Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Différenciation robuste des CSPi humaines en une population pure d’adipocytes pour étudier les troubles associés aux adipocytes

Published: February 9, 2022 doi: 10.3791/63311
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF), 2College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation

Summary

Le protocole permet la génération d’une population adipocytaire pure à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). L’acide rétinoïque est utilisé pour différencier les CSPi en cellules souches mésenchymateuses (CSM) qui sont utilisées pour produire des adipocytes. Ensuite, une approche de tri basée sur la coloration rouge du Nil est utilisée pour obtenir des adipocytes purs.

Abstract

Les progrès récents de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ont permis la génération de différents types de cellules, y compris les adipocytes. Cependant, les méthodes de différenciation actuelles ont une faible efficacité et ne produisent pas une population homogène d’adipocytes. Ici, nous contournons ce problème en utilisant une méthode entièrement trans basée sur les rétinoïques pour produire des cellules souches mésenchymateuses (CSM) à haut rendement. En régulant les voies régissant la prolifération, la survie et l’adhésion cellulaires, notre stratégie de différenciation permet la génération efficace de corps embryonnaires (EB) qui se différencient en une population pure de CSM multipotentes. Le nombre élevé de CSM générées par cette méthode constitue une source idéale pour la génération d’adipocytes. Cependant, l’hétérogénéité des échantillons résultant de la différenciation des adipocytes reste un défi. Par conséquent, nous avons utilisé une méthode à base de rouge du Nil pour purifier les adipocytes matures lipidiques à l’aide de FACS. Cette stratégie de tri nous a permis d’établir un moyen fiable de modéliser les troubles métaboliques associés aux adipocytes à l’aide d’un pool d’adipocytes avec une hétérogénéité d’échantillon réduite et une fonctionnalité cellulaire améliorée.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) agissent comme une ressource transitoire efficace pour produire des cellules d’origine mésodermique comme les adipocytes, les ostéocytes et les chondrocytes, qui pourraient être utilisées pour modéliser leurs troubles génétiques respectifs. Cependant, les approches précédentes reposaient sur l’obtention de ces CSM à partir de tissus adultes 1, ce qui imposait le défi de les obtenir en grand nombre auprès des donneurs et la limitation de leur viabilité fonctionnelle dans des conditions de culture in vitro sous-optimales 1,2. Ces obstacles ont produit une grande demande d’avoir un protocole pour générer des CSM in vitro. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) peuvent être utilisées comme source précieuse de CSM, présentant les caractéristiquesdes CSM 3,4,5. Les CSM dérivées des CSPi peuvent être utilisées comme option thérapeutique dans plusieurs maladies. En outre, la capacité des CSM dérivées des CSPi à générer des adipocytes en fait un modèle humain in vitro précieux pour étudier l’adipogenèse humaine, l’obésité et les troubles associés aux adipocytes.

Les protocoles actuels de différenciation des adipocytes peuvent être classés en deux groupes, l’un impliquant la différenciation des adipocytes à l’aide de cocktails chimiques ou à base de protéines donnant un rendement résultant de 30%-60%6,7,8,9, tandis que l’autre impliquant une manipulation génétique pour une induction robuste de facteurs de transcription clés régissant le développement des adipocytes pour donner un rendement de 80%-90%10, 11. Cependant, la manipulation génétique ne récapitule pas le processus naturel de différenciation des adipocytes et masque souvent les paradigmes subtils arrivant au cours de l’adipogenèse, ce qui la rend inefficace à des fins de modélisation de la maladie12,13. Par conséquent, nous présentons un moyen de trier les adipocytes matures dérivés chimiquement des adipocytes immatures en marquant par fluorescence les adipocytes lipidiques à l’aide de rouge du Nil.

Nous présentons ici un protocole impliquant l’incubation transitoire de corps embryoïdes (EB) dérivés de CSPi avec de l’acide rétinoïque tout-trans pour produire un grand nombre de CSM à prolifération rapide, qui pourraient être utilisés pour générer des adipocytes14. Nous présentons également un moyen de trier les adipocytes matures dérivés chimiquement du pool de différenciation hétérogène en marquant par fluorescence leurs gouttelettes lipidiques à l’aide d’un colorant lipophile; Nil rouge. Cela permettrait la génération d’une population pure d’adipocytes matures avec une fonctionnalité améliorée pour modéliser avec précision les troubles métaboliques associés aux adipocytes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche de l’établissement approprié et réalisée conformément aux normes éthiques énoncées dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs ou à des normes éthiques comparables. Le protocole a été approuvé par l’Institutional Review Board (IRB) du HMC (n° 16260/16) et de l’ICRQ (n° 2016-003). Ce travail est également optimisé pour les CSEh tels que H1 et H9. Des échantillons de sang ont été prélevés sur des personnes en bonne santé avec leur plein consentement éclairé. Les CSPi sont générées à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) d’individus en bonne santé.

1. Culture et maintien des CSPi

  1. Préparer les plaques revêtues de matrice de membrane basale en reconstituant la matrice de revêtement dans du DMEM knockout dans un rapport de 1:80 et stocker à 4 °C.
  2. Préparer les milieux de culture des CSPi en ajoutant 50 mL de milieux de supplément de cellules souches 10x à 500 mL de milieux basaux de cellules souches, ainsi que 5 mL de 100x pénicilline-streptomycine (P/S) et conserver à 4 °C pour une utilisation à court terme ou à -20 °C pour une utilisation à long terme.
  3. Tapisser les plaques d’une matrice de revêtement de 1 mL pour une plaque à 6 puits, de 500 μL pour une plaque de 12 puits, de 250 μL pour une plaque de 24 puits et d’incuber la plaque à 37 °C pendant 1-2 h.
  4. Retirer une partie aliquote du milieu de culture des CSPi et préchauffer à température ambiante avant utilisation.
  5. Décongeler un flacon de CSPi (CSE ou CSPi) dans un bain-marie à 37 °C et transférer dans un tube conique de 15 mL contenant 2 à 3 mL de milieu de culture.
  6. Centrifuger le tube à 120 x g pendant 4 min à température ambiante (RT-23 °C).
  7. Retirer le surnageant et ajouter 2 mL de milieu de culture frais additionné d’inhibiteur de ROCK de 10 μM (Y-27632). Plaquer les cellules dans un puits d’une plaque à 6 puits revêtue de matrice et placer la plaque à 37 °C.
  8. Après 24 h, retirez le support et remplacez-le par un milieu de culture frais.
  9. Changez le média tous les jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% à 90% de confluence.
  10. Lorsque vous atteignez la confluence, passez les cellules en suivant les étapes décrites ci-dessous.
    1. Retirez le média et lavez les cellules avec la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco.
    2. Ajouter le réactif de dissociation des CSPi (voir le tableau des matériaux) - 500 μL pour un puits d’une plaque de 6 puits, 250 μL pour un puits d’une plaque de 24 puits - et incuber pendant 1 min à 37 °C.
    3. Retirer le réactif de dissociation et incuber les cellules à sec pendant 1 min à 37 °C.
    4. Recueillir les cellules à l’aide d’un milieu de culture - 1 mL pour un puits d’une plaque de 6 puits et 250 μL pour un puits d’une plaque de 24 puits - dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 120 x g pendant 4 min.
    5. Resuspendre les cellules dans un milieu de culture - 2 mL pour un puits d’une plaque de 6 puits et 500 μL pour un puits d’une plaque de 24 puits - complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM et les plaquer sur des plaques fraîches revêtues de matrice à 40% de confluence.

2. Différenciation des CSPi en CSM

  1. Préparer le milieu de différenciation MSC en ajoutant 15% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% P/S à faible taux de glucose DMEM + pyruvate et conserver à 4 °C.
  2. Lorsque vous atteignez 80% de confluence, utilisez des CSPi pour la formation de corps embryoïdes (EB) en suivant les étapes décrites ci-dessous.
    1. Lavez les cellules avec DPBS et incuber avec un milieu de dissociation/EDTA-500 μL pour un puits d’une plaque à 6 puits, 250 μL pour un puits d’une plaque de 24 puits.
    2. Incuber à 37 °C pendant 1 min, aspirer le réactif de dissociation et maintenir les cellules à 37 °C pendant 1 min supplémentaire. Pour commencer la différenciation MSC, ~10-12 x 106 cellules sont nécessaires.
    3. Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml à l’aide de milieux de culture. Assurez-vous d’être très doux lors de la collecte pour éviter que les cellules ne deviennent uniques et permettre la formation d’EB. Centrifuger les cellules à 120 x g pendant 4 min.
    4. Resuspendre les cellules dans 3 mL de milieu de différenciation MSC contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK.
    5. Mélanger et répartir 0,5 mL/puits dans une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits.
      REMARQUE: L’utilisation d’une plaque de fixation ultra-basse encouragerait l’agrégation des cellules en EB plutôt que leur fixation à la surface.
    6. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C.
  3. Après 24 h, induire les EB atteints avec un traitement à haute teneur en acide rétinoïque (PR) en suivant les étapes décrites ci-dessous.
    1. Ajouter 10 μM RA à 3 mL de milieu de différenciation MSC. Recueillir les EB dans un tube de 15 ml et les laisser se déposer pendant 15 min.
    2. Retirer le surnageant des EB et ajouter un milieu de différenciation MSC complété par 10 μM RA.
    3. Remettre en suspension délicatement et répartir 0,5 mL/puits dans la même plaque de fixation ultra-basse de 24 puits.
    4. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C. Ne pas déranger les EB pendant les 48 heures suivantes.
    5. Après 48 h, recueillir les EB dans un tube de 15 ml et les laisser reposer pendant 15 min.
    6. Retirer le surnageant des EB et ajouter un milieu de différenciation MSC complété par 0,1 μM RA.
    7. Remettre en suspension délicatement et répartir 0,5 mL/puits dans la même plaque de fixation ultra-basse de 24 puits.
    8. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C. Ne pas déranger les EB pendant les 48 heures suivantes.
  4. Supprimez l’AR ajouté aux cellules en suivant les étapes décrites ci-dessous.
    1. Après 48 h du dernier traitement contre la PR, recueillir les EB et les laisser s’installer pendant 15 min.
    2. Retirez le surnageant et ajoutez un milieu DMEM à faible teneur en glucose sans cytokines.
    3. Remettez doucement en suspension et répartissez 0,5 mL/puits dans une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C.
  5. Plaquez les EB dérivés des CSPi en suivant les étapes décrites ci-dessous.
    1. Après 48 h de l’étape précédente (étape 2.4), recueillir les EB dans un tube de 15 mL et les laisser reposer pendant 15 min.
    2. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 2 mL de milieu de différenciation MSC frais.
    3. Transfert dans deux puits d’une plaque à 6 puits revêtue d’une membrane basale à matrice.
    4. Changez le support tous les deux jours pendant 5 jours supplémentaires.
    5. Après 5 jours, retirez le milieu usé et remplacez-le par un nouveau milieu de différenciation MSC contenant 2,5 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques (FGFb).
  6. Passez les EB plaqués lorsqu’ils atteignent 80% - 90% de confluence, en suivant les étapes décrites ci-dessous.
    1. Laver les cellules avec du DPBS, ajouter de la trypsine-EDTA-500 μL pour un puits d’une plaque à 6 puits et incuber les cellules à 37 °C pendant 3 min.
    2. Recueillir les cellules à l’aide d’un milieu de différenciation MSC dans un tube conique de 15 ml et faire tourner à 750 x g pendant 4 min.
    3. Resuspendre dans un milieu de différenciation MSC avec 2,5 ng/mL de FGFb et plaquer les cellules sur des plaques revêtues de matrice membranaire basale dans un rapport de 1:3.
    4. Répétez le passage lorsque les cellules atteignent 70%-80% de confluence. On s’attend à ce qu’il gagne 3 à 6 millions de cellules par 2 à 3 passages.

3. Analyse par cytométrie en flux des CSM dérivées des CSPi

REMARQUE: Lors de 2-3 passages, les cellules doivent être accessibles pour l’efficacité de la différenciation MSC. La différenciation sera considérée comme réussie si les cellules expriment les marqueurs de différenciation MSC - CD44, CD73, CD90 et CD105 avec une efficacité supérieure à 90% et n’expriment pas des niveaux élevés de marqueurs hématopoïétiques - CD14, CD19, CD34 et CD45. L’efficacité de ces marqueurs est accessible en suivant les étapes ci-dessous.

  1. Passez les cellules en suivant les étapes décrites ci-dessus (étape 2.6) et atteignez 1 x 105 cellules dans un puits d’une plaque de 96 puits à fond en V.
  2. Centrifuger la plaque à 375 x g pendant 4 min à 4 °C.
  3. Resuspendre 1 x 105 cellules dans 100 μL de DPBS froid avec 1 μL d’anticorps conjugué (Ab) (voir le tableau des matériaux) et incuber à 4 °C pendant 30-40 min en évitant l’exposition à la lumière.
  4. Resuspendre 1 x 105 autres cellules dans 100 μL de DPBS froid avec le contrôle isotype respectif de l’Ab conjugué à une concentration de 1:100 ) et incuber à 4 °C pendant 30-40 min en évitant l’exposition à la lumière.
  5. Après incubation, centrifuger la plaque à 375 x g pendant 4 min à 4 °C. Jetez le surnageant en secouant la plaque au-dessus de l’évier.
  6. Remettez les cellules en suspension dans 100 μL de DPBS froid.
  7. Centrifuger les cellules à 375 x g pendant 4 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
  8. Remettez les cellules en suspension dans 200 μL de DPBS froid et recueillez-les dans des tubes microcentrifugeuses froids et sombres de 1,5 mL et maintenez-les sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient analysées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
  9. Pour l’analyse FACS, répartir les cellules en utilisant la dispersion latérale (SSC-A) plutôt que la dispersion vers l’avant (FSC-A) pour exclure les débris. De plus, répartir les cellules fermées en utilisant la hauteur diffusée vers l’avant (FSC-H) par rapport à la zone dispersée vers l’avant (FSC-A) pour distinguer les singulets des doublets de la population de cellules vivantes.
    REMARQUE : Les cellules ont été fermées par rapport au décalage du contrôle de l’isotype pour chaque marqueur, et un minimum de 10 000 événements contrôlés de chaque échantillon coloré a été utilisé pour l’analyse.

4. Différenciation des CSM en adipocytes

  1. Préparer le milieu de base de différenciation des adipocytes en ajoutant 10 % de sérum knockout de remplacement (KOSR), 1 % de glutamine, 1 % P/S, 4,5 ng/μL de glucose au milieu essentiel (MEM)-alpha minimal et conserver à 4 °C.
  2. Permettre aux CSM d’atteindre une confluence supérieure à 90 %. Continuez à les cultiver pendant encore 48 heures pour leur permettre de subir une période d’arrêt de croissance.
  3. Préparer des milieux de différenciation adipocytaire complets en ajoutant 100 μg/mL de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), 1 μM de dexaméthasone, 0,2 U/mL d’insuline, 100 μM d’indométacine et 10 μM de rosiglitazone au milieu basal.
  4. Retirez le milieu de différenciation MSC et lavez les cellules à l’aide de DPBS.
  5. Ajouter un milieu de différenciation adipocytaire complet - 2 mL pour un puits d’une plaque de 6 puits et 1 mL pour un puits d’une plaque de 12 puits - et incuber les cellules à 37 °C. Changez de support de différenciation complet tous les deux jours pendant 14 jours.

5. Évaluation de l’efficacité de différenciation des adipocytes

  1. Au jour 14 de la différenciation, vérifier l’efficacité de la différenciation en colorant les cellules pour les marqueurs de maturation adipocytes, FABP4 et adiponectine.
  2. Retirez le support et lavez les cellules avec DPBS.
  3. Fixez les cellules à l’aide de 4% de paraformaldéhyde (PFA) - 200 μL dans un puits d’une plaque de 24 puits - et incuber à température ambiante pendant 15 min.
  4. Jeter le PFA et laver avec une solution saline tamponnée au tris avec 0,5% de tween (TBST) et le placer sur un agitateur à température ambiante pendant 15 min. Répétez le processus deux fois.
  5. Perméabiliser les cellules fixes avec une solution saline tamponnée au phosphate avec 0,5% de Triton X-100 (PBST) et la placer sur un agitateur à température ambiante pendant 15-20 min.
  6. Jeter le PBST et ajouter le tampon de blocage (5%-6% d’albumine sérique bovine (BSA) dans PBST)-500 μL pour un puits d’une plaque de 6 puits et 250 μL pour un puits d’une plaque de 12 puits - et incuber à température ambiante sur le shaker pendant 40-60 min.
  7. Diluer les anticorps primaires contre FABP4, l’adiponectine, dans 2 % à 3 % de BSA, à une concentration de 1:500 (voir le tableau des matériaux). Ajoutez ces anticorps ensemble uniquement s’ils sont élevés chez différents animaux et placez la plaque sur l’agitateur à 4 °C, pendant une nuit.
  8. Retirer les anticorps primaires et laver les cellules trois fois avec du TBST (15 min chacune) et les placer sur un agitateur à température ambiante.
  9. Préparer les anticorps secondaires Alexa Fluor dans PBST (1:500). Incuber les cellules dans les combinaisons d’anticorps secondaires (selon l’espèce dans laquelle l’anticorps primaire est élevé) pendant 60 minutes à température ambiante et couvrir la plaque avec du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière.
  10. Jetez les anticorps secondaires, lavez avec TBST trois fois et placez la plaque sur le shaker.
  11. Pour colorer les noyaux, ajouter 1 μg/mL de Hoechst 33342-200 μL pour un puits d’une plaque de 24 puits dilué dans du PBS et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  12. Jeter la solution de Hoechst et ajouter du PBS-500 μL pour un puits d’une plaque de 24 puits aux cellules. Gardez les plaques couvertes de lumière jusqu’à ce qu’elles soient visualisées à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée.

6. Tri des adipocytes à l’aide du rouge du Nil

  1. Préparer la solution de travail rouge du Nil en ajoutant 1 mg/mL de solution mère rouge du Nil dans du DMSO et conserver à -20 °C. Juste avant utilisation, décongeler le stock de rouge du Nil et reconstituer dans le DPBS pour atteindre une concentration de solution de travail de 300 nM.
  2. À partir du jour 14 de la différenciation des adipocytes, jeter le média des cellules et laver à l’aide de DPBS.
  3. Ajouter la solution de travail rouge du Nil -1 mL dans un puits d’une plaque de 6 puits et incuber à 37 °C pendant 15 min.
  4. Retirer la solution de rouge du Nil et ajouter la trypsine-EDTA -500 μL dans un puits d’une plaque de 6 puits et incuber à 37 °C pendant 4 min.
  5. Recueillir les cellules à l’aide de DMEM contenant 5% de FBS dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger à 750 x g pendant 4 min.
  6. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans DPBS-1 mL pendant 1 x 106 cellules. Centrifuger à 750 x g pendant 4 min.
  7. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans DPBS-1 mL pendant 1 x 106 cellules. Utilisez un trieur FACS pour isoler les cellules rouges positives du Nil à l’aide du canal FL1.
  8. Re-culture des cellules triées dans des milieux de différenciation adipocytaire ou collecte des cellules triées pour l’isolement de l’ARN et des protéines.
  9. Extraire l’ARN des cellules triées et effectuer une analyse quantitative relative des marqueurs de différenciation des adipocytes, y compris FABP4, PPARG et C / EBPA. Les cellules rouges positives du Nil montrent une régulation positive significative dans l’expression génique d’au moins deux fois par rapport aux cellules non triées.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Schéma et morphologie des cellules au cours de la différenciation mésenchymateuse : La différenciation des CSPi en CSM implique différents stades de développement allant de la formation de l’EB, de la différenciation des CSM et de l’expansion des CSM (Figure 1). Au cours de ces stades de développement, les cellules acquièrent une morphologie variée en raison des différents produits chimiques stimulants auxquels elles sont soumises. Lors du début de la différenciation, les cellules sont plaquées en suspension et devraient être rondes, avec des bordures cellulaires définies, tout en étant de petite à moyenne taille (figure 2). Le choix des cellules en culture en suspension pendant la phase initiale de différenciation lui permet de ressembler étroitement au processus de développement embryonnaire naturel, ce qui rend cette phase hautement cruciale pour une différenciation réussie. La phase de formation d’EB et de traitement de la PR est suivie d’un placage des EB sur des plaques revêtues de matrice membranaire basale. La viabilité des EB lors du placage peut être obtenue en observant leur comportement de prolifération rapide donnant lieu à un plus grand nombre de CSM (Figure 2). Ce comportement de prolifération rapide présenté par les CSM est conservé même après les avoir passées sur des plaques fraîches revêtues de matrice tout en conservant une morphologie particulière et allongée (Figure 2).

Évaluation quantitative des marqueurs de surface MSC: L’efficacité de différenciation des MSC est accessible par quantification des marqueurs de surface spécifiques à la différenciation MSC. Une bonne différenciation produisant des CSM fiables devrait montrer une efficacité supérieure à 90% des marqueurs de surface mésenchymateux CD73, CD44 et CD90 (Figure 3A). En plus de cela, les cellules sont également évaluées pour l’absence de marqueurs de surface représentant le phénotype hématopoïétique, CD14, CD34 et CD19, et on s’attend donc à ce qu’elles montrent une efficacité d’expression inférieure à 1% (Figure 3B).

Différenciation des CSM en adipocytes : La différenciation des CSM en adipocytes peut être obtenue par coloration pour FABP4 et adiponectine. FABP4 est une protéine cytoplasmique, et il est considéré comme un marqueur pour les adipocytes différenciés en phase terminale. Sa forte expression parmi les adipocytes, avec une distribution cytoplasmique, est un signe clé de leur maturité développementale (Figure 4A). En plus de FABP4, l’adiponectine est considérée comme l’un des marqueurs importants de la maturité des adipocytes . Son expression élevée indique que les adipocytes sont suffisamment fonctionnels pour subir le stockage des lipides et l’adipogenèse en réponse à la signalisation du glucose. Étant une protéine sécrétoire, l’adiponectine présente une morphologie globulaire avec chaque globule protéique facilement distinguable dans le cytoplasme (Figure 4B).

Coloration et tri des adipocytes matures à l’aide de rouge du Nil: Lors de la différenciation, les adipocytes matures peuvent être distingués de leurs homologues immatures par coloration pour le rouge du Nil. Le rouge du Nil se lie aux adipocytes lipidiques, une caractéristique exclusive aux adipocytes matures (Figure 5A). Ceci, associé à la caractéristique de roulement fluorescent du rouge du Nil, en fait un outil efficace pour trier les adipocytes matures à l’aide de la cytométrie en flux activée par fluorescence (Figure 5B). Un tri efficace devrait entraîner l’amélioration des marqueurs de maturation - PPARG, C / EBPA et FABP4 - d’au moins deux fois, déterminés par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) (Figure5C).

Figure 1
Figure 1 : Diagramme schématique montrant la différenciation des CSPi en CSM et adipocytes. Les CSPi sont différenciées en CSM à l’aide de la technique du corps embryoïde (EB). Les EB sont soumis à une courte exposition de 10 μM d’acide rétinoïque (PR) tout-trans. Les CSM générées sont différenciées en adipocytes de 40% à 77% sur la base de la lignée iPSC. Les cellules positives au rouge du Nil sont triées à l’aide de FACS pour obtenir une population purifiée d’adipocytes matures qui peuvent être utilisés pour étudier les troubles associés aux adipocytes (modélisation de la maladie), identifier de nouveaux médicaments et, éventuellement, pour une thérapie personnalisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Différenciation des CSPi en CSM. Images morphologiques représentatives montrant différents stades de différenciation des CSM aux jours 2 (D2), 11 (D11), 15 (D15) et 24 (D24). Les corps embryoïdes (EB) générés en présence de 10 μM de PR pendant 24 h ont été plaqués au jour 8 de différenciation, suivis par la dissociation et le passage après 12-17 jours de différenciation. Les MSC ont été adoptés plusieurs fois. Abréviations : P2 = passage 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Expression des marqueurs de CSM et des marqueurs hématopoïétiques dans les CSM dérivées des CSPi. Histogrammes représentatifs de cytométrie en flux montrant l’expression des marqueurs MSC, CD73, CD44 et CD90, (A) et des marqueurs hématopoïétiques, CD34, CD19 et CD14 (B) dans les CSM générées à partir de EB dérivés de CSPi traités avec 10 μM de PR. L’axe X dans le graphique représente l’intensité fluorescente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Différenciation des CSM dérivées des CSPi en adipocytes. Images d’immunomarquage montrant l’expression de FABP4 (A) et d’adiponectine (ADIPO) (B) dans des adipocytes matures dérivés de CSPi. Les noyaux ont été colorés avec Hoechst. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Tri des adipocytes dérivés des CSPi à l’aide du rouge du Nil. (A) Images montrant des adipocytes matures colorés en champ clair (BF) et colorés en rouge du Nil. (B) Quantification du rouge du Nil (cellules PE-positives) dans les adipocytes matures à l’aide de FACS. (C) Analyse PCR en temps réel montrant l’expression de C/EBPA, FABP4 et PPARG dans les adipocytes matures triés et non triés. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± écart-type; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ce protocole revêt une importance primordiale en raison de sa capacité à fournir des CSM à haut rendement et efficacité. Cette production à grande échelle de CSM a été rendue possible par l’incubation transitoire de SE dérivés de CSPi avec 10 μM de RA14,15. Le traitement transitoire avec 10 μM de PR a augmenté le rendement des CSM de 11,2 à 1542 fois14,15, ce protocole étant applicable à la fois aux CSPi et aux CSPh. À cette dose et à la durée du traitement, la PR améliore les capacités de prolifération et de survie des cellules formant EB par régulation directe ou indirecte de l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la prolifération cellulaire, l’apoptose et les adhérences cellule-cellule et ECM-cellule, qui sont essentielles à la survie et à la prolifération des CSPi14,16. Les gènes comprennent, sans toutefois s’y limiter, des facteurs de transcription (tels que EGFR4, SOX4), des facteurs de croissance et des récepteurs de facteurs de croissance (tels que IGF2, FGFR4) et des molécules d’adhésion (telles que FN1 et CAM). Cependant, contrairement aux faibles doses (0,1-10 μM), à fortes doses (≥20 μM), la PR régule négativement la prolifération et la survie des cellules formant EB, ce qui entraîne une réduction du nombre et de la taille des CSP dérivées de la CSP et, par conséquent, une diminution du rendement des CSM14. La PR est considérée comme un inhibiteur de la prolifération dans plusieurs cellules normales différenciées et cancéreuses17,18,19. Dans les EB, la signalisation des rétinoïdes dépend du contexte (temps, concentration, espèce et lignée cellulaire); affectant différemment l’auto-renouvellement, la survie et la différenciation des cellules formant EB en régulant des gènes distincts et des voies de signalisation20,21. Par conséquent, l’utilisation de la PR dans un temps et une concentration optimaux de RA-10 μM le jour 3 de l’induction de l’EB, suivie d’une réduction de la dose à 0,1 μM le jour 5 pendant 2 jours, comme décrit dans le présent protocole, est cruciale pour induire la survie et la prolifération des cellules formant EB.

En plus de réguler la croissance et la survie, la PR soumet les EB traitées à un délai de différenciation par rapport aux cellules non traitées par la PR14. En fait, les EB traités par PR conservent leur forme compacte après le placage et ne parviennent pas à se différencier en cellules de type CSM, contrairement aux EB non traités par PR. Ceci est cohérent avec des études antérieures rapportant que l’exposition à court terme au traitement de la PR inhibe la différenciation cellulaire par la suppression de la signalisation WNT21. De plus, ces cellules retardées de différenciation traitées par PR ont également montré une expression accrue de la cadhérine et des protéines de la matrice extracellulaire14, qui sont connues pour jouer un rôle important dans le maintien de l’état pluripotent desCSPi 16. Pour libérer le bloc de différenciation médié par la PR, les EB doivent être dissociés, ce qui perturbe les adhérences cellulaires et permet une différenciation à long terme des CSM lors du placage. Fait intéressant, le traitement de la PR a maintenu un bloc de différenciation sur les cellules, mais il n’a pas maintenu les cellules dans un état pluripotent. En fait, les cellules formant EB subissant une exposition à court terme à 10 μM RA montrent une expression significativement réduite des marqueurs clés de la pluripotence - OCT4, SOX2 et NANOG14.

Il a été démontré que les CSM générées par le traitement à court terme des EB par PR conservent leur morphologie typique de type fibroblaste avec une expression abondante des marqueurs de surface des CSM et leur multipotence après cryoconservation, rendant ainsi ces CSM produites en masse stockables pour des études d’expansion à long terme14. En les soumettant à des conditions de différenciation adipogénique, chondrogénique et ostéogénique, ces CSM pourraient facilement se différencier en trois types de cellules mésodermiques, ce qui en ferait une source facilement accessible pour la modélisation des maladies tissulaires14. Ainsi, le comportement in vitro stable et polyvalent des CSM généré par le protocole de différenciation médiée par la PR leur confère une importance primordiale dans les contextes de recherche et d’application.

Alors que les potentiels de différenciation chondrogénique et ostéogénique des CSM obtenus à partir de CSE traitées par PR semblent être similaires à ceux des CSM obtenus à partir de CSE non traitées, le premier s’est avéré présenter un potentiel accru de différenciation en lignée adipogène lorsqu’il est soumis à des conditions de différenciation adipogénique14. Cela a été mis en évidence par une augmentation de 2 à 3 fois de l’accumulation de lipides intracellulaires (coloration Oil Red O) et des cellules FABP4-positives du marqueur adipocytaire FABP4 dans le pool de différenciation des cellules obtenues après culture des CSM dérivées de EB traitées par PR avec des milieux de différenciation adipogéniques, par rapport aux CSM dérivées de EB non traitées par PR. Cela pourrait être la conséquence de la régulation, par la PR, de plusieurs voies de signalisation régissant le développement des adipocytes telles que les voies d’interaction hippopotame, WNT et ECM-cellule, comme le révèlent les données de séquençage de l’ARN des EB 14,22,23,24,25 traités et non traités. Cette capacité accrue des CSM dérivées de la PR à subir une différenciation adipogène est précieuse, car les protocoles actuellement disponibles conduisent soit à un faible rendement adipocytaire, soit utilisent la manipulation génétique, ce qui rend les adipocytes générés inestimables pour dériver les adipocytes récapitulés par processus naturel. Les adipocytes sont classés en trois types: blanc, brun et beige. Les adipocytes blancs sont classés par la présence d’une seule gouttelette lipidique et jouent un rôle dans le stockage de l’énergie. Considérant que les adipocytes bruns sont impliqués dans la dépense énergétique par oxydation du substrat en raison de la très grande abondance de mitochondries caractérisée par l’expression d’UCP1. Alors que les adipocytes bruns qui se trouvent localisés dans le tissu adipeux blanc sont connus sous le nom d’adipocytes beiges ou bruns. Ces CSM ont le potentiel de donner un rendement abondant d’adipocytes blancs compte tenu de la pré-exposition des EB à la PR. Des publications antérieures ont fait état d’une induction sélective de l’iPSC dans des cellules exprimant un faible taux d’UCP1, c’est-à-dire des adipocytes blancs, plutôt que d’exposer des cellules présentant des niveaux élevés d’UCP1 à la PR26. Des publications antérieures ont rapporté que la PR produite à partir de cellules de crête neurale dans des embryons de souris et de poissons-zèbres joue un rôle important dans la formation d’adipocytes blancs27,28.

Bien que le protocole basé sur la PR ait permis la génération de CSM qui fournissent un rendement accru des adipocytes atteignant 48,5%-77,4% (vs 22,5%-57,6% sans traitement PR), ne pas atteindre >90% est toujours problématique lors de la modélisation de troubles génétiques multivariants à base d’adipocytes in vitro. En fait, ne pas atteindre une population adipocytaire pure pourrait rendre ambivalents les résultats provenant de modèles de maladies multivariants, car il serait difficile de distinguer si les différences de développement observées sont dues aux différentes constitutions génétiques ou à des efficacités de différenciation incohérentes. Afin de contourner ce problème, il était important de trier les cellules différenciées pour obtenir un pool d’adipocytes matures purs, de sorte que toute différence de phénotypes ne puisse être attribuée qu’à des différences génétiques inhérentes. Plusieurs études ont identifié des marqueurs de surface sur les adipocytes qui pourraient potentiellement être utilisés pour le tri. Par exemple, les travaux menés par Ronald Kahn ont permis d’identifier le transporteur d’acides aminés ASC-1 comme nouveau marqueur de surface sur les adipocytes blancs.29. En outre, des études extrayant des adipocytes matures des régions omentales et sous-cutanées ont rapporté que les adipocytes matures expriment CD34, CD36 et CD59 sur leurs surfaces.30, où CD36 a été signalé comme un transporteur d’acides gras à la surface des adipocytes matures31. Cependant, ces études ont utilisé des populations hétérogènes de cellules dérivées du tissu adipeux sans préciser l’expression de ces marqueurs aux seules populations adipocytaires matures. De plus, ces marqueurs peuvent également être exprimés par d’autres types de cellules et ne sont pas spécifiques aux adipocytes. Par exemple, ASC-1 est présent à la fois sur les astrocytes et les neurones32, CD34 est un marqueur des cellules souches hématopoïétiques33, CD36 est présent sur les plaquettes, les phagocytes mononucléaires, les hépatocytes, les myocytes et certaines épithéliums33, et CD59 est exprimé sur les cellules endothéliales et lymphoïdes34,35. Par conséquent, comme solution alternative, le rouge du Nil, la coloration fluorescente sélective pour les lipides intracellulaires, a été utilisé comme candidat possible pour le tri des adipocytes. Les adipocytes stockent une masse importante de lipides qui peuvent être libérés et utilisés pour produire de l’énergie, construire des membranes ou comme molécules de signalisation qui régulent le métabolisme.36. Le colorant rouge du Nil a déjà été utilisé en cytométrie en flux et en microscopie pour colorer les adipocytes dérivés de CSM murines et humaines37. Des études antérieures ont rapporté l’utilisation du rouge du Nil pour les adipocytes dérivés de l’ESC et l’amélioration des marqueurs adipocytaires après le tri38. Les adipocytes générés par les CSM obtenus par le protocole actuel basé sur la PR ont été évalués pour leur capacité à être colorés par le rouge du Nil, indiquant leur maturité, et triés pour les purifier. Ces cellules triées en rouge du Nil ont montré une augmentation de deux à trois fois de l’expression des marqueurs de maturation adipocytes, y compris PPARG, C/EBPAet FABP4 par rapport aux cellules non triées, augmentant ainsi encore le rendement des adipocytes dérivés des CSPi. Bien que ces marqueurs soient exprimés avant l’accumulation de lipides, leur expression marque une cellule pour la différenciation terminale en adipocytes porteurs de lipides. Vérifier l’efficacité du tri par ces marqueurs nous permet d’identifier un pool où toutes les cellules sont exprimées FABP4, CEBPaet PPARg, indiquant un bassin prédestiné à la formation d’adipocytes matures. Les cellules sont triées en fonction de leur potentiel de coloration au rouge du Nil. L’efficacité de purification a été multipliée par deux à trois en raison du nombre élevé d’adipocytes dans la fraction non triée. La taille des adipocytes porteurs de lipides varie considérablement au cours de la différenciation, où un pool de cellules ayant une distribution de taille identique est trié. La fraction non triée englobe les adipocytes lipidiques, mais ils ne sont pas complètement matures et régis par des proportions de taille dissemblables.

L’hétérogénéité des CSM isolées du corps humain a déjà été rapportée39. Cette hétérogénéité dépend de plusieurs facteurs, tels que l’origine des CSM, les donneurs et les conditions39. Cela peut entraîner des variations dans leur efficacité dans le traitement de différentes maladies. Cette étude suggère qu’un traitement à court terme de la PR des CSPh produites dans des conditions de culture compatibles avec les bonnes pratiques de fabrication (BPF) donnerait une population homogène de CSM. Cela indique que le protocole actuel est une approche prometteuse pour générer un grand nombre de CSM de qualité clinique pouvant être utilisées pour le traitement à base de CSM.

La combinaison du protocole de différenciation MSC basé sur la PR conduisant à la différenciation des adipocytes et du protocole de tri rouge du Nil nous a permis d’obtenir des adipocytes dérivés des CSPi avec une expression améliorée des marqueurs fonctionnels et un rendement et une pureté accrus. Ainsi, ce protocole combiné permettrait la génération, en quantité et pureté suffisantes, d’adipocytes matures à partir d’individus génétiquement distincts et la découverte potentielle de nouvelles variantes génétiques derrière les troubles métaboliques liés aux adipocytes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par une subvention du Fonds national de recherche du Qatar (QNRF) (subvention n° NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi a bénéficié d’une bourse GSRA du Fonds national de recherche du Qatar (QNRF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adiponectin Abcam ab22554 Adipocyte maturation marker
anti-CD105 BD Pharmingen 560839 MSC differentiation marker
anti-CD14 BD Pharmingen 561712 MSC differentiation marker
anti-CD19 BD Pharmingen 555415 MSC differentiation marker
anti-CD34 BD Pharmingen 555824 MSC differentiation marker
anti-CD44 abcam ab93758 MSC differentiation marker
anti-CD45 BD Pharmingen
560975		 MSC differentiation marker
anti-CD73 BD Pharmingen 550256 MSC differentiation marker
anti-CD90 BD Pharmingen 555596 MSC differentiation marker
bFGF R&D 233-FP MSC culture media supplement
C/EBPA Abcam ab40761 Adipocyte maturation marker
Dexamethasone Torics 1126 Adipocyte differentiation media supplement
FABP4 Abcam ab93945 Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serum ThermoFisher 10082147 MSC culture media supplement
Glutamax ThermoFisher 35050-061 MSC culture media supplement
IBMX Sigma Aldrich I5879 Adipocyte differentiation media supplement
Indomethacin Sigma Aldrich I7378 Adipocyte differentiation media supplement
Insulin Sigma Aldrich 91077C Adipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEM ThermoFisher 12660012 Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEM ThermoFisher 11885084 MSC culturing media
Matrigel Corning 354230 Coating matrix
MEM-alpha ThermoFisher 12561056 Adipocyte differentiation media
Nilered Sigma Aldrich 19123 Sorting marker for adipocyte
Penicillin ThermoFisher 15140122 MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered saline ThermoFisher 14190144 wash buffer
Pierce™ 20X TBS Buffer Thermo Fisher 28358 wash buffer
PPARG Cell Signaling Technology 2443 Adipocyte maturation marker
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Dissociation reagent
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625 MSC differentiation media supplement
Rock inhibitor Tocris 1254/10 hPSC culture media supplement
Roziglitazone Sigma Aldrich R2408 Adipocyte differentiation media supplement
StemFlex ThermoFisher A334901 hPSC culture media
Triton Thermo Fisher 28314 Permebealization reagent
Trypsin ThermoFisher 25200072 Dissociation reagent
Tween 20 Sigma Aldrich P7942 Wash buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
  2. Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
  3. Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
  4. Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
  5. Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
  6. Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
  7. Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
  8. van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
  9. Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
  10. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  11. Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
  12. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  13. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  14. Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
  15. Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2020).
  16. Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
  17. Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
  18. Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
  19. di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
  20. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
  21. De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
  22. Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
  23. Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, Pt 3 607-613 (2003).
  24. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
  25. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
  26. Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
  27. Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  28. Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
  29. Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
  30. Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
  31. Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
  32. Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
  33. Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
  34. Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
  35. Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
  36. Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
  37. Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
  38. Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
  39. Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).

Tags

Ce mois-ci dans JoVE numéro 180 cellules souches pluripotentes induites cellules souches mésenchymateuses différenciation adipocytaire tri cellulaire
Différenciation robuste des CSPi humaines en une population pure d’adipocytes pour étudier les troubles associés aux adipocytes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aghadi, M., Karam, M., Abdelalim, E. … More

Aghadi, M., Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders. J. Vis. Exp. (180), e63311, doi:10.3791/63311 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter