEI-NPs-kontroll miRNA visade inte förebyggande effekter på njurfibros (figur 2B, C). Administrering av PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic och PEI-NPs-miRNA-control-miRNAs orsakade inte ett IFN-svar, såsom ökat uttryck av 5-oligoadenylatsyntas och signaltransduktion och aktivator av transkription 1 hos möss (figur 2D).
Leverans och effekter av miRNA-181b-5p-mimic med PEI-NPs i diabetisk njursjukdom modellmöss14
För att bedöma den terapeutiska potentialen för miRNA-181b-5p för diabetisk njursjukdom injicerade vi miRNA-181b-5p-PIE-NPs eller kontrollerar miRNA-PIE-NPs i 10 veckor gamla db / db-möss varje vecka i 10 veckor. Fluorescerande mikroskopianalys visade att svansveninjektion av PEI-NPs kunde leverera miRNA-efterlikning till glomerulus och tubulointerstitiellt utrymme i njurar hos diabetiska njurmodell (db / db) möss in vivo (figur 3A). Dessutom visade qRT-PCR-analysen att injektion av PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic inducerade signifikant överuttryck av miRNA-181b-5p i njuren (figur 3B). Histologisk analys med periodisk syra-Schiff-färgning visade att injektion av PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic en gång per vecka från 10-20 veckors ålder hämmade utvecklingen av diabetisk njursjukdom hos db / db-möss in vivo (figur 3C). Däremot gav injektion av PEI-NPs-kontroll miRNA inte förebyggande effekter på njurfibros (figur 3B, C).
Leverans och effekter av PEI-NPs-miRNA-5100-mimic i akut njurskada modell möss producerade av IRI15
Fluorescerande mikroskopianalys visade att svansveninjektionen av PEI-NPs kunde leverera miRNA-efterlikning till glomerulus och tubulointerstitiellt utrymme hos AKI-modellmöss, njurar in vivo (figur 4A). qRT-PCR-analys visade att injektionen av PEI-NPs-miRNA-5100-5p-mimic inducerade signifikant överuttryck av miRNA-5100 i njurar hos AKI-möss producerade av IRI (figur 3B). Histologisk analys med hematoxylin-eosinfärgning visade att en enda injektion av PEI-NPs-miRNA-5100 reducerade tubulär cellapoptos (svart pil), vilket förhindrade AKI-utveckling i AKI-mössmodellen producerad av IRI. PEI-NPs-miRNA-5100-mimic injicerades via svansvenen 2 dagar före IRI-proceduren (figur 4B). Injektion av PEI-NPs-kontroll miRNA-visade inte förebyggande effekter på njurfibros (figur 4B, C).
Figur 1: Struktur av PEI-NPs-miRNA-mimic-komplexet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Leverans och effekter av PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic hos njurfibrosmöss . (A) Fluorescerande mikroskopianalys. Skalstapel = 200 μm. (B) qRT-PCR-analys av miRNA-146a-5p-uttrycksnivåer i varje grupp (n = 6 per grupp). (C) Histologisk analys med Sirius röd färgning (rött indikerar det fibrotiska området, skalstång = 100 μm). Injektion av PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic 1 dag före, 1 dag efter och 3 dagar efter UUO-behandling hämmade utvecklingen av njurfibros hos möss in vivo. (D) qRT-PCR-analys av njure för att undersöka potentiella IFN-svarseffekter på PEI-NPs-miRNA-146a-5p hos UUO-möss (n = 6 per grupp). Förkortningar: DAPI, 4,6-diamidino-2-fenylindol; FITC, fluoresceinisotiocyanat; qRT-PCR, kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid; NS, inte signifikant; PEI-NPs, polyetylenimin nanopartiklar; miRNA, mikroRNA; UUO, ensidig urinledarobstruktion; OAS1, 5′-oligoadenylatsyntas; STAT1, signaltransduktion och aktivator av transkription 1. Värdena representerar medel- ± standardfel (felstaplar). *P < 0,05. Morishita et al. (International Journal of Nanomedicine 2015, 10: 3475-3488. Ursprungligen publicerad av och använd med tillstånd från Dove Medical Press Ltd). 13. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Leverans och effekter av PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic i diabetisk njursjukdom modellmöss14. (A) Fluorescerande mikroskopianalys. Skalstapel = 200 μm. (B) qRT-PCR-analys för att utvärdera överuttryckseffekter av miRNA-181b-5p efter injektion av PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic (n = 3 per grupp). (C) Fenotypiska förändringar observerades med ljusmikroskopi. Injektion av PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic en gång per vecka från 12-20 veckors ålder hämmade utvecklingen av diabetisk njursjukdom hos db / db-möss in vivo. Skalstapel = 50 μm. Vi använde en variansanalys (ANOVA) för multipel jämförelseanalys testning mellan grupper. Om vi upptäckte statistisk signifikans av ANOVA, utförde vi Turkiets test för att jämföra medelvärdet för två grupper som en post hoc-analys. Förkortningar: PEI-NPs, polyetylenimin nanopartiklar; qRT-PCR, kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid; miRNA, mikroRNA. *P < 0,05. Denna siffra har modifierats från Ishii et al. 14. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Leverans och effekter av PEI-NPs-miRNA-5100-mimic i akut njurskada modell möss producerade av IRI . (A) Fluorescerande mikroskopianalys. Skalstapel = 100 μm. (B) qRT-PCR-analys för att utvärdera överuttryckseffekterna av miRNA-5100 efter injektion av PEI-NPs-miRNA-5100-mimic. (C) Histologisk analys av hematoxylin-eosinfärgad njure. Skalstång = 100 μm. PEI-NPs injicerade via svansvenen 2 dagar före IRI-proceduren förhindrar AKI-progression inducerad av IRI. Förkortningar: PEI-NPs, polyetylenimin nanopartiklar; qRT-PCR, kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid; miRNA, mikroRNA; AKI, akut njurskada; IRI, ischemi-reperfusionsskada. **P < 0,01,*P < 0,05. Denna siffra har modifierats från Aomatsu et al.15. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av protokollet som presenteras i detta manuskript kan PEI-NPs leverera miRNA-efterlikningar till njurarna för att inducera överuttryck av mål-miRNA, vilket resulterar i behandlingseffekter i in vivo-musmodeller av flera njursjukdomar, inklusive njurfibros, diabetisk njursjukdom och AKI.
Metoden för att förbereda komplexet av PEI-NP och miRNA-efterlikning är mycket enkel. Den positivt laddade ytan av PEI-NPs fångar miRNA-efterlikningen när de bara blandas 13,14,15,16,17 (figur 1). Dessutom, som en linjär polyetyleniminbaserad icke-viral vektor, undviker PEI-NP problem i samband med användning av virala vektorer, såsom IFN-svar och onkogenes inducerad av genetisk instabilitet11,15,16.
Injektion av PEI-NPs-mimic via svansvenen kan kräva träning eftersom svansvenerna hos möss med njursjukdom ibland är svåra att punktera på grund av uttorkning, särskilt hos AKI och feta db / db-möss. Dessutom kan upprepad injektion av PEI-NPs-miRNA-mimic krävas för flera musmodeller. Injektionsintervallen bör bestämmas av tidigare erfarenhet av hur överuttryck av PEI-NPs-miRNA-mimic sker i samband med varje musmodell för njursjukdom.
Virala vektorer används ofta för transfektion av miRNA mimic i njurar och kan leda till signifikant transfektion av miRNA 9,10. Virala vektorer har dock potentiella problem som att orsaka interferonrespons och/eller genetisk instabilitet11,12. Därför har flera alternativa leveransmetoder som använder icke-virala vektorer, såsom gelatin-NP 21,22, elektroporering23, hydrodynamisk injektion24,25 och transfektion med ultraljud 26, utvecklats. I detta manuskript introducerade vi PEI-NPs som en icke-viral vektor för njuren. Vissa icke-virala vektorer är mycket invasiva (elektroporering och hydrodynamisk injektion) och kan därför vara svåra att ansöka om klinisk användning. En jämförelse av PEI-NP med andra icke-virala vektorer, såsom lipidbaserade nanopartiklar och gelatin-NP, bör dock utvärderas i ytterligare studier.
Detta protokoll har följande begränsningar. För det första, även om PEI-NPs-miRNA är lämpliga för musmodeller (åtminstone som ett första steg), krävs stora mängder PEI-NPs-miRNA för stora djurmodeller (såsom råttor, kaniner, apor och hundar) som används för preklinisk forskning. Dessutom bör det noteras att PEI-NP inte levererade miRNA-efterlikning specifikt till njurarna eftersom PEI-NP, som virala vektorer, inte är ett riktat leveranssystem. Därför kan fenotypen hos andra organ behöva undersökas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av JSPS KAKENHI (bidrag nr 21K08233). Vi tackar Edanz (https://jp.edanz.com/ac) för redigeringen av utkast till detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
References
- Mohr, A. M., Mott, J. L.
- Bushati, N., Cohen, S. M.
- Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy. Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).
- Yheskel, M., Patel, V. Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic. Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Deng, M., et al. Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).
- Zhou, Y., et al. Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy. Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).
- Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives. Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).
- Morishita, Y., et al. Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo. International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).
- Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).
- Aomatsu, A., et al. MicroRNA expression profiling in acute kidney injury. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems. European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Swami, A., et al. A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).
- Kaneko, S., et al. Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).
- Yanai, K., et al. Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).
- Aomatsu, A., et al. A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).
- Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).
- Xia, Z., et al. Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47. American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).
- Tanaka, T., et al. In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy. American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).
- Hamar, P., et al. Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).
- Ma, D., et al. Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).
- Wei, S., et al. Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).
