从小鼠骨骼肌中分离线粒体用于呼吸测定
Summary
在这里，我们描述了从小鼠骨骼肌中分离线粒体的详细方法，以及随后使用基于微孔板的呼吸测定通过耗氧率（OCR）分析呼吸。该管道可用于研究多种环境或遗传干预措施对线粒体代谢的影响。
Abstract
细胞的大部分能量是通过葡萄糖，脂肪酸和氨基酸的降解获得的，这些途径通过收敛于线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）系统的不同途径获得，该系统响应细胞需求而调节。脂质分子辅酶Q（CoQ）通过恒定的氧化/还原循环将电子转移到电子传递链（ETC）中的复合物III，在此过程中是必不可少的。线粒体状态以及最终的细胞健康可以通过使用呼吸测定法测量ETC耗氧量来评估。这些研究通常在已培养数天的已建立或原代细胞系中进行。在这两种情况下，获得的呼吸参数可能偏离了任何给定器官或组织中的正常生理条件。
此外，从骨骼肌分离的培养单纤维的内在特性阻碍了这种类型的分析。本文提出了一种更新和详细的方案，用于分析从小鼠骨骼肌中新鲜分离的线粒体中的呼吸。我们还为流程任何阶段可能出现的潜在问题提供解决方案。这里介绍的方法可用于比较不同转基因小鼠模型中的耗氧率，并研究线粒体对药物治疗或其他因素（如衰老或性别）的反应。这是一种可行的方法来回答有关线粒体生物能量代谢和调节的关键问题。
Introduction
线粒体是细胞中的主要代谢细胞器1。这些专门的膜封闭细胞器使用营养分子通过OXPHOS以三磷酸腺苷（ATP）的形式产生能量。该过程依赖于ETC2中一系列氧化还原反应中供体分子的电子转移。辅酶Q是唯一一种在所有细胞膜和循环脂蛋白中内源性产生的氧化还原活性脂质，具有抗氧化功能3。它是ETC的重要组成部分，将电子从NADH依赖性复合物I和FADH2依赖性复合物II转移到复合物III，尽管许多其他还原酶可以驱动线粒体CoQ还原为泛醇，作为多个细胞代谢途径中的强制性步骤4，5。
在整个过程中，在线粒体内膜上产生电化学质子梯度，由ATP合酶复合物V2转化为生物活性能量。因此，线粒体功能障碍导致无数的病理状况，主要影响具有高能量需求的组织 – 大脑，心脏和骨骼肌6，7。因此，开发准确分析线粒体生物能量学的方法以研究其在健康和疾病中的作用至关重要，特别是在骨骼肌等高能组织中。
克拉克型氧电极已被经典地用于线粒体呼吸的研究8。然而，该系统已逐渐被更高分辨率的技术所取代，基于微孔板的耗氧技术（如安捷伦海马 XF 分析仪）尤其受欢迎9。在骨骼肌领域，这些研究通常在培养细胞中进行，主要在C2C12永生化小鼠肌母细胞系或来自卫星细胞的原代培养物中进行10，11。然而，这些研究并不能完全概括 体内的情况，特别是在研究线粒体生物学和特定损伤，非遗传干预或遗传操作的组织水平功能时。
此外，由于其他因素，细胞中的呼吸测定更加复杂，包括ATP的线粒体外需求和测定底物或信号传导事件，这可能会误导对结果的解释。或者，也可以使用从肌肉中新鲜分离的单个或一束肌。然而，分离方法在技术上具有挑战性，仅适用于少数肌肉类型。在这种情况下，主要使用短指屈肌（FDB）和长指伸肌（EDL）10，12，13，尽管一些报告也描述了其他肌肉类型的使用14，15。
还报道了骨骼肌切片的生物能量分析16。这种方法的主要优点是可以研究完整的肌肉（作者表明，与分离的肌纤维相比，通过纤维切片不会干扰结果）。然而，线粒体对底物和测定抑制剂的访问是有限的，因此，只能测量几个参数16。最后，分离的线粒体也可以同样使用9，17，18，19。在这种情况下，线粒体会失去其胞质环境，这可能会影响其功能。相比之下，这种方法保证了对底物和抑制剂的访问，能够分析过多的样品类型，并且通常需要更少的材料。
本文描述了一种使用基于微孔板的呼吸测定对小鼠骨骼肌分离的线粒体进行生物能量分析的方法（图1）。特别是，详细列出了三种方案：偶联测定，CA，用于评估ETC和OXPHOS机器之间的偶联程度;电子流测定，EFA测量单个ETC配合物的活性;和BOX测定法测定线粒体β氧化能力。值得注意的是，与传统的呼吸法相比，只需要少量的样品。此处使用的隔离协议已从其他地方发布的方法进行了修改18。
Protocol
Representative Results
Discussion
用于研究线粒体呼吸的所有方法都有其局限性;因此，选择最适合特定实验问题的方法至关重要。这项工作提供了一个更新和详细的方案，从小鼠骨骼肌中分离线粒体，以执行不同的呼吸测定以研究线粒体功能。事实上，使用基于微孔板的技术研究孤立线粒体中的线粒体生物能量对于研究组织特异性呼吸的可重复性，可靠性和复杂性是有价值的。此外，使用分离的线粒体可以控制底物的可用性，从…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢Juan J. Tena使用均质机和CABD蛋白质组学和畜牧业设施提供技术支持。这项工作得到了西班牙教育，文化和体育部通过奖学金FPU16 / 03264到J.D.H.C，法国协会通过奖学金#22450向C.V.-G.，机构资助MDM-2016-0687（Maria de Maeztu卓越单位，CABD基因调节和形态发生系）和BFU2017-83150-P到J.J.C。Junta de Andalucía拨款P18-RT-4572，欧盟的FEDER资助计划以及西班牙科学，创新和大学部向P.N.授予RED2018-102576-T。
Materials
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
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