Summary
Her leverer vi eksogene kunstig syntetiserte miRNA-etterligninger til nyrene via haleveneinjeksjon av en ikke-viral vektor og polyetylenimin nanopartikler i flere musemodeller for nyresykdom. Dette førte til betydelig overekspresjon av mål-miRNA i nyrene, noe som resulterte i hemmet progresjon av nyresykdom i flere musemodeller.
Abstract
mikroRNA (miRNA), små ikke-kodende RNA (21-25 baser) som ikke oversettes til proteiner, hemmer mange målbudbringer-RNA (mRNA) ved å destabilisere og hemme deres oversettelse i ulike nyresykdommer. Derfor er veksling av miRNA-ekspresjon ved eksogene kunstig syntetiserte miRNA-etterligninger et potensielt nyttig behandlingsalternativ for å hemme utviklingen av mange nyresykdommer. Men fordi serum RNAase umiddelbart nedbryter systematisk administrerte eksogene miRNA-etterligninger in vivo, er levering av miRNA til nyrene fortsatt en utfordring. Derfor er vektorer som kan beskytte eksogene miRNA-etterligninger fra nedbrytning av RNAase og levere dem betydelig til nyrene, nødvendige. Mange studier har brukt virale vektorer for å levere eksogene miRNA-etterligninger eller hemmere til nyrene. Imidlertid kan virale vektorer forårsake interferonrespons og/eller genetisk ustabilitet. Derfor er utviklingen av virale vektorer også et hinder for klinisk bruk av eksogene miRNA-etterligninger eller hemmere. For å overvinne disse bekymringene angående virale vektorer, utviklet vi en ikke-viral vektormetode for å levere miRNA-etterligninger til nyrene ved hjelp av haleveneinjeksjon av polyetylenimin nanopartikler (PEI-NP), noe som førte til betydelig overekspresjon av målmiRNA i flere musemodeller av nyresykdom.
Introduction
miRNAer, små ikke-kodende RNA (21-25 baser) som ikke oversettes til proteiner, hemmer mange målbudbringer-RNA (mRNA) ved å destabilisere dem og hemme deres oversettelse i ulike nyresykdommer 1,2. Derfor er genterapi som bruker eksogene kunstig syntetiserte miRNA-etterligninger eller hemmere et potensielt nytt alternativ for å hemme utviklingen av mange nyresykdommer 3,4,5.
Til tross for løftet om miRNA-etterligninger eller hemmere for genterapi, er levering til målorganer fortsatt et stort hinder for in vivo-eksperimenter for å utvikle sitt kliniske potensial. Fordi kunstig syntetiserte miRNA-etterligninger eller hemmere er gjenstand for umiddelbar nedbrytning av serum-RNase, forkortes halveringstiden ved systemisk administrering in vivo6. I tillegg er effektiviteten til miRNA-etterligninger eller hemmere for å krysse plasmamembranen og transfekt cytoplasma generelt mye lavere uten passende vektorer 7,8. Disse bevisene tyder på at utviklingen av miRNA-etterlignings- eller inhibitorleveringssystemet for nyrene er nødvendig, for å muliggjøre bruk i kliniske omgivelser og gjøre dem til et nytt behandlingsalternativ for pasienter med ulike nyresykdommer.
Virale vektorer har blitt brukt som bærere for å levere eksogene miRNA-etterligninger eller hemmere til nyrene 9,10. Selv om de er utviklet for biosikkerhet og transfeksjonseffekt, kan virale vektorer fortsatt forårsake interferonrespons og/eller genetisk ustabilitet11,12. For å overvinne disse bekymringene utviklet vi et miRNA-etterligningssystem for nyrene ved hjelp av polyetylenimin nanopartikler (PEI-NP), en ikke-viral vektor, i flere musemodeller av nyresykdom13,14,15.
PEI-NP er lineære polymerbaserte NPer som effektivt kan levere oligonukleotider, inkludert miRNA-etterligninger, til nyrene, og anses å foretrekke for fremstilling av ikke-virale vektorer på grunn av deres langsiktige sikkerhet og biokompatibilitet13,16,17.
Denne studien demonstrerer effekten av systematisk eksogen miRNA-etterligning med PEI-NP via haleveneinjeksjon i nyrefibrosemodellmus produsert ved ensidig ureterobstruksjon (UUO). I tillegg demonstrerer vi effekten av systematisk eksogen miRNA-etterligning med PEI-NP via haleveneinjeksjon i diabetisk nyresykdomsmodellmus (db / db mus: C57BLKS / J Iar - + Lepr db / + Leprdb) og akutt nyreskade modell mus produsert av renal iskemi-reperfusjonsskade (IRI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøksprotokoller ble godkjent av dyreetikkomiteen ved Jichi Medical University og utført i samsvar med retningslinjer for bruk og pleie av forsøksdyr fra Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals. Her demonstrerte vi miRNA-etterligning til nyrene som resulterte i overuttrykk ved bruk av UUO-mus. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen ved Jichi Medical University [Godkjenning nr. 19-12 for nyrefibrose, 17-024 for akutt nyreinfeksjon (AKI) og 19-11 for diabetisk nefropati].
1. Fremstilling av PEI-NPs-miRNA-etterligne kompleks
MERK: Her er fremstilling av PEI-NPs-miRNA-etterligne13,14,15 og PEI-NPs-control-miRNA (som en negativ kontroll) beskrevet for en mus.
- Forbered følgende elementer:
- Forbered 10 μL lineære PEI-NP.
- Forbered 50 μL kunstig syntetiserte miRNA oppløst i nukleasefritt vann i en konsentrasjon på 100 μM (5 nmol miRNA oppløst i 50 μL nukleasefritt vann).
- Forbered 50 μL kunstig syntetisert kontroll (ikke-mål) miRNA oppløst i nukleasefritt vann i en konsentrasjon på 100 μM (5 nmol miRNA oppløst i 50 μL nukleasefritt vann).
- Forbered 5% og 10% glukoseoppløsninger. Sørg for tilgjengeligheten av 1,5 ml mikrosentrifugerør og en virvelblander.
- Oppløs 10 μL PEI-NP i 90 μL 5% glukoseoppløsning i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Deretter virvler du røret forsiktig og spinner ned.
- Bland 50 μL kunstig syntetiserte miRNA (5 nmol) oppløst i nukleasefritt vann (100 μM konsentrasjon) med 50 μM 10% glukoseoppløsning i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Deretter virvler du røret forsiktig og spinner ned. Denne prosessen gir miRNA oppløst i 5% glukoseoppløsning.
- Bland 100 μL PEI-NP i 5% glukoseoppløsning og 100 μL miRNA-etterligning (5 nmol) i 5% glukoseoppløsning. Deretter virvler du røret forsiktig og spinner ned.
- Inkuber blandingen i 15 minutter ved romtemperatur (RT) for å fremstille et stabilt kompleks av PEI-NPs-miRNA-etterligning. Denne løsningen inneholder PEI-NP og miRNA-etterligning (5 nmol) i forholdet mellom nitrogen (N) i polymeren og fosfat (P) i nukleinsyrer (N / P-forhold) = 6 (figur 1).
MERK: PEI-NPs-control-miRNA-kompleks kan fremstilles ved hjelp av samme prosess som beskrevet i trinn 1.1-1.5 for alle nyresykdomsmusmodeller beskrevet i dette manuskriptet (UUO, diabetisk nefropati og AKI). Ett injeksjonsvolum av PEI-NP-miRNAs-etterligning er det samme som 5 nmol av miRNAs-etterligne konjugert med PEI-NP ved N / P-forhold = 6. Injeksjonsvarigheten og frekvensen av hver PEI-NP-miRNA-etterligning avhenger av sykdomsmodellen der den brukes.
2. Bekreftelse av signifikant levering av miRNA-etterligning til nyrene i UUO-mus ved PEI-NP via haleveneinjeksjon ved bruk av fluorescerende mikroskopi
MERK: Her er leveringsmetoden for kunstig renset miRNA-etterligning til nyrene utarbeidet, noe som indikerer etablering av terapeutiske metoder for ulike nyresykdommer. Kort fortalt ble UUO-mus administrert cyanin3-karboksylsyre (Cy3)-merket miRNA-etterligning tilsatt til 100 μL PEI-NP via halevenen. Leveransen til nyrene ble bekreftet med fluorescensmikroskopi. PEI-NPs-cyanin3 karboksylsyre (Cy3)-merket miRNA-etterligning (oligonukleotider) for en mus er beskrevet. Denne metoden kan betydelig levere miRNA-etterligning til nyrene i flere musemodeller, for eksempel UUO-mus, diabetiske nyresykdomsmus og AKI-mus produsert av IRI. Her brukte vi en UUO-musemodell for videodemonstrasjonen. Induksjonsmetoden til UUO ble beskrevet tidligere andre steder13. Følg disse protokollene innen seks dager etter UUO-operasjonen.
- Forbered følgende elementer:
- Forbered 2 μL PEI-NP og 100 μL Cy3-merkede dobbeltstrengede oligonukleotider [Cy3-merket miRNA-etterligning (1 nmol, 10 μM)].
- Forbered 5% og 10% glukoseoppløsninger. Sørg for tilgjengeligheten av 1,5 ml mikrosentrifugerør og en virvelblander.
- Bruk et 50 ml plastisk sentrifugerør med et lite hull i hetten for å isolere haleårene til UUO-mus.
- For fluorescensmikroskopi, klargjør optimal skjæretemperatur (OCT) forbindelse, en kryostat, flytende nitrogen, fosfatbufret saltvann (PBS), 1,0 ml sprøyter med en 27 G nål og silanbelagt glass.
MERK: Fluoresceinmerket Lotus tetragonolobus lektin (en proksimal tubuli markør) og 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) kan fremstilles for valgfri farging av proksimale tubuli og cellekjerner.
- Oppløs 2 μL PEI-NP i 98 μL 10% glukoseoppløsning i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Deretter virvler du røret forsiktig og spinner ned.
- Tilsett 100 μL Cy3-merket miRNA-etterligning til 100 μL PEI-NP i 10% glukoseoppløsning (fremstilt i trinn 2.2). Deretter virvler du røret forsiktig og spinner ned.
- Inkuber blandingen i 15 minutter ved RT for å forberede et stabilt kompleks av PEI-NPs-Cy3-merket-miRNA-etterligning.
- Plasser UUO-musen med hodet først i et 50 ml sentrifugerør uten bedøvelse, og legg deretter halen gjennom det forberedte hullet i hetten.
- Fyll en 1,0 ml sprøyte med en 27 G kanyle med 200 μL PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic kompleks.
- Injiser PEI-NPs-Cy3-miRNA-etterligning (200 μL) via musens hale ved hjelp av 1,0 ml sprøyten med 27 G nål.
MERK: Tørk av halevenen med bomullsull mettet i etanol (70% -80%) for å utvide halevenen og desinfisere injeksjonsområdet. - En time etter 200 μL PEI-NPs-Cy3-miRNA-etterligne kompleks injeksjon, bedøve musen med isofluran (4% -5%) ved hjelp av en passende bedøvelsesenhet for små dyr. Bekreft dybden av anestesi med fravær av tåklemmerefleks. Oppretthold anestesien med isofluran (3%) gjennom hele operasjonen.
- Deretter gjør du et snitt i huden, musklene og ribbeina med kirurgisk saks og tang for å avsløre hjertet. Etter å ha gjort et snitt i høyre atrium, injiser PBS i venstre ventrikkel for å trekke ut blod gjennom hele kroppen til nyrefargen endres til blekgul (noe som indikerer at hele muselegemet er perfusert med PBS).
MERK: Hjerteperfusjon utføres for å effektivt fjerne blodet i hele kroppen . - Stopp isofluran og fjern nyrene fra musene og vask dem med PBS. Fjern deretter nyrekapsler fra nyrene og vask nyrene to ganger med PBS.
- Legg inn nyrevevsprøvene i OCT-forbindelse og frys i flytende nitrogen.
- Bruk en kryostat for å forberede seksjoner (5 μm tykke). Monter seksjonene på silanbelagte glassglass og fest dem med 4% paraformaldehyd.
MERK: Nyrevev kan eventuelt farges med fluoresceinmerket Lotus tetragonolobus lektin (2 mg / ml) ved RT i 2 timer for proksimale tubuli, etterfulgt av DAPI (30 nM i PBS) ved RT i 15 minutter for cellekjerner. - Vask lysbildene forsiktig to ganger med PBS.
- Visualiser fluorescensfargingen ved fluorescensmikroskopi ved 100x og 400x forstørrelse og passende bildebehandlingsprogramvare.
3. Bekreftelse av mål-miRNA-endringer etter levering av miRNA-etterligning til nyre ved PEI-NP via injeksjon av halevene
- Utfør kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) for å bekrefte mål-miRNA-endringene.
MERK: Se den tidligere publiserte artikkelen for detaljer om qRT-PCR18,19,20. qRT-PCR-systemet som ble brukt til å generere de representative resultatene nedenfor ble endret av produsenten. qRT-PCR skal utføres i samsvar med den nyeste produsentens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MålmiRNAene for nyrefibrose, diabetisk nefropati og AKI beskrevet nedenfor ble valgt basert på mikromatrise, qRT-PCR og / eller databaseforskning for genterapiapplikasjoner. For ytterligere detaljer, se tidligere publikasjoner13,14,15.
Levering og effekter av miRNA-146a-5p-etterligning ved bruk av PEI-NP i nyrefibrosemus13
Fluorescerende mikroskopianalyse viste at haleveneinjeksjon av PEI-NP kunne levere miRNA-etterligningen til tubulointerstitialt rom. Hos nyrefibrosemus produsert av UUO inkluderte dette nyretubulære celler, som ikke har en regelmessig form i nyrene (figur 2A-pil), og glomerulus (figur 2A). qRT-PCR-analyse viste at injeksjon av PEI-NP-miRNA-146a-5p-etterligning induserte signifikant overekspresjon av miRNA-146a-5p i nyrene (figur 2B). Videre hemmet injeksjon progresjonen av nyrefibrose i modellmusene produsert av UUO, som estimert med Sirius rød farging (rød indikerer fibrotiske områder) in vivo. Injeksjon av PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic ble utført 1 dag før, 1 dag etter og 3 dager etter UUO-behandling (estimert 6 dager etter UUO-behandling) (figur 2C). Injeksjon av PEI-NP-kontroll miRNA viste ikke forebyggende effekt på nyrefibrose (figur 2B,C). Administrasjon av PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic og PEI-NPs-miRNA-control-miRNA forårsaket ikke en IFN-respons, slik som økt ekspresjon av 5-oligoadenylatsyntase og signaltransduksjon og aktivator av transkripsjon 1 hos mus (figur 2D).
Levering og effekter av miRNA-181b-5p-etterligning ved bruk av PEI-NP i diabetisk nyresykdom modell mus14
For å vurdere det terapeutiske potensialet til miRNA-181b-5p for diabetisk nyresykdom, injiserte vi miRNA-181b-5p-PIE-NP eller kontrollerte miRNA-PIE-NP i 10 uker gamle db / db mus ukentlig i 10 uker. Fluorescerende mikroskopianalyse viste at haleveneinjeksjon av PEI-NP kunne levere miRNA-etterligning til glomerulus og tubulointerstitielt rom i nyrer av diabetisk nyremodell (db / db) mus in vivo (figur 3A). I tillegg viste qRT-PCR-analysen at injeksjon av PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic induserte signifikant overekspresjon av miRNA-181b-5p i nyrene (figur 3B). Histologisk analyse med periodisk syre-Schiff-farging viste at injeksjon av PEI-NP-miRNA-181b-5p-etterligning en gang per uke fra 10-20 ukers alder hemmet progresjonen av diabetisk nyresykdom hos db/db-mus in vivo (figur 3C). I motsetning til dette ga injeksjon av PEI-NPs-kontroll miRNA ikke forebyggende effekt på nyrefibrose (figur 3B,C).
Levering og effekter av PEI-NPs-miRNA-5100-etterligning i akutt nyreskade modell mus produsert av IRI15
Fluorescerende mikroskopianalyse viste at haleveneinjeksjon av PEI-NP kunne levere miRNA-etterligning til glomerulus og tubulointerstitielt rom av AKI-modellmusnyrer in vivo (figur 4A). qRT-PCR-analyse viste at injeksjon av PEI-NPs-miRNA-5100-5p-etterligning induserte signifikant overekspresjon av miRNA-5100 i nyrer av AKI-mus produsert av IRI (figur 3B). Histologisk analyse med hematoksylin-eosinfarging viste at en enkelt injeksjon av PEI-NPs-miRNA-5100 reduserte tubulær celleapoptose (svart pil), noe som forhindret AKI-utvikling i AKI-musmodellen produsert av IRI. PEI-NPs-miRNA-5100-mimic ble injisert via halevenen 2 dager før IRI-prosedyren (figur 4B). Injeksjon av PEI-NPs-kontroll miRNA-viste ikke forebyggende effekt på nyrefibrose (figur 4B,C).
Figur 1: Struktur av PEI-NPs-miRNA-etterligningskomplekset. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Levering og effekter av PEI-NPs-miRNA-146a-5p-etterligning i nyrefibrosemus . (A) Fluorescerende mikroskopianalyse. Skalalinje = 200 μm. (B) qRT-PCR-analyse av miRNA-146a-5p-uttrykksnivåer i hver gruppe (n = 6 per gruppe). (C) Histologisk analyse med Sirius rød farging (rød indikerer fibrotisk område, skala bar = 100 μm). Injeksjon av PEI-NPs-miRNA-146a-5p-etterligne 1 dag før, 1 dag etter og 3 dager etter UUO-behandling hemmet utviklingen av nyrefibrose hos mus in vivo. (D) qRT-PCR-analyse av nyre for å undersøke potensielle IFN-responseffekter på PEI-NPs-miRNA-146a-5p hos UUO-mus (n = 6 per gruppe). Forkortelser: DAPI, 4,6-diamidino-2-fenylindol; FITC, fluoresceinisotiocyanat; qRT-PCR, kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon; NS, ikke signifikant; PEI-NP, polyetylenimin nanopartikler; miRNA, mikroRNA; UUO, ensidig ureter obstruksjon; OAS1, 5'-oligoadenylatsyntase; STAT1, signaltransduksjon og aktivator av transkripsjon 1. Verdier representerer gjennomsnitt ± standardfeil (feilfelt). * P < 0,05. Morishita et al. (International Journal of Nanomedicine, 2015, 10, 3475-3488. Opprinnelig utgitt av og brukt med tillatelse fra Dove Medical Press Ltd). 13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Levering og effekter av PEI-NPs-miRNA-181b-5p-etterligning i diabetisk nyresykdom modell mus14. (A) Fluorescerende mikroskopianalyse. Skala bar = 200 μm. (B) qRT-PCR-analyse for å evaluere overekspresjonseffekter av miRNA-181b-5p etter injeksjon av PEI-NPs-miRNA-181b-5p-etterligning (n = 3 per gruppe). (C) Fenotypiske forandringer ble observert ved lysmikroskopi. Injeksjon av PEI-NPs-miRNA-181b-5p-etterligne en gang per uke fra 12-20 ukers alder hemmet utviklingen av diabetisk nyresykdom i db / db mus in vivo. Skala bar = 50 μm. Vi benyttet variansanalyse (ANOVA) til multippel sammenlikningsanalyse mellom grupper. Hvis vi oppdaget statistisk signifikans av ANOVA, utførte vi Tyrkias test for å sammenligne gjennomsnittet av to grupper som en post hoc-analyse. Forkortelser: PEI-NP, polyetylenimin nanopartikler; qRT-PCR, kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon; miRNA, mikroRNA. * P < 0,05. Denne figuren er modifisert fra Ishii et al. 14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Levering og effekter av PEI-NPs-miRNA-5100-etterligning i akutt nyreskade modell mus produsert av IRI . (A) Fluorescerende mikroskopi analyse. Skala bar = 100 μm. (B) qRT-PCR-analyse for å evaluere overekspresjonseffektene av miRNA-5100 etter injeksjon av PEI-NPs-miRNA-5100-etterligning. (C) Histologisk analyse av hematoksylin-eosinfarget nyre. Skala bar = 100 μm. PEI-NP injisert via halevenen 2 dager før IRI-prosedyren forhindrer AKI-progresjon indusert av IRI. Forkortelser: PEI-NP, polyetylenimin nanopartikler; qRT-PCR, kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon; miRNA, mikroRNA; AKI, akutt nyreskade; IRI, iskemi-reperfusjonsskade. **P < 0,01,*P < 0,05. Denne figuren er modifisert fra Aomatsu et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av protokollen som presenteres i dette manuskriptet, kan PEI-NP levere miRNA-etterligninger til nyrene for å indusere overekspresjon av mål-miRNA, noe som resulterer i behandlingseffekter i in vivo musemodeller av flere nyresykdommer, inkludert nyrefibrose, diabetisk nyresykdom og AKI.
Metoden for å forberede komplekset av PEI-NP og miRNA-etterligning er veldig enkel. Den positivt ladede overflaten av PEI-NP fanger miRNA-etterligningen når de bare blandes 13,14,15,16,17 (figur 1). I tillegg, som en lineær polyetyleniminbasert ikke-viral vektor, unngår PEI-NP problemer forbundet med bruk av virale vektorer, slik som IFN-respons og onkogenese indusert av genetisk ustabilitet11,15,16.
Injeksjon av PEI-NP-etterligning via halevenen kan kreve trening siden haleårene til mus med nyresykdom noen ganger er vanskelige å punktere på grunn av dehydrering, spesielt hos AKI og overvektige db / db-mus. I tillegg kan gjentatt injeksjon av PEI-NPs-miRNA-etterligning være nødvendig for flere musmodeller. Injeksjonsintervaller bør bestemmes ut fra tidligere erfaring med hvordan overekspresjon av PEI-NPs-miRNA-mimic forekommer i sammenheng med hver musemodell for nyresykdom.
Virale vektorer brukes ofte til transfeksjon av miRNA-etterligning i nyrer og kan føre til signifikant transfeksjon av miRNA 9,10. Imidlertid har virale vektorer potensielle problemer som å forårsake en interferonrespons og / eller genetisk ustabilitet11,12. Derfor har flere alternative leveringsmetoder ved bruk av ikke-virale vektorer, som Gelatin-NP 21,22, elektroporering 23, hydrodynamisk injeksjon 24,25 og transfeksjon ved bruk av ultralyd 26, blitt utviklet. I dette manuskriptet introduserte vi PEI-NP som en ikke-viral vektor for nyrene. Noen ikke-virale vektorer er svært invasive (elektroporering og hydrodynamisk injeksjon), og kan derfor være vanskelige å anvende for klinisk bruk. Imidlertid bør en sammenligning av PEI-NP med andre ikke-virale vektorer, som lipidbaserte nanopartikler og gelatin-NP, evalueres i videre studier.
Denne protokollen har følgende begrensninger. For det første, selv om PEI-NPs-miRNA er egnet for musemodeller (i det minste som et første stadium), kreves store mengder PEI-NPs-miRNA for store dyremodeller (som rotter, kaniner, aper og hunder) som brukes til preklinisk forskning. I tillegg bør det bemerkes at PEI-NP ikke leverte miRNA-etterligning spesielt til nyrene fordi PEI-NP, som virale vektorer, ikke er et målrettet leveringssystem. Derfor kan det være nødvendig å undersøke fenotypen til andre organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av JSPS KAKENHI (Grant No. 21K08233). Vi takker Edanz (https://jp.edanz.com/ac) for redigering av utkast til dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
References
- Mohr, A. M., Mott, J. L.
- Bushati, N., Cohen, S. M.
- Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy. Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).
- Yheskel, M., Patel, V. Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic. Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Deng, M., et al. Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).
- Zhou, Y., et al. Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy. Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).
- Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives. Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).
- Morishita, Y., et al. Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo. International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).
- Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).
- Aomatsu, A., et al. MicroRNA expression profiling in acute kidney injury. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems. European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Swami, A., et al. A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).
- Kaneko, S., et al. Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).
- Yanai, K., et al. Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).
- Aomatsu, A., et al. A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).
- Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).
- Xia, Z., et al. Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47. American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).
- Tanaka, T., et al. In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy. American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).
- Hamar, P., et al. Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).
- Ma, D., et al. Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).
- Wei, S., et al. Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).
