Summary
כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר ואת הניתוח הבא של נשימה על ידי שיעור צריכת חמצן (OCR) באמצעות בדיקות respirometric מבוססות מיקרופלט. צינור זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות סביבתיות או גנטיות מרובות על חילוף החומרים המיטוכונדריאלי.
Abstract
רוב האנרגיה של התא מתקבלת באמצעות השפלה של גלוקוז, חומצות שומן וחומצות אמינו על ידי מסלולים שונים המתכנסים על מערכת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS), אשר מוסדר בתגובה לדרישות הסלולר. מולקולת השומנים קואנזים Q (CoQ) חיונית בתהליך זה על ידי העברת אלקטרונים ל- III מורכב בשרשרת הובלת האלקטרונים (ETC) באמצעות מחזורי חמצון/הפחתה קבועים. מצב המיטוכונדריה, ובסופו של דבר, בריאות התא ניתן להעריך על ידי מדידת צריכת חמצן ETC באמצעות בדיקות respirometric. מחקרים אלה מבוצעים בדרך כלל בשורות תא מבוססות או ראשוניות אשר היו בתרבית במשך מספר ימים. בשני המקרים, הפרמטרים של הנשימה שהושגו עשויים לסטות ממצבים פיזיולוגיים רגילים בכל איבר או רקמה נתון.
בנוסף, המאפיינים המהותיים של סיבים בודדים מתורבתים המבודדים משרירי השלד מעכבים סוג זה של ניתוח. מאמר זה מציג פרוטוקול מעודכן ומפורט לניתוח נשימה במיטוכונדריה מבודדת טרייה משריר השלד של העכבר. אנו מספקים גם פתרונות לבעיות פוטנציאליות שעלולות להתעורר בכל שלב של התהליך. השיטה המוצגת כאן יכולה להיות מיושמת כדי להשוות את שיעורי צריכת החמצן במודלים שונים של עכבר מהונדס וללמוד את התגובה המיטוכונדריאלית לטיפולים תרופתיים או גורמים אחרים כגון הזדקנות או מין. זוהי שיטה אפשרית להגיב לשאלות מכריעות על חילוף החומרים והרגולציה הביו-אנרגטית המיטוכונדריאלית.
Introduction
המיטוכונדריה הם האברונים המטבוליים העיקריים בתא1. אברונים מיוחדים אלה סגורים ממברנה להשתמש במולקולות מזין כדי לייצר אנרגיה בצורה של אדנוזין טריפוספט (ATP) על ידי OXPHOS. תהליך זה מסתמך על העברת אלקטרונים ממולקולות תורמות בסדרה של תגובות redox ב ETC2. CoQ הוא השומנים הפעילים היחידים המיוצרים באופן אנדוגני בכל הקרומים התאיים וליפופרוטאינים במחזור שמראה תפקוד נוגד חמצון3. זהו מרכיב חיוני של ETC, העברת אלקטרונים מ NADH תלוי קומפלקס I ו FADH2 תלוי קומפלקס II מורכב מורכב III מורכב, אם כי צמצומים רבים אחרים יכולים להניע את ההפחתה של CoQ מיטוכונדריאלי ליוביקינול כצעד חובה במסלולים מטבוליים תאיים מרובים4,5.
לאורך כל התהליך, שיפוע פרוטונים אלקטרוכימי נוצר על פני הממברנה הפנימית המיטוכונדריאלית, אשר הופכת לאנרגיה פעילה ביולוגית על ידי V2 קומפלקס סינתאז ATP. כתוצאה מכך, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מוביל למספר עצום של מצבים פתולוגיים המשפיעים בעיקר על רקמות עם דרישות אנרגיה גבוהה - המוח, הלב, ושרירי השלד6,7. לכן, זה בסיסי לפתח שיטות לנתח במדויק ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית כדי לחקור את תפקידה בבריאות ובמחלות, במיוחד ברקמות אנרגטיות מאוד כגון שרירי השלד.
אלקטרודת חמצן מסוג קלארק שימשה באופן קלאסי במחקר של נשימה מיטוכונדריאלית8. עם זאת, מערכת זו נעקרה בהדרגה על ידי טכנולוגיות ברזולוציה גבוהה יותר, עם טכנולוגיות צריכת חמצן מבוססות מיקרופלט כגון מנתחי סוסון ים XF Agilent להיות פופולרי במיוחד9. בשדה שרירי השלד, מחקרים אלה מתנהלים בדרך כלל בתאים מתורבתים, בעיקר בקו התאים של העכבר המונצח C2C12 או בתרביות ראשוניות שמקורן בתאי לווין10,11. עם זאת, מחקרים אלה אינם מסכמים באופן מלא את המצב ב- vivo, במיוחד כאשר חוקרים ביולוגיה מיטוכונדריאלית ותפקוד ברמת הרקמה על עלבונות ספציפיים, התערבויות לא גנטיות או מניפולציות גנטיות.
יתר על כן, בדיקות נשימה בתאים מורכבות יותר בשל גורמים נוספים, כולל דרישה חוץ-מיטוכונדריאלית של ATP ומצעים לבדיקה או אירועי איתות, אשר עלול להטעות את הפרשנות של התוצאות. לחלופין, ניתן גם להשתמש יחיד או חבילות של myofibers מבודד טרי מן השרירים. עם זאת, שיטת הבידוד מאתגרת מבחינה טכנית ואפשרית רק עבור כמה סוגי שרירים. במקרה זה, flexor digitorum brevis (FDB) ו- extensor digitorum longus השרירים (EDL) משמשים בעיקר 10,12,13, אם כי כמה דיווחים מתארים את השימוש בסוגי שרירים אחרים, כמו גם 14,15.
פרופיל ביו-אנרגטי של מקטעי שרירי שלד דווח גם הוא16. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי שרירים שלמים ניתן ללמוד (המחברים מראים כי חיתוך דרך סיבים אינו מפריע לתוצאות בהשוואה myofibers מבודד). עם זאת, הגישה המיטוכונדריאלית למצעים ומעכבי בדיקה מוגבלת, ולכן, רק כמה פרמטרים ניתן למדוד16. לבסוף, מיטוכונדריה מבודדת יכולה להיות מועסקת גם 9,17,18,19. במקרה זה, המיטוכונדריה מאבדת את הסביבה הציטוטוסולית שלהם, מה שעלול להשפיע על תפקודם. לעומת זאת, שיטה זו מבטיחה גישה למצעים ומעכבים, מאפשרת ניתוח של שפע של סוגי מדגמים, ובדרך כלל דורשת פחות חומר.
מאמר זה מתאר שיטה לביצוע הפרופיל הביו-אנרגטי של המיטוכונדריה המבודדת משריר השלד של העכבר באמצעות בדיקות ספירומטריות מבוססות מיקרופלסטיק (איור 1). בפרט, שלושה פרוטוקולים מפורטים: בדיקת צימוד, CA כדי להעריך את מידת הצימוד בין ETC ומכונות OXPHOS; אסאי זרימת האלקטרונים, EFA כדי למדוד את הפעילות של מתחמי ETC בודדים; ואת הבדיקה BOX כדי לקבוע את יכולת חמצון β מיטוכונדריאלי. ראוי לציין, רק כמויות קטנות של דגימות נדרשות בהשוואה לשיטות נשימה קונבנציונליות. פרוטוקול הבידוד המשמש כאן שונה מהשיטה שפורסמה במקום אחר18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
איסוף דיור ורקמות של עכברים בוצעו באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה פבלו דה אולביד (סביליה, ספרד; פרוטוקולים 24/04/2018/056 ו-12/03/2021/033) בהתאם לצו המלכותי הספרדי 53/2013, הוראה אירופית 2010/63/EU, והנחיות רלוונטיות אחרות.
1. הכנת מניות, חוצצים, ריאגנטים לבדיקות הנשימה
- הכן את פתרונות המלאי הבאים, אשר ניתן לאחסן בטמפרטורה שצוינה במשך חודשים. השתמש ב- H2O אולטרה-פורמט בכל המקרים.
- יש להמיס טבליות מלוחות עם אגירת פוספט (PBS) ב-H2O (טבליה אחת לכל 200 מ"ל של H2O) כדי להכין 1x PBS. יש לאתחלק אוטומטית את הפתרון ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר (RT).
- להמיס 2 גרם של כדורי NaOH ב 50 מ"ל של H2O כדי להכין 1 M NaOH.
- הכן מניות KOH של 0.1 M, 1 M, 5 M ו- 10 M KOH לכיול pH.
- הוסיפו 14.612 גרם של EDTA ל-70 מ"ל של H2O. הוסיפו כדורי NaOH עד שה-pH יגיע ל-8.0 כך ש-EDTA יתמוסס לחלוטין. הוסף את סאטיס הקוונטי H2O (QS) ל-100 מ"ל. סגור אוטומטית את פתרון 0.5 M EDTA (pH 8) המתקבל ואחסן אותו ב- RT.
- הוסיפו 19 גרם EGTA ל-70 מ"ל של H2O. הוסיפו כדורי NaOH עד שה-pH יגיע ל-8.0 כדי לאפשר ל-EGTA להתמוסס במלואו. הוסף H2O QS ל-100 מ"ל. סגור אוטומטית את פתרון 0.5 M EGTA (pH 8) המתקבל ואחסן אותו ב- RT.
- הוסף 2 מ"ל של 0.5 M EDTA ל-98 מ"ל של PBS. אחסן את פתרון EDTA/PBS של 10 מ"מ מ"מ ב- RT.
- יש להמיס 5.958 גרם HEPES ב-40 מ"ל H2O. התאימו את ה-pH ל-7.2 עם KOH ו-QS ל-50 מ"ל עם H2O. סננו את מאגר ה-HEPES של 0.5 מ"מ באמצעות רשת של 0.45 מיקרומטר ואחסנו אותו ב-RT.
- להמיס 3.402 גרם של KH2PO4 בעד 50 מ"ל של H2O. לסנן את הפתרון 0.5 M KH2PO4 וכתוצאה מכך באמצעות רשת 0.45 מיקרומטר ואחסן אותו ב RT.
- להמיס 9.521 גרם של MgCl2 נטול מים עד 100 מ"ל של H2O. Autoclave את הפתרון 1 M MgCl2 וכתוצאה מכך ולאחסן אותו ב RT.
הערה: מכיוון שמדובר בתגובה אקסותרמית, המשיכו בזהירות והמיסו את ה-MgCl2 על הקרח.
- הכן פתרונות מלאי מצע ומעכבים (ראה טבלה 1). Aliquot ולאחסן אותם ב -20 °C (50 °F). הימנע מחזורי הקפאה-הפשרה. כחריג, תמיד להכין חומצה פירובית מיד לפני השימוש.
- הכנה ב- H2O אולטרה-פורה: 0.5 M תמצית, 0.5 M חומצה פירובית, 0.5 M חומצה מאלית, 100 mM ADP, 1 M חומצה אסקורבית, ו 50 מ "מ N, N, N ′,N′,N′-tetramethyl-para-פנילן-דיאמין (TMPD) (מוגן מפני אור).
- היכונו ב-100% דימתיל סולפוקסיד (DMSO): 50 מ"מ פלמיטויל-ל-קרניטין, רוטנון 4 מ"מ, 20 מ"מ קרבוניל ציאניד-פ-טריפלואורומאתוקסידרזון (FCCP), 4 מ"מ אוליגומיצין ו-5 מ"מ אנטימיצין A.
הערה: אין לחרוג מריכוז DMSO סופי של 0.1% בבארות המיקרו-פלטה. לכן, להכין פתרונות מלאי מרוכזים מאוד להישאר מתחת למגבלה זו.
- הכן את המאגרים לבידוד המיטוכונדריה וכימות חלבונים טריים ביום הניסוי. השתמש ב- H2O אולטרה-פורמט בכל המקרים ולשמור את כל המאגרים על קרח אלא אם צוין אחרת.
הערה: כדי לחסוך זמן, ניתן לשקול את כל הריאגנטים ולשמור אותם במיכלים המתאימים (למשל, צינורות 15 מ"ל) בטמפרטורה הנכונה ביום הקודם.- להכנת 10% חומצות שומן חופשיות (FFA) BSA, יש להמיס ביסודיות 150 מ"ג FFA BSA ב-1.5 מ"ל של H2O על ידי גלגל היפוך/סיבובי. אין לערבב מערבולת כדי למנוע קצף.
- כדי להכין 1x ברדפורד ריאגנט, לדלל את פתרון מניות מסחרי 5x עם H2O ולשמור אותו בחושך ב RT.
- כדי להכין 8x מיטוכונדריה חוצץ (MB), להמיס 4.112 גרם של סוכרוז ו 763 מ"ג של HEPES ב 15 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2, להוסיף 1.6 מ"ל של 10% FFA BSA ו QS ל 20 מ"ל עם H2O.
- כדי להכין 20 מ"ל של מאגר בידוד 1 (IB1) (4 מ"ל בשימוש לדגימה), להמיס 400 μL של 0.5 M EDTA, 784 מ"ג של D-מניטול, ו 2.5 מ"ל של 8x MB ב 15 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2 ו QS עם H2O.
- כדי להכין 5 מ"ל של מאגר בידוד 2 (IB2) (500 μL בשימוש לכל מדגם), להמיס 30 μL של 0.5 M EGTA, 196 מ"ג של D-מניטול, ו 625 μL של 8x MB ב 4 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2 ו QS עם H2O.
- כדי להכין 5 מ"ל של מאגר Resuspension (RB) (200 μL בשימוש לכל מדגם), להמיס 120 מ"ג של סוכרוז, 191.3 מ"ג של D-מניטול, 50 μL של 0.5 M HEPES, ו 10 μL של 0.5 M EGTA ב 4 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2 ו- QS עם H2O.
- כדי להכין 2x פתרון אסאיט מיטוכונדריאלי-1 (MAS-1), להמיס 1.199 גרם סוכרוז, 2.8 גרם מניטול, 1 מ"ל של 0.5 M KH2PO4, 250 μL של 1 M MgCl2, 200 μL של 0.5 M HEPES, ו 100 μL של 0.5 M EGTA ב 20 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2 ו QS ל 25 מ"ל עם H2O. שמור בקרח לתקופות קצרות. לתקופות ארוכות יותר, לשמור אותו ב 4 °C (65 °F) כדי למנוע משקעים.
- כדי להכין 1x צימוד Asay בינוני (CAM), להכין שני מאגרים שונים מבוססי MAS-1: 1) CAM + BSA עבור CA לבדוק כראוי, ו 2) CAM-BSA להכנת מעכבי הבדיקה. תמיד לשמור על יחס פירובט:מלאטה ב 10:1.
הערה: כמו BSA יכול לסתום את יציאות ההזרקה, לדלל את המעכבים ב- מצלמת ללא BSA.- כדי להכין CAM + BSA, לדלל 300 μL של 0.5 M חומצה פירובית, 30 μL של 0.5 M חומצה מאלית, ו 7.5 מ"ל של 2x MAS-1 ב 6 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2. הוסף 300 μL של 10% FFA BSA ו- QS ל 15 מ"ל עם H2O.
- כדי להכין CAM-BSA, לדלל 120 μL של 0.5 M חומצה פירובית, 12 μL של 0.5 M חומצה מאלית, ו 3 מ"ל של 2x MAS-1 ב 2 מ"ל של H2O. כוונן את ה- pH ל- 7.2 ו- QS ל- 6 מ"ל עם H2O.
- כדי להכין 1x אלקטרון זרימת אסאיט מדיום (EFAM), הכן הן מאגרי EFAM המכילים BSA והן מאגרי EFAM ללא BSA.
- כדי להכין EFAM + BSA, לדלל 300 μL של 0.5 M חומצה פירובית, 60 μL של 0.5 M חומצה מאלית, 3 μL של 20 mM FCCP, ו 7.5 מ"ל של 2x MAS-1 ב 6 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2. הוסף 300 μL של 10% FFA BSA ו- QS ל 15 מ"ל עם H2O.
- כדי להכין EFAM-BSA, לדלל 120 μL של 0.5 M חומצה פירובית, 24 μL של 0.5 M חומצה מאלית, 1.2 μL של 20 mM FCCP, ו 3 מ"ל של 2x MAS-1 ב 2 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2 ו QS ל 6 מ"ל עם H2O.
- כדי להכין 1x β-חמצון בינוני (BOXM), להכין פתרונות BOXM המכילים BSA וללא BSA.
- להכנת BOXM + BSA, לדלל 12 μL של 50 mM פלמיטויל-L-קרניטין, 30 μL של 0.5 M חומצה מאלית, ו 7.5 מ"ל של 2x MAS-1 ב 7 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2. הוסף 300 μL של 10% FFA BSA ו- QS ל 15 מ"ל עם H2O.
- כדי להכין BOXM-BSA, לדלל 4.8 μL של 50 mM palmitoyl-L-קרניטין, 12 μL של 0.5 M חומצה מאלית, ו 3 מ"ל של 2x MAS-1 ב 2 מ"ל של H2O. כוונן את ה- pH ל-7.2 ו- QS ל- 6 מ"ל עם H2O.
2. ניתוח שרירים, הומוגניזציה ובידוד מיטוכונדריאלי
- מניחים את כל החומרים והמאגרים על הקרח. ודא שכל החומרים קרים כקרח במהלך כל ההליך כדי להגן על המיטוכונדריה מפני נזק.
- מניחים שלוש כוסות 50 מ"ל לכל מדגם על קרח, ולהוסיף את הפתרונות הבאים: 10 מ"ל של PBS בכוס 1, 10 מ"ל של 10 מ"ל EDTA / PBS בכוס 2, ו 4 מ"ל של IB1 בכוס 3.
- המתת חסד לעכבר על ידי פריקת צוואר הרחם. הימנע המתת חסד CO2 כמו שרירי השלד יכול להיות היפוקסי, מפריע ניתוחי נשימה.
- יש לרסס את החלק האחורי הימני ב-70% אתנול כדי למנוע מהפרווה להשיל, והדביקו את הגפה ללוח הניתוחים של הפקק. תדביק גם את השמאל הקדמי.
- בצע חתך עם אזמל חד פעמי סטרילי דרך העור מכף רגל ועד ראש.
- לאחוז את העור עם מלקחיים שיניים בגובה הקרסול לחתוך אותו עם מספריים עדינים סביב הקרסול.
- הקל את העור הרחק מהשרירים שמתחתיו עם פינצטה עדינה ביד אחת תוך משיכתו למעלה עם מלקחיים בעלי שיניים ביד השנייה.
- ניתח את כל שרירי השלד מהקרסול ועד הברך (איור 2).
- הסר את כל רקמת החיבור מעל השריר הקדמי tibialis (TA) כדי להקל על מיצוי שרירים באמצעות פינצטה עדינה ומספריים.
- מצא את ארבעת הגידים הדיסטליים של שריר ה- EDL וחתך אותם קרוב להכנסות שלהם בבהונות. אתר את גיד ת"א דיסטלי וחתוך אותו קרוב להכנסתו, תמיד מתחת לקרסול.
- בזהירות למשוך את גידי ת"א ו- EDL מעל הקרסול כדי לשחרר את הקצוות הפתוחים.
- לאחוז את הקצוות הרופפים של הגידים ולהקל על השרירים הרחק משאר השרירים והעצמות על ידי משיכתם למעלה. השתמש פינצטה עדינה או מספריים כדי להקל על התהליך. המשך בזהירות כדי למנוע התכווצות מיופייבר.
- חותכים את הגיד הפרוקסימלי של EDL ושריר ת"א קרוב ככל האפשר לפיקת הברך.
- הפוך את העכבר כדי להמשיך עם גסטרוקנימוס (GA) ומיצוי שריר סולוס.
- לאחוז בכיס שנוצר בין שרירי הזרוע ואת GA עם מלקחיים שיניים. השתמש במספריים עדינות כדי להפריד את השרירים האלה ולדמיין את גיד GA הפרוקסימלי.
- אוחזים בגיד אכילס במלקחיים עדינים וחותכים אותו בזהירות במספריים עדינות. שחררו את שרירי ה-GA והסוליה מהעצם הבסיסית על ידי משיכתם דרך הגידים שלהם. חותכים את גיד GA הפרוקסימלי משחרר אותו יחד עם הסוליה הבסיסית.
- בזהירות לנתח את השרירים הנותרים מן הגיד לגיד לאחר אותו הליך עד רק עצמות להישאר.
- הצמד מחדש את העכבר במצב ההתחלתי כדי לנתח את שריר הארבע ראשי.
- להשליך את רקמת השומן מעל quadriceps בצד הפרוקסימלי באמצעות מלקחיים שיניים ומספריים עדינים.
- הכנס פינצטה עדינה בין הארבע ראשי לעצם הירך והזז אותם בשני הכיוונים לאורך ציר עצם הירך כדי להפריד את השריר מהעצם.
- אוחזים בגידי השרירים הדיסטליים עם מלקחיים בעלי שיניים וחותכים את הגיד במספריים עדינות קרוב ככל האפשר לפיקת הברך.
- משכו את שריר הארבע ראשי למעלה ושחררו אותו בהכנסה הפרוקסימלית עם מספריים עדינות.
- חזור על שלבים 4-8 ממקטע זה עם האחורי השמאלי.
- יש לשטוף תחילה את כל השרירים בכוס 1 ולאחר מכן בכוס 2.
- מעבירים את כל השרירים לכוס 3 וטחונים דק את כל השרירים עם מספריים חדים על הקרח.
- מעבירים את ההשעיה לצינור C (מכסה סגול), תמיד שומרים אותו בקרח.
- סגור בחוזקה את צינור C ולחבר אותו הפוך על השרוול של homogenizer. ודא כי החומר לדוגמה נמצא באזור של המסובב / סטטור. בחר את התוכנית של דקה אחת הנקראת m_mito_tissue_01.
- מחלקים את ההומוגנט לשני צינורות מיקרו-צנטריפוגות 2 מ"ל וצנטריפוגה ב-700 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה שולחנית.
- העבר את supernatants לצינורות חדשים 2 מ"ל prechilled, בזהירות הימנעות שומן ורקמות לא הומוגניות. אחסן את הכדורים בטמפרטורה של מינוס 80 °C לקביעת טוהר פיצול (שבר N) (איור 3).
- צנטריפוגה supernatants ב 10,500 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F).
- העבר את supernatants לצינורות חדשים 2 מ"ל prechilled ולתייג אותם כמו Supernatant מספר 1 (SN1). אחסנו אותם בטמפרטורה של מינוס 80 °C לקביעת טוהר הפיצול (איור 3).
- Resuspend ולשלב את שני הכדורים בנפח כולל של 500 μL של IB2 בקרח.
- צנטריפוגה ב 10,500 × גרם במשך 10 דקות ב 4°C.
- מעבירים את הסופר-נרטיב לצינור חדש עם 2 מ"ל מראש ומתייגים אותו כמספר 2 סופר-נרטיבי (SN2). אחסן אותו בטמפרטורה של 80 °C (80 °C) לקביעת טוהר הפיצול (איור 3).
- Resuspend גלולה המיטוכונדריאלית הסופית ב 200 μL של RB. הקצו במהירות 10 μL לכימות חלבונים והוסיפו מיד 10 μL של 10% FFA BSA למתלה המיטוכונדריאלי הנותר כדי למנוע נזק.
- קבע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת ברדפורד.
- עבור העקומה הסטנדרטית, להכין 30 μL של דילול סדרתי של ריכוז ידוע של חלבון במאגר RB. לדוגמה, יש להשתמש ב-1 מ"ג/מ"ל, 0.5 מ"ג/מ"ל, 0.25 מ"ג/מ"ל, 0.125 מ"ג/מ"ל, 0.0625 מ"ג/מ"ל ו-0 מ"ג/מ"ל של BSA.
- הכן 1:3 ו 1:6 דילולים סדרתיים של דגימות המיטוכונדריה במאגר RB.
- בצלחת שטוחה-תחתון 96 היטב, טען תחילה 2.5 μL של מדגם / סטנדרטי לבאר. הבא, להוסיף 10 μL של 1 M NaOH לכל מדגם, ולבסוף, 200 μL של 1x ברדפורד ריאגנט. מערבבים היטב, הימנעות בועות אוויר. בדוק חזותית שצבע הדגימות נמצא בתוך קו הכיול. תמיד לבצע את הניתוח בשלושה עותקים.
- לדגור על הצלחות במשך 5 דקות ב RT בחושך, ולקרוא את הספיגה ב 595 ננומטר בספקטרופוטומטר microplate.
- חשב את העקומה הסטנדרטית על-ידי התוויית ערכי הספיגה (ציר y) לעומת ריכוז החלבון המתאים של הדילולים שהוכנו בשלב 22.1 בסעיף זה (ציר x).
- חשב את הכמות הכוללת של חלבון בדגימות המיטוכונדריה על ידי אקסטרפולציה עם העקומה הסטנדרטית.
3. הכנת בדיקות ספירומטריות מבוססות מיקרופלט
- העניק לחות לחיישן הבדיקה השופעת לפחות 12 שעות לפני הניסוי עם 1 מ"ל של חיץ כיול לבאר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (ללא CO2).
הערה: ניתן להשתמש בחיישנים עם לחות למשך עד 72 שעות. יש לטפל במחסנית בזהירות במהלך שלב זה: אם משהו נוגע בחיישנים, רגישות המדידה עלולה להיות מושפעת. - Prechill צנטריפוגה הכנה עם רוטור מיקרופלט דלי מתנדנד ומתאמי microplate המתאים ב 4 °C (60 °F).
- הפעל את המחשב, פתח את תוכנת הניתוח ובחר את הפרוטוקול הרצוי.
הערה: קליק נשמע כאשר התוכנה מתחברת למכשיר מדידת צריכת החמצן. חיישן החימום צריך להיות ירוק ב 37 °C (50 °F) לפני תחילת הניסוי. - הכן את פתרונות המעכבים מהמניות המצוינות בסעיף 1, שלב 2 על פי הבדיקה שתבוצע. הכן מספיק אמצעי אחסון עבור כל פתרון. עיין בטבלה 1 ובטבלה 2 לעיון.
- הוסף את הנפח המתאים של כל מעכב בכל יציאה, הכנס את המחסנית למכשיר מדידת צריכת החמצן והתחל בכיול.
הערה: הוספת מעכב למחסנית והכנסת המחסנית למכשיר אורכת 15-20 דקות. ודא שרכיבי המחסנית הנכונים מוצגים. ניתן להשליך את מכסה המחסנית ואת המאיץ ההידרו בזמן שיש צורך במחסנית חיישן ומקום השירות. - צנטריפוגה ההשעיה המיטוכונדריאלית המרוכזת של סעיף 2, שלב 21 ב 10,500 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F).
- Resuspend גלולה מיטוכונדריאלי ב 100 μL של 1x CAM + BSA, 1x EFAM + BSA, או 1x BOXM + BSA, בהתאם לפרוטוקול להתבצע.
- לדלל עוד יותר את המדגם המיטוכונדריאלי מרוכז לריכוז סופי 0.2 מיקרוגרם / μL במדיום הבדיקה המקביל.
- זרע 50 μL של ההשעיה (סה"כ 10 מיקרוגרם של חלבון) לבאר במיקרוגל 24-welled מראש על קרח. אין להוסיף מיטוכונדריה בבארות תיקון הרקע; הוסף רק את מדיום הבדיקה המתאים. אחסן את ההשעיה המיטוכונדריאלית הנותרת בטמפרטורה של מינוס 80 °C לקביעת טוהר הפיצול (איור 3).
- לסובב את המיקרופלט בצנטריפוגה הכנה prechilled ב 2,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 °C (4 °F). משקל נגד לאיזון בהתאם.
- מחממים את המדיום הנותר ב 37 °C (50 °F) במהלך צנטריפוגה microplate.
- לאחר צנטריפוגה, להשאיר את המיקרופלט על הספסל במשך 5 דקות כדי שיווי משקל. הוסף 450 μL של מדיום בדיקה חמה עבור נפח סופי של 500 μL לבאר ב RT. לעשות את זה לאט ובזהירות, הוספת המדיום לקיר הבארות, כדי למנוע ניתוק המיטוכונדריה.
- מניחים את המיקרופלט מיד במכשיר מדידת צריכת החמצן ללא המכסה, ומתחילים את הפרוטוקול (טבלה 3). ודא כי הצעד הראשון הוא דגירה של 10 דקות כדי לאפשר למיקרופלט להתחמם.
- לאחר סיום הניסוי, הסר את המחסנית ואת המיקרו-לוחית, כבה את המכשיר והתחל את הניתוח.
4. ניתוח התוצאות
- במקרה של בדיקות CA ו- BOX, בצע את הניתוחים הבאים:
- שיא צריכת O2 nonmitochondrial, אשר תואם את הממוצע של הערכים שהושגו לאחר אנטימיצין A והזרקת רוטנון.
הערה: אנטימיצין A ורוטנון הם מעכבי III ו- I מורכבים, בהתאמה. - חשב נשימה בסיסית על-ידי חיסור צריכת O2 לא מיטוכונדריאלית מערכי בסיס (נקודות מדידה 1 ו- 2).
- הפחת צריכת O2 לא מיטוכונדריאלית מהערכים לאחר הזרקת מצע V המורכב ADP (הזרקה A) כדי לקבוע מצב מיטוכונדריאלי III.
- להפחית צריכת O2 nonmitochondrial מן ערכי הנשימה לאחר הזרקה של מוליגומיצין מעכב V מורכב (הזרקה B) כדי לקבל מצב מיטוכונדריאלי IVo.
- חשב מצב מיטוכונדריאלי IIIu על ידי ניכוי צריכת O2 לא מיטוכונדריאלית מהזרקת FCCP לאחר נשימה (הזרקה C).
הערה: FCCP הוא זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי רב עוצמה uncoupylation. סינתזת ATP נעקפת בנוכחותה, ו- ETC משיגה פעילות מקסימלית. - להפחית ערכי נשימה בסיסית מן המדינה המיטוכונדריאלית IIIu ערכים כדי להשיג קיבולת חילוף מיטוכונדריאלי, המהווה את היכולת לייצר ATP נוסף במקרה של ביקוש אנרגיה מוגברת.
- חלוקת מצב מיטוכונדריאלי IIIu לפי ערכי IVo של המדינה כדי לקבל את יחס בקרת הנשימה (RCR).
הערה: ערכי RCR שליליים או ריקים מציינים כי צימוד מיטוכונדריאלי מושפע.
- שיא צריכת O2 nonmitochondrial, אשר תואם את הממוצע של הערכים שהושגו לאחר אנטימיצין A והזרקת רוטנון.
- בהתייחס ל- EFA, בצע את החישובים הבאים:
- להשיג פעילות שיורית על ידי חישוב הערך הממוצע לאחר רוטנון ו אנטימיצין A הזרקה (זריקות A ו- C).
- חשב פעילות מורכבת I ל- IV (CI-CIV) על-ידי חיסור פעילות שיורית מערכי הבסיס (נקודות מדידה 1 ו- 2).
- לחסר את הפעילות השיורית מן הערכים לאחר הזרקה של תמצית מצע CII (הזרקה B) כדי להשיג פעילות CII-CIII-CIV.
- חשב פעילות אזרחית על ידי ניכוי הפעילות השיורית מהערכים שהושגו לאחר הזרקת הסוכנים להפחתת ציטוכרום c, חומצה אסקורבית ו- TMPD (הזרקה D).
- ייצגו את כל התוצאות באמצעות התוויות עמודות, כמו באיור 4, כדי לחלץ מסקנות מתאימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר ניתוח in vivo של נשימה מיטוכונדריאלית באמצעות בידוד של המיטוכונדריה משריר שלד העכבר. חלוקה לרמות של השיטה מוצגת באיור 1. לאחר ניתוח שרירי השלד מההינדלימבים (איור 2), הרקמות הומוגניות והמיטוכונדריה מטוהרת, בתנאים איזוטוניים, באמצעות צנטריפוגות סדרתיות. את טוהר השברים השונים המתקבלים במהלך תהליך הבידוד ניתן לנתח על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדנים נגד סמני אברונים שונים. איור 3A מציג את פרופיל החלבון הכללי מהשברים השונים המציגים אוכלוסיות חלבונים שונות בשברים המבודדים.
איור 3B מראה כי כל התוכן המיטוכונדריאלי נמצא בשבר המיטוכונדריאלי, כפי שמעידים האותות החזקים עבור סמנים של הקרומים החיצוניים (VDAC ו- TOMM20) והפנימיים (TIMM23) המיטוכונדריאליים, ואפילו עבור חלבונים הקשורים לנוקלואיד (mtTFA). כל הגרעינים והציטוסקלטון (β-אקטין) נמצאים בשבר N, המייצג גרעינים וחומרים לא מרוסנים (איור 3C). יתר על כן, רוב הרשתות האנדופלזמיות (ER) (Calnexin), קרום הפלזמה (Na+/K+-ATPaseα1), או סמני הציטופלסמה (LDHA, HSP70 או AKT) נשארים בשברירי SN1 או SN2, המדגישים את הטוהר הגבוה המתקבל במהלך הבידוד (איור 3C). עם זאת, ישנם כמה עקבות של זיהום ER בשבר המיטוכונדריאלי, אולי בשל הקרבה של אברונים אלה. בהתחשב בתוצאות שהושגו בבדיקות הנשימה הבאות, הליך הבידוד המתואר כאן מניב הכנות מיטוכונדריאליות טהורות מאוד, קיימא.
בדיקות CA ו- BOX מאפשרות חישוב של מצבים מיטוכונדריאליים שונים בנוכחות מספר מצעים הממריצים מסלולים מטבוליים ספציפיים. באופן ספציפי, בדיקות אלה מבוצעות בנוכחות חומצה פירובית או פלמיטויל-L-קרניטין כלוריד. חומצה פירובית היא מצע של מחזור קרבס; חומצה מאלית היא מתווך מחזור קרבס ומשרן NADH, בעוד פלמיטויל-L-קרניטין הוא מצע של חומצת השומן β-חמצון מסלול. (איור 4א,ב). בשתי הבדיקות, המצב הראשון שניתן למדוד הוא שיעור הנשימה הבסיסית, המייצג נשימה מיטוכונדריאלית בנוכחות המצעים שנוספו בתחילה למדיום הבדיקה. לאחר מכן, מצב מיטוכונדריאלי III מושגת, המייצגת ייצור ATP מ- ADP ופוספט אנאורגני, המציג את הנשימה המקסימלית במצב מצמיד. כך, יש עלייה בצריכת החמצן לאחר תוספת ADP, כפי שנצפה באיור 4A,B.
יתר על כן, המדינה IVo מציין את דליפת פרוטון הקשורים לעיכוב של סינתאז ATP על ידי oligomycin, מה שמוביל לירידה בנשימה, כפי שנצפה בגרפים CA ו- BOX (איור 4A,B). התוספת של FCCP מובילה ל- State IIIu, אשר מראה את יכולת הנשימה המקסימלית כי המיטוכונדריה יכולה להציג במצב לא מנותק כאשר צריכת החמצן מגיעה לרמה הגבוהה ביותר שלה בבדיקות אלה. כדי לחשב את כל המצבים האלה, זה בסיסי הראשון כדי לקבוע נשימה לא מיטוכונדריאלית, אשר מתקבל בסוף הבדיקה כאשר אנטימיצין A ורוטנון מוזרקים לעכב נשימה חמצונית. כפי שניתן לראות באיור 4A,B, ערכים אלה צריכים להיות תמיד מתחת לנשימה הבסיסית וקרובים מאוד לאפס במקרה של בדיקות עם מיטוכונדריה מבודדת כמו הבדיקות המתוארות כאן. לבסוף, יש לחשב את הפרמטר RCR כדי להעריך שלמות מיטוכונדריאלית. זה משקף אם המיטוכונדריה יכולה להגיב ל- ADP על ידי הפקת ATP בשיעור גבוה עם דליפת פרוטונים נמוכה. ערכי RCR הממוצעים שנמצאו בבדיקות CA ו- BOX היו 5.78 ± 1.03 ו- 3.47 ± 0.42 (איור 4A,B), בהתאמה, אשר בהסכמה עם RCRs אופטימלי שדווחו בעבר 21,22,22,23,24.
בנוסף, ה-EFA בוחן את פעילות מתחמי ETC בנפרד או בשילוב באמצעות הזרקת מצעים ומעכבים ספציפיים (איור 4C). פעילות CI-CIV מייצגת נשימה מיטוכונדריאלית המבוססת על מצעים פירובט ומאלט כאשר אין קומפלקסים מעוכבים; במקרה זה, רוב האלקטרונים עוברים CI. מכיוון שרוטנון הוא מעכב ספציפי של CI, CI נחסם לאחר הוספתו, וכתוצאה מכך צריכת חמצן ירדה (איור 4C). פעילות CII-CIII-CIV מראה נשימה כאשר רק CI נחסם, ו- CII מופעל: תמציתי, מוזרק דרך יציאה B, הוא מצע ספציפי של מורכב II (תמציתי דהידרוגנאז). לפיכך, CII מצטמצם, יוזם את זרימת האלקטרונים מ- CII ל- CIV, בעוד CI עדיין מעוכב על ידי הזרקת הרוטנון הקודמת, המייצרת עלייה בצריכת החמצן (איור 4C). אנטימיצין תוספת מעכבת CIII, חוסמת את זרימת האלקטרונים דרך ETC ומפחיתה את צריכת החמצן. כמו כן, פעילות אזרחית נקבעת כאשר הוא מגורה על ידי חמצון ציטוכרום C לאחר שהופחת על ידי תוספת של חומצה אסקורבית / TMPD; איור 4C מראה כי הפעלת CIV מייצרת עלייה בצריכת החמצן. לבסוף, פעילות שיורית מתייחסת לצריכת חמצן כאשר שרשרת הזרחן החמצוני מושבתת לאחר רוטנון ואנטימיצין תוספת. ערך זה קובע את הרקע לחישוב פעילות הקומפלקסים כפי שצוין בשלבי הפרוטוקול 2.2-2.4 בסעיף 4.
איור 1: הדמיה סכמטית של השיטה. קיצורים: זיהוי תווים אופטי ( OCR ) = שיעור צריכת חמצן; ADP = אדנוזין דיפוספט; OL = אוליגומיצין; FCCP = קרבוניל ציאניד-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone; Anta = אנטימיצין A; רוט = רוטנון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח ובידוד של שרירי שלד מורין מהידיים האחוריים לניתוחי נשימה מיטוכונדריאליים. (א) האחורי הימני נמתח ומנותק בנייר דבק. (ב) חתך נעשה דרך העור ליד הקרסול, עצירה קרוב לברך. רקמת חיבור מעל ת"א הוסרה בקפידה. גידים של EDL (C) ות"א (D) נחתכו קרוב להוספות שלהם. גיד ת"א נמשך למעלה כדי להקל על השריר הרחק מהשרירים והעצמות שמתחת. לאחר מכן, ת"א נחתך בסמיכות, קרוב לפסגת הגחון לשוקה. באופן דומה, שריר ה- EDL הוקל, והגיד הפרוקסימלי נחתך בקפדנות בצד הברך. (ו) ממש מאחור לאחר ניתוח ת"א ו-EDL. (ז) באחוריים האחוריים, גיד אכילס נחתך כדי לנתח את שרירי GA וסולאוס. (ח) GA וסולוס שוחררו בזהירות מעצם טיביאל. (I) השרירים הנותרים נאספו מהקרסול עד הברך עד שרק השוקית ועצמות טיביאל נותרו. (J) הינדלמב לאחר ניתוח. (K) Quadriceps נותח. (L) כל שרירי השלד שנאספו לבידוד מיטוכונדריאלי אחורי. התהליך בוצע עבור שני האחוריים. קיצורים: TA = tibialis חזיתי; EDL = extensor digitorum longus; GA = גסטרוקנמיוס. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: טוהר תהליך הפיצול. (A) פרופיל חלבון כללי מוכתם בכחול קומסי. (B) פרופיל טוהר חלבון מיטוכונדריאלי. (ג) סמנים לא מיטוכונדריאליים. השברים השונים שהושגו במהלך בידוד המיטוכונדריה היו טעונים ודגרו בנוגדנים נגד חלבונים שונים בשברים תת-תאיים ספציפיים. קיצורים: שבר N = רקמות וגרעינים לא הומוגניים; SN1 = מספר סופר-טבעי 1: ציטופלסמה + אברונים; SN2 = מספר סופר טבעי 2: ציטופלסמה + אברונים; VDAC = ערוץ אניון תלוי מתח; TOMM20 = טרנסלוקאז של קרום מיטוכונדריאלי חיצוני 20; mtTFA = גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A; TIMM23 = טרנסלוקאז של קרום המיטוכונדריה הפנימית 23; LDHA = לקטט דהידרוגנאז A; HSP70 = חלבון הלם חום 70; ER = רשתית אנדופלסמית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות מייצגות. פרופיל ביו-אנרגטי של המיטוכונדריה מבודד משרירים אחוריים של עכבר C57BL/6N מסוג זכר בן 13 חודשים. נקודות ההזרקה של המצעים והמעכבים השונים מסומנים בכל בדיקה. ניתן לנתח את הביצועים של מכונות ETC ו- OXPHOS באמצעות פירובט ומלאטה, או פלמיטויל-L-קרניטין ומלאטה כמצעים בבדיקת צימוד (A) או β-חמצון של בדיקות FA (B), בהתאמה. (ג) בדיקת זרימת האלקטרונים מאפשרת לחקור קומפלקסים מיטוכונדריאליים בודדים בנוכחות פירובט, מלאטה ו- FCCP; 10 מיקרוגרם של המיטוכונדריה היו מצופים לבאר. התוצאות מוצגות לאחר אפשרות הייצוג של נקודת הביניים כדי להציג באופן חזותי תוצאות בטופס צבור. זאת בניגוד לאפשרות מנקודה לנקודה, שתאפשר הדמיה של 9 המדידות הרצופות המבוצעות בדרך כלל במהלך כל שלב מדידה. ניתן לשנות את סוג הפריט החזותי לאחר השלמת הבדיקה תחת אפשרויות תרשים הקו הקינטי בתוכנת הניתוח. קיצורים: FA = חומצות שומן; OCR = שיעור צריכת חמצן; ADP = אדנוזין דיפוספט; FCCP = קרבוניל ציאניד-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone; RCR = יחס שליטה בדרכי הנשימה; EFA = בדיקת זרימת אלקטרונים; BOX = β-חמצון של FA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| בדיקת צימוד | ||||||
| נמל | מעכב | [מלאי] | [יציאת הזרקה] | [סופי] | מתכון | |
| Inhib | CAM-BSA | |||||
| A | ADP | 100 מ"ר | 50 מ"מ | 5 מ"מ | 650 μL | 650 μL |
| B | אוליגומיצין | 4 מ"מ | 31.6 מיקרומטר | 3.16 מיקרומטר | 11.3 μL | 1418.7 μL |
| C | FCCP | 20 מ"מ | 60 מיקרומטר | 6 מיקרומטר | 4.68 μL | 1555.32 μL |
| D | אנטימיצין A // רוטנון | 5 מ"ר // 4 מ"מ | 40 מיקרומטר // 50 מיקרומטר | 4 מיקרומטר // 5 מיקרומטר | 13.52 μL // 21.12 μL | 1655.36 μL |
| בדיקת זרימת אלקטרונים | ||||||
| נמל | מעכב | [מלאי] | [יציאת הזרקה] | [סופי] | מתכון | |
| Inhib | אפ"ם-בסה | |||||
| A | רוטנון | 4 מ"מ | 50 מיקרומטר | 5 מיקרומטר | 16.25 μL | 1283.7 μL |
| B | תמציתי | 500 מ"ר | 100 מ"ר | 10 מ"מ | 286 μL | 1144 μL |
| C | אנטימיצין A | 5 מטר | 4 מיקרומטר | 4 מיקרומטר | 12.48 μL | 1547.5 μL |
| D | אסקורבט // TMPD | 1 מטר // 50 מ"מ | 100 מ"מ // 1 מ"מ | 10 מ"מ // 100 מיקרומטר | 169 μL // 33.8 μL | 1487.2 μL |
| בדיקת β-חמצון | ||||||
| נמל | מעכב | [מלאי] | [יציאת הזרקה] | [סופי] | מתכון | |
| Inhib | BOX-BSA | |||||
| A | ADP | 100 מ"ר | 40 מ"מ | 4 מ"מ | 520 μL | 780 μL |
| B | אוליגומיצין | 4 מ"מ | 31.6 מיקרומטר | 3.16 מיקרומטר | 11.3 μL | 1418.7 μL |
| C | FCCP | 20 מ"מ | 60 מיקרומטר | 6 מיקרומטר | 4.68 μL | 1555.32 μL |
| D | אנטימיצין A // רוטנון | 5 מ"ר // 4 מ"מ | 40 מיקרומטר // 20 מיקרומטר | 4 מיקרומטר // 2 מיקרומטר | 13.52 μL // 8.45 μL | 1668 μL |
טבלה 1: הכנת פתרונות מעכבים לבדיקות השונות. העמודה [מניות] מציגה את הריכוזים של פתרונות המלאי של המתחם המצוין בעמודה מעכב . [יציאת הזרקה] מתייחס לריכוז פתרונות המעכבים שיש לטעון ביציאות השונות של המחסנית, בעוד שהעמודה [הסופית] מציינת את הריכוז הסופי של המעכבים בבארות. לבסוף, עמודות המתכון מציינות את הנפחים של פתרונות מעכבי מלאי ומדיה ללא BSA שיש לערבב כדי להכין את הפתרונות שיש לטעון ביציאות ההזרקה. קיצורים: ADP = אדנוזין דיפוספט; FCCP = קרבוניל ציאניד-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone; TMPD = N,N,N′,N′-טטרמתיל-פרה-פנילן-דיאמין; Inhib = מעכב; BSA = אלבומין סרום בקר; CAM-BSA = מדיום בדיקת צימוד ללא BSA; EFAM-BSA = בדיקת זרימת אלקטרונים ללא BSA; BOX-BSA = ללא BSA β-חמצון של חומצת שומן בדיקת בינוני.
| נמל | עוצמת קול מוזרקת | מלאי מוכן (26 בארות) |
| A | 50 μL | 1300 μL |
| B | 55 μL | 1430 μL |
| C | 60 μL | 1560 μL |
| D | 65 μL | 1690 μL |
טבלה 2: חישוב נפחי הזרקה.
| פעולה | זמן (דקות) | חזרה | נמל |
| כייל | 15-20 | ||
| המתין | 10 | ||
| ערבוב + המתנה | 1 + 3 | × 2 | |
| לערבב | 1 | ||
| מדידה + מיקס | 3 + 1 | × 2 | |
| להזריק | A | ||
| לערבב | 1 | ||
| מידה | 3 | ||
| לערבב | 1 | ||
| להזריק | B | ||
| לערבב | 1 | ||
| מידה | 3 | ||
| לערבב | 1 | ||
| להזריק | C | ||
| לערבב | 1 | ||
| מידה | 3 | ||
| לערבב | 1 | ||
| להזריק | D | ||
| מיקס + מדידה | 1 + 3 | × 2 |
טבלה 3: הגדרות פרוטוקול עבור הבדיקות השונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לכל השיטות המשמשות לחקר הנשימה המיטוכונדריאלית יש מגבלות; לפיכך, חשוב לבחור את השיטה המתאימה ביותר לשאלה ניסיונית ספציפית. עבודה זו מספקת פרוטוקול מעודכן ומפורט כדי לבודד את המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר כדי לבצע בדיקות נשימה שונות כדי לחקור את תפקוד המיטוכונדריה. ואכן, המחקר של ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית במיטוכונדריה מבודדת באמצעות טכנולוגיות מבוססות מיקרופלט הוא בעל ערך לחקר נשימה ספציפית לרקמות במונחים של רבייה, אמינות ומורכבות. יתר על כן, השימוש במיטוכונדריה מבודדת מעניק שליטה על זמינות המצע, ומאפשר את ההבנה של התהליכים הביולוגיים הבסיסיים. היבט חיובי נוסף של שימוש במיטוכונדריה מבודדת הוא שניתן ללמוד את מצב III מכיוון שה- ATP שנוצר לאחר הזרקת ADP אינו מומר שוב ל- ADP חדש מכיוון שרוב ה- ATPases של transmembrane הולכים לאיבוד. יתר על כן, בבדיקות המתוארות כאן, אוליגומיצין מתווסף לחסום סינתזת ATP לא ספציפית פוטנציאלית20.
יש להדגיש מספר שיקולים חשובים עבור פרוטוקול זה. ראשית, המיטוכונדריה המבודדת רגישה ביותר ויש לטפל בה בזהירות. התוכן הגבוה של סוכרוז ומניטול במאגרים המשמשים מבטיח את התנאים האוסמוטיים האופטימליים כדי להגן על המיטוכונדריה המבודדת מפני נזק. עם זאת, יש לשמור על משך הבדיקה לכל הפחות כדי לשמר את הכדאיות המיטוכונדריאלית ולמנוע ניתוק מהמיקרו-לוחית לאחר הזרע. לכן, בהתחשב בכך שצעדי פרוטוקול, כגון הכנת מדיה assay ופתרונות מצע ומעכבים, או טעינת המעכבים במחסנית הבדיקה respirometric, הם זמן רב, כל צעד צריך להיות מתואם בצורה מושלמת. יתר על כן, שלא כמו שיטות אחרות המבוססות על עיכול אנזימטי21,24 והומוגניזציה מרגמה ועלי17,19,21,23,24, השיטה המתוארת כאן מסתמכת על שימוש בהומוגניזציה אוטומטית, המאפשרת הומוגניזציה מדגם מהירה ויעילה. חשוב לציין, השעיות מיטוכונדריאליות הן פחות רגישות אם מרוכזות מאוד. לכן, רק להכין דילול מיד לפני השימוש בהם. לבסוף, זה חיוני לעבוד במהירות במהלך הבדיקה respirometric כראוי. בדרך כלל, כאשר מנתחים תאים בתרבית בבדיקות אלה, שלושה שלבי מדידה רצופים מבוצעים לאחר הזרקת מצעים או מעכבים, מה שמביא לפרוטוקולים המשתרעים בין 40 ל -50 דקות, כדי להבטיח את הכדאיות של המיטוכונדריה המבודדת לאורך כל ההליך, מספר שלבי המדידה נשמר לעתים קרובות למינימום בשל הפגיעות שלהם19, 23,25, הפחתת הזמן שלוקח להשלים את הניתוח respirometric ל ~ 20 דקות. הפרוטוקולים המתוארים בעבודה זו (טבלה 3) עוקבים אחר מגמה זו, למרות ששיטות אחרות שפורסמו בעבר מדווחות על פרופילי זיהוי תווים אופטי (OCR) יעילים עם שלבי מדידה ארוכים וסטנדרטיים יותר26.
לדוגמה, אם שתי בדיקות רצופות הולכות להיות מנוהלות עם אותה קבוצה של דגימות באותו יום, הכן את כל הריאגנטים לבדיקה השנייה במהלך הבדיקה הראשונה למעט הדילול המיטוכונדריאלי: רק לדלל, זרעים, ומיטוכונדריה ספין מיד לפני תחילת הבדיקה השנייה, בעוד המכשיר מכויל. לאחר השלמת הניסוי, יש לחשב את הפרמטר RCR (סעיף 4, שלב 1.7) כדי להעריך את איכות ההכנות המיטוכונדריאליות המשמשות. בדרך כלל, ערכי RCR בין 3.5 ל- 5 מציינים כי שלמות המיטוכונדריה היא אופטימלית ומציגה נשימה חמצונית מצמדת פונקציונלית25. בדיקות עם ערכי RCR נמוכים יותר חייבות להימחק מכיוון שהשלמות המיטוכונדריאלית נפגעה במהלך הבידוד. במקרים אלה, שקול לשטוף את הכדור המיטוכונדריאלי פעמיים (סעיף 2, שלבים 19-21)22, כפי שדווח בעבר.
שנית, שמירה על ה- pH הנכון לאורך כל ההליך היא קריטית להשגת תוצאות מוצלחות. ודא כי ה- pH של כל הפתרונות מוגדר כמצוין, כלומר, pH 7.2, וכי ה- pH מותאם תמיד עם KOH אלא אם צוין אחרת. ראוי לציין כי אין למדוד ישירות את ה- pH של מאגרים המכילים BSA עם מד ה- pH מכיוון ש- BSA יכול להזיק לגשוש. לכן, התאם את ה- pH במאגרים המתאימים לפני הוספת BSA. כדי להימנע משינויים ב- pH עקב תוספת BSA, השתמש תמיד ב- FFA BSA. יתר על כן, כמה אצוות H2O ultrapure יכול להיות חומצי, ולכן השימוש מטוהר מסחרית, pH 7 H2O מומלץ. יתר על כן, יש צורך להבטיח כי מד pH מכויל כראוי וכי הוא המודל המתאים למדוד את ה- pH של הכימיקלים להיות מוכנים.
שלישית, חשוב לבצע נכון את שלב איסוף המדגם למדידת חלבון של ההשעיה המיטוכונדריאלית הסופית (סעיף 2, שלב 21) כדי למנוע הרס מיטוכונדריאלי. resuspend את הכדור במהירות אבל ביסודיות, לאסוף aliquot, ולהוסיף FFA BSA להשעיה הנותרת כדי לשמר את האיזון האוסמוטי ולהגן על המיטוכונדריה מפני נזק. אם FFA BSA כבר היה נוכח במאגר resuspension, ולכן, במהלך כימות חלבון, התוכן חלבון גבוה היה מבלבל את תוצאות הכימות. זו הסיבה שיש להוסיף FFA BSA לאחר הגדרת aliquot בצד לכימות.
רביעית, שיטה זו היא רב-תכליתית ביותר וניתן להתאים אותה לצרכי הנסיין. לדוגמה, אם המודל החייתי תחת המחקר מאופיין במסת שריר מופחתת (למשל, עכברים סרקופיניים), שרירים נוספים יכולים להגדיל את התשואה המיטוכונדריאלית. למרות עכבר C57BL/6N זכר מסוג בר מבוגר שימש בעבודה זו, בעלי חיים מכל מין, גיל, או רקע גנטי, כמו גם סוגי שרירים ספציפיים, ניתן להעסיק במקום.
חמישית, ערכי הנשימה יכולים להיות שונים בין ניסויים עקב שינויים קלים בהרכב של חוצצים ריאגנטים, אשר צריך להיות מוכן טרי בכל פעם. גיל, מין, רקע גנטי או תנאים סביבתיים יכולים גם להשפיע עמוקות על התוצאות. עם זאת, ניסוי מוצלח צריך להציג עלייה בצריכת החמצן לאחר הזרקת מצעים מורכבים כגון ADP ו succinate, פוחתת לאחר הזרקת מעכבים כגון oligomycin או rotenone, ועליות ניכרות כאשר FCCP uncoupler החזק מתווסף. יתר על כן, כדי למנוע שונות טכנית גבוהה, להבטיח resuspension יסודי של כדורי מיטוכונדריה כדי להשיג השעיות הומוגניות לפני זריעת אותם במיקרופלט.
שישית, אם ערכי הנשימה הבסיסיים נמוכים, שקול לבצע ניסוי טיטרציה כדי להתאים את כמות החלבון לזריעה. לבסוף, כי עבודה זו מספקת שיטה להשיג תמציות מיטוכונדריאלי גולמי, כיתה מסוימת של טומאה הקשורים אברונים אחרים, בעיקר ER, צפוי. תהליך פיצול אגרסיבי יותר כדי להסיר זיהומים אלה יהיה מזיק הכדאיות המיטוכונדריאלית, לעכב את הביצועים של בדיקות נשימה. אם טוהר הוא דאגה, במיוחד אם הוא אינו עקבי בין דגימות, ניתן לנרמל את תוצאות הבדיקה ביחס לטוהר המיטוכונדריאלי לאחר הפעלת כתמים מערביים נגד סמני אברונים שונים (איור 3). למיטב ידיעתנו, זוהי השיטה הראשונה המדגישה חששות לגבי טוהר מיטוכונדריאלי בתמציות גולמיות. בדרך כלל, בפרוטוקולים אחרים לבדיקות ספירומטריות עם מיטוכונדריה מבודדת, אותה כמות של תמצית חלבון נזרעת בבארות כדי להשוות דגימות, בהנחה כי אותה כמות של מיטוכונדריה משמשת בכל המקרים. זוהי הנחה סבירה בהתחשב בכך שהבידוד מתבצע במקביל בכל הדגימות. עם זאת, הרקע הגנטי או הסביבתי של הדגימות תחת המחקר עלול להוביל הבדלים ניכרים בטוהר של תמציות המיטוכונדריה. לדוגמה, אם מוטציה גנטית נתונה גורמת להתפתחות מוגברת של ER ציטופלסמי, תמציות מיטוכונדריאלי גולמיות מבעלי חיים אלה יכולות להכיל תוכן ER גדול מהצפוי, וכתוצאה מכך, נמוך מהצפוי חלבון מיטוכונדריאלי. לכן, גם אם אותה כמות של חלבון כולל משליטה ודגימות מוטציות נזרעות במיקרו-לוחית, צריכת החמצן של המוטנטים תיחשב לחסר. לפיכך, מומלץ לקבוע את טוהר התמציות של כל התנאים הנחקרים. אם הערכים דומים, אין צורך בנורמליזציה. עם זאת, אם ערכי הטוהרה בין הדגימות שונים במידה ניכרת מעבר לטעות הסטטיסטית שהנסיין מוכן לקבל, יש להשתמש בהם כדי לנרמל את תוצאות צריכת החמצן.
לפרוטוקול הנוכחי יש כמה מגבלות. שימו לב, שיטה זו עברה אופטימיזציה לרקמת שריר השלד המבודדת מעכברים. ייתכן שיהיה צורך לבצע התאמות אם משתמשים ברקמות שונות או בשריר השלד ממינים שונים. בנוסף, כאשר ניתוחים מבוצעים על מיטוכונדריה מבודדת, המיקרו-סביבה התאית הרגילה הולכת לאיבוד בשל היעדר הקשר תאי ושאר האברונים שיכולים לקיים אינטראקציה עם המיטוכונדריה. זה יכול להוביל לתוצאות כי מעט לסטות ממצבים פיזיולוגיים. לבסוף, כמו המיטוכונדריה הם צנטריפוגה, הם דבקים בתחתית הבארות. בעוד הכרחי לחלוטין, ההשפעות הפוטנציאליות של צנטריפוגה על מצבם הרגיל אינם ידועים.
חשוב לקחת בחשבון כי לאחר ביצוע ניתוחי הבדיקה הספירומטרית, ירידה בצריכת החמצן הקשורה לנשימה הקשורה ל- ATP או FCCP מגורה במיטוכונדריה מבודדת יכולה להצביע על שינויים מיטוכונדריאליים פוטנציאליים שניתן להסביר על ידי 20: 1) הובלה מוגבלת של מצעים על פני הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית, 2) פעילות מופחתת של האנזימים המעורבים בתגובות מגבילות קצב של מסלולים מטבוליים ספציפיים כגון ETC, מחזור קרבס, או β-חמצון, או 3) תפקוד ETC לקוי, בין הסברים אפשריים אחרים.
לסיכום, השיטה המעודכנת המתוארת כאן מייצגת דרך נאותה ואמינה להעריך ETC ותפקוד OXPHOS מרקמת שריר השלד. יש לו יישומים מרובים כדי להעריך כיצד שינויים גנטיים או הסביבה יכול להשפיע על נשימה מיטוכונדריאלית התורמת פנוטיפ מסוים. למרבה הפלא, הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מותאם אורגניזמים מודל אחרים או לשמש עם דגימות אנושיות כדי להעריך תפקודים מיטוכונדריאליים פוטנציאליים הקשורים למחלות אנושיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות לחואן ג'יי טנה על השימוש בהומוגניזר ובמתקני הפרוטאומיקה של CABD וגידול בעלי חיים על תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך, התרבות והספורט הספרדי באמצעות מלגה FPU16/03264 ל- J.D.H.C., האגודה Française contre les Myopathies (AFM) באמצעות מענק מלגה #22450 ל- C.V.-G., מענק מוסדי MDM-2016-0687 (יחידת המצוינות מריה דה מאזטו, המחלקה לרגולציה גנטית ומורפוגנזה ב- CABD) ו- BFU2017-83150-P ל- J.J.C. מענק החונטה דה אנדלוסיה P18-RT-4572, תוכנית המימון של FEDER מהאיחוד האירופי, ומשרד המדע, החדשנות והאוניברסיטאות הספרדי מעניקים RED2018-102576-T ל- P.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
- Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
- Gorman, G. S., et al.
- Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
- Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
- Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
- Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
- Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
- Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
- Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
- Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).
