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Developmental Biology

एडिपोसाइट्स से जुड़े विकारों का अध्ययन करने के लिए एडिपोसाइट्स की शुद्ध आबादी में मानव आईपीएससी का मजबूत भेदभाव

Published: February 9, 2022 doi: 10.3791/63311
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF), 2College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation

Summary

प्रोटोकॉल प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से एक शुद्ध एडिपोसाइट आबादी की पीढ़ी की अनुमति देता है। रेटिनोइक एसिड का उपयोग आईपीएससी को मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) में अलग करने के लिए किया जाता है जिसका उपयोग एडिपोसाइट्स के उत्पादन के लिए किया जाता है। फिर, शुद्ध एडिपोसाइट्स प्राप्त करने के लिए नील लाल धुंधलापन पर आधारित एक सॉर्टिंग दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है।

Abstract

प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकी में हालिया प्रगति ने एडिपोसाइट्स सहित विभिन्न सेल प्रकारों की पीढ़ी की अनुमति दी है। हालांकि, वर्तमान भेदभाव विधियों में कम दक्षता है और एडिपोसाइट्स की समरूप आबादी का उत्पादन नहीं करते हैं। यहां, हम उच्च उपज में मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) का उत्पादन करने के लिए एक ऑल-ट्रांस रेटिनोइक-आधारित विधि का उपयोग करके इस समस्या को दरकिनार करते हैं। सेल प्रसार, अस्तित्व और आसंजन को नियंत्रित करने वाले मार्गों को विनियमित करके, हमारी भेदभाव रणनीति भ्रूण निकायों (ईबी) की कुशल पीढ़ी की अनुमति देती है जो मल्टीपोटेंट एमएससी की शुद्ध आबादी में अंतर करती है। इस विधि द्वारा उत्पन्न एमएससी की उच्च संख्या एडिपोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए एक आदर्श स्रोत प्रदान करती है। हालांकि, एडिपोसाइट्स भेदभाव से उत्पन्न नमूना विषमता एक चुनौती बनी हुई है। इसलिए, हमने एफएसीएस का उपयोग करके लिपिड-असर परिपक्व एडिपोसाइट्स को शुद्ध करने के लिए नील लाल-आधारित विधि का उपयोग किया। इस सॉर्टिंग रणनीति ने हमें कम नमूना विषमता और बढ़ी हुई सेल कार्यक्षमता के साथ एडिपोसाइट्स के पूल का उपयोग करके एडिपोसाइट्स से जुड़े चयापचय विकारों को मॉडल करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका स्थापित करने की अनुमति दी।

Introduction

मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) एडिपोसाइट्स, ओस्टियोसाइट्स और चोंड्रोसाइट्स जैसे मेसोडर्मल मूल की कोशिकाओं के उत्पादन के लिए एक प्रभावी क्षणभंगुर संसाधन के रूप में कार्य करते हैं, जिनका उपयोग आगे उनके संबंधित आनुवंशिक विकारों के मॉडलिंग के लिए किया जा सकता है। हालांकि, पिछले दृष्टिकोण वयस्क ऊतकों से इन एमएससी को प्राप्त करने पर निर्भर थे1, जिसने उन्हें दाताओं से उच्च संख्या में प्राप्त करने की चुनौती दी, और उन्हें इन विट्रो कल्चर स्थितियों में कार्यात्मक रूपसे व्यवहार्य रखने की सीमा 1,2। इन बाधाओं ने इन विट्रो में एमएससी उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल होने की एक बड़ी मांग पैदा की है। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) का उपयोग एमएससी के मूल्यवान स्रोत के रूप में किया जा सकता है, जो एमएससी विशेषताओं 3,4,5 का प्रदर्शन करता है। आईपीएससी-व्युत्पन्न एमएससी का उपयोग कई बीमारियों में चिकित्सीय विकल्प के रूप में किया जा सकता है। इसके अलावा, एडिपोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न एमएससी की क्षमता, उन्हें मानव एडिपोजेनेसिस, मोटापे और एडिपोसाइट्स से जुड़े विकारों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान इन विट्रो मानव मॉडल बनाती है।

एडिपोसाइट्स के वर्तमान विभेदन प्रोटोकॉल को दो समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है, जिसमें से एक में रासायनिक या प्रोटीन-आधारित कॉकटेल का उपयोग करके एडिपोसाइट्स के भेदभाव को शामिल किया जाता है, जिससे 30% -60% 6,7,8,9 की परिणामी उपज मिलती है, जबकि दूसरे में 80% -90% की उपज देने के लिए एडिपोसाइट्स विकास को नियंत्रित करने वाले प्रमुख प्रतिलेखन कारकों के मजबूत प्रेरण के लिए आनुवंशिक हेरफेर शामिल है। 11. हालांकि, आनुवंशिक हेरफेर एडिपोसाइट्स भेदभाव की प्राकृतिक प्रक्रिया को पुन: उत्पन्न नहीं करता है, और अक्सर एडिपोजेनेसिस के दौरान आने वाले सूक्ष्म प्रतिमानों को मुखौटा करता है, जिससे यह रोग मॉडलिंग उद्देश्यों के लिए अप्रभावी हो जाता है12,13. इसलिए, हम नील लाल रंग का उपयोग करके लिपिड-असर एडिपोसाइट्स को फ्लोरोसेंटली टैग करके अपरिपक्व लोगों से रासायनिक रूप से व्युत्पन्न परिपक्व एडिपोसाइट्स को सॉर्ट करने का एक तरीका प्रस्तुत करते हैं।

यहां हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें सभी ट्रांस रेटिनोइक एसिड के साथ आईपीएससी व्युत्पन्न भ्रूण निकायों (ईबी) के क्षणिक इनक्यूबेशन शामिल हैं ताकि तेजी से प्रसार एमएससी की एक उच्च संख्या का उत्पादन किया जा सके, जिसका उपयोग एडिपोसाइट्स14 उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। हम लिपोफिलिक डाई का उपयोग करके उनके लिपिड बूंदों को फ्लोरोसेंटली टैग करके विषम भेदभाव पूल से रासायनिक रूप से व्युत्पन्न परिपक्व एडिपोसाइट्स को सॉर्ट करने का एक तरीका भी प्रस्तुत करते हैं; नील लाल। यह परिपक्व एडिपोसाइट्स की शुद्ध आबादी की पीढ़ी को बढ़ी हुई कार्यक्षमता के साथ एडिपोसाइट्स से जुड़े चयापचय विकारों को सटीक रूप से मॉडल करने की अनुमति देगा।

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Protocol

अध्ययन को उचित संस्थागत अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और हेलसिंकी की 1964 की घोषणा और इसके बाद के संशोधनों या तुलनीय नैतिक मानकों में निर्धारित नैतिक मानकों का पालन किया गया है। प्रोटोकॉल को एचएमसी (संख्या 16260/16) और क्यूबीआरआई (संख्या 2016-003) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। यह काम एच 1 और एच 9 जैसे एचईएससी के लिए भी अनुकूलित है। पूर्ण सूचित सहमति के साथ स्वस्थ व्यक्तियों से रक्त के नमूने प्राप्त किए गए थे। आईपीएससी स्वस्थ व्यक्तियों के परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से उत्पन्न होते हैं।

1. आईपीएससी का संवर्धन और रखरखाव

  1. 1: 80 के अनुपात में नॉकआउट-डीएमईएम में कोटिंग मैट्रिक्स का पुनर्गठन करके बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटें तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. 500 एमएल स्टेम सेल बेसल मीडिया में 10x स्टेम सेल पूरक मीडिया के 50 मिलीलीटर को जोड़कर आईपीएससी कल्चर मीडिया तैयार करें, साथ ही 100x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के 5 मिलीलीटर और अल्पकालिक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या दीर्घकालिक उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. 6-वेल प्लेट के लिए कोटिंग मैट्रिक्स -1 एमएल के साथ प्लेटों को लाइन करें, 12-वेल प्लेट के लिए 500 μL, 24-वेल प्लेट के लिए 250 μL - और प्लेट को 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. आईपीएससी कल्चर मीडिया का एक एलिकोट निकालें और उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर पूर्व-गर्म करें।
  5. आईपीएससी (ईएससी या आईपीएससी) की एक शीशी को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघलाएं और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 2-3 एमएल कल्चर मीडिया हो।
  6. कमरे के तापमान (आरटी -23 डिग्री सेल्सियस) पर 4 मिनट के लिए ट्यूब को 120 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. सुपरनैटेंट को हटा दें और 10 μM ROCK इनहिबिटर (Y-27632) के साथ पूरक ताजा संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें। कोशिकाओं को मैट्रिक्स-लेपित 6-वेल प्लेट के एक कुएं में प्लेट करें और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  8. 24 घंटे के बाद, मीडिया को हटा दें और इसे ताजा संस्कृति मीडिया के साथ बदलें।
  9. हर दिन मीडिया बदलें जब तक कि कोशिकाएं 80% -90% कंफ्लुएंसी तक न पहुंच जाएं।
  10. कंफ्लुएंसी तक पहुंचने पर, नीचे उल्लिखित चरणों का पालन करके मार्ग कोशिकाएं।
    1. मीडिया को हटा दें और डलबेकको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    2. आईपीएससी पृथक्करण अभिकर्मक (सामग्री की तालिका देखें) - 6-वेल प्लेट के कुएं के लिए 500 μL, 24-वेल प्लेट के कुएं के लिए 250 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. पृथक्करण अभिकर्मक को हटा दें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए कोशिकाओं को सूखने दें।
    4. 6-वेल प्लेट के कुएं के लिए कल्चर मीडिया -1 एमएल और 24-वेल प्लेट के कुएं के लिए 250 μL का उपयोग करके कोशिकाओं को इकट्ठा करें - 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में और 4 मिनट के लिए 120 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. कल्चर मीडिया -2 एमएल में कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट के कुएं के लिए और 500 μएल को 24-वेल प्लेट-10 μM रॉक इनहिबिटर के साथ पूरक के लिए पुन: निलंबित करें और उन्हें 40% कंफ्लुएंसी पर ताजा मैट्रिक्स लेपित प्लेटों पर प्लेट करें।

2. एमएससी में आईपीएससी का भेदभाव

  1. कम ग्लूकोज डीएमईएम + पाइरूवेट में 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पी / एस जोड़कर एमएससी भेदभाव मीडिया तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने पर, नीचे उल्लिखित चरणों का पालन करते हुए भ्रूण शरीर (ईबी) गठन के लिए आईपीएससी का उपयोग करें।
    1. कोशिकाओं को डीपीबीएस के साथ धोएं और उन्हें 6-वेल प्लेट के कुएं के लिए पृथक्करण माध्यम / EDTA-500 μL, 24-वेल प्लेट के कुएं के लिए 250 μL के साथ इनक्यूबेट करें।
    2. 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, पृथक्करण अभिकर्मक को एस्पिरेट करें और अतिरिक्त 1 मिनट के लिए कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। एमएससी भेदभाव शुरू करने के लिए, ~ 10-12 x 106 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है।
    3. संस्कृति मीडिया का उपयोग करके 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करें। कोशिकाओं को एकल होने से रोकने और ईबी गठन की अनुमति देने के लिए एकत्र करते समय बहुत सौम्य होना सुनिश्चित करें। 4 मिनट के लिए 120 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. 10 μM ROCK अवरोधक युक्त MSC भेदभाव मीडिया के 3 mL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    5. 24-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट में 0.5 एमएल / अच्छी तरह से मिलाएं और वितरित करें।
      नोट: अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट का उपयोग सतह पर उनके लगाव के बजाय ईबी में सेल एकत्रीकरण को प्रोत्साहित करेगा।
    6. इनक्यूबेटर में प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. 24 घंटे के बाद, नीचे उल्लिखित चरणों का पालन करके उच्च रेटिनोइक एसिड (आरए) उपचार के साथ प्राप्त ईबी को प्रेरित करें।
    1. एमएससी भेदभाव मीडिया के 3 एमएल में 10 μM RA जोड़ें। 15 एमएल ट्यूब में ईबी इकट्ठा करें और उन्हें 15 मिनट के लिए बसने दें।
    2. ईबी से सुपरनैटेंट को हटा दें और 10 μM RA के साथ पूरक MSC भेदभाव मीडिया जोड़ें।
    3. धीरे से पुन: निलंबित करें और उसी 24-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट में 0.5 एमएल / अच्छी तरह से वितरित करें।
    4. इनक्यूबेटर में प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। अगले 48 घंटे तक ईबी को परेशान न करें।
    5. 48 घंटे के बाद, 15 एमएल ट्यूब में ईबी इकट्ठा करें और उन्हें 15 मिनट के लिए बसने दें।
    6. ईबी से सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 0.1 μM RA के साथ पूरक MSC भेदभाव मीडिया जोड़ें।
    7. धीरे से पुन: निलंबित करें और उसी 24-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट में 0.5 एमएल / अच्छी तरह से वितरित करें।
    8. इनक्यूबेटर में प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। अगले 48 घंटे तक ईबी को परेशान न करें।
  4. नीचे दिए गए चरणों का पालन करके कक्षों में जोड़े गए आरए को हटा दें।
    1. अंतिम आरए उपचार के 48 घंटे के बाद, ईबी एकत्र करें और उन्हें 15 मिनट के लिए बसने की अनुमति दें।
    2. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और साइटोकिन्स के बिना डीएमईएम कम ग्लूकोज मीडिया जोड़ें।
    3. धीरे से पुन: निलंबित करें और 24-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट में 0.5 एमएल / वेल वितरित करें। इनक्यूबेटर में प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  5. नीचे उल्लिखित चरणों का पालन करके आईपीएससी-व्युत्पन्न ईबी को प्लेट करें।
    1. पिछले चरण (चरण 2.4) से 48 घंटे के बाद, ईबी को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें और उन्हें 15 मिनट के लिए बसने दें।
    2. सुपरनैटेंट को हटा दें और ताजा एमएससी भेदभाव मीडिया के 2 एमएल में फिर से निलंबित करें।
    3. एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 6-वेल प्लेट के दो कुओं में स्थानांतरित करें।
    4. अतिरिक्त 5 दिनों के लिए हर दूसरे दिन मीडिया बदलें।
    5. 5 दिनों के बाद, खर्च किए गए मीडिया को हटा दें और इसे 2.5 एनजी / एमएल बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ) युक्त ताजा एमएससी भेदभाव मीडिया के साथ बदलें।
  6. नीचे उल्लिखित चरणों का पालन करके, प्लेटेड ईबी को 80% -90% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने पर पारित करें।
    1. डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं, 6-वेल प्लेट के कुएं के लिए ट्रिप्सिन-ईडीटीए -500 μL जोड़ें- और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    2. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एमएससी भेदभाव मीडिया का उपयोग करके कोशिकाओं को इकट्ठा करें और 4 मिनट के लिए 750 x g पर स्पिन करें।
    3. बीएफजीएफ के 2.5 एनजी / एमएल के साथ एमएससी भेदभाव मीडिया में पुन: निलंबन और 1: 3 के अनुपात में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर कोशिकाओं को प्लेट करें।
    4. जब कोशिकाएं 70% -80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं तो मार्ग को दोहराएं। यह 2-3 मार्गों द्वारा 3-6 मिलियन कोशिकाओं को प्राप्त करने की उम्मीद है।

3. आईपीएससी-व्युत्पन्न एमएससी का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण।

नोट: 2-3 मार्ग से गुजरने पर, कोशिकाओं को एमएससी भेदभाव की दक्षता के लिए एक्सेस किया जाना चाहिए। विभेदन को सफल माना जाएगा यदि कोशिकाएं एमएससी भेदभाव मार्कर-सीडी 44, सीडी 73, सीडी 90 और सीडी 105 को 90% से अधिक दक्षता पर व्यक्त करती हैं, और हेमटोपोइएटिक मार्कर-सीडी 14, सीडी 19, सीडी 34 और सीडी 45 के उच्च स्तर को व्यक्त नहीं करती हैं। इन मार्करों की दक्षता नीचे दिए गए चरणों का पालन करके एक्सेस की जा सकती है।

  1. ऊपर उल्लिखित चरणों (चरण 2.6) का उपयोग करके कोशिकाओं को पारित करें और वी-बॉटम 96-वेल प्लेट के एक कुएं में 1 x 105 कोशिकाओं को प्राप्त करें।
  2. प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 375 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. 1 μL संयुग्मित एंटीबॉडी (AB) (सामग्री की तालिका देखें) के साथ ठंडे DPBS के 100 μL में 1 x10 5 कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और प्रकाश के संपर्क को रोकने के लिए 30-40 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. 1:100 की सांद्रता पर संयुग्मित एबी के संबंधित आइसोटाइप नियंत्रण के साथ ठंडे डीपीबीएस के 100 μL में एक और 1 x 105 कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और प्रकाश के संपर्क को रोकने के लिए 30-40 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. इनक्यूबेशन बाद, प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 375 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सिंक के ऊपर प्लेट को हिलाकर सतह पर तैरनेवाला को फेंक दें।
  6. ठंडे डीपीबीएस के 100 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 375 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  8. ठंडे डीपीबीएस के 200 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और अंधेरे, ठंडे 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में इकट्ठा करें और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) द्वारा विश्लेषण किए जाने तक उन्हें बर्फ पर रखें।
  9. एफएसीएस विश्लेषण के लिए, मलबे को बाहर करने के लिए साइड स्प्रेटेड (एसएससी-ए) बनाम फॉरवर्ड बिखरी (एफएससी-ए) का उपयोग करके कोशिकाओं को वितरित करें। इसके अलावा, जीवित सेल आबादी से डबल्स से सिंगल्स को अलग करने के लिए फॉरवर्ड बिखरी हुई ऊंचाई (एफएससी-एच) बनाम फॉरवर्ड बिखरे हुए क्षेत्र (एफएससी-ए) का उपयोग करके गेटेड कोशिकाओं को वितरित करें।
    नोट: कोशिकाओं को प्रत्येक मार्कर के लिए आइसोटाइप नियंत्रण के बदलाव के सापेक्ष गेट किया गया था, और विश्लेषण के लिए प्रत्येक दाग वाले नमूने से न्यूनतम 10,000 गेटेड घटनाओं का उपयोग किया गया था।

4. एडिपोसाइट्स में एमएससी का भेदभाव।

  1. न्यूनतम आवश्यक मीडिया (एमईएम)-अल्फा में ग्लूकोज के 10% नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन (केओएसआर), 1% ग्लूटामाइन, 1% पी / एस, 4.5 एनजी / μL जोड़कर एडिपोसाइट्स भेदभाव बेसल मीडिया तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. एमएससी को 90% से ऊपर पहुंचने की अनुमति दें। उन्हें 48 घंटे के लिए खेती जारी रखें ताकि उन्हें विकास गिरफ्तारी की अवधि से गुजरने की अनुमति मिल सके।
  3. बेसल मीडिया में 3-आइसोबुटिल-1-मिथाइलक्सैंथिन (आईबीएमएक्स) के 100 μg /mL, डेक्सामेथासोन के 1 μM, इंसुलिन के 0.2 U/mL, इंडोमेथेसिन के 100 μM और रोज़िग्लिटाज़ोन के 10 μM को जोड़कर पूर्ण एडिपोसाइट्स भेदभाव मीडिया तैयार करें।
  4. एमएससी भेदभाव मीडिया को हटा दें और डीपीबीएस का उपयोग करके कोशिकाओं को धो लें।
  5. 6-वेल प्लेट के कुएं के लिए पूर्ण एडिपोसाइट भेदभाव मीडिया -2 एमएल और 12-वेल प्लेट के कुएं के लिए 1 एमएल जोड़ें- और 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। 14 दिनों के लिए हर दूसरे दिन पूर्ण भेदभाव मीडिया बदलें।

5. एडिपोसाइट्स की भेदभाव दक्षता का मूल्यांकन

  1. भेदभाव के 14 वें दिन, एडिपोसाइट्स परिपक्वता मार्करों, एफएबीपी 4 और एडिपोनेक्टिन के लिए कोशिकाओं को धुंधला करके भेदभाव की दक्षता की जांच करें।
  2. मीडिया को हटा दें और डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  3. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) - 200 μL का उपयोग करके कोशिकाओं को 24-वेल प्लेट के कुएं में ठीक करें - और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  4. पीएफए को छोड़ दें और 0.5% ट्वीन (टीबीएसटी) के साथ ट्राइस-बफर्ड सेलाइन का उपयोग करके धो लें और इसे 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शेकर पर रखें। इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।
  5. 0.5% ट्राइटन एक्स -100 (पीबीएसटी) के साथ फॉस्फेट-बफर्ड खारा के साथ निश्चित कोशिकाओं को परमेबिलाइज करें और इसे 15-20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शेकर पर रखें।
  6. पीबीएसटी को छोड़ दें और ब्लॉकिंग बफर (पीबीएसटी में 5% -6% बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) ) -6-वेल प्लेट के कुएं के लिए 500 μL और 12-वेल प्लेट के कुएं के लिए 250 μL जोड़ें- और शेकर पर 40-60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  7. 1:500 की एकाग्रता पर 2% -3% बीएसए में एफएबीपी 4, एडिपोनेक्टिन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें ( सामग्री की तालिका देखें)। इन एंटीबॉडी को केवल एक साथ जोड़ें यदि विभिन्न जानवरों में उठाया जाता है और प्लेट को शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखें।
  8. प्राथमिक एंटीबॉडी को हटा दें और टीबीएसटी (प्रत्येक 15 मिनट) के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं और इसे कमरे के तापमान पर शेकर पर रखें।
  9. पीबीएसटी (1: 500) में एलेक्सा फ्लुर द्वितीयक एंटीबॉडी तैयार करें। कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी संयोजनों (प्रजातियों के अनुसार जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी उठाया जाता है) में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और प्लेट को प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें।
  10. द्वितीयक एंटीबॉडी को छोड़ दें, टीबीएसटी से तीन बार धो लें, और प्लेट को शेकर पर रखें।
  11. नाभिक को दाग ने के लिए, पीबीएस में पतला 24-वेल प्लेट के कुएं के लिए 1 μg / mL Hoechst 33342-200 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  12. होचस्ट समाधान को त्याग दें और कोशिकाओं में 24-वेल प्लेट के कुएं के लिए पीबीएस -500 μL जोड़ें। उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना किए जाने तक प्लेटों को प्रकाश से ढककर रखें।

6. नील लाल रंग का उपयोग करके एडिपोसाइट्स की छंटाई

  1. डीएमएसओ में 1 मिलीग्राम / एमएल नील रेड स्टॉक घोल जोड़कर नाइल रेड वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग करने से ठीक पहले, नील लाल स्टॉक को पिघलाएं और 300 एनएम कामकाजी समाधान एकाग्रता प्राप्त करने के लिए डीपीबीएस में पुनर्गठित करें।
  2. एडिपोसाइट्स भेदभाव के 14 वें दिन या बाद में, कोशिकाओं से मीडिया को छोड़ दें और डीपीबीएस का उपयोग करके धो लें।
  3. 6-वेल प्लेट के एक कुएं में नील लाल वर्किंग घोल -1 एमएल जोड़ें - और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. नील लाल घोल निकालें और ट्रिप्सिन-ईडीटीए -500 μL को 6-वेल प्लेट के कुएं में जोड़ें- और 4 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 5% एफबीएस युक्त डीएमईएम का उपयोग करके कोशिकाओं को इकट्ठा करें। 4 मिनट के लिए 750 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  6. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 1 x 106 कोशिकाओं के लिए डीपीबीएस -1 एमएल में पुन: निलंबित करें। 4 मिनट के लिए 750 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  7. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 1 x 106 कोशिकाओं के लिए डीपीबीएस -1 एमएल में पुन: निलंबित करें। एफएल 1 चैनल का उपयोग करके नील लाल-सकारात्मक कोशिकाओं को अलग करने के लिए एफएसीएस सॉर्टर का उपयोग करें।
  8. एडिपोसाइट्स भेदभाव मीडिया में क्रमबद्ध कोशिकाओं को फिर से कल्चर करें या आरएनए और प्रोटीन अलगाव के लिए क्रमबद्ध कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  9. क्रमबद्ध कोशिकाओं से आरएनए निकालें और एफएबीपी 4, पीपीएआरजी और सी / ईबीपीए सहित एडिपोसाइट्स भेदभाव मार्करों का सापेक्ष मात्रात्मक विश्लेषण करें। नील लाल-सकारात्मक कोशिकाएं गैर-क्रमबद्ध कोशिकाओं की तुलना में कम से कम दो गुना जीन अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण अपरेग्यूलेशन दिखाती हैं।

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Representative Results

मेसेनकाइमल भेदभाव के दौरान कोशिकाओं की योजनाबद्ध और आकृति विज्ञान: एमएससी में आईपीएससी के भेदभाव में ईबी गठन, एमएससी भेदभाव और एमएससी विस्तार (चित्रा 1) में फैले विकास के विभिन्न चरण शामिल हैं। विकास के इन चरणों के दौरान, कोशिकाएं विभिन्न उत्तेजक रसायनों के कारण विभिन्न आकृति विज्ञान प्राप्त करती हैं। विभेदन शुरू करने पर, कोशिकाओं को निलंबन में चढ़ाया जाता है और परिभाषित सेल सीमाओं के साथ गोल होने की उम्मीद होती है, जबकि व्यास में छोटे से मध्यम आकार के होते हैं (चित्रा 2)। भेदभाव के प्रारंभिक चरण के दौरान निलंबन में कोशिकाओं की खेती का विकल्प इसे प्राकृतिक भ्रूण के विकास की प्रक्रिया के समान होने की अनुमति देता है, जिससे यह चरण सफल भेदभाव के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण हो जाता है। ईबी गठन और आरए उपचार के चरण के बाद तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर ईबी चढ़ाना किया जाता है। चढ़ाना पर ईबी की व्यवहार्यता को उनके तेजी से प्रसार व्यवहार को देखकर प्राप्त किया जा सकता है जो अधिक एमएससी को जन्म देता है (चित्रा 2)। एमएससी द्वारा प्रदर्शित इस तेजी से प्रसार व्यवहार को अजीबोगरीब, लम्बी आकृति विज्ञान को बनाए रखने के साथ-साथ ताजा मैट्रिक्स लेपित प्लेटों पर पारित करने के बाद भी बनाए रखा जाता है (चित्रा 2)।

एमएससी सतह मार्करों का मात्रात्मक मूल्यांकन: एमएससी की विभेदन दक्षता एमएससी भेदभाव के लिए विशिष्ट सतह मार्करों की मात्रा का परिमाणीकरण करके एक्सेस की जाती है। विश्वसनीय एमएससी का उत्पादन करने वाले अच्छे भेदभाव को मेसेनकाइमल सतह मार्कर सीडी 73, सीडी 44 और सीडी 90 (चित्रा 3 ए) की 90% से अधिक दक्षता दिखानी चाहिए। इसके अलावा, कोशिकाओं को हेमटोपोइएटिक फेनोटाइप, सीडी 14, सीडी 34 और सीडी 1 9 को दर्शाने वाले सतह मार्करों की अनुपस्थिति के लिए भी मूल्यांकन किया जाता है, और इसलिए उनके लिए 1% से कम अभिव्यक्ति दक्षता दिखाने की उम्मीद है (चित्रा 3 बी)।

एडिपोसाइट्स में एमएससी का भेदभाव: एडिपोसाइट्स में एमएससी के भेदभाव को एफएबीपी 4 और एडिपोनेक्टिन के लिए धुंधला करके एक्सेस किया जा सकता है। एफएबीपी 4 एक साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन है, और इसे टर्मिनल रूप से विभेदित एडिपोसाइट्स के लिए एक मार्कर के रूप में माना जाता है। एडिपोसाइट्स के बीच इसकी उच्च अभिव्यक्ति, साइटोप्लाज्मिक वितरण के साथ, उनकी विकासात्मक परिपक्वता का एक महत्वपूर्ण संकेत है (चित्रा 4 ए)। एफएबीपी 4 के अलावा, एडिपोनेक्टिन को एडिपोसाइट्स परिपक्वता के लिए महत्वपूर्ण मार्करों में से एक माना जाता है। इसकी उच्च अभिव्यक्ति इंगित करती है कि एडिपोसाइट्स ग्लूकोज सिग्नलिंग के जवाब में लिपिड भंडारण और एडिपोजेनेसिस से गुजरने के लिए पर्याप्त कार्यात्मक हैं। एक स्रावी प्रोटीन होने के नाते, एडिपोनेक्टिन प्रत्येक प्रोटीन ग्लोब्यूल के साथ गोलाकार आकृति विज्ञान प्रदर्शित करता है जिसे साइटोप्लाज्म (चित्रा 4 बी) के भीतर आसानी से अलग किया जा सकता है।

नील लाल रंग का उपयोग करके परिपक्व एडिपोसाइट्स का धुंधला होना और छंटाई करना: भेदभाव पर, परिपक्व एडिपोसाइट्स को नील लाल रंग के लिए धुंधला करके उनके अपरिपक्व समकक्षों से अलग किया जा सकता है। नील लाल लिपिड-असर एडिपोसाइट्स को बांधता है, जो परिपक्व एडिपोसाइट्स (चित्रा 5 ए) के लिए विशिष्ट विशेषता है। यह, नील लाल की फ्लोरोसेंट असर विशेषता के साथ, इसे फ्लोरोसेंट सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री (चित्रा 5 बी) का उपयोग करके परिपक्व एडिपोसाइट्स को सॉर्ट करने के लिए एक प्रभावी उपकरण बनाता है। प्रभावी छंटाई के परिणामस्वरूप परिपक्वता मार्करों-पीपीएआरजी, सी / ईबीपीए और एफएबीपी 4 की वृद्धि कम से कम दो गुना होनी चाहिए, जो मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) (चित्रा5 सी) द्वारा निर्धारित की जाती है।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध आरेख एमएससी और एडिपोसाइट्स में आईपीएससी के भेदभाव को दर्शाता है। आईपीएससी को भ्रूण शरीर (ईबी) तकनीक का उपयोग करके एमएससी में विभेदित किया जाता है। ईबी को ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड (आरए) के 10 μM के छोटे जोखिम के अधीन किया जाता है। उत्पन्न एमएससी को आईपीएससी लाइन के आधार पर 40% -77% एडिपोसाइट्स में विभेदित किया जाता है। नील लाल सकारात्मक कोशिकाओं को परिपक्व एडिपोसाइट्स की शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए एफएसीएस का उपयोग करके क्रमबद्ध किया जाता है जिसका उपयोग एडिपोसाइट से जुड़े विकारों (रोग मॉडलिंग) का अध्ययन करने, नई दवाओं की पहचान करने और अंततः व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एमएससी में आईपीएससी का भेदभाव। प्रतिनिधि रूपात्मक छवियां 2 (डी 2), 11 (डी 11), 15 (डी 15), और 24 (डी 24) दिनों में एमएससी भेदभाव के विभिन्न चरणों को दिखाती हैं। 24 घंटे के लिए आरए के 10 μM की उपस्थिति में उत्पन्न भ्रूण निकायों (EBs) को भेदभाव के दिन 8 पर चढ़ाया गया था, इसके बाद 12-17 दिनों के भेदभाव के बाद पृथक्करण और पासिंग किया गया था। एमएससी को कई बार पारित किया गया था। संक्षेप: पी 2 = गद्यांश 2। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: आईपीएससी-व्युत्पन्न एमएससी में एमएससी मार्करों और हेमटोपोइएटिक मार्करों की अभिव्यक्ति। प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री हिस्टोग्राम एमएससी मार्करों, सीडी 73, सीडी 44, और सीडी 90, (ए) और हेमटोपोइएटिक मार्करों, सीडी 34, सीडी 19 और सीडी 14 (बी) की अभिव्यक्ति को दर्शाता है। ग्राफ में एक्स-अक्ष फ्लोरोसेंट तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: आईपीएससी-व्युत्पन्न एमएससी का एडिपोसाइट्स में भेदभाव। आईपीएससी से प्राप्त परिपक्व एडिपोसाइट्स में एफएबीपी 4 (ए) और एडिपोनेक्टिन (एडीआईपीओ) (बी) की अभिव्यक्ति दिखाने वाली इम्यूनोस्टेनिंग छवियां। नाभिक होचस्ट से सना हुआ था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: नील लाल रंग का उपयोग करके आईपीएससी-व्युत्पन्न एडिपोसाइट्स की छंटाई। (ए) उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) और नील लाल दाग वाले परिपक्व एडिपोसाइट्स दिखाने वाले चित्र। (बी) एफएसीएस का उपयोग करके परिपक्व एडिपोसाइट्स में नील लाल (पीई-पॉजिटिव कोशिकाओं) का परिमाणीकरण। (सी) वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण क्रमबद्ध बनाम मिश्रित परिपक्व एडिपोसाइट्स में सी / ईबीपीए, एफएबीपी 4 और पीपीएआरजी की अभिव्यक्ति को दर्शाता है। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में दर्शाया जाता है; * पी < 0.05, ** पी < 0.01, ***पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल उच्च उपज और दक्षता में एमएससी प्रदान करने की अपनी क्षमता के कारण सर्वोपरि महत्व रखता है। एमएससी का यह बड़े पैमाने पर उत्पादन आरए14,15 के 10 μM के साथ आईपीएससी-व्युत्पन्न ईबी के क्षणिक इनक्यूबेशन से संभव हुआ था। आरए के 10 μM के साथ क्षणिक उपचार ने एमएससी उपज को 11.2 से 1542 गुना14,15 तक बढ़ा दिया, इस प्रोटोकॉल के साथ आईपीएससी और एचपीएससी दोनों पर लागू होने के साथ। इस खुराक और उपचार की अवधि में, आरए सेल प्रसार, एपोप्टोसिस और सेल-सेल और ईसीएम-सेल आसंजन में शामिल कई जीनों की अभिव्यक्ति के प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष विनियमन द्वारा ईबी-बनाने वाली कोशिकाओं की प्रोलिफेरेटिव और उत्तरजीविता क्षमताओं में सुधार करता है, जो आईपीएससी14,16 के अस्तित्व और प्रसार के लिए महत्वपूर्ण हैं।. जीन में प्रतिलेखन कारक (जैसे ईजीएफआर 4, एसओएक्स 4), विकास कारक और विकास कारक रिसेप्टर्स (जैसे आईजीएफ 2, एफजीएफआर 4), और आसंजन अणु (जैसे एफएन 1 और सीएएम) शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं। हालांकि, कम खुराक (0.1-10 μM) के विपरीत, उच्च खुराक (≥20 μM) पर, आरए ईबी बनाने वाली कोशिकाओं के प्रसार और अस्तित्व को नकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है जिसके परिणामस्वरूप पीएससी-व्युत्पन्न ईबी संख्या और आकार कम हो जाता है और इस प्रकार एमएससी14 की उपज कम हो जाती है। आरए को कई सामान्य विभेदित और कैंसर कोशिकाओं17,18,19 में प्रसार अवरोधक के रूप में माना जाता है। ईबी में, रेटिनोइड सिग्नलिंग संदर्भ (समय, एकाग्रता, प्रजातियां, और सेल लाइन) -निर्भर है; अलग-अलग जीन औरसिग्नलिंग मार्गों को विनियमित करके ईबी-बनाने वाली कोशिकाओं के आत्म-नवीकरण, अस्तित्व और भेदभाव को अलग-अलग प्रभावित करना। इसलिए, ईबी प्रेरण के तीसरे दिन आरए -10 μM के इष्टतम समय और एकाग्रता में आरए का उपयोग और वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित 2 दिनों के लिए दिन 5 पर 0.1 μM तक खुराक में कमी - ईबी बनाने वाले सेल अस्तित्व और प्रसार को प्रेरित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

विकास और अस्तित्व को विनियमित करने के अलावा, आरए आरए14 के साथ गैर-उपचारित कोशिकाओं की तुलना में इलाज किए गए ईबी को भेदभाव में देरी के अधीन करता है। वास्तव में, आरए-उपचारित ईबी चढ़ाना के बाद अपना कॉम्पैक्ट आकार बनाए रखते हैं और आरए-अनुपचारित ईबी के विपरीत, एमएससी जैसी कोशिकाओं में अंतर करने में विफल रहते हैं। यह पिछले अध्ययनों की रिपोर्ट के अनुरूप है कि आरए उपचार के लिए अल्पकालिक जोखिम डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग21 के दमन के माध्यम से सेल भेदभाव को रोकता है। इसके अलावा, इन आरए-उपचारित भेदभाव-विलंबित कोशिकाओं ने कैडरिन और अतिरिक्त-सेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन14 की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति भी दिखाई, जो आईपीएससी16 की प्लुरिपोटेंट स्थिति को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाने जाते हैं। आरए-मध्यस्थता भेदभाव ब्लॉक को जारी करने के लिए, ईबी को अलग किया जाना चाहिए, जिसके परिणामस्वरूप सेल आसंजन बाधित होता है और चढ़ाना पर दीर्घकालिक एमएससी भेदभाव की अनुमति मिलती है। दिलचस्प बात यह है कि आरए उपचार ने कोशिकाओं पर एक भेदभाव ब्लॉक रखा, लेकिन इसने कोशिकाओं को प्लुरिपोटेंट अवस्था में बनाए नहीं रखा। वास्तव में, 10 μM RA के अल्पकालिक संपर्क से गुजरने वाली ईबी बनाने वाली कोशिकाएं प्रमुख प्लूरिपोटेंसी मार्करों-OCT4, SOX2 और NANOG14 की अभिव्यक्ति को काफी कम दिखाती हैं।

ईबी के अल्पकालिक आरए उपचार द्वारा उत्पन्न एमएससी को एमएससी सतह मार्करों की प्रचुर अभिव्यक्ति और क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद उनकी बहुशक्ति के साथ उनके विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट जैसी आकृति विज्ञान को बनाए रखने के लिए दिखाया गया है, इस प्रकार इन बड़े पैमाने पर उत्पादित एमएससी को दीर्घकालिकविस्तार अध्ययन के लिए संग्रहणीय बनाया गया है। जब उन्हें एडिपोजेनिक, चोंड्रोजेनिक और ओस्टोजेनिक भेदभाव स्थितियों के अधीन किया जाता है, तो ये एमएससी आसानी से तीन मेसोडर्मल सेल प्रकारों में अंतर कर सकते हैं, इस प्रकार उन्हें ऊतक सेसंबंधित बीमारियों के मॉडलिंग के लिए आसानी से प्राप्य स्रोत बना सकते हैं। इस प्रकार, आरए-मध्यस्थता भेदभाव प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न एमएससी का स्थिर और बहुमुखी इन विट्रो व्यवहार उन्हें अनुसंधान और अनुप्रयोग-आधारित सेटिंग्स में सर्वोपरि महत्व प्रदान करता है।

जबकि आरए-उपचारित ईबी से प्राप्त एमएससी की चोंड्रोजेनिक और ओस्टोजेनिक भेदभाव क्षमता अनुपचारित ईबी से प्राप्त एमएससी के समान प्रतीत होती है, पूर्व को एडिपोजेनिकभेदभाव स्थितियों के अधीन होने पर एडिपोजेनिक वंश में अंतर करने की बढ़ी हुई क्षमता प्रदर्शित करने के लिए पाया गया था। आरए-अनुपचारित ईबी से प्राप्त एमएससी की तुलना में आरए-उपचारित ईबी से प्राप्त एमएससी को एडिपोजेनिक भेदभाव मीडिया के साथ संवर्धित करने के बाद प्राप्त कोशिकाओं के विभेदन पूल में इंट्रासेल्युलर लिपिड संचय (ऑयल रेड ओ स्टेनिंग) और एडिपोसाइट्स मार्कर एफएबीपी 4-पॉजिटिव कोशिकाओं में 2 से 3 गुना वृद्धि से इसका प्रमाण मिला। यह आरए द्वारा हिप्पो, डब्ल्यूएनटी और ईसीएम-सेल इंटरैक्शन मार्गों जैसे एडिपोसाइट्स विकास को नियंत्रित करने वाले कई सिग्नलिंग मार्गों के विनियमन का परिणाम हो सकता है, जैसा कि आरए-उपचारित और अनुपचारित ईबी14,22,23,24,25 से आरएनए अनुक्रमण डेटा से पता चला है। एडिपोजेनिक भेदभाव से गुजरने के लिए आरए-व्युत्पन्न एमएससी की यह बढ़ी हुई क्षमता मूल्यवान है, क्योंकि वर्तमान में उपलब्ध प्रोटोकॉल या तो खराब एडिपोसाइट्स उपज का कारण बनते हैं या आनुवंशिक हेरफेर का उपयोग करते हैं जिससे उत्पन्न एडिपोसाइट्स प्राकृतिक-प्रक्रिया रिकैपिटुलेटेड एडिपोसाइट्स प्राप्त करने के लिए अमूल्य हो जाते हैं। एडिपोसाइट्स को तीन प्रकारों में वर्गीकृत किया जाता है- सफेद, भूरा और बेज। सफेद एडिपोसाइट्स को एकल लिपिड बूंद की उपस्थिति से वर्गीकृत किया जाता है और ऊर्जा भंडारण में भूमिका निभाता है। जबकि, ब्राउन एडिपोसाइट्स यूसीपी 1 की अभिव्यक्ति की विशेषता वाले माइटोकॉन्ड्रिया की बहुत अधिक प्रचुरता के कारण सब्सट्रेट ऑक्सीकरण द्वारा ऊर्जा व्यय में शामिल हैं। जबकि भूरे रंग के एडिपोसाइट्स जो सफेद वसा ऊतक में स्थानीयकृत पाए जाते हैं, उन्हें बेज-या भूरे रंग की तरह-एडिपोसाइट्स के रूप में जाना जाता है। इन एमएससी में आरए के लिए ईबी के पूर्व-जोखिम को देखते हुए सफेद एडिपोसाइट्स की प्रचुर मात्रा में उपज देने की क्षमता है। पिछले प्रकाशनों ने उच्च यूसीपी 1 स्तर वाली कोशिकाओं को आरए26 में उजागर करने के बजाय कम यूसीपी 1 यानी सफेद एडिपोसाइट्स को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में आईपीएससी के चयनात्मक प्रेरण का उल्लेख किया है। पिछले प्रकाशनों ने बताया है कि माउस और ज़ेब्राफिश भ्रूण में तंत्रिका शिखा कोशिकाओं से उत्पादित आरए सफेद एडिपोसाइट्स गठन27,28 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

हालांकि आरए-आधारित प्रोटोकॉल ने एमएससी की पीढ़ी की अनुमति दी जो एडिपोसाइट्स की बढ़ी हुई उपज 48.5% -77.4% (आरए उपचार के बिना 22.5% -57.6%) तक पहुंच जाती है, >90% प्राप्त नहीं करना अभी भी समस्याग्रस्त है जब बहु-संस्करण एडिपोसाइट्स-आधारित आनुवंशिक विकारों को मॉडलिंग किया जाता है। in vitro. वास्तव में, एक शुद्ध एडिपोसाइट्स आबादी तक नहीं पहुंचने से बहु-वेरिएंट रोग मॉडल से आने वाले परिणाम अस्पष्ट हो सकते हैं, क्योंकि यह अंतर करना मुश्किल होगा कि क्या देखे गए विकास संबंधी अंतर विभिन्न आनुवंशिक मेकअप के कारण हैं या असंगत भेदभाव क्षमता के कारण हैं। इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, शुद्ध परिपक्व एडिपोसाइट्स का एक पूल प्राप्त करने के लिए विभेदित कोशिकाओं को क्रमबद्ध करना महत्वपूर्ण था, ताकि फेनोटाइप्स में किसी भी अंतर को केवल अंतर्निहित आनुवंशिक मतभेदों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सके। कई अध्ययनों ने एडिपोसाइट्स पर सतह मार्करों की पहचान की है जो संभावित रूप से छंटाई के लिए उपयोग किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, रोनाल्ड कहन द्वारा किए गए काम ने सफेद एडिपोसाइट्स पर एक उपन्यास सतह मार्कर के रूप में अमीनो एसिड ट्रांसपोर्टर एएससी -1 की पहचान की अनुमति दी।29. इसके अलावा, ओमेंटल और चमड़े के नीचे के क्षेत्रों से परिपक्व एडिपोसाइट्स निकालने वाले अध्ययनों ने अपनी सतहों पर सीडी 34, सीडी 36 और सीडी 5 9 को व्यक्त करने के लिए परिपक्व एडिपोसाइट्स की सूचना दी है।30, जहां सीडी 36 को परिपक्व एडिपोसाइट्स की सतह पर फैटी एसिड ट्रांसपोर्टर के रूप में कार्य करने की सूचना दी गई है।31. हालांकि, इन अध्ययनों ने वसा ऊतक से प्राप्त कोशिकाओं की विषम आबादी का उपयोग किया है, इन मार्करों की अभिव्यक्ति को केवल परिपक्व एडिपोसाइट्स आबादी के लिए निर्दिष्ट किए बिना। इसके अलावा, इन मार्करों को अन्य सेल प्रकारों द्वारा भी व्यक्त किया जा सकता है और एडिपोसाइट्स के लिए विशिष्ट नहीं हैं। उदाहरण के लिए, एएससी -1 एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स दोनों पर मौजूद है।32सीडी 34 हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं का एक मार्कर है33, सीडी 36 प्लेटलेट्स, मोनोन्यूक्लियर फागोसाइट्स, हेपेटोसाइट्स, मायोसाइट्स और कुछ एपिथेलिया पर मौजूद है।33, और सीडी 59 एंडोथेलियल और लिम्फोइड कोशिकाओं पर व्यक्त किया जाता है।34,35. इसलिए, एक वैकल्पिक समाधान के रूप में, नील लाल, इंट्रासेल्युलर लिपिड के लिए चयनात्मक फ्लोरोसेंट दाग, एडिपोसाइट्स को छांटने के लिए एक संभावित उम्मीदवार के रूप में इस्तेमाल किया गया था। एडिपोसाइट्स लिपिड का एक महत्वपूर्ण थोक स्टोर करते हैं जिन्हें ऊर्जा का उत्पादन करने, झिल्ली बनाने या चयापचय को नियंत्रित करने वाले सिग्नलिंग अणुओं के रूप में जारी और उपयोग किया जा सकता है।36. नील लाल डाई का उपयोग पहले फ्लो साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी में मुराइन और मानव एमएससी से प्राप्त एडिपोसाइट्स को दागने के लिए किया गया था।37. पिछले अध्ययनों ने ईएससी-व्युत्पन्न एडिपोसाइट्स के लिए नील लाल रंग के उपयोग और छंटाई के बाद एडिपोसाइट्स मार्करों में वृद्धि की सूचना दी है।38. वर्तमान आरए-आधारित प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त एमएससी से उत्पन्न एडिपोसाइट्स का मूल्यांकन नील लाल रंग से दागदार होने की उनकी क्षमता के लिए किया गया था, जो उनकी परिपक्वता का संकेत देता है, और उन्हें शुद्ध करने के लिए क्रमबद्ध किया गया था। इन नील लाल-क्रमबद्ध कोशिकाओं ने एडिपोसाइट्स परिपक्वता मार्करों की अभिव्यक्ति में दो से तीन गुना वृद्धि का प्रदर्शन किया, जिसमें शामिल हैं PPARG, C/EBPAऔर FABP4 मिश्रित कोशिकाओं की तुलना में, इस प्रकार आईपीएससी-व्युत्पन्न एडिपोसाइट्स की उपज में और वृद्धि होती है। यद्यपि इन मार्करों को लिपिड संचय से पहले व्यक्त किया जाता है, उनकी अभिव्यक्ति लिपिड असर एडिपोसाइट्स के टर्मिनल भेदभाव के लिए एक सेल को टैग करती है। इन मार्करों द्वारा सॉर्टिंग दक्षता की जांच करने से हमें एक पूल की पहचान करने की अनुमति मिलती है जहां सभी कोशिकाएं व्यक्त होती हैं। FABP4, CEBPaऔर PPARg, एक पूल को इंगित करता है, जो परिपक्व एडिपोसाइट्स गठन के लिए पूर्व-नियत था। कोशिकाओं को नील लाल रंग में उनकी धुंधला क्षमता के आधार पर क्रमबद्ध किया जाता है। मिश्रित अंश में एडिपोसाइट्स की उच्च संख्या के कारण शुद्धिकरण दक्षता में दो से तीन गुना की वृद्धि हुई। लिपिड असर एडिपोसाइट्स का आकार भेदभाव के दौरान काफी हद तक भिन्न होता है, जहां समान आकार वितरण वाली कोशिकाओं का एक पूल क्रमबद्ध होता है। मिश्रित अंश में लिपिड-असर एडिपोसाइट्स शामिल हैं, लेकिन वे पूरी तरह से परिपक्व नहीं हैं और असमान आकार अनुपात द्वारा शासित हैं।.

मानव शरीर से पृथक एमएससी की विषमता पहले39 बताई गई है। यह विषमता कई कारकों पर निर्भर करती है, जैसे कि एमएससी मूल, दाता और शर्तें39। इससे विभिन्न बीमारियों के इलाज में उनकी दक्षता में भिन्नता हो सकती है। इस अध्ययन से पता चलता है कि अच्छे विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) -संगत संस्कृति स्थितियों के तहत उत्पादित एचपीएससी के लघु आरए उपचार से एमएससी की एक समरूप आबादी मिलेगी। यह इंगित करता है कि वर्तमान प्रोटोकॉल बड़ी संख्या में नैदानिक-ग्रेड एमएससी उत्पन्न करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है जिसका उपयोग एमएससी-आधारित चिकित्सा के लिए किया जा सकता है।

आरए-आधारित एमएससी भेदभाव प्रोटोकॉल के संयोजन से एडिपोसाइट्स भेदभाव और नाइल रेड-सॉर्टिंग प्रोटोकॉल ने हमें कार्यात्मक मार्करों की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति और उपज और शुद्धता में वृद्धि के साथ आईपीएससी-व्युत्पन्न एडिपोसाइट्स प्राप्त करने की अनुमति दी। इस प्रकार, यह संयुक्त प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से अलग-अलग व्यक्तियों से परिपक्व एडिपोसाइट्स की पर्याप्त मात्रा और शुद्धता में उत्पादन और एडिपोसाइट से संबंधित चयापचय विकारों के पीछे नए आनुवंशिक रूपों को उजागर करने की अनुमति देगा।

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Disclosures

लेखक ों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को कतर राष्ट्रीय अनुसंधान कोष (क्यूएनआरएफ) (अनुदान संख्या एनपीआरपी 10-1221-160041) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। मरियम अघाड़ी को कतर नेशनल रिसर्च फंड (क्यूएनआरएफ) से जीएसआरए छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adiponectin Abcam ab22554 Adipocyte maturation marker
anti-CD105 BD Pharmingen 560839 MSC differentiation marker
anti-CD14 BD Pharmingen 561712 MSC differentiation marker
anti-CD19 BD Pharmingen 555415 MSC differentiation marker
anti-CD34 BD Pharmingen 555824 MSC differentiation marker
anti-CD44 abcam ab93758 MSC differentiation marker
anti-CD45 BD Pharmingen
560975		 MSC differentiation marker
anti-CD73 BD Pharmingen 550256 MSC differentiation marker
anti-CD90 BD Pharmingen 555596 MSC differentiation marker
bFGF R&D 233-FP MSC culture media supplement
C/EBPA Abcam ab40761 Adipocyte maturation marker
Dexamethasone Torics 1126 Adipocyte differentiation media supplement
FABP4 Abcam ab93945 Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serum ThermoFisher 10082147 MSC culture media supplement
Glutamax ThermoFisher 35050-061 MSC culture media supplement
IBMX Sigma Aldrich I5879 Adipocyte differentiation media supplement
Indomethacin Sigma Aldrich I7378 Adipocyte differentiation media supplement
Insulin Sigma Aldrich 91077C Adipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEM ThermoFisher 12660012 Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEM ThermoFisher 11885084 MSC culturing media
Matrigel Corning 354230 Coating matrix
MEM-alpha ThermoFisher 12561056 Adipocyte differentiation media
Nilered Sigma Aldrich 19123 Sorting marker for adipocyte
Penicillin ThermoFisher 15140122 MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered saline ThermoFisher 14190144 wash buffer
Pierce™ 20X TBS Buffer Thermo Fisher 28358 wash buffer
PPARG Cell Signaling Technology 2443 Adipocyte maturation marker
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Dissociation reagent
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625 MSC differentiation media supplement
Rock inhibitor Tocris 1254/10 hPSC culture media supplement
Roziglitazone Sigma Aldrich R2408 Adipocyte differentiation media supplement
StemFlex ThermoFisher A334901 hPSC culture media
Triton Thermo Fisher 28314 Permebealization reagent
Trypsin ThermoFisher 25200072 Dissociation reagent
Tween 20 Sigma Aldrich P7942 Wash buffer

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References

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Aghadi, M., Karam, M., Abdelalim, E. … More

Aghadi, M., Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders. J. Vis. Exp. (180), e63311, doi:10.3791/63311 (2022).

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