Summary
在这里，我们通过在几种肾脏疾病小鼠模型中通过尾静脉注射非病毒载体和聚乙烯亚胺纳米颗粒 将 外源人工合成的miRNA模拟物输送到肾脏。这导致靶miRNA在肾脏中的显着过表达，导致几种小鼠模型中肾脏疾病的进展受到抑制。
Abstract
microRNA（miRNA）是未翻译成蛋白质的小非编码RNA（21-25个碱基），通过破坏和抑制它们在各种肾脏疾病中的翻译来抑制大量靶信使RNA（mRNA）。因此，通过外源人工合成的miRNA模拟物交替表达miRNA是抑制许多肾脏疾病发展的潜在有用治疗选择。然而，由于血清RNA酶会立即降解体内系统施用的外源性miRNA模拟 物，因此将miRNA递送到肾脏仍然是一个挑战。因此，能够保护外源性miRNA模拟物免受RNA酶降解并显着将其递送到肾脏的载体是必要的。许多研究使用病毒载体将外源性miRNA模拟物或抑制剂递送到肾脏。然而，病毒载体可能导致干扰素反应和/或遗传不稳定。因此，病毒载体的开发也是临床使用外源性miRNA模拟物或抑制剂的障碍。为了克服这些关于病毒载体的担忧，我们开发了一种非病毒载体方法，使用尾静脉注射聚乙烯亚胺纳米颗粒（PEI-NPs）将miRNA模拟物递送到肾脏，这导致靶miRNA在几种肾脏疾病小鼠模型中显着过表达。
Introduction
miRNA，即未翻译成蛋白质的小非编码RNA（21-25个碱基），通过破坏它们在各种肾脏疾病中的翻译来抑制大量靶信使RNA（mRNA）1，2。因此，采用外源性人工合成的miRNA模拟物或抑制剂的基因治疗是抑制许多肾脏疾病发展的潜在新选择3，4，5。
尽管miRNA模拟物或抑制剂有望用于基因治疗，但递送到靶器官仍然是体内实验开发其临床潜力的一大障碍。由于人工合成的miRNA模拟物或抑制剂会立即被血清RNA酶降解，因此在体内全身施用时，它们的半衰期缩短6。此外，如果没有合适的载体，miRNA模拟物或抑制剂穿过质膜和转染细胞质的效率通常要低得多7，8。这些证据表明，需要开发miRNA模拟物或肾脏抑制剂递送系统，使其能够在临床环境中使用，并使其成为各种肾脏疾病患者的新治疗选择。
病毒载体已被用作载体，将外源性miRNA模拟物或抑制剂递送到肾脏9，10。尽管病毒载体是为生物安全性和转染功效而开发的，但仍可能导致干扰素反应和/或遗传不稳定11，12。为了克服这些问题，我们在几种肾脏疾病小鼠模型中使用聚乙烯亚胺纳米颗粒（PEI-NPs）开发了miRNA模拟肾脏递送系统13，14，15。
PEI-NPs是基于线性聚合物的NPs，可以有效地将寡核苷酸（包括miRNA模拟物）递送到肾脏，并且由于其长期安全性和生物相容性，被认为是制备非病毒载体的首选13，16，17。
本研究证明了系统外源miRNA通过尾静脉注射模拟PEI-NPs递送对单侧输尿管梗阻（UUO）产生的肾纤维化模型小鼠的影响。此外，我们证明了系统外源miRNA模拟物通过尾静脉注射与PEI-NPs递送在糖尿病肾病模型小鼠（db / db小鼠：C57BLKS / J Iar -+Lepr db / + Leprdb）和由肾缺血再灌注损伤（IRI）产生的急性肾损伤模型小鼠中的影响。
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Protocol
所有动物实验方案均经吉智医科大学动物伦理委员会批准，并按照《吉智医科大学实验动物指南》中的实验动物使用和护理指南进行。在这里，我们证明了miRNA模拟递送到肾脏，导致其使用UUO小鼠过表达。本研究已获得吉智医科大学伦理委员会批准[肾纤维化批准号19-12，急性肾脏感染（AKI）批准17-024，糖尿病肾病批准19-11]。
1. PEI-NPs-miRNA模拟复合物的制备
注意：这里描述了一只小鼠的PEI-NPs-miRNA-模拟物13，14，15和PEI-NPs-对照-miRNA（作为阴性对照）的制备。
- 准备以下物品：
- 制备 10 μL 线性 PEI-NP。
- 制备 50 μL 人工合成的 miRNA 溶解在无核酸酶水中，浓度为 100 μM（5 nmol miRNA 溶解在 50 μL 无核酸酶水中）。
- 制备 50 μL 人工合成的对照（非靶标）miRNA 溶解在无核酸酶水中，浓度为 100 μM（5 nmol miRNA 溶解在 50 μL 无核酸酶水中）。
- 准备5%和10%的葡萄糖溶液。确保 1.5 mL 微量离心管和涡旋混合器的可用性。
- 将 10 μL PEI-NPs 溶解在 1.5 mL 微量离心管中的 90 μL 5% 葡萄糖溶液中。然后，轻轻涡旋管并向下旋转。
- 将溶解在无核酸酶水（100 μM 浓度）中的 50 μL 人工合成的 miRNA （5 nmol） 与 50 μM 10% 葡萄糖溶液在 1.5 mL 微量离心管中混合。然后，轻轻涡旋管并向下旋转。该过程产生溶解在5%葡萄糖溶液中的miRNA。
- 将 100 μL PEI-NPs 与 5% 葡萄糖溶液和 100 μL miRNA 模拟物 （5 nmol） 与 5% 葡萄糖溶液混合。然后，轻轻涡旋管并向下旋转。
- 将混合物在室温（RT）下孵育15分钟，以制备稳定的PEI-NPs-miRNA模拟物复合物。该溶液含有PEI-NPs和miRNA模拟物（5 nmol），聚合物中的氮（N）与核酸中的磷酸盐（P）的比例（N / P比率）= 6（图1）。
注意：PEI-NPs-control-miRNA复合物可以使用步骤1.1-1.5中描述的相同方法制备本手稿中描述的所有肾病小鼠模型（UUO，糖尿病肾病和AKI）。PEI-NP-miRNA 模拟物的一次进样体积与 5 nmol的 miRNA 模拟物与 PEI-NPs 偶联的 n/P 比率 = 6 相同。每种PEI-NP-miRNAs模拟物的注射持续时间和频率取决于应用它的疾病模型。
2.使用荧光显微镜通过尾静脉注射 通过 PEI-NP确认UUO小鼠miRNA模拟物显着递送到肾脏
注意：本文阐述了人工纯化的miRNA模拟物向肾脏的递送方法，表明建立了针对各种肾脏疾病的治疗方法。简而言之，UUO小鼠通过尾静脉施用花青3羧酸（Cy3）标记的miRNA模拟物添加到100μLPEI-NPs中。通过荧光显微镜检查确认向肾脏的输送。描述了PEI-NPs-花青3羧酸（Cy3）标记的miRNA模拟物（寡核苷酸）用于一只小鼠。该方法可以在几种小鼠模型中显着地将miRNA模拟物递送到肾脏，例如UUO小鼠，糖尿病肾病小鼠和IRI产生的AKI小鼠。在这里，我们使用UUO鼠标模型进行视频演示。UUO的诱导方法在前面的其他地方有描述13。在UUO手术后六天内遵循这些协议。
- 准备以下物品：
- 制备 2 μL PEI-NPs 和 100 μL Cy3 标记的双链寡核苷酸 [Cy3 标记的 miRNA 模拟物 （1 nmol; 10 μM）]。
- 准备5%和10%的葡萄糖溶液。确保 1.5 mL 微量离心管和涡旋混合器的可用性。
- 使用盖子上有小孔的 50 mL 塑料离心管分离 UUO 小鼠的尾静脉。
- 对于荧光显微镜，制备最佳切割温度 （OCT） 化合物、低温恒温器、液氮、磷酸盐缓冲盐水 （PBS）、带 27 G 针头的 1.0 mL 注射器和硅烷涂层玻璃。
注意：可以制备荧光素标记的 莲花四角 藻凝集素（近端小管标志物）和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）用于近端小管和细胞核的可选染色。
- 将 2 μL PEI-NPs 溶解在 1.5 mL 微量离心管中的 98 μL 10% 葡萄糖溶液中。然后，轻轻涡旋管并向下旋转。
- 在 10% 葡萄糖溶液中将 100 μL Cy3 标记的 miRNA 模拟物加入 100 μL PEI-NPs 中（在步骤 2.2 中制备）。然后，轻轻涡旋管并向下旋转。
- 将混合物在室温下孵育15分钟，以制备稳定的PEI-NPs-Cy3标记-miRNA-模拟物复合物。
- 将UUO小鼠头朝下放入没有麻醉的50 mL离心管中，然后将尾巴穿过盖子上准备好的孔。
- 用 27 G 针头填充 1.0 mL 注射器，其中含有 200 μL PEI-NPs-Cy3-miRNA 模拟复合物。
- 使用带有27 G针头的1.0 mL注射器通过小鼠尾静脉 注射 PEI-NPs-Cy3-miRNA模拟物（200μL）。
注意：用浸有乙醇（70%-80%）的棉绒擦拭尾静脉以扩张尾静脉并对注射区域进行消毒。 - 200μLPEI-NPs-Cy3-miRNA模拟复合物注射一小时后，使用适当的小动物麻醉装置用异氟醚（4%-5%）麻醉小鼠。确认麻醉深度，无脚趾夹伤反射。在整个手术过程中用异氟醚（3%）维持麻醉。
- 接下来，用手术剪刀和镊子切开皮肤、肌肉和肋骨，露出心脏。在右心房切开后，将PBS注射到左心室中，以抽出全身血液，直到肾脏颜色变为淡黄色（表明整个小鼠身体都注入了PBS）。
注意：进行心脏灌注以有效地去除全身血液。 - 停止异氟醚并从小鼠身上取出肾脏并用PBS清洗它们。之后，从肾脏中取出肾囊，并用PBS清洗肾脏两次。
- 将肾组织样品嵌入OCT化合物中并在液氮中冷冻。
- 使用低温恒温器制备切片（5μm厚）。将这些切片安装到硅烷涂层载玻片上，并用4%多聚甲醛固定。
注意：肾组织可以选择在室温下用荧光素标记的 莲花四角藻 凝集素（2mg / mL）染色2小时用于近端小管，然后在室温下对DAPI（PBS中的30nM）染色15分钟用于细胞核。 - 用PBS轻轻清洗载玻片两次。
- 通过 100 倍和 400 倍放大倍率的荧光显微镜和适当的成像软件可视化荧光染色。
3. 确认通过尾静脉注射 将 miRNA模拟物递送到肾脏后靶miRNA改变
- 执行定量实时聚合酶链反应 （qRT-PCR） 以确认目标 miRNA 交替。
注意：有关 qRT-PCR18、19、20 的详细信息，请参阅之前发表的文章。制造商更改了用于生成下面提供的代表性结果的qRT-PCR系统。qRT-PCR 应按照最新的制造商协议进行。
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Representative Results
根据微阵列、qRT-PCR 和/或基因治疗应用的数据库研究，选择了下面描述的用于肾纤维化、糖尿病肾病和 AKI 的靶 miRNA。有关更多详细信息，请参阅以前的出版物13，14，15。
使用PEI-NPs的miRNA-146a-5p模拟物在肾纤维化小鼠中的递送和作用13
荧光显微镜分析表明，尾静脉注射PEI-NPs可将miRNA模拟物递送至肾小管间质间隙。在UUO产生的肾纤维化小鼠中，这包括肾小管细胞，其在肾脏中没有规则形式（图2A 箭头）和肾小球（图2A）。qRT-PCR分析显示，注射PEI-NPs-miRNA-146a-5p-模拟物诱导miRNA-146a-5p在肾脏中显着过表达（图2B）。此外，注射抑制了UUO产生的模型小鼠肾纤维化的进展，如体内天狼星红色染色（红色表示纤维化区域）估计 的那样。 在UUO治疗前1天，后1天和3天（估计在UUO治疗后6天）注射PEI-NPs-miRNA-146a-5p-模拟物（图2C）。注射PEI-NPs对照miRNA未显示出对肾纤维化的预防作用（图2B，C）。给予PEI-NPs-miRNA-146a-5p-模拟物和PEI-NPs-miRNA-对照-miRNAs不会引起IFN反应，例如小鼠中5-寡腺苷酸合酶和信号转导和转录1激活剂的表达增加（图2D）。
使用PEI-NPs的miRNA-181b-5p模拟物在糖尿病肾病模型小鼠中的递送和效果14
为了评估miRNA-181b-5p对糖尿病肾病的治疗潜力，我们每周将miRNA-181b-5p-PIE-NPs或对照miRNA-PIE-NPs注射到10周龄 的db / db 小鼠中，持续10周。荧光显微镜分析表明，尾静脉注射PEI-NPs可以在 体内将 miRNA模拟物递送到糖尿病肾模型（db/db）小鼠肾脏的肾小球和肾小管间质间隙（图3A）。此外，qRT-PCR分析显示，注射PEI-NPs-miRNA-181b-5p-模拟物诱导miRNA-181b-5p在肾脏中显着过表达（图3B）。高碘酸-希夫染色的组织学分析表明，从10-20周龄开始每周注射一次PEI-NPs-miRNA-181b-5p-模拟物可抑制体内db / db小鼠糖尿病 肾病的进展（图3C）。相比之下，注射PEI-NPs对照miRNA对肾纤维化没有预防作用（图3B，C）。
PEI-NPs-miRNA-5100-模拟物在IRI 15生产的急性肾损伤模型小鼠中的递送和作用
荧光显微镜分析表明，尾静脉注射PEI-NPs可以在 体内将 miRNA模拟物递送到AKI模型小鼠肾脏的肾小球和肾小管间质间隙（图4A）。qRT-PCR分析表明，注射PEI-NPs-miRNA-5100-5p-模拟物诱导IRI产生的AKI小鼠肾脏中miRNA-5100的显着过表达（图3B）。苏木精-伊红染色的组织学分析显示，单次注射PEI-NPs-miRNA-5100可减少肾小管细胞凋亡（黑色箭头），从而阻止IRI产生的AKI小鼠模型中的AKI发生。PEI-NPs-miRNA-5100-模拟物在IRI程序前2天通过尾静脉 注射 （图4B）。注射PEI-NPs控制miRNA-没有显示出对肾纤维化的预防作用（图4B，C）。
图1：PEI-NPs-miRNA模拟复合物的结构。 请点击此处查看此图的大图。
图2：PEI-NPs-miRNA-146a-5p-模拟物在肾纤维化小鼠中的递送和作用 。 （A）荧光显微镜分析。比例尺 = 200 μm. （B） 每组 miRNA-146a-5p 表达水平的 qRT-PCR 分析（每组 n = 6）。（C）天狼星红染色的组织学分析（红色表示纤维化区域，比例尺= 100μm）。在UUO治疗前1天，后1天和3天注射PEI-NPs-miRNA-146a-5p-模拟物抑制小鼠体内肾纤维化 的发展。（D）肾脏的qRT-PCR分析，以研究UUO小鼠中PEI-NPs-miRNA-146a-5p的潜在IFN反应效应（每组n = 6）。缩写： DAPI，4，6-二脒基-2-苯基吲哚;FITC，异硫氰酸荧光素;qRT-PCR，定量实时聚合酶链反应;NS，不重要;PEI-NPs，聚乙烯亚胺纳米颗粒;miRNA，microRNA;UUO，单侧输尿管梗阻;OAS1，5′-寡腺苷酸合酶;STAT1，信号转导和转录激活剂1。值表示平均值±标准误差（误差线）。*P < 0.05。Morishita et al. （International Journal of NanoMedicine 2015 10 3475-3488.最初由Dove Medical Press Ltd出版并经其许可使用）。13. 请点击此处查看此图的大图。
图3：PEI-NPs-miRNA-181b-5p-模拟物在糖尿病肾病模型小鼠中的递送和效果14. （A）荧光显微镜分析。比例尺= 200μm。 （B）qRT-PCR分析以评估注射PEI-NPs-miRNA-181b-5p-模拟物后miRNA-181b-5p的过表达效应（每组n = 3）。（C）通过光学显微镜观察表型变化。从12-20周龄开始每周注射一次PEI-NPs-miRNA-181b-5p-模拟物可抑制体内db / db小鼠糖尿病肾病的进展。比例尺 = 50 μm。我们使用方差分析（ANOVA）进行组间多重比较分析检验。如果我们通过方差分析检测到统计显著性，我们进行了土耳其的测试，以比较两组的平均值作为事后分析。缩写：PEI-NPs，聚乙烯亚胺纳米颗粒;qRT-PCR，定量实时聚合酶链反应;miRNA，microRNA。*P < 0.05。该图由石井等人修改而成。14. 请点击此处查看此图的大图。
图4：PEI-NPs-miRNA-5100-模拟物在IRI产生的急性肾损伤模型小鼠中的递送和作用 。 （A）荧光显微镜分析。比例尺 = 100 μm。 （B） qRT-PCR 分析以评估注射 PEI-NPs-miRNA-5100 模拟物后 miRNA-5100 的过表达效应。（C）苏木精-伊红染色肾脏的组织学分析。比例尺 = 100 μm。在IRI手术前2天通过尾静脉 注射 PEI-NPs可防止IRI诱导的AKI进展。缩写：PEI-NPs，聚乙烯亚胺纳米颗粒;qRT-PCR，定量实时聚合酶链反应;miRNA，microRNA;AKI，急性肾损伤;IRI，缺血再灌注损伤。**P < 0.01，*P < 0.05。这个数字是从青松等人15修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
使用本手稿中提出的方案，PEI-NPs可以将miRNA模拟物递送到肾脏以诱导靶miRNA的过表达，从而在几种肾脏疾病的 体内小鼠模型中 产生治疗效果，包括肾纤维化，糖尿病肾病和AKI。
制备PEI-NPs和miRNA模拟物复合物的方法非常简单。PEI-NPs的带正电荷的表面在刚刚混合13，14，15，16，17时捕获miRNA模拟物（图1）。此外，作为一种基于线性聚乙烯亚胺的非病毒载体，PEI-NPs避免了与使用病毒载体相关的问题，例如由遗传不稳定性引起的IFN反应和肿瘤发生11，15，16。
通过尾静脉注射PEI-NPs-模拟物可能需要训练，因为患有肾脏疾病的小鼠的尾静脉有时由于脱水而难以穿刺，特别是在AKI和肥胖的db / db小鼠中。此外，对于几种小鼠模型，可能需要重复注射PEI-NPs-miRNA模拟物。注射间隔应通过在每个肾脏疾病小鼠模型的背景下PEI-NPs-miRNA-模拟物的过表达如何发生的预先经验来确定。
病毒载体经常用于肾脏中miRNA模拟物的转染，并可导致miRNA的显着转染9，10。然而，病毒载体存在潜在问题，例如引起干扰素反应和/或遗传不稳定11，12。因此，已经开发了几种使用非病毒载体的替代递送方法，例如明胶-NPs21，22、电穿孔23、流体动力注射24，25 和使用超声 26 的转染。在本手稿中，我们介绍了PEI-NPs作为肾脏的非病毒载体。一些非病毒载体具有高度侵入性（电穿孔和流体动力注射），因此可能难以申请临床使用。然而，PEI-NPs与其他非病毒载体（如脂质纳米颗粒和明胶-NPs）的比较应在进一步的研究中进行评估。
此协议具有以下限制。首先，尽管PEI-NPs-miRNA适用于小鼠模型（至少作为第一阶段），但用于临床前研究的大型动物模型（如大鼠，兔子，猴子和狗）需要大量的PEI-NPs-miRNA。此外，应该注意的是，PEI-NPs并没有特异性地将miRNA模拟物递送到肾脏，因为PEI-NPs与病毒载体一样，不是靶向递送系统。因此，可能需要研究其他器官的表型。
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Disclosures
提交人声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了JSPS KAKENHI的部分支持（批准号21K08233）。我们感谢Edanz （https://jp.edanz.com/ac）编辑这份手稿的草稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
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