Summary

Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos

Published: February 10, 2022
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Summary

Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.

Abstract

La mayor parte de la energía de la célula se obtiene a través de la degradación de glucosa, ácidos grasos y aminoácidos por diferentes vías que convergen en el sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS), que se regula en respuesta a las demandas celulares. La molécula lipídica Coenzima Q (CoQ) es esencial en este proceso mediante la transferencia de electrones al complejo III en la cadena de transporte de electrones (ETC) a través de ciclos constantes de oxidación/reducción. El estado de las mitocondrias y, en última instancia, la salud celular se pueden evaluar midiendo el consumo de oxígeno ETC utilizando ensayos respirométricos. Estos estudios se realizan típicamente en líneas celulares establecidas o primarias que se han cultivado durante varios días. En ambos casos, los parámetros respiratorios obtenidos pueden haberse desviado de las condiciones fisiológicas normales en cualquier órgano o tejido dado.

Además, las características intrínsecas de las fibras individuales cultivadas aisladas del músculo esquelético impiden este tipo de análisis. Este artículo presenta un protocolo actualizado y detallado para el análisis de la respiración en mitocondrias recién aisladas del músculo esquelético de ratón. También proporcionamos soluciones a posibles problemas que podrían surgir en cualquier etapa del proceso. El método aquí presentado podría aplicarse para comparar las tasas de consumo de oxígeno en diversos modelos de ratones transgénicos y estudiar la respuesta mitocondrial a los tratamientos farmacológicos u otros factores como el envejecimiento o el sexo. Este es un método factible para responder a preguntas cruciales sobre el metabolismo y la regulación de la bioenergética mitocondrial.

Introduction

Las mitocondrias son los principales orgánulos metabólicos de la célula1. Estos orgánulos especializados encerrados en membrana utilizan moléculas de nutrientes para producir energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP) por OXPHOS. Este proceso se basa en la transferencia de electrones de moléculas donantes en una serie de reacciones redox en el ETC2. La CoQ es el único lípido redox-activo que se produce endógenamente en todas las membranas celulares y lipoproteínas circulantes que muestra función antioxidante3. Es un componente esencial de la ETC, transfiriendo electrones del complejo I dependiente de NADH y del complejo II dependiente de FADH2 al complejo III, aunque muchas otras reductasas pueden impulsar la reducción de la CoQ mitocondrial a ubiquinol como paso obligatorio en múltiples vías metabólicas celulares4,5.

A lo largo del proceso, se crea un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana interna mitocondrial, que se transforma en energía biológicamente activa por el complejo ATP sintasa V2. En consecuencia, la disfunción mitocondrial conduce a una miríada de condiciones patológicas que afectan principalmente a los tejidos con altos requerimientos de energía: el cerebro, el corazón y el músculo esquelético6,7. Por lo tanto, es fundamental desarrollar métodos para analizar con precisión la bioenergética mitocondrial para investigar su papel en la salud y la enfermedad, particularmente en tejidos altamente energéticos como los músculos esqueléticos.

El electrodo de oxígeno tipo Clark se ha utilizado clásicamente en el estudio de la respiración mitocondrial8. Sin embargo, este sistema ha sido desplazado progresivamente por tecnologías de mayor resolución, siendo especialmente populares las tecnologías de consumo de oxígeno basadas en microplacas como los analizadores Agilent Seahorse XF9. En el campo del músculo esquelético, estos estudios se realizan típicamente en células cultivadas, principalmente en la línea celular de mioblastos de ratón inmortalizada C2C12 o cultivos primarios derivados de células satélite10,11. Sin embargo, estos estudios no recapitulan completamente la situación in vivo, especialmente cuando se investiga la biología mitocondrial y la función a nivel tisular sobre insultos específicos, intervenciones no genéticas o manipulaciones genéticas.

Además, los ensayos de respiración en las células son más complejos debido a factores adicionales, incluida la demanda extramitocondrial de ATP y sustratos de ensayo o eventos de señalización, que podrían inducir a error la interpretación de los resultados. Alternativamente, también es posible usar miofibras individuales o haces de miofibras recién aisladas de los músculos. Sin embargo, el método de aislamiento es técnicamente desafiante y solo factible para unos pocos tipos de músculo. En este caso, los músculos flexor digitorum brevis (FDB) y extensor digitorum longus (EDL) se utilizan principalmente10,12,13, aunque algunos informes describen el uso de otros tipos de músculos también14,15.

También se ha reportado perfil bioenergético de secciones del músculo esquelético16. La principal ventaja de este método es que se pueden estudiar los músculos intactos (los autores muestran que cortar a través de las fibras no altera los resultados en comparación con las miofibras aisladas). Sin embargo, el acceso mitocondrial a sustratos e inhibidores de ensayos es limitado y, por lo tanto, solo se pueden medir unos pocos parámetros16. Finalmente, las mitocondrias aisladas también pueden ser empleadas9,17,18,19. En este caso, las mitocondrias pierden su entorno citosólico, lo que podría afectar su función. Por el contrario, este método garantiza el acceso a sustratos e inhibidores, permite el análisis de una gran cantidad de tipos de muestras y, por lo general, requiere menos material.

Este artículo describe un método para realizar el perfil bioenergético de mitocondrias aisladas del músculo esquelético de ratón utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas (Figura 1). En particular, se detallan tres protocolos: el Ensayo de Acoplamiento, CA para evaluar el grado de acoplamiento entre el ETC y la maquinaria OXPHOS; el ensayo de flujo de electrones, EFA para medir la actividad de los complejos ETC individuales; y el ensayo BOX para determinar la capacidad de β-oxidación mitocondrial. En particular, solo se requieren pequeñas cantidades de muestras en comparación con los métodos de respirometría convencionales. El protocolo de aislamiento utilizado aquí ha sido modificado a partir del método publicado en otra parte18.

Protocol

El alojamiento del ratón y la recolección de tejidos se realizaron utilizando protocolos aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, España; protocolos 24/04/2018/056 y 12/03/2021/033) de acuerdo con el Real Decreto 53/2013, la Directiva Europea 2010/63/UE y otras directrices relevantes. 1. Preparación de existencias, tampones y reactivos para los ensayos de respiración Prepare las siguientes soluciones de stock, que se pueden…

Representative Results

El protocolo aquí presentado permite el análisis in vivo de la respiración mitocondrial a través del aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón. En la Figura 1 se muestra un esquema del método. Después de diseccionar los músculos esqueléticos de las extremidades posteriores (Figura 2), los tejidos se homogeneizan y las mitocondrias se purifican, en condiciones isotónicas, a través de centrifugaciones en serie. La pureza de…

Discussion

Todos los métodos utilizados para estudiar la respiración mitocondrial tienen sus limitaciones; por lo tanto, es crucial seleccionar el método que mejor se adapte a una pregunta experimental específica. Este trabajo proporciona un protocolo actualizado y detallado para aislar las mitocondrias del músculo esquelético del ratón para realizar diferentes ensayos respiratorios para investigar la función mitocondrial. De hecho, el estudio de la bioenergética mitocondrial en mitocondrias aisladas utilizando tecnología…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Queremos agradecer a Juan J. Tena por el uso del homogeneizador y a las instalaciones de Proteómica y Ganadería de CABD por el apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación, Cultura y Deporte de España a través de la beca FPU16/03264 a J.D.H.C., la Association Française contre les Myopathies (AFM) a través de la beca #22450 a C.V.-G., una Beca Institucional MDM-2016-0687 (Unidad de Excelencia Maria de Maeztu, Departamento de Regulación Génica y Morfogénesis en CABD) y BFU2017-83150-P a J.J.C. La Junta de Andalucía concede P18-RT-4572, el Programa de Financiación FEDER de la Unión Europea, y el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades a P.N.

Materials

ADP Sigma A5285 Stock at -20 °C
AKT antibody Cell Signaling Technology C67E7 Rabbit (Host species)
anti-Goat HRP Sigma 401504 Rabbit (Host species)
anti-Mouse HRP Cell Signaling #7076 Horse (Host species)
Antimycin A Sigma A8674 Stock at -20 °C
anti-Rabbit HRP Cell Signaling #7074 Goat (Host species)
Ascorbic acid Sigma A5960 Stock at RT
Bactin antibody Sigma MBS4-48085 Goat (Host species)
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002 It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve
BSA, fraction V, Fatty Acid-Free Calbiochem 126575 Stock at 4 °C
C tube Miltenyi Biotec 130-093-237 Purple lid
Calnexin antibody ThermoFisher MA3-027 Mouse (Host species)
D-mannitol Sigma M4125 Stock at RT
EDTA BDH 280254D Stock at 4 °C
EGTA Sigma E-4378 Stock at RT
FCCP Sigma C2920 Stock at -20 °C
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Homogenizer
HEPES Sigma H3375 Stock at RT
HSP70 antibody Proteintech 10995-1-AP Rabbit (Host species)
LDH-A antibody Santa Cruz Biotechnology SC27230 Goat (Host species)
Magnesium chloride ChemCruz sc-255260A Stock at RT
Malic acid Sigma P1645 Stock at RT
Microplate spectrophotometer BMG LABTECH GmbH POLARstar OMEGA S/N 415-0292 Stock at RT
Milli-Q water Millipore system F7HA17757A Ultrapure water
mtTFA antibody Santa Cruz Biotechnology SC23588 Goat (Host species)
Na+/K+-ATPase α1 antibody Novus Biologicals NB300-14755 Mouse (Host species)
Oligomycin Sigma O4876 Stock at -20 °C
Palmitoyl-L-carnitine Sigma P1645 Stock at -20 °C
PBS tablets Sigma P4417-100TAB 1x stock at RT
Potassium dihydrogen phosphate ChemCruz sc-203211 Stock at RT
Potassium hydroxide Sigma 60377 Stock at RT
Pyruvic acid Sigma 107360 Stock at 4 °C
Rotenone Sigma R8875 Stock at -20 °C
Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer Agilent Technologies 420179 XFe24 model
Seahorse XFe24 FluxPak mini Agilent Technologies 102342-100 The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution
Succinate Sigma S7626 Stock at RT
Sucrose Sigma S9378 Stock at RT
TIMM23 antibody Abcam ab230253 Rabbit (Host species)
TMPD Sigma T7394 Stock at -20 °C
TOMM20 antibody Abcam ab56783 Mouse (Host species)
VDAC antibody Abcam ab15895 Rabbit (Host species)

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).
  3. Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
  4. Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
  5. Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
  6. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).
  7. Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
  8. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
  9. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
  10. Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
  11. Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
  12. Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
  13. Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
  14. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
  15. Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
  16. Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
  17. Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
  18. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
  19. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  20. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  21. Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
  22. Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
  23. Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
  24. Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
  25. Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
  26. Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).

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Hernández-Camacho, J. D., Vicente-García, C., Sánchez-Cuesta, A., Fernandez-Ayala, D. J. M., Carvajal, J. J., Navas, P. Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays. J. Vis. Exp. (180), e63336, doi:10.3791/63336 (2022).

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