Summary
A desmielinização ocorre em múltiplas doenças do sistema nervoso central. Uma técnica confiável de entrega de medicamentos in vivo é necessária para remyeliar testes de drogas. Este protocolo descreve um método baseado em bomba osmótica que permite a entrega de drogas a longo prazo diretamente no parenchyma cerebral e melhora a biodisponibilidade da droga, com ampla aplicação em pesquisas de remyelination.
Abstract
A desmielinização foi identificada não apenas na esclerose múltipla (EM), mas também em outras doenças do sistema nervoso central, como a doença de Alzheimer e o autismo. Como as evidências sugerem que a remyelination pode efetivamente amenizar os sintomas da doença, há um foco crescente no desenvolvimento de medicamentos para promover o processo de regeneração da mielina. Assim, é necessária uma técnica de entrega de medicamentos selecionável e confiável para resultados para testar a eficiência e especificidade desses medicamentos in vivo. Este protocolo introduz o implante da bomba osmótica como uma nova abordagem de entrega de drogas no modelo de rato de desmielinização induzido por lisecitina. A bomba osmótica é um pequeno dispositivo implantável que pode contornar a barreira hemencefálica (BBB) e entregar drogas de forma constante e direta para áreas específicas do cérebro do camundongo. Também pode melhorar efetivamente a biodisponibilidade de drogas como peptídeos e proteínas com uma meia-vida curta. Portanto, este método é de grande valor para o campo da pesquisa de regeneração de mielina do sistema nervoso central.
Introduction
A bomba osmótica é um pequeno dispositivo implantável de liberação de soluções. Pode ser usado para parto sistêmico quando implantado subcutâneamente ou na cavidade abdominal. A superfície da bomba osmótica é uma membrana semi-permeável, e seu lado interno é uma camada permeável. A bomba osmótica opera usando a diferença de pressão osmótica entre a camada osmótica e o ambiente tecidual onde a bomba é implantada. A alta osmolalidade da camada osmótica faz com que a água do tecido flua para a camada osmótica através da membrana semi-permeável na superfície da bomba. A camada osmótica expande e comprime o reservatório flexível dentro da bomba, deslocando assim a solução do reservatório flexível a uma determinada taxa por uma longa duração1. A bomba possui três volumes diferentes de reservatório, 100 μL, 200 μL e 2 mL, com suas taxas de entrega variando de 0,11 μL/h a 10 μL/h. Dependendo do tipo de bomba selecionada, o dispositivo pode operar de 1 dia a 6 semanas2. Neste protocolo, é utilizada uma bomba osmótica de 100 μL com uma taxa de transferência de 0,25 μL/h que pode operar por 14 dias.
Na década de 1970, a bomba osmótica tinha sido usada em pesquisas de neurociência 3,4. Por exemplo, Wei et al. adotaram a abordagem da bomba osmótica para injetar peptídeos opioides no ventrículo em um estudo sobre o vício em drogas3. Após a melhoria contínua, a bomba osmótica tem sido usada agora no estudo da entrega controlada de milhares de drogas, incluindo peptídeos, fatores de crescimento, drogas viciantes, hormônios, esteroides, anticorpos, e assim por diante. Além disso, com cateteres especiais (Kits de Infusão Cerebral) ligados, pode ser usado para infusão direcionada a tecidos ou órgãos específicos, incluindo a medula espinhal, cérebro, baço e fígado 5,6,7.
No estudo da remielinação, muitas drogas têm sido demonstradas para promover a regeneração da mielina in vitro, mas a maioria deles não tem alcançado efeitos significativos in vivo, possivelmente devido à falta de um método de administração adequado. Métodos tradicionais de administração, como injeção intraperitoneal, injeção subcutânea e administração intragástrica têm limitações na biodisponibilidade dos medicamentos. Além disso, algumas drogas têm má permeabilidade da barreira hematoencefálica, o que prejudica seu acesso ao parênquim cerebral. Juntas, essas limitações exigem um novo método de entrega eficiente. Em combinação com os kits de infusão cerebral, as bombas osmóticas podem contornar a barreira hematoencefálica e entregar drogas diretamente ao corpo caloso, o que efetivamente melhora a biodisponibilidade de drogas, especialmente para alguns polipeptídeos e drogas proteicas com uma meia-vida curta. Portanto, a bomba osmótica como uma nova técnica de entrega de drogas é de grande valor para o campo da pesquisa de regeneração de mielina do sistema nervoso central. A aplicação desta técnica será introduzida em detalhes abaixo.
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Protocol
Todos os procedimentos animais foram conduzidos sob diretrizes institucionais e protocolos aprovados pelo comitê de bem-estar animal e ética da Terceira Universidade Médica Militar.
1. Estabelecimento do modelo de rato de desmielinização induzido por lysolecithin
- Prepare 1% de solução de lisecirina (também chamada de L-α-Lysophosphatidylcholine) com PBS estéril.
- Esterilizar tesouras, fórceps, hemostat curvo e outros instrumentos cirúrgicos por esterilização autoclave. Esterilize a área cirúrgica e coloque lençóis estéreis. Todos os materiais e reagentes utilizados para a cirurgia devem ser preparados de forma asepticamente. É importante manter a área cirúrgica estéril durante todo o procedimento.
- Anestesiar um mouse pós-natal 56 (P56) C57BL6 da seguinte forma.
- Coloque o rato na câmara isoflurane da pequena máquina de anestesia animal. Ajuste o fluxo O2 para 300-500 mL/min e isoflurane para 3%-4%. Após anestesia suficiente, quando o mouse ficar imóvel com uma respiração lenta e estável, transfira o mouse para o aparelho estereotaxico com uma almofada de aquecimento.
- Mude a saída de gás da câmara para a máscara de anestesia e ajuste isoflurane para 1% - 1,5% para manter o rato no estado de anestesia. Espere até que o mouse esteja totalmente anestesiado, injete cetoprofeno (3 – 5 mg/kg) intraperitonealmente para aliviar a dor. Antes da operação, aperte os dedo do mouse e verifique sua reação para confirmar a anestesiabem sucedida 8.
- Quando o rato é anestesiado, ele não pode regular sua temperatura corporal. Portanto, monitore e regulamente a temperatura corporal do camundongo durante a cirurgia. Para manter os olhos do camundongo úmidos enquanto estiver sob anestesia, cubra a superfície dos globos oculares com pomada ocular eritromicina.
- Fixar a cabeça do mouse no aparelho estereotaxico com barra de dente e barras de ouvido. (Figura 1A).
- Use uma navalha para remover o cabelo da parte superior da cabeça. Higienize a pele da cabeça com três ciclos de betadina e 75% de etanol. Por questões éticas, cubra o corpo animal, exceto o local da cirurgia. Usando um bisturi, faça uma incisão de 1 cm de comprimento médio da pele da base do pescoço até entre os olhos para expor o crânio (Figura 1B).
- Limpe suavemente a superfície do crânio com um cotonete estéril contendo 30% de peróxido de hidrogênio para visualizar as suturas cranianas (Figura 1C). Ajuste a altura da barra de dente e das barras de ouvido para colocar o ponto lambda e bregma na mesma altura (ou seja, com as mesmas coordenadas do eixo z quando a ponta da agulha toca os pontos), de modo que a sutura sagital seja horizontal.
- Coloque suavemente a ponta da agulha de seringa microliter (10 μL, 33 G) no ponto de bregma e reinicie as coordenadas x, y e z para 0 (Figura 1D). Mova a seringa para o local de injeção (x: 1,04; y: 1.0, ou seja, 1,04 mm lateral para a linha média e 1,0 mm posterior ao ponto de bregma) de acordo com o prompt da leitura digital (Figura 1E).
- Faça lentamente um pequeno orifício de rebarba através do crânio no local da injeção sem penetrar a dura dura com uma agulha de seringa de 1 mL (26 G, 0,45 mm) (Figura 1F). Insira lentamente a agulha de seringa microliter no tecido cerebral através do orifício até que uma certa profundidade seja atingida (z = -1,62 mm para a maioria dos camundongos P56) (Figura 1G).
NOTA: Empiricamente, a profundidade de inserção de -1,62 mm permite que a ponta da agulha chegue ao meio do caloso corpus da maioria dos camundongos P56 para que a lissolecithin possa ser entregue diretamente no caloso corpus para induzir a desmielinização. - Injete 1,5 μL de 1% de lisecirina a uma velocidade de 0,3 μL/min. Após a injeção, espere por 5 minutos antes de retirar lentamente a seringa microliter para evitar o vazamento de líquido ao longo do caminho da agulha de injeção.
- Costure a pele com suturas cirúrgicas 5-0 (Figura 1H).
- Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para evitar uma queda na temperatura corporal. Administre uma injeção subcutânea de 5 mg/kg de carprofeno a cada 24 horas para aliviar a dor. Aplique pomada de eritromicina na incisão todos os dias para garantir que a ferida se cure adequadamente. Coloque o rato que passou por cirurgia em uma gaiola sozinho e alimente-o com alimentos úmidos até que esteja totalmente recuperado. Monitore o mouse diariamente após a operação.
Figura 1: Estabelecimento do modelo do mouse de desmielinização induzido pela lisesolecithin. (A) Fixar o mouse no aparelho estereotaxico. (B) Abra uma incisão de 1 cm no meio da sagiário para expor o crânio. (C) Visualize as suturas cranianas. (D) Redefinir as coordenadas x, y e z para 0 no ponto Bregma. (E) Mova a seringa para o local da injeção. (F) Faça um furo no crânio no local da injeção. (G) Insira a agulha no tecido cerebral lentamente e injete lisecithin. (H) Costure a pele. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Preparação da bomba osmótica
NOTA: Os componentes-chave da bomba são mostrados na Figura 2A.
- Determine a profundidade da inserção da cânula de infusão cerebral no cérebro. Certifique-se de que a agulha da cânula de infusão cerebral usada tem 3 mm de comprimento e cada espaçador de ajuste de profundidade é de 0,5 mm. Para alcançar uma profundidade de injeção de 1,5 mm (perto do caloso), conecte três espaçadores de ajuste de profundidade à agulha da cânula de infusão cerebral com adesivo de tecido (Figura 2B, C).
- Para encher a bomba osmótica, conecte a agulha de seringa que vem com o pacote da bomba a uma seringa de 1 mL e aspire a droga. Segure a bomba ereto, insira a seringa na abertura na parte superior da bomba e injete lentamente a droga, tomando cuidado para não criar bolhas9 (ver Figura 2D). Quando o líquido fluir para fora da abertura, puxe lentamente a seringa.
- Remova a flange branca do regulador de fluxo com uma tesoura ou alicates tomando cuidado para não dobrar ou esmagar o moderador de fluxo. Em seguida, insira o moderador de fluxo na bomba (Figura 2E). Para determinar se há bolhas na bomba osmótica, pese a bomba osmótica separadamente antes e depois do enchimento.
- Corte o cateter a um certo comprimento de acordo com o tamanho do animal (cateteres de 20-25 mm para camundongos P56 que pesam cerca de 25 g). Coloque o cateter na cânula de infusão cerebral.
- Encha o cateter com drogas usando a seringa sem introduzir ar (Figura 2F).
- Conecte o cateter ao moderador de fluxo. Após o acessório, certifique-se de que o cateter cubra cerca de 4 mm do moderador de fluxo exposto (Figura 2G).
- Para garantir que a bomba osmótica possa funcionar instantaneamente após a implantação, mergulhe as bombas preenchidas em soro fisiológico estéril de 0,9% ou PBS a 37 °C por pelo menos 4 a 6 h (de preferência estender-se à pernoite) para pré-molhar a membrana semi-permeável na superfície da bomba com soluções que tenham a mesma pressão osmótica do ambiente tecidual (Figura 2H).
- Todas as soluções carregadas nas bombas devem ser estéreis. As bombas ALZET são fornecidas estéreis, tendo sido expostas a uma dose esterilizadora de 60Co. No entanto, se ocorrer contaminação externa, a superfície da bomba pode ser limpa limpando-a com álcool isopropílico (70% em água).
Figura 2: Preparação da bomba osmótica. (A) Componentes-chave da bomba osmótica. (B,C) Conecte espaçadores de ajuste de profundidade à agulha da cânula de infusão cerebral. (D) Encha a bomba osmótica usando uma seringa de 1 mL. (E) Insira o moderador de fluxo na bomba. (F) Encha o cateter usando a seringa. (G) Conecte o cateter ao moderador de fluxo. (H) Mergulhe as bombas preenchidas em solução salina estéril de 0,9% ou PBS a 37 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Implantação da bomba osmótica
- Aguarde 3 dias após a criação do modelo de desmielinização corpus callosum. Ligue o sistema de anestesia animal pequeno. Desinfetar tesouras, pinças e alicate hemostáticos e mergulhá-los em 75% de solução alcoólica. Coloque lençóis estéreis na área cirúrgica.
- Anestesiar e fixar os ratos no aparelho estereotaxista novamente. Cubra a superfície dos globos oculares com uma pomada ocular para evitar o ressecamento.
- Desinfete a ferida original com 75% de álcool. Abra a incisão cirúrgica previamente costurada (Figura 3A) e amplie a incisão para as omoplatas (Figura 3B).
- Separe a pele do tecido conjuntivo subcutâneo com alicates hemostáticos ou pinças na escápula para abrir uma cavidade (Figura 3C). Coloque a bomba osmótica na cavidade (Figura 3D,E).
- Com um cotonete, limpe suavemente e exponha o orifício na superfície do crânio criado ao estabelecer o modelo de desmielinização (ver passo 1.8). Insira a cânula de infusão cerebral através deste orifício perpendicularmente e fixe-a no crânio rapidamente com adesivo tecidual (Figura 3F).
- Remova a guia removível acima da cânula de infusão cerebral com um par de tesouras (Figura 3G, H). Alternativamente, remova a aba primeiro antes de inserir a cânula para evitar tremer nesse processo.
- Costure a incisão ou anexe-a com adesivo tecidual (Figura 3I).
- Após a cirurgia, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para evitar uma queda de temperatura corporal. Administre uma injeção subcutânea de 5 mg/kg de carprofeno a cada 24 horas para aliviar a dor. Aplique pomada de eritromicina na incisão todos os dias para garantir que a ferida se cure adequadamente. Coloque o animal em uma gaiola sozinho e alimente com alimentos úmidos até que esteja totalmente recuperado. Monitore os ratos todos os dias e verifique se a cânula de infusão cerebral estava firmemente presa.
- Eutanize o rato 11 dias após a cirurgia injetando 150-200 mg/kg de sódio pentobarbital intraperitoneal seguido por perfusing transcardialmente com 4% de formaldeído.
- Para verificar se a solução é entregue normalmente, remova cuidadosamente a bomba osmótica e meça o volume residual no reservatório da bomba antes da dissecação cerebral.
- Para medir o volume residual, remova a cânula de infusão cerebral, conecte uma seringa de 1 mL ao cateter e, em seguida, aspire a solução restante para determinar seu volume. Compare o volume residual real com o volume residual teórico (volume inicial - taxa média de bombeamento * duração da infusão).
NOTA: O volume residual excessivo indica infusão sem sucesso, que pode ser devido à oclusão do cateter ou mau funcionamento da bomba.
- Para medir o volume residual, remova a cânula de infusão cerebral, conecte uma seringa de 1 mL ao cateter e, em seguida, aspire a solução restante para determinar seu volume. Compare o volume residual real com o volume residual teórico (volume inicial - taxa média de bombeamento * duração da infusão).
Figura 3: Implantação da bomba osmótica. (A) Abra a incisão cirúrgica. (B) Expandir a incisão para as omoplatas. (C) Separar a pele do tecido conjuntivo subcutâneo para fazer uma cavidade. (D,E) Coloque a bomba osmótica na cavidade. (F) Insira a cânula de infusão cerebral no orifício na superfície do crânio e fixe-a firmemente no crânio. (G,H) Remova a guia removível da cânula. (I) Costure a incisão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Para verificar o efeito da bomba osmótica na pesquisa de regeneração de mielina, um modelo de desmielinização induzido por lisolecithin foi criado em camundongos P56, seguido pela implantação de bombas osmóticas contendo UM206 (1 mg em 1,5 mL 0,9% salino), um peptídeo com uma meia-vida curta e má permeabilidade BBB que foi recentemente relatado para promover a remielinização10 . 0,9% salino foi usado como controle. Quatorze dias após o estabelecimento do modelo, os camundongos foram transcardialmente perfumados com 4% de formaldeído para isolar os cérebros para secção, seguido por microscopia eletrônica in situ e transmissão para avaliar o nível de remyelinação.
A coloração do DAPI revelou o orifício no tecido cerebral logo acima da matéria branca, indicando implantação bem sucedida da cânula de infusão cerebral da bomba osmótica (Figura 4A). No experimento de hibridização in situ, a sonda MAG, marcador oligodendrocida madura, foi usada para rotular oligodenrócitos recém-diferenciados, como mostrado em estudos anteriores 10,11,12. Os resultados mostraram que o tratamento UM206 produziu mais células MAG-positivas na região desmielinizada do que o grupo controle (Figura 4B). A microscopia eletrônica de transmissão da região desmielinizada também mostrou que o número de axônios mieliados foi aumentado no grupo de tratamento UM206 em comparação com o grupo controle (Figura 4C), sugerindo que um206 induziu um maior nível de remyelinação. Esses resultados mostram que a bomba osmótica pode fornecer drogas eficientemente ao corpus calosum na pesquisa de remyelinação.
Figura 4: Resultados representativos. (A) Imagem representativa da fatia manchada de DAPI mostrando o orifício no tecido cerebral. Barra de escala: 1.000 μm. (B) Imagens representativas mostrando hibridização in situ de MAG na região desmíada, como mostrado pela coloração da DAPI. O tratamento UM206 aumentou o número de oligodendrócitos rotulados por MAG. Barra de escala: 100 μm. (C) Imagens representativas de microscopia eletrônica de transmissão da região desmielinizada. O tratamento UM206 aumentou o número de axônios mieliados. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve a bomba osmótica como uma nova técnica de entrega de medicamentos para a pesquisa de regeneração de mielina, que pode fornecer medicamentos diretamente ao local de tratamento e permitir a entrega consistente de medicamentos por um período prolongado, criando uma concentração estável de drogas no microambiente do sistema nervoso central em toda a duração experimental. Em comparação com outros métodos de entrega de medicamentos, a bomba osmótica é mais propícia para manter a concentração de drogas na lesão de desmielinização13. Por exemplo, para certos fatores neurotróficos, a medicação sistêmica não pode alcançar qualquer efeito devido à baixa concentração da droga no local da lesão. Mas se a dosagem for aumentada, os efeitos colaterais serão mais significativos14. Nesses casos, administrar em um local específico através de uma bomba osmótica pode reduzir os efeitos colaterais periféricos efetivamente15. Além disso, muitas drogas relacionadas à regeneração de mielina têm má permeabilidade hematoencefálica (BBB) ou exibem uma curta meia-vida in vivo devido à suscetibilidade à degradação proteolítica. Esses problemas podem ser bem resolvidos pelas bombas osmóticas.
No entanto, o método da bomba osmótica não é sem ressalvas e limitações. Primeiro, sendo um sistema invasivo de entrega de drogas, inevitavelmente causa danos no tecido cerebral e neuroinflamação no local de inserção de cânula de infusão cerebral, o que pode obscurecer o efeito das drogas. Assim, deve ser criado um grupo de controle adequado somente para solventes. Em segundo lugar, algumas drogas requerem solventes como sulfóxido de dimetila (DMSO), N-metil-2-pyrrolidone (NMP) para dissolver, mas esses solventes são incompatíveis com o material do reservatório e podem causar uma falha significativa das bombas. Por exemplo, altas concentrações de sulfóxido de dimetila (DMSO) e PEG400 têm sido demonstradas para afetar negativamente a liberação da bomba e podem não ser adequadas para uso em bombas osmóticas 16,17,18. Em terceiro lugar, drogas instáveis a 37 °C podem não ser adequadas para infusão a longo prazo usando a bomba osmótica. Todas essas questões merecem atenção se o planejamento para aplicar a bomba osmótica.
Várias etapas deste protocolo requerem atenção extra durante os experimentos. Para o funcionamento normal das bombas osmóticas, os pesquisadores devem garantir que a bomba osmótica seja montada corretamente e que nenhuma bolha seja introduzida na bomba, o que prejudicará muito a eficiência da infusão. Além disso, a oclusão do cateter ou o mau funcionamento da bomba osmótica podem causar falha de infusão19, o que pode ser determinado pela medição do volume residual no reservatório da bomba após o experimento. Para a aplicação da bomba osmótica em camundongos mais jovens com tamanhos cerebrais menores, recomenda-se um experimento experimental para garantir uma profundidade adequada de inserção. Além disso, a cânula de infusão cerebral deve ser firmemente presa no crânio para minimizar seu movimento durante a infusão.
Atualmente, muitos estudos in vitro têm encontrado uma variedade de medicamentos que podem promover a regeneração da mielina, mas devido à má permeabilidade do BBB, meia-vida curta e outros problemas, essas drogas são difíceis de serem validadas com sucesso in vivo. Portanto, a bomba osmótica é de grande valor para o campo da pesquisa de regeneração de mielina do sistema nervoso central, especialmente relevante para aqueles medicamentos com meia-vida curta, má permeabilidade BBB e efeitos colaterais periféricos óbvios.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Nature Science Foundation of China (NSFC 32070964, 31871045) à J.N. e à Shenzhen Basic Research Foundation (JCYJ20210324121214039) a Y.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Air Pump | RWD | R510-29 | E05818-006 |
| Brain Infusion kit 3 | ALZET | 0008851 | 1-3 mm |
| Carprofen | Macklin | C830557-1g | 5 mg/kg every 24 h |
| Erythromycin eye ointment | Along technology | YCKJ-RJ-024780 | Cover the surface of the eyeballs during anesthesia |
| Erythromycin ointment | pythonbio | RG180 | |
| Gas Evacuation Apparatus | RWD | R546W | E05518-002 |
| L-α-Lysophosphatidylcholine | Sigma | L0906 | Dissolve at 1% with sterile PBS |
| Microliter Syringe | Hamilton | 65460-05 | Syringe Series:1700, 10 µL, 33 gauge |
| Micro-smotic pump model 1002 | ALZET | 0004317 | 0.25 µL per hour, 14 days |
| PBS (pH = 7.3) | ORIGENE | ZLI-9061 | |
| Pentobarbital sodium | Shanghai Civi | CAS NO: 57-33-0 | 150-200 mg/kg intraperitoneal injection for euthanasia |
| Small Animal Anesthesia Machine | RWD | R520IE | E05807-006 M |
| Stereotaxic Equipment | RWD | E06382 | |
| STERI 250 sterilizer | Keller | 31101 | Rapid sterilization of surgical instruments |
| Surgical sutures | Shanghai jinhuan | F504 | 5-0 |
| Syringe needle (1 mL) | Shanghai KDL | 6930197811018 | 26 gauge (0.45 mm x 16 mm) |
| Testing drug and solvent | Experiment dependent | N/A | |
| ThermoStar Homeothermic Monitoring System | RWD | 69026 | Maintain body temperature during anesthesia |
| Vetbond Tissue adhesive | 3M | 1469SB | Secure the brain infusion cannula , Adhere the skin incision |
References
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