Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Robust differentiering af humane iPSC'er i en ren population af adipocytter for at studere adipocytassocierede lidelser

Published: February 9, 2022 doi: 10.3791/63311
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF), 2College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation

Summary

Protokollen tillader generering af en ren adipocytpopulation fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er). Retinsyre bruges til at differentiere iPSC'er til mesenkymale stamceller (MSC'er), der anvendes til fremstilling af adipocytter. Derefter anvendes en sorteringsmetode baseret på Nilrød farvning til at opnå rene adipocytter.

Abstract

Nylige fremskridt inden for induceret pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) har gjort det muligt at generere forskellige celletyper, herunder adipocytter. De nuværende differentieringsmetoder har imidlertid lav effektivitet og producerer ikke en homogen population af adipocytter. Her omgår vi dette problem ved at bruge en all-trans retinologisk-baseret metode til at producere mesenkymale stamceller (MSC'er) med højt udbytte. Ved at regulere veje, der styrer celleproliferation, overlevelse og vedhæftning, muliggør vores differentieringsstrategi effektiv generering af embryonale kroppe (EB'er), der differentierer sig til en ren population af multipotente MSC'er. Det store antal MSC'er, der genereres ved denne metode, giver en ideel kilde til generering af adipocytter. Imidlertid er prøveheterogenitet som følge af adipocytdifferentiering fortsat en udfordring. Derfor brugte vi en Nile red-baseret metode til rensning af lipidbærende modne adipocytter ved hjælp af FACS. Denne sorteringsstrategi gjorde det muligt for os at etablere en pålidelig måde at modellere adipocytassocierede metaboliske lidelser ved hjælp af en pulje af adipocytter med reduceret prøveheterogenitet og forbedret cellefunktionalitet.

Introduction

Mesenkymale stamceller (MSC'er) fungerer som en effektiv forbigående ressource til fremstilling af celler af mesodermal oprindelse som adipocytter, osteocytter og chondrocytter, som yderligere kan bruges til modellering af deres respektive genetiske lidelser. Tidligere tilgange var imidlertid afhængige af at opnå disse MSC'er fra voksent væv 1, hvilket pålagde udfordringen med at få dem i stort antal fra donorerne og begrænsningen ved at holde dem funktionelt levedygtige under suboptimale in vitro-dyrkningsbetingelser 1,2. Disse hindringer har skabt et stort behov for at have en protokol til generering af MSC'er in vitro. Human inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) kan anvendes som en værdifuld kilde til MSC'er og udviser MSC-karakteristika 3,4,5. iPSC'er-afledte MSC'er kan bruges som en terapeutisk mulighed i flere sygdomme. Også iPSC'er-afledte MSC'ers evne til at generere adipocytter gør dem til en værdifuld in vitro human model til at studere human adipogenese, fedme og adipocytassocierede lidelser.

Nuværende differentieringsprotokoller for adipocytter kan klassificeres i to grupper, hvor den ene involverer differentiering af adipocytter ved hjælp af kemiske eller proteinbaserede cocktails, hvilket giver et resulterende udbytte på 30%-60%6,7,8,9, mens den anden involverer genetisk manipulation til robust induktion af nøgletranskriptionsfaktorer, der styrer adipocytudviklingen, for at give et udbytte på 80%-90%10, 11. Imidlertid rekapitulerer genetisk manipulation ikke den naturlige proces med adipocytdifferentiering og maskerer ofte de subtile paradigmer, der ankommer under adipogenese, hvilket gør det ineffektivt til sygdomsmodelleringsformål12,13. Derfor præsenterer vi en måde at sortere kemisk afledte modne adipocytter fra umodne ved fluorescerende mærkning af lipidbærende adipocytter ved hjælp af Nilrød.

Her præsenterer vi en protokol, der involverer forbigående inkubation af iPSC'er afledte embryoidlegemer (EB'er) med all-trans retinsyre for at producere et stort antal hurtigt prolifererende MSC'er, som yderligere kan bruges til at generere adipocytter14. Vi præsenterer også en måde at sortere kemisk afledte modne adipocytter fra den heterogene differentieringspulje ved fluorescerende mærkning af deres lipiddråber ved hjælp af et lipofilt farvestof; Nilen rød. Dette ville muliggøre generering af en ren population af modne adipocytter med forbedret funktionalitet til nøjagtigt at modellere adipocytassocierede metaboliske lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Undersøgelsen er godkendt af den relevante institutionelle forskningsetiske komité og udført i overensstemmelse med de etiske standarder, der er fastlagt i Helsingfors-erklæringen fra 1964 og dens senere ændringer eller sammenlignelige etiske standarder. Protokollen blev godkendt af Institutional Review Board (IRB) i HMC (nr. 16260/16) og QBRI (nr. 2016-003). Dette arbejde er også optimeret til hESC'er som H1 og H9. Blodprøver blev taget fra raske personer med fuldt informeret samtykke. IPSC'erne genereres fra mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) hos raske individer.

1. Dyrkning og vedligeholdelse af iPSC'er

  1. Plader med kældermembranmatrix fremstilles ved at rekonstituere belægningsmatrixen i knockout-DMEM i forholdet 1:80 og opbevares ved 4 °C.
  2. Forbered iPSCs kulturmedier ved at tilføje 50 ml 10x stamcelletilskudsmedier til 500 ml stamcellebasalmedier sammen med 5 ml 100x penicillin-streptomycin (P / S) og opbevar ved 4 ° C til kortvarig eller ved -20 ° C til langvarig brug.
  3. Beklæd pladerne med belægningsmatrix-1 ml til en 6-brønds plade, 500 μL til en 12-brønds plade, 250 μL til en 24-brønds plade - og inkuber pladen ved 37 °C i 1-2 timer.
  4. Fjern en prøve af iPSC'er kulturmedier og forvarm ved stuetemperatur før brug.
  5. Optø et hætteglas med iPSC'er (ESC'er eller iPSC'er) i et 37 °C vandbad og overfør til et 15 ml konisk rør indeholdende 2-3 ml kulturmedier.
  6. Centrifuger glasset ved 120 x g i 4 minutter ved stuetemperatur (RT-23 °C).
  7. Supernatanten fjernes og tilsættes 2 ml friske dyrkningsmedier suppleret med 10 μM ROCK-hæmmer (Y-27632). Cellerne anbringes i ét hul i en matrixbelagt plade med 6 huller, og pladen anbringes ved 37 °C.
  8. Efter 24 timer skal du fjerne mediet og udskifte det med friske kulturmedier.
  9. Skift mediet hver dag, indtil cellerne når 80% -90% sammenløb.
  10. Når du når sammenløb, passerer celler ved at følge nedenstående trin.
    1. Fjern mediet og vask cellerne med Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS).
    2. Der tilsættes iPSC'ers dissociationsreagens (se materialetabellen)-500 μL for en brønd med en plade med 6 huller, 250 μL for en brønd med en plade med 24 brønde og inkuberes i 1 min ved 37 °C.
    3. Dissociationsreagenset fjernes, og cellerne udtørres i 1 minut ved 37 °C.
    4. Saml cellerne ved hjælp af kulturmedier-1 ml til en brønd med en 6-brøndplade og 250 μL til en brønd med en 24-brøndplade - i et 15 ml konisk rør og centrifuger ved 120 x g i 4 minutter.
    5. Resuspender celler i kulturmedier-2 ml for en brønd med en 6-brøndplade og 500 μL for en brønd i en 24-brønds plade suppleret med 10 μM ROCK-hæmmer og plade dem på friske matrixbelagte plader ved 40% sammenløb.

2. Differentiering af iPSC i MSC'er

  1. Forbered MSC-differentieringsmedier ved at tilsætte 15 % føtalt bovint serum (FBS) og 1 % P/S til DMEM + pyruvat med lavt glukoseindhold og opbevares ved 4 °C.
  2. Når du har nået 80% sammenløb, skal du bruge iPSC'er til embryoid kropsdannelse (EB) ved at følge nedenstående trin.
    1. Cellerne vaskes med DPBS og inkuberes med dissociationsmedium/EDTA-500 μL for en brønd med en 6-brønds plade, 250 μL for en brønd med en plade med 24 brønde.
    2. Der inkuberes ved 37 °C i 1 min., dissociationsreagenset suges, og cellerne opbevares ved 37 °C i yderligere 1 min. For at starte MSC-differentiering kræves ~ 10-12 x 106 celler.
    3. Saml cellerne i et 15 ml konisk rør ved hjælp af kulturmedier. Sørg for at være meget forsigtig, mens du samler for at forhindre celler i at blive single og tillade EB-dannelse. Centrifuger cellerne ved 120 x g i 4 min.
    4. Resuspender cellerne i 3 ml MSC-differentieringsmedier indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer.
    5. Bland og fordel 0,5 ml/brønd i en 24-brønds ultralav fastgørelsesplade.
      BEMÆRK: Brug af ultralav fastgørelsesplade ville tilskynde til celleaggregering i EB'er snarere end deres fastgørelse på overfladen.
    6. Pladen anbringes i inkubatoren ved 37 °C.
  3. Efter 24 timer induceres de opnåede EB'er med behandling med høj retinsyre (RA) ved at følge nedenstående trin.
    1. Tilføj 10 μM RA til 3 ml MSC-differentieringsmedier. Saml EB'er i et 15 ml rør og lad dem slå sig ned i 15 minutter.
    2. Supernatanten fjernes fra EB'erne, og der tilsættes MSC-differentieringsmedier suppleret med 10 μM RA.
    3. Resuspender forsigtigt og fordel 0,5 ml / hul i den samme 24-brønds ultra-lave fastgørelsesplade.
    4. Pladen anbringes i inkubatoren ved 37 °C. Forstyr ikke EB'er i de næste 48 timer.
    5. Efter 48 timer samles EB'er i et 15 ml rør og lader dem slå sig ned i 15 minutter.
    6. Supernatanten fjernes fra EB'erne, og der tilsættes MSC-differentieringsmedier suppleret med 0,1 μM RA.
    7. Resuspender forsigtigt og fordel 0,5 ml / hul i den samme 24-brønds ultra-lave fastgørelsesplade.
    8. Pladen anbringes i inkubatoren ved 37 °C. Forstyr ikke EB'er i de næste 48 timer.
  4. Fjern den RA, der er føjet til cellerne, ved at følge nedenstående trin.
    1. Efter 48 timer efter den sidste RA-behandling skal du samle EB'erne og lade dem slå sig ned i 15 minutter.
    2. Supernatanten fjernes, og der tilsættes DMEM-medier med lavt glukoseindhold uden cytokiner.
    3. Resuspender forsigtigt og fordel 0,5 ml / hul i en 24-brønds ultra-lav fastgørelsesplade. Pladen anbringes i inkubatoren ved 37 °C.
  5. Plade de iPSC'er, der er afledt af EB'er, ved at følge nedenstående trin.
    1. Efter 48 timer fra det foregående trin (trin 2.4) samles EB'erne i et 15 ml rør og lader dem falde til ro i 15 minutter.
    2. Supernatanten fjernes og opslæmmes igen i 2 ml friske MSC-differentieringsmedier.
    3. Overfør til to brønde i en kældermembranmatrixbelagt 6-brøndplade.
    4. Skift mediet hver anden dag i yderligere 5 dage.
    5. Efter 5 dage fjernes det brugte medie, og det erstattes med friske MSC-differentieringsmedier, der indeholder 2,5 ng/ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF).
  6. Passage de belagte EB'er, når de når 80% -90% sammenløb, ved at følge nedenstående trin.
    1. Cellerne vaskes med DPBS, trypsin-EDTA-500 μL tilsættes til en brønd med en 6-brønds plade - og inkuberes cellerne ved 37 °C i 3 minutter.
    2. Saml cellerne ved hjælp af MSC-differentieringsmedier i et 15 ml konisk rør og drej ved 750 x g i 4 minutter.
    3. Resuspender i MSC-differentieringsmedier med 2,5 ng/ml bFGF og plade cellerne på kældermembranmatrixbelagte plader i forholdet 1:3.
    4. Gentag passagen, når cellerne når 70% -80% sammenløb. Det forventes at få 3-6 millioner celler med 2-3 passager.

3. Flowcytometrianalyse af iPSC'er-afledte MSC'er

BEMÆRK: Efter at have gennemgået 2-3 passager skal cellerne tilgås for effektiviteten af MSC-differentiering. Differentiering betragtes som vellykket, hvis cellerne udtrykker MSC-differentieringsmarkører-CD44, CD73, CD90 og CD105 med mere end 90% effektivitet og ikke udtrykker høje niveauer af hæmatopoietiske markører-CD14, CD19, CD34 og CD45. Effektiviteten af disse markører kan tilgås ved at følge nedenstående trin.

  1. Før cellerne ved hjælp af de trin, der er skitseret ovenfor (trin 2.6), og opnå 1 x 105 celler i en brønd i en v-bund 96-brøndplade.
  2. Pladen centrifugeres ved 375 x g i 4 minutter ved 4 °C.
  3. Resuspender 1 x 105 celler i 100 μL kold DPBS med 1 μL konjugeret antistof (Ab) (se materialetabel) og inkuber ved 4 °C i 30-40 minutter, hvilket forhindrer udsættelse for lys.
  4. Resuspender yderligere 1 x 105 celler i 100 μL kold DPBS med den respektive isotypekontrol af den konjugerede Ab i en koncentration på 1:100 ) og inkuber ved 4 °C i 30-40 minutter, hvilket forhindrer udsættelse for lys.
  5. Efter inkubation centrifugeres pladen ved 375 x g i 4 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres ved at ryste tallerkenen over vasken.
  6. Resuspender cellerne i 100 μL kold DPBS.
  7. Cellerne centrifugeres ved 375 x g i 4 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres.
  8. Resuspender cellerne i 200 μL kold DPBS og saml dem i mørke, kolde 1,5 ml mikrocentrifugerør og hold dem på is, indtil de analyseres ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS).
  9. Til FACS-analyse fordeles cellerne ved hjælp af sidespredt (SSC-A) versus fremadspredt (FSC-A) for at udelukke affaldet. Fordel endvidere de lukkede celler ved hjælp af fremadrettet spredt højde (FSC-H) versus fremadrettet spredt område (FSC-A) for at skelne singlets fra dubletter fra den levende cellepopulation.
    BEMÆRK: Celler blev lukket i forhold til skiftet af isotypekontrol for hver markør, og mindst 10.000 lukkede begivenheder fra hver farvet prøve blev brugt til analyse.

4. Differentiering af MSC'er i adipocytter

  1. Forbered basalmedier til adipocytdifferentiering ved at tilsætte 10 % knockout-serumerstatning (KOSR), 1 % glutamin, 1 % P/S, 4,5 ng/μl glucose til minimale essentielle medier (MEM)-alfa og opbevares ved 4 °C.
  2. Tillad MSC'er at nå over 90% sammenløb. Fortsæt med at dyrke dem i yderligere 48 timer for at give dem mulighed for at gennemgå en periode med vækststop.
  3. Forbered komplette adipocytdifferentieringsmedier ved at tilsætte 100 μg/ml 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), 1 μM dexamethason, 0,2 E/ml insulin, 100 μM indomethacin og 10 μM rosiglitazon til basalmediet.
  4. Fjern MSC-differentieringsmedier, og vask cellerne ved hjælp af DPBS.
  5. Der tilsættes komplette adipocytdifferentieringsmedier - 2 ml til en brønd med en 6-brøndplade og 1 ml til en brønd med en 12-brøndplade - og inkuber cellerne ved 37 °C. Skift komplette differentieringsmedier hver anden dag i 14 dage.

5. Evaluering af differentieringseffektiviteten af adipocytter

  1. På dag 14 af differentiering skal du kontrollere effektiviteten af differentiering ved farvning af celler for adipocytmodningsmarkører, FABP4 og adiponectin.
  2. Fjern mediet og vask cellerne med DPBS.
  3. Fastgør cellerne ved hjælp af 4% paraformaldehyd (PFA) - 200 μL til en brønd med en 24-brøndplade - og inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter.
  4. Kassér PFA'en og vask med tris-bufret saltvand med 0,5% tween (TBST) og læg den på en ryster ved stuetemperatur i 15 min. Gentag processen to gange.
  5. Permeabiliser de faste celler med fosfatbufret saltvand med 0,5% Triton X-100 (PBST) og læg det på en ryster ved stuetemperatur i 15-20 minutter.
  6. PBST kasseres, og den blokerende buffer (5%-6% bovint serumalbumin (BSA) i PBST)-500 μL tilsættes til en brønd med en plade med 6 huller og 250 μL til en brønd med en plade med 12 huller, og der inkuberes ved stuetemperatur på rysteren i 40-60 minutter.
  7. Fortynd de primære antistoffer mod FABP4, adiponectin i 2% -3% BSA, i en koncentration på 1:500 (se materialetabel). Disse antistoffer tilsættes kun, hvis de er opdrættet i forskellige dyr, og pladen anbringes på rysteren ved 4 °C natten over.
  8. Fjern de primære antistoffer og vask cellerne tre gange med TBST (15 min hver) og læg det på en ryster ved stuetemperatur.
  9. Forbered Alexa Fluor sekundære antistoffer i PBST (1:500). Inkuber cellerne i de sekundære antistofkombinationer (i henhold til den art, hvor det primære antistof er hævet ) i 60 minutter ved stuetemperatur og dæk pladen med aluminiumsfolie for at beskytte den mod lys.
  10. Kassér de sekundære antistoffer, vask med TBST tre gange, og læg pladen på rysteren.
  11. For at plette kernerne tilsættes 1 μg/ml Hoechst 33342-200 μL til et hul med en plade med 24 huller, der er fortyndet i PBS, og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
  12. Hoechst-opløsningen kasseres, og der tilsættes PBS-500 μL til cellerne til et hul med en plade med 24 huller. Hold pladerne dækket af lys, indtil de visualiseres ved hjælp af et omvendt fluorescensmikroskop.

6. Sortering af adipocytter ved hjælp af Nilrød

  1. Forbered Nilens røde arbejdsopløsning ved at tilsætte 1 mg/ml Nilens rødstamopløsning i DMSO og opbevar ved -20 °C. Lige før brug optø Nilens røde stamme og rekonstituere i DPBS for at opnå en koncentration på 300 nM arbejdsløsning.
  2. På eller efter dag 14 af adipocytdifferentiering kasseres mediet fra cellerne og vaskes ved hjælp af DPBS.
  3. Tilsæt Nilrød arbejdsopløsning -1 ml i en brønd med en 6-brønds plade- og inkuber ved 37 °C i 15 minutter.
  4. Den Nilrøde opløsning fjernes, og trypsin-EDTA -500 μL tilsættes i et hul med en plade- med 6 huller, og der inkuberes ved 37 °C i 4 minutter.
  5. Opsaml cellerne ved hjælp af DMEM indeholdende 5% FBS i et 15 ml konisk rør. Centrifuger ved 750 x g i 4 min.
  6. Supernatanten fjernes og opslæmmes i DPBS-1 ml i 1 x 106 celler. Centrifuger ved 750 x g i 4 min.
  7. Supernatanten fjernes og opslæmmes i DPBS-1 ml i 1 x 106 celler. Brug en FACS-sortering til at isolere Nilens rødpositive celler ved hjælp af FL1-kanalen.
  8. Genkultur de sorterede celler i adipocytdifferentieringsmedier eller saml de sorterede celler til RNA- og proteinisolering.
  9. Uddrag RNA fra de sorterede celler og udfør relativ kvantitativ analyse af adipocytdifferentieringsmarkører, herunder FABP4, PPARG og C / EBPA. Nilens rødpositive celler viser en signifikant opregulering i genekspressionen af mindst to folder sammenlignet med usorterede celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skematisk og morfologi af celler under mesenkymal differentiering: Differentiering af iPSC'er i MSC'er involverer forskellige udviklingsstadier, der spænder over EB-dannelse, MSC-differentiering og MSC-ekspansion (figur 1). I løbet af disse udviklingsstadier erhverver celler forskellige morfologier på grund af de forskellige stimulerende kemikalier, de udsættes for. Ved initiering af differentiering belægges celler i suspension og forventes at være runde med definerede cellekanter, mens de er små til mellemstore i diameter (figur 2). Valg af dyrkning af celler i suspension i den indledende fase af differentiering gør det muligt at ligne processen med naturlig embryonal udvikling, hvilket gør denne fase meget afgørende for vellykket differentiering. Fasen med EB-dannelse og RA-behandling efterfølges af plettering af EB'er på kældermembranmatrixbelagte plader. EB'ernes levedygtighed ved plettering kan tilgås ved at observere deres hurtige spredningsadfærd, hvilket giver anledning til flere MSC'er (figur 2). Denne hurtige spredningsadfærd, der udvises af MSC'er, bevares, selv efter at de er ført på friske matrixbelagte plader sammen med bevarelse af ejendommelig, langstrakt morfologi (figur 2).

Kvantitativ vurdering af MSC-overflademarkører: MSC'ers differentieringseffektivitet tilgås ved kvantificering af overflademarkører, der er specifikke for MSC-differentiering. God differentiering, der producerer pålidelige MSC'er, bør vise større end 90% effektivitet af mesenkymale overflademarkører CD73, CD44 og CD90 (figur 3A). Derudover vurderes celler også for fraværet af overflademarkører, der viser hæmatopoietisk fænotype, CD14, CD34 og CD19, og forventes derfor at vise mindre end 1% ekspressionseffektivitet for dem (figur 3B).

Differentiering af MSC'er i adipocytter: Differentiering af MSC'er i adipocytter kan tilgås ved farvning for FABP4 og adiponectin. FABP4 er et cytoplasmatisk protein, og det betragtes som en markør for terminalt differentierede adipocytter. Dens høje ekspression blandt adipocytter med en cytoplasmatisk fordeling er et nøgletegn på deres udviklingsmæssige modenhed (figur 4A). Ud over FABP4 betragtes adiponectin som en af de vigtige markører for adipocytmodenhed. Dens høje udtryk indikerer, at adipocytter er funktionelle nok til at gennemgå lipidopbevaring og adipogenese som reaktion på glukosesignalering. Som et sekretorisk protein udviser adiponectin kuglemorfologi med hver proteinkugle, der let kan skelnes inden for cytoplasmaet (figur 4B).

Farvning og sortering af modne adipocytter ved hjælp af Nilrød: Efter differentiering kan modne adipocytter skelnes fra deres umodne modstykker ved farvning for Nilrød. Nilrød binder til lipidbærende adipocytter, en karakteristik eksklusiv for modne adipocytter (figur 5A). Dette sammen med det fluorescerende leje, der er karakteristisk for Nilrød, gør det til et effektivt værktøj til sortering af modne adipocytter ved hjælp af fluorescerende aktiveret flowcytometri (figur 5B). Effektiv sortering bør resultere i forbedring af modningsmarkører-PPARG, C/EBPA og FABP4-med mindst to gange, bestemt ved kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) (figur5C).

Figure 1
Figur 1: Skematisk diagram, der viser differentieringen af iPSC'er i MSC'er og adipocytter. iPSC'er differentieres til MSC'er ved hjælp af embryoid body (EB) teknikken. EB'erne udsættes for en kort eksponering på 10 μM all-transretinsyre (RA). De genererede MSC'er differentieres i 40% -77% adipocytter baseret på iPSC-linjen. Nilens røde positive celler sorteres ved hjælp af FACS for at opnå en oprenset population af modne adipocytter, der kan bruges til at studere adipocytassocierede lidelser (sygdomsmodellering), identificere nye lægemidler og til sidst til personlig terapi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Differentiering af iPSC'er i MSC'er. Repræsentative morfologiske billeder, der viser forskellige stadier af MSC-differentiering på dag 2 (D2), 11 (D11), 15 (D15) og 24 (D24). Embryoidlegemer (EB'er) genereret i nærværelse af 10 μM RA i 24 timer blev belagt på dag 8 af differentiering, efterfulgt af dissociation og passaging efter 12-17 dages differentiering. MSC'erne blev passeret flere gange. Forkortelser: P2 = passage 2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Ekspression af MSC-markører og hæmatopoietiske markører i iPSC-afledte MSC'er. Repræsentative flowcytometrihistogrammer, der viser ekspressionen af MSC-markørerne, CD73, CD44 og CD90, (A) og de hæmatopoietiske markører, CD34, CD19 og CD14 (B) i MSC'erne genereret fra iPSC-afledte EB'er behandlet med 10 μM RA. X-aksen i grafen repræsenterer den fluorescerende intensitet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Differentiering af iPSC-afledte MSC'er i adipocytter. Immunfarvningsbilleder, der viser ekspressionen af FABP4 (A) og adiponectin (ADIPO) (B) i modne adipocytter afledt af iPSC'er. Kernerne var farvet med Hoechst. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Sortering af iPSC-afledte adipocytter ved hjælp af Nilrød. (A) Billeder, der viser lyse felt (BF) og Nilens rødfarvede modne adipocytter. (B) Kvantificering af Nilrøde (PE-positive celler) i modne adipocytter ved hjælp af FACS. (C) PCR-analyse i realtid, der viser ekspressionen af C/EBPA, FABP4 og PPARG i sorterede versus usorterede modne adipocytter. Data repræsenteres som gennemsnitlig ± SD; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol har afgørende betydning på grund af dens evne til at levere MSC'er med højt udbytte og effektivitet. Denne masseproduktion af MSC'er blev muliggjort ved forbigående inkubation af iPSC'er-afledte EB'er med 10 μM RA14,15. Transient behandling med 10 μM RA forbedrede MSC-udbyttet med 11,2 til 1542 gange14,15, idet denne protokol kan anvendes på både iPSC'er og hPSC'er. Ved denne dosis og behandlingsvarighed forbedrer leddegigt EB-dannende cellers proliferative og overlevelseskapacitet ved direkte eller indirekte regulering af ekspressionen af flere gener, der er involveret i celleproliferation, apoptose og celle- og ECM-celleadhæsioner, som er kritiske for overlevelse og spredning af iPSC'er14,16. Generne omfatter, men er ikke begrænset til, transkriptionsfaktorer (såsom EGFR4, SOX4), vækstfaktorer og vækstfaktorreceptorer (såsom IGF2, FGFR4) og vedhæftningsmolekyler (såsom FN1 og CAM'er). I modsætning til lave doser (0,1-10 μM) regulerer RA imidlertid negativt spredning og overlevelse af EB-dannende celler ved høje doser (≥20 μM), hvilket resulterer i reduceret PSC-afledt EB-antal og -størrelse og derved et nedsat udbytte af MSC'er14. RA betragtes som en proliferationshæmmer i flere normale differentierede og kræftceller17,18,19. I EB'er er retinoidsignalering kontekstafhængig (tid, koncentration, art og cellelinje); differentielt påvirker selvfornyelse, overlevelse og differentiering af EB-dannende celler ved at regulere forskellige gener og signalveje20,21. Derfor er brugen af RA på en optimal tid og koncentration af RA-10 μM på dag 3 af EB-induktion efterfulgt af dosisreduktion til 0,1 μM på dag 5 i 2 dage som beskrevet i denne protokol afgørende for at inducere EB-dannende celleoverlevelse og proliferation.

Ud over at regulere vækst og overlevelse udsætter RA de behandlede EB'er for differentieringsforsinkelse sammenlignet med celler, der ikke er behandlet med RA14. Faktisk bevarer RA-behandlede EB'er deres kompakte form efter plettering og undlader at differentiere sig til MSC-lignende celler i modsætning til RA-ubehandlede EB'er. Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der rapporterer, at kortvarig eksponering for RA-behandling hæmmer celledifferentiering gennem undertrykkelse af WNT-signalering21. Desuden viste disse RA-behandlede differentieringsforsinkede celler også forbedret ekspression af cadherin og ekstracellulære matrixproteiner14, som vides at spille en vigtig rolle i opretholdelsen af den pluripotente tilstand af iPSC'er16. For at frigøre den RA-medierede differentieringsblok skal EB'er adskilles, hvilket resulterer i forstyrrelse af celleadhæsioner og muliggør langsigtet MSC-differentiering ved plettering. Interessant nok holdt RA-behandling en differentieringsblok over celler, men det opretholdt ikke cellerne i en pluripotent tilstand. Faktisk viser de EB-dannende celler, der gennemgår kortvarig eksponering for 10 μM RA, signifikant reduceret ekspression af vigtige pluripotensmarkører-OCT4, SOX2 og NANOG14.

MSC'erne, der genereres ved kortvarig RA-behandling af EB'er, har vist sig at opretholde deres typiske fibroblastlignende morfologi med rigelig ekspression af MSC-overflademarkører og deres multistyrke efter kryopræservering, hvilket gør disse masseproducerede MSC'er lagerbare til langsigtede ekspansionsundersøgelser14. Når de udsættes for adipogene, kondrogene og osteogene differentieringsbetingelser, kunne disse MSC'er let differentiere sig til de tre mesodermale celletyper, hvilket gør dem til en let opnåelig kilde til modellering af vævsrelaterede sygdomme14. Således giver MSC'ernes stabile og alsidige in vitro-adfærd , der genereres af den RA-medierede differentieringsprotokol, dem afgørende betydning i forsknings- og applikationsbaserede indstillinger.

Mens de kondrogene og osteogene differentieringspotentialer for MSC'er opnået fra RA-behandlede EB'er synes at svare til MSC'erne opnået fra ubehandlede EB'er, viste førstnævnte sig at udvise et øget potentiale til at differentiere sig til adipogen afstamning, når de udsættes for adipogene differentieringsbetingelser14. Dette blev påvist ved en 2 til 3 gange stigning i intracellulær lipidakkumulering (Oil Red O-farvning) og adipocytmarkør FABP4-positive celler i differentieringspuljen af celler opnået efter dyrkning af MSC'erne afledt af RA-behandlede EB'er med adipogene differentieringsmedier sammenlignet med MSC'er afledt af RA-ubehandlede EB'er. Dette kan være konsekvensen af RAs regulering af flere signalveje, der styrer adipocytudvikling, såsom flodhest, WNT og ECM-celleinteraktionsveje, som afsløret af RNA-sekventeringsdata fra RA-behandlede og ubehandlede EB'er 14,22,23,24,25. Denne forbedrede evne hos RA-afledte MSC'er til at gennemgå adipogen differentiering er værdifuld, da de aktuelt tilgængelige protokoller enten fører til dårligt adipocytudbytte eller gør brug af genetisk manipulation, hvilket gør de genererede adipocytter uvurderlige til at udlede naturlige procesrekapitulerede adipocytter. Adipocytter klassificeres i tre typer-hvid, brun og beige. Hvide adipocytter klassificeres ved tilstedeværelsen af en enkelt lipiddråbe og spiller en rolle i energilagring. Mens brune adipocytter er involveret i energiforbrug ved substratoxidation på grund af den meget høje overflod af mitokondrier, der er kendetegnet ved ekspressionen af UCP1. Mens de brune adipocytter, der findes lokaliseret i hvidt fedtvæv, er kendt som beige-eller brun-lignende-adipocytter. Disse MSC har potentiale til at give et rigeligt udbytte af hvide adipocytter givet EB'ers præeksponering for RA. Tidligere publikationer har angivet selektiv induktion af iPSC i celler, der udtrykker lav UCP1, dvs. hvide adipocytter, snarere end at udsætte celler med høje UCP1-niveauer for RA26. Tidligere publikationer har rapporteret, at RA produceret fra neurale kamceller i muse- og zebrafiskembryoner spiller en vigtig rolle i dannelsen af hvid adipocyt27,28.

Selvom den RA-baserede protokol tillod generering af MSC'er, der giver øget udbytte af adipocytter, der når 48,5% -77,4% (vs. 22,5% -57,6% uden RA-behandling), er det stadig problematisk ikke at opnå >90% ved modellering af multivariante adipocytbaserede genetiske lidelser in vitro. Faktisk kan ikke at nå en ren adipocytpopulation gøre resultater fra multivariante sygdomsmodeller ambivalente, da det ville være svært at skelne, om de observerede udviklingsforskelle skyldes de forskellige genetiske sammensætninger eller på grund af inkonsekvent differentieringseffektivitet. For at omgå dette problem var det vigtigt at sortere de differentierede celler for at opnå en pulje af rene modne adipocytter, så eventuelle forskelle i fænotyper kun kunne tilskrives iboende genetiske forskelle. Flere undersøgelser har identificeret overflademarkører på adipocytter, der potentielt kan bruges til sortering. For eksempel tillod arbejde udført af Ronald Kahn identifikation af aminosyretransportøren ASC-1 som en ny overflademarkør på hvide adipocytter29. Derudover har undersøgelser, der ekstraherer modne adipocytter fra omentale og subkutane regioner, rapporteret modne adipocytter til at udtrykke CD34, CD36 og CD59 på deres overflader30, hvor CD36 er rapporteret at fungere som fedtsyretransportør på overfladen af modne adipocytter31. Disse undersøgelser har imidlertid gjort brug af heterogene populationer af celler afledt af fedtvævet uden at specificere ekspressionen af disse markører til kun modne adipocytpopulationer. Desuden kan disse markører også udtrykkes af andre celletyper og er ikke specifikke for adipocytter. For eksempel er ASC-1 til stede på både astrocytter og neuroner32, CD34 er en markør for hæmatopoietiske stamceller33, CD36 er til stede på blodplader, mononukleære fagocytter, hepatocytter, myocytter og nogle epitel33, og CD59 udtrykkes på endotel- og lymfoide celler34,35. Derfor blev Nilrød, den selektive fluorescerende plet til intracellulære lipider, som en mulig kandidat til sortering af adipocytter som en alternativ løsning. Adipocytter opbevarer en betydelig masse lipider, der kan frigives og bruges til at producere energi, bygge membraner eller som signalmolekyler, der regulerer stofskiftet36. Nilrødt farvestof er tidligere blevet brugt i flowcytometri og mikroskopi til at plette adipocytter afledt af murine og humane MSC'er37. Tidligere undersøgelser har rapporteret brug af Nilrød til ESC-afledte adipocytter og forbedring af adipocytmarkører efter sortering38. De adipocytter, der genereres fra MSC'erne opnået ved den nuværende RA-baserede protokol, blev vurderet for deres evne til at blive farvet af Nilrød, hvilket indikerer deres modenhed, og sorteret for at rense dem. Disse Nile rødsorterede celler udviste en to til tre gange stigning i ekspressionen af adipocytmodningsmarkørerne, herunder PPARG, C/EBPAog FABP4 sammenlignet med usorterede celler, hvilket yderligere øger udbyttet af iPSC-afledte adipocytter. Selvom disse markører udtrykkes før lipidakkumulering, mærker deres ekspression en celle til terminal differentiering til lipidbærende adipocytter. Kontrol af sorteringseffektivitet ved hjælp af disse markører giver os mulighed for at identificere en pulje, hvor alle celler er udtryksfulde FABP4, CEBPaog PPARg, hvilket indikerer en pool, som var forudbestemt til moden adipocytdannelse. Celler sorteres baseret på deres farvningspotentiale til Nilrød. Oprensningseffektiviteten steg med to til tre gange på grund af det høje antal adipocytter i den usorterede fraktion. Størrelsen af lipidbærende adipocytter varierer stort set under differentiering, hvor en pulje af celler med identisk størrelsesfordeling sorteres. Usorteret fraktion omfatter lipidbærende adipocytter, men de er ikke fuldt modne og styres af forskellige størrelsesforhold.

Heterogeniteten af MSC'er isoleret fra menneskekroppen er tidligere blevet rapporteret39. Denne heterogenitet afhænger af flere faktorer, såsom MSC-oprindelse, donorer og betingelser39. Dette kan føre til variationer i deres effektivitet i behandlingen af forskellige sygdomme. Denne undersøgelse tyder på, at kort RA-behandling af hPSC'er, der er produceret under GMP-kompatible dyrkningsbetingelser, ville give en homogen population af MSC'er. Dette indikerer, at den nuværende protokol er en lovende tilgang til generering af et stort antal MSC'er af klinisk kvalitet, der kan bruges til MSC-baseret terapi.

Kombinationen af den RA-baserede MSC-differentieringsprotokol, der førte til adipocytdifferentiering og Nilens rødsorteringsprotokol, gjorde det muligt for os at opnå iPSC-afledte adipocytter med forbedret ekspression af funktionelle markører og øget udbytte og renhed. Denne kombinerede protokol vil således muliggøre generering i tilstrækkelig mængde og renhed af modne adipocytter fra genetisk forskellige individer og potentiel afdækning af nye genetiske varianter bag adipocytrelaterede metaboliske lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra Qatar National Research Fund (QNRF) (bevilling nr. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi blev støttet af GSRA-stipendium fra Qatar National Research Fund (QNRF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adiponectin Abcam ab22554 Adipocyte maturation marker
anti-CD105 BD Pharmingen 560839 MSC differentiation marker
anti-CD14 BD Pharmingen 561712 MSC differentiation marker
anti-CD19 BD Pharmingen 555415 MSC differentiation marker
anti-CD34 BD Pharmingen 555824 MSC differentiation marker
anti-CD44 abcam ab93758 MSC differentiation marker
anti-CD45 BD Pharmingen
560975		 MSC differentiation marker
anti-CD73 BD Pharmingen 550256 MSC differentiation marker
anti-CD90 BD Pharmingen 555596 MSC differentiation marker
bFGF R&D 233-FP MSC culture media supplement
C/EBPA Abcam ab40761 Adipocyte maturation marker
Dexamethasone Torics 1126 Adipocyte differentiation media supplement
FABP4 Abcam ab93945 Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serum ThermoFisher 10082147 MSC culture media supplement
Glutamax ThermoFisher 35050-061 MSC culture media supplement
IBMX Sigma Aldrich I5879 Adipocyte differentiation media supplement
Indomethacin Sigma Aldrich I7378 Adipocyte differentiation media supplement
Insulin Sigma Aldrich 91077C Adipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEM ThermoFisher 12660012 Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEM ThermoFisher 11885084 MSC culturing media
Matrigel Corning 354230 Coating matrix
MEM-alpha ThermoFisher 12561056 Adipocyte differentiation media
Nilered Sigma Aldrich 19123 Sorting marker for adipocyte
Penicillin ThermoFisher 15140122 MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered saline ThermoFisher 14190144 wash buffer
Pierce™ 20X TBS Buffer Thermo Fisher 28358 wash buffer
PPARG Cell Signaling Technology 2443 Adipocyte maturation marker
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Dissociation reagent
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625 MSC differentiation media supplement
Rock inhibitor Tocris 1254/10 hPSC culture media supplement
Roziglitazone Sigma Aldrich R2408 Adipocyte differentiation media supplement
StemFlex ThermoFisher A334901 hPSC culture media
Triton Thermo Fisher 28314 Permebealization reagent
Trypsin ThermoFisher 25200072 Dissociation reagent
Tween 20 Sigma Aldrich P7942 Wash buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
  2. Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
  3. Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
  4. Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
  5. Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
  6. Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
  7. Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
  8. van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
  9. Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
  10. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  11. Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
  12. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  13. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  14. Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
  15. Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2020).
  16. Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
  17. Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
  18. Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
  19. di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
  20. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
  21. De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
  22. Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
  23. Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, Pt 3 607-613 (2003).
  24. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
  25. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
  26. Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
  27. Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  28. Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
  29. Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
  30. Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
  31. Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
  32. Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
  33. Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
  34. Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
  35. Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
  36. Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
  37. Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
  38. Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
  39. Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 180 inducerede pluripotente stamceller mesenkymale stamceller adipocytdifferentiering cellesortering
Robust differentiering af humane iPSC'er i en ren population af adipocytter for at studere adipocytassocierede lidelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aghadi, M., Karam, M., Abdelalim, E. … More

Aghadi, M., Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders. J. Vis. Exp. (180), e63311, doi:10.3791/63311 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter