Summary
Fettvevsavledede mesenchymale stamceller (Ad-MSCer) kan være en potensiell kilde til MSCer som skiller seg ut i insulinproduserende celler (IPCer). I denne protokollen gir vi detaljerte trinn for isolering og karakterisering av rotte epididymale Ad-MSCer, etterfulgt av en enkel, kort protokoll for generering av IPCer fra samme rotte Ad-MSCer.
Abstract
Mesenchymale stamceller (MSCs) - spesielt de som er isolert fra fettvev (Ad-MSCs) - har fått spesiell oppmerksomhet som en fornybar, rikelig kilde til stamceller som ikke utgjør noen etiske bekymringer. Gjeldende metoder for å isolere Ad-MSCer er imidlertid ikke standardiserte og bruker kompliserte protokoller som krever spesialutstyr. Vi isolerte Ad-MSCer fra det epididymale fettet til Sprague-Dawley-rotter ved hjelp av en enkel, reproduserbar metode. De isolerte AD-MSCene vises vanligvis innen 3 dager etter isolasjon, ettersom adherentceller viser fibroblastisk morfologi. Disse cellene når 80% samløp innen 1 uke etter isolasjon. Etterpå, ved passasje 3-5 (P3-5), ble det utført en full karakterisering for de isolerte Ad-MSCene ved immunofenotyping for karakteristisk MSC-klynge av differensieringsmarkører (CD) som CD90, CD73 og CD105, samt indusere differensiering av disse cellene ned osteogene, adipogene og kondrogene avstamninger. Dette innebærer i sin tur multipotensen til de isolerte cellene. Videre induserte vi differensiering av de isolerte Ad-MSCene mot insulinproduserende celler (IPCs) avstamning via en enkel, relativt kort protokoll ved å inkorporere høy glukose Dulbeccos modifiserte Eagle medium (HG-DMEM), β-mercaptoethanol, nikotinamid og exendin-4. IPCs differensiering ble genetisk vurdert, for det første, ved å måle uttrykksnivåene til spesifikke β-cellemarkører som MafA, NKX6.1, Pdx-1 og Ins1, samt dithizone farging for de genererte IPCene. For det andre ble vurderingen også utført funksjonelt av en glukose-stimulert insulinsekresjon (GSIS) analyse. Til slutt kan ad-MSCer enkelt isoleres, og viser alle MSC-karakteriseringskriterier, og de kan faktisk gi en rikelig, fornybar kilde til IPCer i laboratoriet for diabetesforskning.
Introduction
Mesenchymale stamceller (MSCer), også kjent som mesenchymale stromale celler, er blant de mest brukte celletypene for regenerativ medisin 1,2. De er klassifisert som voksne stamceller og preget av multilineage differensieringspotensial og selvfornyelseskapasitet3. MSCer kan isoleres og hentes fra ulike kilder, inkludert fettvev, benmarg, perifert blod, navlestrengsvev og blod, hårsekkene og tennene 4,5.
Isolering av stamceller fra fettvev blir sett på som både tiltalende og lovende på grunn av deres enkle tilgang, rask ekspansjon in vitro og høyt utbytte6. Fettvevsavledede mesenchymale stamceller (Ad-MSC) kan isoleres fra forskjellige arter som mennesker, storfe, mus, rotter og, mer nylig, geiter7. Det har vist seg at Ad-MSCs nå er potensielle kandidater for vevsteknikk og gen/ celleterapi som til og med kan brukes til å utvikle et autologt alternativ for langsiktig reparasjon av bløtvevsskade eller defekter 7,8.
International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) har definert tre minimumskriterier som må stilles ut av MSC for full karakterisering9. Først må de være plasttilhørig. For det andre bør MSCer uttrykke mesenchymale stamcelleoverflateindikatorer som CD73, CD90 og CD105 og mangle uttrykk for de hematopoietiske markørene CD45, CD34, CD14 eller CD11b, CD79α eller CD19 og HLA-DR. Til slutt bør MSCer vise evne til å skille seg ut i de tre mesenchymale avstamningene: adipocytter, osteocytter og kondrocytter. Interessant nok kan MSCer også skille seg ut i andre avledninger som nevronceller, kardiomyocytter, hepatocytter og epitelceller10,11.
Faktisk har MSC unike egenskaper som gjør dem i stand til å bli brukt som potensielle terapeutiske midler i regenerativ terapi for forskjellige sykdommer. MSCer kan utskille løselige faktorer for å indusere et immunmodulerende miljø som gir terapeutiske fordeler12. I tillegg kan MSC migrere mot steder med skade og tumormikromiljø for å levere målrettet terapi; Mekanismene er imidlertid ikke fullt ut belyst13. I tillegg har MSC evnen til å utskille eksosomer, ekstracellulære vesikler i nanoskalaen som bærer en last med ikke-kodende RNAer, protein og løselige faktorer, som i det siste dukket opp som en ny mekanisme for MSCs terapeutiske potensial i ulike sykdommer14.
Enda viktigere er at MSC-er har generert markert oppmerksomhet for deres potensial til å skille seg ut i insulinproduserende celler (IPCer), enten ved genetisk modifikasjon15,16 eller ved å bruke ulike ekstrinsisk-induserende faktorer innen kulturmediene in vitro17. IPC-induksjonsperioden varierer sterkt, da den avhenger av den brukte induksjonsprotokollen og de brukte ekstrinsiske faktorene. Differensieringsprosessen kan vare fra dager til måneder, og det krever en kombinasjon av eksogene induserende faktorer som må legges til og / eller trekkes tilbake i forskjellige stadier. Mange av disse faktorene som har blitt brukt til endokrine pankreas differensiering er biologisk aktive forbindelser som har vist seg å fremme spredning eller differensiering / neogenese av insulin-utskillende β-celler og / eller øke insulininnholdet i IPCer 18,19,20,21. Det er bemerkelsesverdig her at MSCs også har blitt rapportert å ha terapeutiske effekter i diabetes og dets komplikasjoner via flere mekanismer, inkludert deres sekretom, samt et bredt spekter av immunmodulerende handlinger 22,23,24.
I denne protokollen presenterer vi en detaljert trinnvis protokoll for isolering og karakterisering av ad-MSCer fra rotte epididymalt fett, etterfulgt av en enkel, relativt kort protokoll for generering av IPCer fra Ad-MSCer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført i henhold til de godkjente retningslinjene, og alle prosedyrer ble godkjent av Den etiske komitéen ved Det farmasøytiske fakultet, Det britiske universitetet i Egypt (BUE), Kairo, Egypt. Ad-MSC-isolasjonsprotokollen ble tatt i bruk fra Lopez og Spencer, med modifikasjoner15.
1. Isolering av ad-MSCer fra rotte epididymal fett pads
- Bruk mannlige Sprague-Dawley rotter som veier 250-300 g som ikke er mer enn 1 måned (to per isolasjon). Bedøv dyrene, og euthanize dem deretter ved cervical dislokasjon. Spray det euthanized dyret med 70% etanol. Slukk huden og muskelen i underdelen av magen, og trekk deretter ut de to testiklene for å eksponere de epididymale fettputene.
- Klipp forsiktig de epididymale fettputene og vær forsiktig så du ikke kutter blodkarene.
- Isoler fettvevet rundt epididymis, og legg det deretter i en Petri-tallerken som inneholder fosfatbufret saltvann (PBS).
- I biosikkerhetsskapet, kutt disse fettputene i små biter ved hjelp av tang og skalpell. Overfør disse kuttede fettvevsstykkene i et 50 ml sentrifugerør som inneholder 10 ml steril PBS.
- Vask hakket fettvev 5 ganger med 10 ml PBS hver gang for å fjerne det forurensende blodet. Følgende vaskeprosedyrer må utføres omhyggelig.
- Tilsett 10 ml PBS i vevet og bland grundig i 45 s. La deretter vevet slå seg ned via tyngdekraften ved å holde røret stående i 5 minutter for å skille seg i to lag.
- Aspirer PBS fra infranatanten ved hjelp av en 10 ml sprøyte og erstatt med frisk 10 ml PBS for en annen vask.
- Gjenta dette vasketrinnet 4-5 ganger til PBS er fri for blod. Dette indikerer at de fleste, om ikke alle, av blodet er fjernet.
- Etter vask, resuspender fettvevet i 10 ml kollagenoppløsning (0,1% kollagenalus type 1 i PBS). Forsegle røret tett med parafilm, og inkuber det deretter i et ristende vannbad (37 °C, 80 o/min, i 45 minutter) til vevet er nesten homogent.
MERK: Unngå fullstendig fordøyelse av vevet (når løsningen blir helt homogen med fullstendig forsvinning av alle vevrester / stykker), fordi det påvirker kulturing av celler negativt etterpå. Vanligvis tar fordøyelsen 30-45 min. - Når kollagenalisse fordøyelsen er ferdig, virvel røret i 15 s, deretter sentrifuge i 5 min ved 300 x g. Virvel røret igjen i 10 s, etterfulgt av en annen 5 min sentrifugering. Tre lag vil da bli observert. Kast forsiktig oljelaget, etterfulgt av det vandige laget, uten å forstyrre den stromale vaskulære fraksjonen (SVF) pellets.
MERK: Fjern supernatanten som inneholder adipocytter og kollagenoppløsningen. Fjern først adipocyttene og det medfølgende oljelaget med en 10 ml pipette for å sikre fullstendig fjerning av oljedråpene, og fjern deretter det under vandige laget. - Resuspend SVF pellet på bunnen av røret i 10 ml steril BSA-løsning (1% albumin, bovint serum Fraction V-løsning i PBS), og sentrifuger deretter røret i 5 min ved 300 x g.
- Etter sentrifugering, kast supernatanten og suspender SVF-pelletsen i 8,5 ml komplette medier for Ad-MSCer (sammensatt av Dulbeccos Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 [DMEM/F12] medier supplert med 10% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0,25 μg/ml amfotericin B og 2 mM L-glutamin).
- Kultur cellene i en 25 cm2 kolbe ved 37 °C under 5 % CO2. På neste dag kontrollerer du de vedlagte cellene, fjerner de suspenderte cellene og erstatter mediet. Etterpå skifter du media annenhver dag.
- Før cellene hver 5-7 dager når de er 80% -90% sammenfallende ved hjelp av Trypsin-EDTA. Bruk celler mellom avsnittene 3-5 for de påfølgende eksperimentene som er beskrevet i denne protokollen. En skjematisk presentasjon av alle isolasjonstrinnene finnes i figur 1.
MERK: Vanligvis kan Trypisn-EDTA-styrken variere mellom forskjellige leverandører, så prøv å minimere tiden for forsøk for å unngå toksiske effekter på cellene.
2. Karakterisering av ad-MSCer ved immunofenotyping ved hjelp av strømningscytometrianalyser
- Ved passering 3 deler du cellene ved hjelp av Trypsin-EDTA. Vask med PBS 2 ganger og tell deretter cellene med et hemocytometer.
- Inkuber 100 000 celler ved 4 °C i mørket i 20 minutter med enten mus anti-rotte CD90 eller CD105 (mesenchymale markører) eller CD34 (hematopoietisk markør) monoklonalt antistoff merket med fluorescein-isothiocyanate (FITC).
- Vask cellene og suspender dem i 500 μL FACS-buffer. Analyser etter strømningscytometri25.
3. Vurdering av differensieringspotensialet til isolerte ad-MSCer i ulike mesenchymale avstamninger
- Adipogene differensiering
- Resuspend cellene i komplette medier (som beskrevet i trinn 1.9.), deretter kultur cellene med en tetthet på 3,7 x 104 celler / brønn i en 24-brønns vev kulturplate. Inkuber ved 37 °C i en fuktig atmosfære på 5 % CO2. Deretter endrer du mediet hver tredje dag til cellene når nesten 100% samløp, som vanligvis tar 3 dager.
- Når cellene når ønsket samløp, erstatt spredningsmediet med de adipogene differensieringsmediene (bestående av LG-DMEM-medier supplert med 10% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0,25 μg/ml amfotericin B og 2 mM L-glutamin med 1x adipogene supplement, levert med Mesenchymal Stem Cells Functional Identification Kit) for å indusere adipogenese. Deretter endrer du media hver tredje dag (0,5 ml / brønn). Pass på å utføre medieutskiftingen forsiktig for ikke å forstyrre lipidvakuolene.
- Etter 21 dager, vurdere den adipogene differensiering ved mikroskopisk undersøkelse av lipid vakuoler utseende og av Olje Rød farging.
- Forbered en lagerløsning av Oil Red ved å oppløse 30 mg oljerød flekk i 10 ml isopropanol, og hold den deretter i minst 20 minutter ved romtemperatur. Deretter forbereder du en arbeidsløsning ved å blande 3 deler lagerløsning med 2 deler dobbelt destillert vann (ddH2O), bland dem godt og hold det i 10 minutter ved romtemperatur, og filtrer deretter etterpå med filterpapir.
- For å dokumentere den adipogene differensiering, vask cellene 2 ganger med PBS, og fest dem deretter ved hjelp av nøytralbufret formalin 10% (0,75 ml / brønn) i 15 minutter. Deretter vasker du cellene 2 ganger med PBS ved hjelp av 1 ml / brønn og inkuberer cellene i 5 minutter hver gang. Det er viktig å fullstendig aspirere PBS før du legger til oljerød arbeidsløsning.
- Etter den siste vasken, legg til oljerød arbeidsløsning i cellene og inkuber dem i 60 min ved 37 °C. Deretter fjerner du flekkløsningen og vasker cellene forsiktig 2 ganger med PBS. Vær oppmerksom på de fargede lipiddråpene under mikroskopet.
- Osteogen differensiering
- Frø 7,4 x 103 celler/brønn (0,5 ml medium/brønn) i en 24-brønns plate og inkuber dem ved 37 °C i en fuktig atmosfære på 5 % CO2 i komplette medier (som beskrevet i trinn 1.9.) i 3 dager for å nå nesten 70 % samløp.
- Induser cellene med det osteogene tilskuddet (følger med settet) i LG-DMEM-medier supplert med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,25 μg / ml amfotericin B og 2 mM L-glutamin.
- Fortsett den osteogene induksjonen i 21 dager, og endre differensieringsmediene hver tredje dag.
- Forbered en arbeidsløsning av Alizarin Red S-flekk ved å oppløse 200 mg Alizarin Red S-flekk i 9 ml ddH2O, og juster deretter pH til 4,1-4,3 ved hjelp av ammoniumhydroksid og HCl. Deretter utgjør volumet til 10 ml ved ddH2O. Deretter fjerner du eventuelle utfellinger ved filtrering ved hjelp av filterpapir.
- Vask cellene 2 ganger med PBS, og fest dem deretter ved hjelp av 10% bufret formalin (0,75 ml / brønn) i 15 minutter. Deretter vasker du cellene 2 ganger ved hjelp av PBS (1 ml/brønn). Hver gang, inkuber cellene i 5 min.
- Inkuber de faste cellene med den tilberedte 2% Alizarin-Red S-løsningen i 30 min i en 37 °C inkubator.
- Deretter fjerner du flekkløsningen, vasker cellene 2 ganger med ddH2O og en gang med PBS, og observer deretter den fargede kalsiumrike ekstracellulære matrisen for å vurdere osteogen differensiering under mikroskopet.
- Kondrogen differensiering
- Frø 7,4 x 103 celler/brønn (0,5 ml medium/brønn) i en 24-brønns plate og inkuber disse ved 37 °C i en fuktig atmosfære på 5 % CO2 i komplette medier (som beskrevet i trinn 1.9.) i 3 dager for å nå nesten 70 % samløp.
- Når ønsket samløp er nådd, indusere kondrogene differensiering av cellene med serumfri DMEM/F12 som inneholder insulin-transferrin selen (ITS), kondrogent supplement (følger med settet), 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0,25 μg/ml amfotericin B og 2 mM L-glutamin21.
- Inkuber cellene med kondrogene medier i 21 dager, mens du endrer kondrogene differensieringsmedier hver tredje dag.
- Forbered en arbeidsløsning av Alcian Blue 8GX flekk som følger: Forbered først en 3% issyreoppløsning i ddH2O ved å tilsette 3 ml issyre til 97 ml ddH2O. Lag deretter en arbeidsløsning av Alcian Blue 8GX-flekk ved å blande 0,1 g i 100 ml 3% issyreoppløsning, og fjern eventuelle utfellinger ved filtrering ved hjelp av filterpapir.
- Vask cellene 2 ganger med PBS, og fest dem deretter ved hjelp av 10% bufret formalin (0,75 ml / brønn) i 15 minutter. Deretter vasker du cellene 2 ganger ved hjelp av PBS (1 ml/brønn). Hver gang, inkuber cellene i 5 min.
- Det neste trinnet er å inkubere cellene i den tilberedte 0,1% Alcian Blue 8GX-flekken i 3% issyre i 60 min ved 37 °C. Vask de fargede cellene 2 ganger med ddH2O og en gang med PBS, og observer deretter de fargede sulfaterte proteoglykanene under mikroskopet.
4. Differensiering av ad-MSCer i IPCer
- Ved passering 3 deler du ad-MSCene ved hjelp av Trypsin-EDTA. Først fjerner du mediet, vask deretter cellene mens de fortsatt er festet i kulturflasken med 5 ml PBS. Deretter legger du til 5 ml Trypsin-EDTA i 75 cm2 kolbe og inkuberer ved 37 °C i 3-10 minutter.
MERK: Prøv å indusere cellene ved tidlige passasjer, vanligvis mellom P3-P5, da sene passasjer påvirker cellenes egenskaper og differensieringsevner17,24 negativt. - Deretter inspiserer cellene for løsrivelse og for å være en encellet suspensjon. Tilsett 5 ml komplette DMEM/F12-medier i kolben for å hemme trypsin-handlingen. Samle cellefjæringen og overfør den til et 15 ml rør, og legg deretter til ytterligere 5 ml komplette DMEM / F12-medier til røret.
- Sentrifuger cellene på 300 x g i 2 min for å pellet cellene.
- Vask cellene en gang med PBS, sentrifuger igjen ved 300 x g i 2 min, og bruk deretter cellepelleten på nytt i 3-5 ml komplette DMEM / F12-medier.
- Tell cellene ved hjelp av trypan blå eksklusjonsfargestoff og et hemocytometer.
- Deretter frø cellene i 6-brønns plater (1 x 106 celler / plate) og en 12-brønns plate (for GSIS-analyse; 1 x 106 celler / plate) og inkubere i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator i komplette medier (som beskrevet i trinn 1.9.) i 3 dager for å nå nesten 90% konfluens.
- På induksjonsdagen fjerner du mediet, vasker cellene med PBS, og deretter pre-induserer cellene i 2 dager ved pre-induksjonsmedier (DMEM / F12 supplert med 10% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0,25 μg/ml amfotericin B, 2 mM L-glutamin, 10 mM nikotinamid [NA], og 1mM β-mercaptoethanol [β-ME]).
- Induser cellene i ytterligere 1 dag ved hjelp av høy glukose DMEM (HG-DMEM, 4,5 g/l glukose) supplert med 2,5 % FBS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0,25 μg/ml amfotericin B, 2 mM L-glutamin, 10 mM NA og 1 mM β-mercaptoethanol. Samle cellepellets på slutten av dette stadiet (utpekte D3-celler i denne protokollen).
- Inkuber cellene i ytterligere 7 dager i det endelige differensieringsinduksjonsmediet som består av HG-DMEM supplert med 2,5% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0,25 μg/ml amfotericin B, 2 mM L-glutamin, 10 mM NA, 1mM β-mercaptoethanol og 10 nM exendin-4.
- På slutten av den angitte perioden samler du cellepellets (kalt Final i denne protokollen), og vurderer vellykket differensiering av cellene ved DTZ-farging og GSIS-analyse, som følger i denne protokollen.
- Vurder de genererte IPCene ved å følge trinn 5 og 6 nedenfor.
5. Dithizone flekker
- Forbered dithizone (DTZ) flekkbestandsløsning som følger: Oppløs 25 mg DTZ helt i 2,5 ml dimetylsulfoksid (DMSO), del i aliquots og oppbevar ved −20 °C i mørket til bruk.
- For farging, lag en arbeidsløsning 1:100 (volum/volum) ved å fortynne lagerløsningen i komplett kulturmedium (HG-DMEM supplert med 5% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0,25 μg/ml amfotericin B og 2 mM L-glutamin). Deretter filtrerer du arbeidsløsningen gjennom et 0,2 μm sprøytefilter.
- Deretter, for de angitte DTZ-fargingskulturcellene i en 6-brønns plate og, etter å ha aspirert kulturmediene, vask cellene en gang med PBS, og tilsett deretter 2 ml DTZ arbeidsløsning i hver brønn. Inkuber i minst 2 timer ved 37 °C i CO 2-inkubatoren.
- Vask cellene forsiktig 2 ganger med PBS. Etter siste vask, tilsett 2 ml PBS i hver brønn. Følg deretter crimson rødfargede IPCer under et invertert mikroskop. Bruk uinduserte ad-MSCer som opprinnelig ble dyrket i komplett vekstmedium (10 % FBS – DMEM/F12) som en kontroll.
6. Genuttrykk av β-cellemarkører av RT-qPCR
- RNA-ekstraksjon
- Etter differensiering, samle cellepellets og lagre dem ved −80 °C til bruk. Suspender hver cellepellet (avledet fra de seks brønnene i en 6-brønns plate samlet) i 1 ml guanidiumtiocyanat RNA ekstraksjonsreagens i et 1,5 ml nukleasefritt rør, sammen med pipettering opp og ned flere ganger. Inkuber de lysede prøvene ved romtemperatur i 5 minutter for å tillate fullstendig dissosiasjon av nukleoproteinkompleksene.
- Tilsett 200 μL kloroform per 1 ml RNA ekstraksjonsreagens, og het rørene som skal ristes kraftig for hånd i 15 s. Deretter inkuberer du i 3 min ved romtemperatur.
- Sentrifuger prøvene ved 13 800 x g i 15 minutter ved 4 °C. Dette vil føre til blandingsseparasjon i en nedre kloroformfase, en interfase og en fargeløs øvre vandig fase, med RNA igjen i den vandige fasen.
- Plasser den øvre vandige fasen i et nytt rør, samtidig som du forsiktig unngår å berøre interfasen.
- Tilsett 600 μL 100% isopropanol i vandig fase (1:1 volum), bland deretter prøvene grundig ved inversjon 25 ganger, og inkuber ved romtemperatur i 10 minutter.
- Sentrifuger prøvene ved 18 800 x g i 30 min ved 4 °C. Den utfelte RNA danner en liten gellignende pellets på rørsiden.
- Fjern supernatanten og vask pelletsene med 1 ml 80% iskald etanol. Etter å ha tilsendet etanol, utfør sakte flere pipettering av RNA-pellets i 10 s.
- Sentrifuger prøvene i 5 min ved 9600 x g ved 4 °C. Kast supernatanten og la RNA-pelletsene lufttørke i 5-10 min.
- Etter tørking oppløses RNA-pelletsene i 25-100 μL RNase-fritt vann (i henhold til den opprinnelige pelletsstørrelsen) ved å pipettere opp og ned flere ganger til fullstendig solubilisering i 1,5 ml nukleasefrie rør. Unngå overdreven tørking av RNA-pelletsen.
MERK: Vanligvis blir pelletsen gjennomsiktig når den tørker. Men når det er klart, resuspender det raskt for å unngå overdreven tørrhet i pelletsen. - Kvantifisere RNA ved å bestemme de optiske tetthetene (OD) ved 260 nm og 280 nm, ved hjelp av nukleasefritt vann som blankt.
- Påse at prøvene har OD260/OD280 = 1,8-2,0.
- cDNA-syntese
- Syntetiser cDNA fra den isolerte totale RNA ved hjelp av et cDNA-syntesesett.
- Utfør cDNA-syntesereaksjonen i henhold til produsentens instruksjoner. I et 200 μL PCR-rør legger du til et volum RNA-oppløsning som inneholder 0,5 μg total RNA til reaksjonsmasterblandingen vist i tabell 1.
- Etter å ha lagt RNA til mesterblandingen, skriv inn blandingen gjennom et sykkelprogram på 50 °C i 30 minutter i en syklus, etterfulgt av en inaktiveringssyklus på 95 °C i 2 minutter, ved hjelp av en termisk syklist.
- Fortynn cDNA ved hjelp av nukleasefritt vann til en endelig konsentrasjon på 2 ng/μL. Oppbevares ved −20 °C for påfølgende RT-qPCR.
- RT-qPCR ved hjelp av SYBR Green Master Mix
- Utfør RT-qPCR-reaksjonen for hvert målgen ved hjelp av cDNA-malen i henhold til reaksjonsblandingen vist i tabell 2. Gjør alle tiltakene i triplikater.
- Settene med primere som brukes, vises i tabell 3. Utfør alle RT-qPCR-prosedyrene på is.
- Utfør RT-qPCR-reaksjonen ved hjelp av en PCR-maskin i sanntid på standard programinnstillinger. De termiske sykkelforholdene inkluderte innledende denaturering på 95 °C i 10 minutter, etterfulgt av 45 sykluser med denaturering (95 °C, 15 s) og kombinert gløding/forlengelse (60 °C, 1 min).
- Bestem Ct-verdiene og oppdag uttrykksnivåene i henhold til 2-ΔΔCt, med β-aktin som internkontroll.
| cDNA masterblanding for syntese | Volum (μl) |
| 5x cDNA-syntesebuffer | 4 |
| dNTP | 2 |
| RNA primer | 1 |
| Verso enzym blanding | 1 |
| RT-forsterker | 1 |
| Nuclease Fritt vann | Variabel |
| Totalt RNA | Variabel |
| Totalt reaksjonsvolum | 20 |
Tabell 1: cDNA-syntese master mix volumer.
| RT-qPCR reaksjonsblanding | Volum (μl) | Endelig konsentrasjon i 10 μL |
| cDNA | 2 | 2 ng/brønn |
| RT-qPCR Fremoverprimer (3 μM) | 1 | 300 nM |
| RT-qPCR Omvendt primer (3 μM) | 1 | 300 nM |
| Nukleasefritt vann | 1 | ------- |
| 2x SYBR Grønn master mix | 5 | 1x |
| Totalt reaksjonsvolum | 10 |
Tabell 2: RT-qPCR reaksjonsblanding.
| Gen | Fremoverprimer | Omvendt primer |
| FOXA2 | GAGCCGTGAAGATGGAAGG | ATGTTGCCGGAACCACTG |
| PDX-1 | ATCCACCTCCCGGACCTTTC | CCTCCGGTTCTGCTGCGTAT |
| NKX6.1 | ACACCAGACCCACATTCTCCG | ATCTCGGCTGCGTGCTTCTT |
| Mafa | TTCAGCAAGGAGGAGGTCAT | CCGCCAACTTCTCGTATTTC |
| Inn-1 | CACCTTTGTGGTCCTCACCT | CTCCAGTGCCAAGGTCTGA |
| β-aktin | TGGAGAAGATTTGGCACCAC | AACACAGCCTGGATGGCTAC |
Tabell 3: Fremover og bakoverprimer sekvenser.
7. Glukose-stimulert insulin sekresjon
- Utarbeidelse av Krebs Ringer bikarbonatbuffer (KRB)
- Forbered Krebs Ringer bikarbonatbufferløsning (KRB) med både 2 mM glukose (lav glukose) og 20 mM glukose (høy glukose) konsentrasjoner for glukose-stimulert insulinsekresjon (GSIS) analyse. Komponentene som brukes til krb-bufferforberedelsene er angitt i tabell 4.
- Juster pH-en til bufferen ved hjelp av 1 N HCl til ca. 7,25-7,35 (dvs. 0,1-0,2 enheter under ønsket pH 7,4, fordi den kan stige under filtrering).
- Tilsett bovint serumalbumin (BSA) ferskt i en konsentrasjon på 0,1 % (vekt/volum).
- Tilsett glukose etterpå (18 mg for 50 ml KRB for å forberede 2 mM lav glukose KRB buffer, og 180 mg for 50 ml KRB for å forberede 20 mM høy glukose KRB buffer).
- Steriliser de tilberedte LG- og HG KRB-bufferne ved filtrering gjennom et 0,2 μm sprøytefilter for å være klar for GSIS-analysen.
- GSIS-analyse
- I utgangspunktet frø 1 x 105 celler / brønn i en 12-brønns cellekulturplate og indusere disse cellene ved å bruke nøyaktig samme differensieringsinduksjonsprotokoll.
- På slutten av induksjonsprotokollen vasker du forsiktig de genererte IPCene (i plate) 2 ganger med PBS og en gang med LG-KRB.
- Deretter inkuberer du IPCene med 300 μL LG-KRB / brønn i 1 time, og deretter kaster du denne bufferen.
- Deretter inkuberer du IPCene med 300 μL av enten 2 mM (LG) eller 20 mM (HG) KRB-buffer i ytterligere 1 time. På slutten av inkubasjonsperioden samler du supernatanten og oppbevarer ved −80 °C for den påfølgende utskilte insulinanalysen ved hjelp av et kommersielt ELISA-sett og følger produsentens instruksjoner.
MERK: Prøv å være så skånsom som mulig mens du aspirerer eller tilsetter PBS- og KRB-bufferen når du utfører GSIS-analysen.
| Komponent | Konsentrasjon |
| Magnesiumklorid (vannfri) | 0,0468 g/l |
| Kaliumklorid | 0,34 g/l |
| Natriumklorid | 7,00 g/l |
| Natriumfosfat dibasisk (vannfri) | 0,1 g/l |
| Natriumfosfatmonobasisk (vannfri) | 0,18 g/l |
| Natron | 1,26 g/l |
| Kalsiumklorid | 0,2997 g/l |
Tabell 4: Komponentene som brukes til krb-bufferforberedelsene.
8. Statistisk analyse
- Uttrykk alle data som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Alle sammenligninger ble gjort ved hjelp av enveis analyse av varians (ANOVA) og Tukeys post hoc-test ved hjelp av statistisk programvare. Resultater med p-verdier **p ≤ 0,01 og *p ≤ 0,05 ble ansett som statistisk signifikante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolering og karakterisering av ad-MSCer
Som vist i figur 2 viste de isolerte cellene fra fettvev en heterogen populasjon av avrundede og fibroblastlignende celler fra og med neste isoleringsdag (figur 2A). 4 dager etter isolasjon begynte fibroblastcellene å øke i antall og størrelse og vokse som en homogen befolkning ved passasje 1 (figur 2B,C). Disse cellene fortsatte å vokse som plasttilnærte, fibroblastiske celler som vist til passasje 3, og oppfylte det første kriteriet for MSC-egenskaper (figur 2D). Disse AD-MSCene viste svært gode kulturegenskaper, og denne protokollen ble funnet å være en relevant, enkel og relativt rask protokoll for å isolere Ad-MSCer fra epididymale fettputer.
Det neste trinnet var å karakterisere de isolerte Ad-MSCene. Ifølge ISCT bør MSC-er følge de tre kriteriene for plasttilslutning, uttrykk for mesenchymale CD-er med mangel på hematopoietiske markører, og evnen til å skille seg ut i adipocytter, osteocytter og kondrocytter. Som vist i figur 3A viste strømningscytometrianalysen at de fleste av disse cellene uttrykte CD90 og CD105 (henholdsvis 76,4 % og 73,6 %). I mellomtiden var de nesten negative for CD34 (0,1%).
Videre, ved induksjon av differensiering av disse cellene, viste de evnen til å skille seg ut i adipocytter, osteocytter og kondrocytter. Som vist i figur 3B (øvre panel) viste adipocyttene oljerød farging av lipidvakuoler sammenlignet med kontroll av uinduserte celler. Osteocyttene viste karakteristiske Alizarin Rødfarging (figur 3B, midtpanel) sammenlignet med kontrollceller. Til slutt viste kondrocyttinduserte celler blå farging av den ekstracellulære matrisen sammenlignet med kontrollinduserte celler (figur 3B, bunnpanel).
Disse dataene indikerer tydelig at isolerte celler fra fettvev ikke bare viser gode kulturegenskaper, men også viser alle kriteriene som er foreslått for MSCer.
Differensiering av AD-MSCer i insulinproduserende celler (IPCer)
Som vist i figur 4A brukte vi en relativt enkel, kort protokoll for å skille ad-MSCer til IPCer. Etter induksjonen av differensiering ble de induserte IPCene vurdert på flere måter. De induserte cellene viste markerte morfologiske endringer. Som vist i figur 4B (øvre panel) viste de induserte cellene avrundet, klyngelignende morfologi sammenlignet med den normale fibroblastiske morfologien til Ad-MSCer. Interessant, ved farging med dithizone, viste disse klyngene en crimson flekk, som er karakteristisk for sinkgranulat av β-celle flekk (figur 4B, nedre panel).
Etterpå ble de genererte IPCene genetisk vurdert for uttrykket av de spesifikke β-cellemarkørene sammenlignet med de uinduserte kontrollcellene. Som vist i figur 5A-E, var de induserte cellene i stand til å uttrykke ulike spesifikke β-cellemarkører, noe som indikerer deres evne til å generere IPCer. Når det gjelder FOXA2-en definitiv endodermmarkør (som vist i figur 5A)-, ble den sterkt uttrykt ved D3-differensiering sammenlignet med kontroll, og nådde nesten 30 ganger og deretter avtagende til bare 10 ganger kontrollen i de endelige differensierte cellene (D3: 28,37 ± 0,88; Finale: 12.10 ± 1.27; p < 0,05). Når det gjelder Pdx-1 (som regnes som en tidlig markør for β celler), ble den forhøyet i både D3 og endelige differensierte celler, og nådde nesten 20 ganger sammenlignet med kontrollinduserte celler (D3: 22,39 ± 5,14; Finale: 17.13 ± 0.342; p < 0,05; Figur 5B). Når det gjelder de andre β-cellemarkørene, nemlig NKX6.1, MafA og insulin-1 (Ins1), viste de alle høyde fra D3 til endelig differensiering, nå nesten 8 ganger, 12 fold, og 300 fold, henholdsvis sammenlignet med kontroll uinduserte celler (NKX6.1: D3: 1.94 ± 0.86, Final: 7.97 ± 1.34, s<0.05; MafA: D3: 6,59 ± 0,4, Finale: 11,54 ± 2,40, s < 0,05; og Ins1: D3: 27.29 ± 20.27, Final: 318.20 ± 76.09, p < 0.05) (Figur 5C-E). Dette indikerer at disse ad-MSCene kan skille seg ut i IPCer som uttrykker β-cellemarkører.
Til slutt ble disse cellene vurdert for sekresjon av insulin når de ble utfordret med økende konsentrasjoner av glukose. Som vist i figur 5F, insulin utskilt i supernatant av induserte IPCer når utfordret med 20 mM glukose var betydelig høyere enn det utskilt da cellene ble utfordret med 2 mM glukose (HG: 390 pg / ml ± 33 pg / ml; LG: 234 pg / ml ± 32 pg / ml, p < 0,05; Figur 5F)
Disse dataene bekreftet at den brukte protokollen klarte å skille ad-MSCene til IPCer, som ble genetisk og funksjonelt bekreftet.
Figur 1: En skjematisk presentasjon av trinnene i protokollen som brukes til isolering og karakterisering av ad-MSCer. Generert av Biorender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fotomikrografer som viser de isolerte Ad-MSCene. (A) Isolerte celler som viser plast-tilhenger, fibroblastlignende morfologi begynner å dukke opp dagen etter isolasjon. (B) Over tid sprer disse tilhenger ad-MSCene (med fibroblastlignende morfologi) seg og øker i antall, og når en mer homogen fibroblastlignende befolkning i (C) P1 og (D) P3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av ad-MSCer (A) Flow-cytometrisk analyse av ad-MSCer viser at disse cellene er nesten negative for CD34 (øvre panel), mens de fleste cellene uttrykker CD90 og CD105 (nedre panel). Ad-MSCer kan skille seg ut i de tre mesenchymale avstamningene, nemlig (B) adipocytter (hvor oljedråper er farget av oljerøde), (C) osteocytter, farget av alizarinrøde og (D) kondrocytter, farget av Alcian Blue (sammenlignet med kontroll av uinduserte celler). Kontroll: uinduserte celler, Diff: differensierte celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Differensiering av ad-MSCer i IPCer. (A) Skjematisk presentasjon av differensieringsprotokollen som brukes til å generere IPCer fra AD-MSCer, sammen med fotomikrografer for cellene i hvert trinn under induksjon av differensiering mot IPCer. Ved differensiering mister celler sin fibroblastiske morfologi og har en tendens til å aggregere formingsklynger, som har en tendens til å løsne og vokse i suspensjonsmedier. (B) Fotomikrografer viser kontroll Ad-MSCer og IPCer generert av protokollen ovenfor som viser runde klyngemorfologiske endringer (høyre panel) sammenlignet med den fibroblasterlignende morfologien til de ikke-induserte Ad-MSCene (venstre panel), enten unstained (øvre panel) eller DTZ farget (nedre panel).
Kontroll: ikke-induserte celler; IPCer: insulinproduserende celler; NA: nikotinamid; β-ME: beta mercaptoetanol; D3: Induserte celler på dag 3 under induksjon av differensiering mot IPCer; D10: endelige differensierte IPCer på slutten av induksjonsprotokollen; Ex-4: exendin-4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Relative uttrykksnivåer for β-cellemarkører og GSIS for IPCer. Relative uttrykksnivåer av qRT-PCR for (A) FOXA2, (B) Pdx-1, (C) NKX6.1, (D) MafA og (E) Ins-1. (F) Nivåer av utskilt insulin i supernatanten ved å utfordre de genererte IPCene med 2mM glukose (LG) eller 20mM glukose (HG). Kontroll: uinduserte AD-MSCer, Dag-3: differensierte celler samlet ved D3; Endelig: endelige differensierte IPCer; LG: lav glukose; HG: høy glukose. a: middelverdi er forskjellig fra kontroll ved p < 0,05; b: gjennomsnittet er forskjellig fra dag-3 ved p < 0,05; *: gjennomsnittet av LG er forskjellig fra HG ved p < 0,05; sammenligningen ble gjort ved hjelp av en uavhengig prøve t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen klarte vi å presentere en detaljert protokoll for isolering av Ad-MSCer fra rotte epididymalt fett og differensiering av disse Ad-MSCene i IPCer. Faktisk er rotte epidydimalt fett en lett oppnåelig kilde til fettvev for å skaffe Ad-MSC og krever ikke noe spesialutstyr, verken for innsamling eller for behandling av 15,26,27. De isolerte ad-MSCene viste utmerket kulturutvidelse og viste alle kriteriene som skal defineres som MSCer. Den brukte protokollen ble tidligere beskrevet med små modifikasjoner15. Denne protokollen har vist seg å være effektiv og reproduserbar. Cellene viste fibroblastisk-lignende morfologi fra dag 1 etter isolasjon og fortsatte å ekspandere til de nådde en homogen befolkning. Interessant nok brukte vi den samme protokollen for å isolere menneskelige Ad-MSCer fra lipo-aspirat med sammenlignbar suksess med rottevev (data ikke vist). Den eneste begrensningen i denne prosessen er den kjemiske fordøyelsen ved hjelp av kollagenalisse når den settes fra side til side med mekanisk fordøyelse i andre protokoller28. Dette trinnet representerer også et kritisk tiltak, da den kjemiske fordøyelsen av cellene kan påvirke deres levedyktighet29,30 negativt. Ellers gir denne protokollen en god start for enhver forsker som vil vurdere å lansere en Ad-MSC-forskningslinje i laboratoriet.
Bruken av MSC i behandlingen av diabetes har åpnet nye veier og gitt nye håp om behandling av diabetes. Imidlertid er genereringen av fullt modne IPCer fra MSC fortsatt et spørsmål om debatt og utfordring31. For tiden er det flere protokoller for å indusere differensiering av MSCer mot IPCer i litteraturen. Disse protokollene bruker en mengde kjemiske forbindelser og vekstfaktorer i ulike tidsperioderpå 20,32,33. Disse faktorene avhenger hovedsakelig av MSC-typen og kilden til å begynne med34,35. Likevel er det fortsatt snakk om debatt og forskning på feltet20 om å skaffe modne funksjonelle IPCer fra MSP-er.
I den presenterte protokollen tilbyr vi en kort, relativt enkel og effektiv måte å få funksjonelle IPCer fra Ad-MSCer. De resulterende cellene viste markerte morfologiske endringer med positiv DTZ-farging, uttrykte det meste av β-cellemarkører, og viste økt insulinsekresjon som svar på økt glukosekonsentrasjonsutfordring. Alt dette beviset bekrefter effektiviteten til denne protokollen som en β-celle induksjonsprotokoll fra Ad-MSCer. Vi brukte denne protokollen i en annen type MSCer, nemlig humane Whartons gelé-MSCer (WJ-MSCer), avledet fra navlestrengen, og den viste faktisk lignende resultater21,36. Disse resultatene garanterer å prøve vår protokoll på andre typer og kilder til MSCer, noe som gjør prosedyren til en universell protokoll for generering av IPCer fra MSCer. Det er bemerkelsesverdig å markere viktigheten av å indusere cellene ved tidlige passasjer, vanligvis mellom P3-P5, da sene passasjer påvirker cellenes egenskaper og differensieringsevner17,24 negativt.
Som nevnt tidligere, er det et spørsmål om debatt og langt fra fullstendig belysning å oppnå fullt modne β-celler fra MSP-er. Imidlertid gir slike protokoller som de som er beskrevet her en enkel, rask måte å bedre forstå de underliggende mekanismene for differensiering av Ad-MSCer, eller til og med andre typer MSCer, i IPCer. Evnen til de tilsatte forbindelsene for induksjon av Ad-MSC-ene til å uttrykke spesifikke β-cellemarkører gir et nyttig verktøy for å studere de genetiske og epigenetiske faktorene som styrer differensiering av MSCer i IPCer. I tillegg tillater den raske, enkle protokollen forskere å studere andre iboende faktorer som kan forbedre utfallet av slik differensiering. Disse faktorene kan representere enten en adjuvant terapi med stamceller eller til og med kan gi en terapeutisk modalitet for diabetes. I laboratoriet vårt brukte vi en lignende tilnærming for å bevise at obestatin, et tarmhormon, kan være en ny potensiell faktor for generering av IPCer fra WJ-MSCs37.
Det er også verdt å nevne at den nåværende protokollen har to hovedbegrensninger. Først, som nevnt tidligere, brukte vi kjemisk fordøyelse av kollagenalisse, noe som kan påvirke levedyktigheten til cellene29,30 negativt. For det andre brukte vi differensieringsprosessen in vitro og undersøkte ikke forventet ytterligere modning og differensieringsforbedring av de genererte IPCene in vivo. Det er viktig å påpeke at transplantasjonen av in vitro-differensierte MSCer i IPCer viste en dyp induksjon av uttrykket av ulike β-cellers markører. Denne økningen nådde ca 100 ganger 12-18 måneder etter transplantasjon in vivo38. Dermed vil fremtidige studier for å undersøke in vivo modning av genererte IPCer ved denne enkle protokollen være av god verdi.
Til slutt ga vi en detaljert protokoll for isolering og karakterisering av AD-MSCer, etterfulgt av en relativt enkel, rask og effektiv protokoll for generering av IPCer fra Ad-MSCer. Disse protokollene gir ikke bare et effektivt verktøy for å starte en stamcelleterapilinje av forskning, men kan også bidra til å utvikle det stadig voksende feltet MSC-celleterapi for diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle medforfatterne erklærer ingen interessekonflikt knyttet til dette arbeidet.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, veterinærspesialist, Farmasøytisk fakultet, Det britiske universitetet i Egypt (BUE) for å hjelpe til med disseksjonen av rottene.
Vi ønsker også å anerkjenne og sette pris på innsatsen fra Fakultet for massekommunikasjon, Det britiske universitetet i Egypt (BUE) for produksjon og redigering av videoen av dette manuskriptet.
Vi vil takke Miss Fatma Masoud, MSc, assisterende foreleser i engelsk, The British University in Egypt (BUE) for revisjon og engelskspråklig korrekturlesing av manuskriptet.
Dette arbeidet ble delvis finansiert av Center for Drug Research and Development (CDRD), Det farmasøytiske fakultet, Det britiske universitetet i Egypt (BUE), Kairo, Egypt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM - High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM - Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
References
- Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
- Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. Haider, K. H. , Springer. Singapore. 1-28 (2022).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
- Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
- Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
- Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
- Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
- Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
- Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
- Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton's jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
- Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
- Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
- Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
- Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
- Krishnamurthy, H., Cram, L. S.
- Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
- Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
- Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
- Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
- Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
- Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
- El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
- El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
- Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).
