Summary
이 기사에서는 SARS-CoV-2 감염 또는 백신 접종에 대한 면역 반응으로 인해 발생하는 두 개의 면역글로불린 이소형(IgA, IgM 또는 IgG)에 대한 항체 역가의 동적 변화를 동시에 모니터링하는 편리한 방법을 설명합니다. 이 '다중 분석 물질 Covid-19 면역 반응 패널'은 '이중 채널'기능을 갖춘 흐름 기반 멀티플렉스 리더를 사용하여 판독되는 코딩된 미소 구체를 기반으로 구축된 세 가지 간접 면역 분석법을 사용합니다.
Abstract
여러 바이오마커를 공동으로 조사하기위한 멀티플렉스 기술은 수십 년 동안 존재 해 왔습니다. 그러나, 동일한 분석물 상의 다중 에피토프를 평가하는 방법은 제한적이다. 이 보고서는 SARS-CoV-2 감염 또는 백신접종에 대한 면역 반응과 관련된 일반적인 면역글로불린 이소형(예를 들어, IgA, IgM 및 IgG)의 혈청학적 시험을 위한 다중화 면역비드 분석의 개발 및 최적화를 기술한다. 분석은 이중 채널 기능을 갖춘 흐름 기반의 멀티플렉스 형광 판독기를 사용하여 수행되었습니다. 최적화는 분석물 포획 시간, 검출 항체 농도 및 검출 항체 배양 시간에 중점을 두었습니다. 분석 분석 성능 특성(예를 들어, 분석 범위(정량의 하한 및 상한 포함) 및 인트라 및 인터 어세이 정밀도)이 '이중 채널' 모드를 사용하여 IgG/IgM 또는 IgA/IgM 혈청형 조합에 대해 동시에 확립되었다. IgG의 경우 30분, IgM의 경우 60분, IgA의 경우 120분의 분석물 포획 시간이 대부분의 응용 분야에 적합하여 분석 성능과 처리량의 균형을 제공했습니다. 30분 동안 4 μg/mL에서 최적의 검출 항체 인큐베이션이 관찰되었으며, 관찰된 민감도 값을 고려할 때 전반적으로 우수한 정밀도(분산계수(%CV) ≤ 20%)를 고려하여 일반적인 용도에 권장됩니다. IgG 이소형에 대한 동적 범위는 각 검정 (스파이크 S1, 뉴클레오캡시드 및 막 당단백질)에 대해 수 배의 크기에 걸쳐 있었으며, 이는 임상 적용을 위한 1:500 희석 인자에서 강력한 역가 평가를 지원한다. 마지막으로, 최적화된 프로토콜은 SARS-CoV-2 백신 요법을 완료한 피험자(n=4)에 대한 스파이크 S1 혈청 전환을 모니터링하는데 적용되었다. 이 코호트 내에서, 스파이크 S1 IgG 수준은 IgM 또는 IgA 이소형보다 훨씬 더 높은 (~40배) 신호 강도에서 두 번째 투여 후 14일에 최대 역가에 도달하는 것으로 관찰되었다. 흥미롭게도, 우리는 매우 가변적인 스파이크 S1 IgG 역가 붕괴 속도를 관찰하였고 이는 주로 피험자-의존적이었으며 이는 향후 연구의 주제가 될 것이다.
Introduction
생물학적 샘플에서 여러 질병 관련 바이오마커를 동시에 측정하면 병리학 적 과정에 대한 설명 및 예측 통찰력을 얻을 수 있습니다. 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISAs)과 같은 기존의 단일 분석 물질 면역 학적 절차는 임상 및 연구 설정 모두에서 정량 분석의 초석이 되었지만, 이러한 기술은 처리량, 각 측정에 필요한 표본의 양 및 질병 과정1 전반에 걸쳐 자주 얽혀있는 여러 생물학적 요소에 대한 연구를 크게 제한하는 비용 효율성과 관련하여 상당한 한계를 가질 수 있습니다. . 마이크로스피어 기반 멀티플렉싱 기술은 실험실 처리량을 향상시키고, 샘플 부족을 완화하고, 반복적 인 테스트를 줄여 비용 절감을 극대화하기 위해 분석을 결합 할 수있는 능력을 갖춘 진단 및 연구 시설 모두에 없어서는 안될 플랫폼이되었습니다 1,2,3,4. 최근에는 이중 리포터 기능을 갖춘 장비로 이러한 멀티플렉싱 파워의 추가 증강이 도입되었습니다. 이중 리포터 기능은 검출을 위해 두 개의 형광 채널을 구현하여 멀티플렉싱의 또 다른 차원을 제공하여 동일한 분석물에서 여러 에피토프를 검출할 수 있도록 합니다.
중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2)는 현재 코로나 바이러스 질병 2019 (COVID-19) 전염병5를 담당하는 병원체입니다. RT-PCR 검사는 질병 과정의 시작에서 감염 확인에 중요하지만, 항체 역가에 대한 혈청 학적 검사는 이전의 노출 또는 회복에 관한 개인의 정확하고 완전한 비판에 필수적임이 입증되었습니다. 예방 접종에 대한 반응; 및/또는 Covid-19 백신 접종 효능 평가 6,7.
이 보고서는 흐름 기반의 멀티플렉스 리더 이중 보고 시스템을 활용하는 여러 SARS-CoV-2 바이러스 항원에 대한 혈청 전환을 측정하는 방법을 설명합니다. 구체적으로, 스파이크 S1, 뉴클레오캡시드 및 멤브레인 (일명 매트릭스) 당단백질에 대한 분석을 포함하는 3-플렉스 SARS-CoV-2 항원 패널에 대한 2개의 항체 서브타입 (IgG/IgM 또는 IgA/IgM으로 구성됨)의 동시 검출이 기술된다. 이 접근법은 종단 혈청 전환의 포착을위한 이상적인 기업을 제공하고 Covid-19 전염병에 대한 무기고에 귀중한 도구를 제공합니다.
Protocol
모든 피험자는 ORA 프로토콜 20101207에 따라 러쉬 대학 의료 센터의 IRB (Institutional Review Board) 승인과 함께 서면 정보에 입각 한 동의하에 등록되었으며 윤리적 연구 수행에 대한 모든 제도적 지침이 관찰되었습니다. 혈액은 통상적인 정맥절제술을 통해 라벤더 진공 청소기 (K2EDTA)로 수집되고 권장 프로토콜로 처리되었습니다. 생성된 혈장은 평가가 수행될 때까지 -80°C에서 보관되었다.
1. 항원 컨쥬게이션된 마이크로스피어의 제조
- 고유 한 비드 영역을 가진 자기 미소 구체의 세 가지 다른 바이알을 선택하여 사용 된 각 바이알에 대한 비드 ID 및 로트 정보를 기록하십시오.
참고: 각 별개의 마이크로스피어 영역에 대해 다음 단계를 따릅니다. 미소 구체는 빛에 민감하며 빛에 장기간 노출되지 않도록 보호해야합니다. 세척 단계 동안, 미소 구체들을 방해하지 않도록 주의하라. 방해를 받으면 두 번째 60 초 분리를 허용하십시오. - 마이크로스피어 스톡을 60초 동안 소용돌이치고, 응집된 비드를 해리시키기 위해 사용하기 전에 5분 동안 초음파 처리한다.
- 1.0 x 106 비드를 1.5 mL 저단백질 결합 마이크로원심분리 튜브에 옮깁니다.
- 튜브를 자기 분리기에 삽입하고 60 초 동안 분리가 이루어지도록하십시오. 튜브를 자기 분리기에 가만히 두고, 비드 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.
- 자기 분리기에서 튜브를 분리하고, 비드를 100μL의 HPLC 등급 물로 재현탁시키고, 30초 동안 와류시킨다. 튜브를 다시 자기 분리기에 60초 동안 넣고, 이어서 상청액을 제거한다. 이 세척 프로토콜을 두 번 반복하십시오.
- 자기 분리기로부터 튜브를 제거하고, 세척된 미소 구체를 90 μL의 100 mM 일염기성 인산나트륨, pH 6.2 (활성화 완충액)에 30초 동안 와류시켜 재현탁시켰다.
- 10 μL의 50 mg/mL Sulfo-NHS (활성화 완충액으로 희석)를 미소 구체에 첨가하고 10 초 동안 부드럽게 와동하십시오. 50mg/mL EDC 용액 10μL(활성화 버퍼로 희석)를 넣고 10초 동안 부드럽게 와류합니다. 실온에서 20분 동안 미소 구체들을 인큐베이션(RT)하고 매 10분마다 완만한 와류를 가한다.
- LC/MS 등급 물 대신 50 mM MES, pH 5.0 (커플링 버퍼)로 세척 단계 1.4-1.5를 반복하여 총 두 번의 세척을 실시하십시오.
- 자기 분리기로부터 튜브를 제거하고 비드를 100 μL의 커플링 버퍼로 재현탁시키고 30 초 동안 와류시킨 다음 즉시 원하는 양의 단백질을 첨가한다.
- 커플링 버퍼를 사용하여 총 부피를 150 μL로 가져옵니다. 혼합 커플링 반응을 30초 동안 와류에 의해 혼합하고, RT에서 회전에 의해 2시간 동안 인큐베이션한다.
참고: 본원에 정의된 검정을 위해, 컨쥬게이션은 다음의 단백질 농도로 수행되었다: 스파이크 S1: 5 μg; 뉴클레오캡시드: 5 μg; 멤브레인: 12.5 μg. - LC/MS 등급 물 대신 인산완충식염수(PBS)-1% 염소혈청알부민, 0.01% 폴리소르베이트-20(담금질 완충액)으로 세척 단계 1.4를 반복하여 총 2회 세척한다. 세척된 미소 구체를 30초 동안 와류에 의해 0.05% 나트륨 아지드를 함유하는 100 μL의 퀀치 완충액에 재현탁시킨다.
참고: 다른 절차를 진행하기 전에 비드가 적어도 6시간 동안 완전히 담금질되도록 허용하십시오. - 자동화된 세포 계수기 또는 혈구측정기를 사용하여 회수된 미소 구체의 수를 계수하십시오. 관찰된 비드 농도를 기록한다.
- 결합된 미소 구체들을 어둠 속에서 4°C에서 냉장 보관한다.
2. 절차
- 분석 성능 (기본 프로토콜)
- 결합 된 미소 구체를 30 초 동안 와류로 재현탁시키고 ~ 60-90 초 동안 초음파 처리하십시오.
- 각 튜브로부터 각 비드 콜로이드의 필요한 양을 제거하고 비드 콜로이드를 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 결합시킨다.
- 튜브를 자기 분리기에 넣고 60 초 동안 분리가 이루어지도록하십시오. 튜브를 자기 분리기에 가만히 두고, 비드 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.
- 세퍼레이터로부터 비드를 제거하고, 비드를 100 μL의 PBS-1% 소 혈청 알부민, 0.01% 폴리소르베이트-20 (어세이 버퍼) 및 30 초 동안 와류로 재현탁시켰다. 튜브를 자기 분리기에 넣고 60 초 동안 분리가 이루어지도록하십시오. 이 세척 프로토콜 (즉, 2.1.3-2.1.4 단계)을 두 번 반복하십시오.
- 적절한 부피의 어세이 버퍼를 첨가하여 3-플렉스 작동 미소 구체 혼합물의 농도를 조정하여 각 표적에 대해 1 μL 당 100 미소 구체의 최종 농도를 생성한다.
- 단계 2.1.5에서 제조된 미소 구체 혼합물 12.5 μL를 분취량하여 384-웰 플레이트의 각 웰 또는 25 μL의 각 웰에 넣고 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣는다.
- 혈장/혈청 표본을 분석 버퍼에 500배 희석합니다. 원하는 적정에 따라 표준 표본을 준비하십시오.
- 빈 샘플로서 12.5 μL의 Assay Buffer를 첨가하고, 희석된 시편 또는 표준물을 384-웰 시편 플레이트의 각 지정된 웰 또는 25 μL의 블랭크, 희석된 시편 또는 표준의 각 웰에 96-웰 시편 플레이트의 각 웰에 첨가한다.
- 플레이트를 알루미늄 씰 또는 호일로 덮고 700rpm으로 설정된 플레이트 진탕기 상에서 RT에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
참고: 희석 곡선에 대한 개략도는 표 1에 제공된다. - 단계 2.1.11에 명시된 대로 분석 버퍼를 사용하여 4 μg/mL의 항인간 검출 항체(이차 항체 용액) 용액을 준비합니다.
- 슈퍼 브라이트 436 (SB) / 염소 - 항 인간 IgA, 피코 에리트린 (PE) 컨쥬게이트 검출 항체와 접합 된 염소 - 항 인간 IgM을 4 μg / mL에서 준비하십시오. 또는 염소-항-인간 IgM, SB 컨쥬게이트/염소-항-인간 IgG, PE 컨쥬게이트는 4 μg/mL에서 항체를 검출한다.
참고: 384-웰 플레이트 포맷의 경우, 준비된 이차 항체 용액의 12.5 μL/웰이 요구되며, 96-웰 플레이트 포맷의 경우, 25 μL/웰이 요구된다. - 플레이트를 자기 분리기에 놓고 빠르게 씻은 다음 생물 위험 용기 위로 강제로 뒤집어 웰에서 액체를 제거하십시오. 접시가 여전히 거꾸로 된 상태에서 두꺼운 종이 덩어리에 대해 접시를 강제로 누릅니다.
- 각 웰을 100 μL의 어세이 버퍼로 세척하고, 앞서 기술한 바와 같이 생물학적 위험 용기 위에 강제 역전시켜 액체를 제거하였다. 이 단계(2.1.12-2.1.13)를 반복하여 총 두 번 세척합니다. 사용 된 모든 종이 덩어리를 생물 위험 용기에 버리십시오.
- 12.5 μL의 이차 항체 작동 용액을 384-웰 플레이트의 각 웰 또는 25 μL의 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 알루미늄 씰 또는 호일로 덮고 700 rpm으로 설정된 플레이트 진탕기 상에서 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 세척 단계 2.1.12-2.1.13 반복
- 75μL의 어세이 버퍼를 384-웰 플레이트의 각 웰에 넣거나 100 μL를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 알루미늄 씰 또는 호일로 덮고 700 rpm으로 설정된 플레이트 진탕기 상에서 RT에서 5분 동안 인큐베이션한다.
- 시스템 설명서에 따라 계측기 분석기를 통해 60μL를 분석합니다.
- 시편 포획 배양 시간 최적화
- 단계 2.1.9에서 30분, 60분, 및 120분의 인큐베이션 시간의 지속기간을 사용하여 섹션 2.1의 단계를 수행한다.
참고: 인큐베이션은 별개의 플레이트를 사용하거나 단계 2.1.9로 진행될 때까지 단계 2.1.6에서 일시 중지하여 수행될 수 있습니다. 원하는 배양 시간을 달성한다. - 제조자의 권고에 따라 60 μL의 분석 혼합물을 사용하여 분석기 상에서 플레이트 판독을 진행한다.
- 단계 2.1.9에서 30분, 60분, 및 120분의 인큐베이션 시간의 지속기간을 사용하여 섹션 2.1의 단계를 수행한다.
- 이차 항체 농도의 최적화
- 섹션 2.1에 상술된 바와 같이, 다음과 같이 변형된 2차 항체 작동액 (단계 2.1.10-2.1.11에서 제조됨) 중의 시약의 최종 농도를 제외하고, 이 절차를 수행한다:
염소-항-인간 (또는 토끼) IgM, SB-접합체 검출 항체를 8, 4, 2, 1 및 0.5 μg/mL에서 수득하였다.
염소-항-인간 (또는 토끼) IgA, 8, 4, 2, 1 및 0.5 μg/mL에서 PE-접합체 검출 항체.
염소-항-인간 (또는 토끼) IgG, 8, 4, 2, 1 및 0.5 μg/mL에서 PE-접합체 검출 항체.
염소-항-인간 (또는 토끼) IgG, PE-접합체/염소-항-인간 (또는 토끼) IgM, 8, 4, 2, 1 및 0.5 μg/mL의 SB-접합체 검출 항체.
염소-항-인간 (또는 토끼) IgA, PE-접합체/염소-항-인간 (또는 토끼) IgM, 8, 4, 2, 1 및 0.5 μg/mL의 SB-접합체 검출 항체. - 제조자의 권고에 따라 60 μL의 분석 혼합물을 사용하여 분석기 상에서 플레이트 판독을 진행한다.
- 섹션 2.1에 상술된 바와 같이, 다음과 같이 변형된 2차 항체 작동액 (단계 2.1.10-2.1.11에서 제조됨) 중의 시약의 최종 농도를 제외하고, 이 절차를 수행한다:
- 이차 항체 배양 시간의 최적화
- 단계 2.1.14에서 정의된 인큐베이션 지속 시간의 15분, 30분, 60분 및 120분으로 섹션 2.1에 설명된 대로 이 절차를 수행하십시오.
- 제조자의 권고에 따라 60 μL의 분석 혼합물을 사용하여 분석기 상에서 플레이트 판독을 진행한다.
- 최적화된 이중 채널 분석을 통한 피험체 표본 평가
- Covid-19 백신의 완료일에 대하여 대상체 혈장 샘플 (n=4)을 수집한다 -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90, 및 +120 (즉, 2차 용량) 투여.
참고: 0일차는 백신 접종이 완료된 시점을 나타냅니다. - 기본 프로토콜(섹션 2.1)을 사용하여 IgG/IgM 또는 IgA/IgM 이중 채널 분석으로 모든 분석을 수행합니다.
- 각각의 특이적 면역글로불린 및 검정에 대해 관찰된 최대 중간 형광 강도(MFI) 값으로 결과를 정규화한다.
- Covid-19 백신의 완료일에 대하여 대상체 혈장 샘플 (n=4)을 수집한다 -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90, 및 +120 (즉, 2차 용량) 투여.
Representative Results
일반적인 분석 결과 및 성능 평가
면역비드 분석은 일반적으로 도 1에 제시된 각각의 패널에 예시된 바와 같이, 여러 (로그) 크기의 순서에 걸쳐 평가될 때 시그모이드 곡선을 제공한다. 사용자는 멀티플렉스의 각 분석물에 대한 최적 농도 범위를 실험적으로 정의하여 전체 정량 범위를 결정하고, 극단(정량 하한[LLOQ] 또는 정량 상한[ULOQ]에 근접하는 영역)을 과도하게 샘플링하지 않도록 해야 합니다. 그러나 분석에 필요한 실제 범위는 주어진 희석 인자에서 생물학적 매트릭스 (즉, '미지수')에서 표적 분석물의 분포에 의해 결정됩니다. 또한, 표준 곡선이 일반적으로 4- 또는 5-파라메트릭 적합 알고리즘을 사용한 선형 회귀를 통해 해석되지만, 주어진 곡선의 선형 부분은 일반적으로 정량의 선형 (y = mx + b) 모델을 사용하여 정량적 정확도에 대한 가장 큰 신뢰를 제공합니다. 주어진 희석 인자에서 알려지지 않은 것에 대한 관찰된 값에 대한 보정 곡선을 일치시키는 것이 정량적 분석 개발의 목표가 되어야 한다.
이와 관련하여, 1:5 연속 희석 계열에 기초한 7-포인트 표준 곡선을 스파이크 S1, 뉴클레오캡시드 및 멤브레인 항체의 경우 각각 1 μg/mL 내지 0.000064 μg/mL 사이, 멤브레인의 경우 5 μg/mL 및 0.00032 μg/mL 사이의 범위인 멤브레인 항체에 대해 평가하였다(도 1에 도시된 바와 같이). 각 분석에 대한 검출의 하한(LLOD)은 그 배경과 구별할 수 있는 신호를 산출하는 가장 낮은 분석물 농도로 정의되었다. LLOD는 앞서 설명한 수학식8,9, LLOD = LoB + 1.645(SD저농도 샘플)에 의해 식별될 수 있다. LoB는 블랭크의 하한이며, 0 값이 예상될 때 블랭크로부터 생성되는 분석물의 "명백한" 농도이며, 이 방정식 LoB = 평균블랭크 + 1.645(SD블랭크)8을 사용하여 확인할 수 있습니다. 이 방법을 기반으로 스파이크 S1 분석의 MFI 값은 134.38 ~ 20191.2 범위였으며 134.38 MFI는 0.00024 μg/mL를 나타내며 LLOD로 정의됩니다. 멤브레인 분석의 경우, 실제 MFI 범위는 52.24 ~ 4764.9였으며, 52.24 MFI는 0.004885 μg/mL로 계산되어 LLOD로 할당되었습니다. 뉴클레오캡시드 분석의 MFI 범위는 517.9 내지 19666.34였으며, 517.9는 LLOD인 0.00024 μg/mL로 규정되었다. 검출의 상한(ULOD)은 MFI의 변화가 더 이상 선형이 아니며 신호 응답이 포화된 후 분석물의 농도로 정의됩니다. 이 곡선의 완전한 시그모이드 특성은 Nucleocapsid 곡선을 제외하고 테스트 된 표준에 대해 관찰 할 수 없다는 점에 유의해야합니다. 그러나, 현재까지 분석된 모든 미지의 것에 대해 관찰된 MFI 값(1:500 희석시)이 주어진 경우, 각 분석물에 대해 제시된 곡선 범위 내에 있으며, 선형 회귀를 통해 4- 또는 5-파라메트릭 핏을 사용하여 쉽게 정량화된다.
분석 정밀도
인트라-어세이 정밀도: 분석의 네 번의 반복실험은 %CV로 계산되거나, 표준 편차의 몫과 평균을 100을 곱한 분석 정밀도를 평가하기 위해 동일한 플레이트에서 수행되었다. 표준 포인트 2 및 5는 이러한 표 2에 카탈로그된 값과 함께 이러한 표에 대해 선택되었습니다. %CV 값에 대한 전형적인 허용 가능한 상한값 임계값은 ≤20%이며, 이는 멤브레인 IgG의 표준 2에 대한 것을 제외하고는, 이들 데이터에 대해 관찰되었으며, 이는 배경 수준에서 비롯될 가능성이 있고 외딴 값(데이터는 나타내지 않음)을 제거함으로써 정류될 수 있다. 판독 값에 대한 명백한 불안정성이 MFI 값이 <200인 막 분석에 대해 관찰되었으며, IgA 및 IgM 이소형의 경우 가장 흔하다는 점에 유의해야 한다.
인터-어세이 정밀도: 비드 세트의 세 개의 별개의 배치를 각 어세이에 대해 제조하고, 인트라-어세이 정밀도에 대해 정의된 바와 같이 테스트하였다(위 및 도 1에서 볼 수 있음). 인터-어세이 가변성은 표 3에 나타낸 바와 같이 3개의 배치들 각각에 대한 평균 결과로부터 %CV를 계산함으로써 평가되었다. 다시, 허용가능한 %CV에 대한 상한 임계값은 시험된 모든 조건에 대해 존재하는 ≤20%로 설정된다(위에서 살펴본 바와 같이 멤브레인 IgG의 표준 2와 유사한 효과로). 순 MFI 값의 배치-배치 간 가변성은 커스텀 어세이 개발 동안 동일한 면역시약의 다중 배치 내에서 일반적으로 관찰된다는 점에 유의해야 한다. 상업적으로 수득된 항-표적 항체 (예를 들어, 토끼 항-스파이크 S1)로부터 건립된 보정 곡선의 사용은 항-종 검출 항체에 이어서 분석 결과에 일관성을 제공할 수 있고, 상이한 기간에 다수의 배치들 사이의 비교를 허용할 수 있다.
인간 샘플과의 인터-어세이 정밀도: SARS-CoV-2 감염에 대한 최초 보고된 증상의 한 달 이내에 수집된 인간 혈장 샘플(n=5)로 인간 분석 정밀도의 평가를 반복하였다; 분석의 세 개의 별개의 배치(즉, 비드 세트의 상이한 제제)로 달성된다. 이러한 결과는 표 4에 묘사되어 있으며 ≤20%의 전형적인 상한값을 갖는 %CV 값을 갖는 정밀도를 입증한다. 스파이크 S1, 뉴클레오캡시드 및 막 IgG 역가에 대한 평균 %CV 값은 각각 9.9%(범위 2.6%-18%), 11.0%(범위 3.5%-24.4%), 및 7.6%(범위 3.2%-12.9%)로 계산되었다. 이 세 분석물의 IgM 및 IgA 역가와 유사한 관찰이 이루어졌으며, 모두 %CV 값 <20%를 제공하였다. 이에 대한 유일한 예외는 막 단백질에 대한 피험자 5 IgM 역가였으며, 이는 후속적으로 특이치로서 배제되었다. 인간 피험자 평가에 대한 정밀도 값은 토끼 항체에 대해 위에서 본 것과 일치하며, 이는 이들 검정이 검정 정밀도에 거의 영향을 미치지 않는 다수의 종에서 항원의 역가를 평가하도록 쉽게 재구성될 수 있음을 시사한다. 상기 언급된 바와 같이, MFI 값이 <200인 멤브레인 분석법에 대해 관찰된 판독 값에 대한 명백한 불안정성이 존재하였고, IgA 및 IgM 이소형의 경우에 가장 흔하게 나타났다.
일차 항체 농도 최적화
분석물 '포획 시간'을 항원 컨쥬게이션된 비드로 평가하고, 혈장 검체 또는 표준물질 내의 항체를 1차 인큐베이션의 길이를 변형시킴으로써 시험하였다(30분, 1h, 2h, 및 4h). 평균 MFI의 차이는 특정 인큐베이션 및 최대 인큐베이션 시간의 몫으로서 제시되며, 도 2에서는 30분 인큐베이션 (최소 지속기간)과 4 h 인큐베이션 (최대 지속) 사이의 % Max라고 한다. 120분에서의 값은 스파이크 S1, 멤브레인 및 뉴클레오캡시드 항체에 대한 IgG 역가에 대해 최적이었으며, 이는 빠른 1차 항체 결합 동역학을 나타내며, 분석 처리량을 증가시키는 유연성을 허용한다. 그러나, IgA 및 IgM (데이터는 나타내지 않음) 이소형에 대해 더 느린 동역학이 관찰되었고, 도 2에 도시된 바와 같이 4 h 시점에서의 피크 포획 수준을 입증하였다. 전반적으로, 접근 분석 포화도와 생산 중일 때 각 분석을 실행하기위한 실용적인 시간 편익 (처리량을 최대화하기 위해) 사이에는 균형이 있습니다. 이를 통해, 이들 발견에서 IgG의 경우 30분, IgM의 경우 60분, IgA의 경우 120분의 최소 배양 시간에서 정량적 목적에 적합한 신호가 관찰되었다.
이차 항체 농도 최적화
5 농도의 2차 항체(염소 항-인간 IgG, PE-접합; 염소 항-인간 IgA, PE-접합; 염소 항-인간 IgM, SB-접합됨)를 시험하였다(0.5, 1, 2, 4, 및 8 μg/mL). 모든 항체는 어떤 조건에서도 명백한 신호 포화도 없이 광범위한 신호를 밝혀냈으며, 따라서 임의의 농도에 대한 선형 측정을 보장하였다. 예를 들어, 0.5 μg/mL에서 SB 컨쥬게이션된 염소 항인간 IgM을 사용한 스파이크 S1 분석에서 생성된 평균 신호는 최대 신호(8 μg/mL)에서 생성된 MFI의 13.2%인 반면, 4 μg/mL에서 생성된 MFI는 최대 신호에서 나타나는 MFI의 73.3%였다. 다른 Spike S1 항체 이소형, 막 항체, 및 뉴클레오캡시드 항체로부터의 신호 범위에 대한 세부사항은 표 5 및 도 3에 포함된다. 실용적인 점으로, 최적의 이차 항체 농도와 이전에 언급 된 4 μg / mL 이차 항체 농도 사이의 주요 영향은 분석 감도 및 분석 비용 측면에서 반영됩니다. 즉, 8 μg/mL 이차 항체 농도는 낮은 항체 역가 또는 낮은 양의 귀중한 샘플로 적용하는데 바람직할 수 있지만, 이들 분석과 관련된 비용은 이전에 정의된 4 μg/mL 농도의 사용보다 상당히 높을 것이다. 반대로, 높은 항체 역가가 관찰되는 경우 (예 : Covid-19 예방 접종을 경험 한 개인 또는 비제한적인 양의 혈청)는 더 적은 양의 이차 항체 (예 : 1 μg / mL)의 적용을 통해 비용 이익을 볼 수 있습니다.
이차 항체 인큐베이션 최적화
이차 항체 인큐베이션의 지속기간의 잠재적 영향은 또한 인큐베이션의 길이를 변형시킴으로써 조사하였다 (15, 30, 60, 및 120 분). 일반적으로, 특정 인큐베이션 및 최대 인큐베이션 시간의 몫으로서 제시되는 바와 같은 평균 MFI의 차이는, %Max라고 불리며, 15분 인큐베이션(minimum duration)과 120분 인큐베이션(maximum duration) 사이의 스파이크 S1, 멤브레인, 및 뉴클레오캡시드 항체에 대해 각각 30%, 55%, 및 50%를 초과하지 않았으며, 이차 항체 결합에서 빠른 동역학적 단계를 나타내고 분석 처리량을 증가시키는 수단을 포함한다. 표 6은 모든 인큐베이션 시간에 대한 신호 변화에 대한 세부사항을 포함한다. 이 분석의 상이한 인큐베이션으로부터의 관찰된 신호의 예시는 도 4에 도시되어 있다.
듀얼 채널 성능 및 특이성
각각의 분석물에 대해, 단일 리포터 포맷 실행(IgG-PE 전용, IgA-PE 전용, 또는 IgM-SB만)을 이중 리포터 포맷으로 실행했을 때 동일한 분석물에 대해 생성된 신호와 비교하였다(예를 들어, 스파이크 S1 IgG-PE 대 스파이크 S1 IgG-PE와 조합된 스파이크 S1 IgM-SB 이중 리포터 포맷). 두 가지 형식으로 생성된 신호에 대한 분석 정밀도(%CV로 표시됨)를 본 실험의 결과에서 관계를 분석하는데 사용하였다. 스파이크 S1 분석의 %CV 값은 IgM, IgG 및 IgA에 대해 각각 6.19%, 16.4% 및 23%였다. 멤브레인 분석의 경우, %CV 값은 IgM, IgG 및 IgA에 대해 각각 3.3%, 7.9% 및 16.4%였다. 마지막으로, 뉴클레오캡시드 분석은 IgM, IgG 및 IgA에 대해 각각 8.7%, 10.3% 및 24.2%에서 %CV 값을 제공하였다. IgM 및 IgA 이소타입에 대해 관찰된 정밀도 값은 더 긴 인큐베이션 시간이 이들 부류의 면역글로불린에 걸친 알려진 결합 동역학적 차이로 인해 우수한 분석 결과를 부여할 수 있음을 시사한다. 도 4는 상이한 농도의 이차 항체의 형식 사이의 일치를 보여준다.
리포터 채널의 특이성을 확인하기 위해, 하나의 리포터 채널을 한 번에 테스트하고, 다른 채널은 비특이적 신호(출혈 효과)에 대해 문의하기 위해 블랭크로 할당하였다. 이러한 발견은 조건의 스펙트럼에 걸쳐 높은 특이성을 감안할 때 두 리포터 채널 사이에 무시할 수있는 교차 신호 오염이 있음을 나타냅니다. 이러한 발견은 그림 5에 예시되어 있다. 전반적으로, 우리는 채널 1에서 채널 2까지 6.45 %의 간섭을 관찰했습니다. 그러나, 신호의 크기가 설명되었을 때, 우리는 이중 리포터 모드에서 다음과 같은 잠재적 간섭 수준을 관찰했다: 스파이크 IgG/IgM은 71.98%, 스파이크 IgA/IgM은 28.11%에서; 막 IgG/IgM에서 7.41%, 멤브레인 IgA/IgM에서 134.61%; 뉴클레오캡시드 IgG/IgM은 146.03%, 뉴클레오캡시드 IgA/IgM은 112.13%이다. 지정된 구성에서, 이것은 IgA 이소형과 조합된 스파이크 IgM의 측정, IgM 이소형을 갖는 막 IgM, 및 이중 채널 포맷에서 수행되지 않은 뉴클레오캡시드 측정의 측정을 필요로 할 것이다. 이러한 발견은 IgA 및 IgG가 채널 1의 채널 2 및 IgM에서 측정되는 라벨링 전략의 역전에 대한 탐구를 필요로 할 수 있다.
Covid-19 예방 접종 후 혈청 전환 사건 평가
혈청 전환은 스파이크 S1 분석법으로 IgA, IgM 및 IgG의 평가시 네 명의 피험자에서 사전 백신 접종에서 Covid-19 백신 접종 시리즈 완료 후 4 개월에 이르는 시점에서 모니터링되었습니다. 측정은 이중 채널 모드 (IgG/IgM 및 IgA/IgM, IgM 값은 평균화됨)에서 달성되었다. 모든 피험자는 표준 관행에 따라 2 단계 예방 접종으로 백신을 접종 받았으며 첫 번째 용량과 두 번째 투여 사이에 21 일 간격을 두었습니다. 각 피험자의 면역 반응의 플롯은 도 6A-C에 도시되어 있다. 뉴클레오캡시드 및 막 항원에 대한 면역 반응 값은 평가된 모든 면역글로불린에 대한 배경 수준에서 관찰되었고(데이터는 나타내지 않음), 이는 백신 접종 전 시간에 이전에 SARS-CoV-2 감염이 문서화되지 않은 피험자와 일치하였다. 전반적으로, 관찰된 스파이크 S1 IgA 및 IgM 값은 IgG 이소형의 역가보다 약 40배 더 낮았고, 피크 역가는 IgM 및 IgG 이소형과 IgA 이소형에 대해 14일 이내에 볏이 볏을 볏이 되어 두 번째 투여 시점(0일째)과 두 번째 투여 후 14일 사이에 피크 역가에 도달하고, 주제에 따라. 주목할 만하게, 스파이크 S1 IgG 역가는 대상체-의존적 방식으로 고도로 가변적인 속도로 백신접종 완료 후 넉 달의 과정 동안 붕괴되기 시작한다.
그림 1: 대표적인 3플렉스 표준 곡선. 세 분석물에 대한 대표적인 표준 곡선; (A) 스파이크 S1의 경우 1μg/mL, (B) 멤브레인의 경우 5μg/mL, (C) 뉴클레오캡시드 및 항체의 경우 1μg/mL에서 시작하는 7점, 1:5 연속 희석 곡선으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 1차 항체/샘플 배양 시간 최적화: 표준 1-7의 경우 30분에서 4시간 사이의 일차 항체/샘플(항체 포획)의 서로 다른 배양 시간으로부터 생성된 평균 MFI 신호(표 1에 표시됨). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이차 항체 농도 최적화 및 이중 채널 성능. 곡선은 시험된 이차 항체 농도로부터 생성된 평균 MFI(시리즈에서 가장 높은 기록값으로 정규화됨)를 보여주며, 이는 0.5-8 μg/mL에 이른다. 각 인스턴스는 실험 포맷의 차이를 이해하기 위해 단일- 및 이중-채널 분석으로서 둘 다 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 이차 항체 배양 시간 최적화, 이중 채널 포맷. 이차 항체와의 인큐베이션 시간에 대하여 관찰된 MFI 값(계열에서 가장 높은 기록값으로 정규화됨)의 대표적인 플롯. 실험은 (A-C) IgA/IgM 또는 (D-F) IgG/IgM 조합과 같은 이중 채널 분석으로서 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 이중 채널 분석에 대한 특이성 평가. 블랭크로 지정된 각각의 조합 중 하나를 갖는 이중 채널 분석 포맷의 분석 결과는 교차 채널 형광 또는 간섭의 결여를 예시한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: Covid-19 백신 접종 후 혈청 전환의 그림. Covid-19 백신접종 과정 동안 (A) IgG, (B) IgM, 및 (C) 스파이크 S1 항원에 대한 IgA 항체의 상대적 역가를 예시하는 플롯 (사전 백신접종 - 완료 후 4개월); 시간은 백신 접종 시리즈의 완료와 관련된 일로 표시됩니다. 백신 투여의 일반적인 점(빨간색 선)이 표시되어 있다. 실험은 프로토콜에 설명된 바와 같이 이중 채널 모드에서 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 표준 번호 | 희석 시리즈 | 스파이크 방지 S1 또는 N(μg/mL) | 멤브레인 방지(μg/mL) |
| 빈 | 빈 | - | - |
| 1 | 성7 1:1 | 1 | 5 |
| 2 | 성6 1:5 | 0.2 | 1 |
| 3 | 성5 1:25 | 0.04 | 0.2 |
| 4 | 성트4 1:125 | 0.008 | 0.04 |
| 5 | 성3 1:625 | 0.0016 | 0.008 |
| 6 | 성트2 1:3125 | 0.00032 | 0.0016 |
| 7 | 성1 1:15625 | 0.000064 | 0.00032 |
표 1: 표준 곡선에 대한 희석 시리즈: IgG 혈청형에 대한 표준 곡선에 사용된 희석 인자의 표; α-Spike S1 및 α-Nucleocapsid의 경우 1μg/mL, α-Membrane 항체의 경우 5μg/mL에서 시작하는 7점, 1:5 연속 희석 곡선으로 제시됩니다.
| 분석물 | 견본 | 담당자 1 | 담당자 2 | 담당자 3 | 담당자 4 | 애비뉴 | 증권 시세 표시기 | %CV |
| 스파이크 S1 | 성병2 | 369.4 | 356.9 | 295.2 | 271.5 | 323.3 | 47.4 | 14.6 |
| 성병5 | 3869.1 | 3437 | 3970.2 | 4240.7 | 3879.3 | 334 | 8.6 | |
| 양피지 | 성병2 | 40.6 | 37.7 | 49.9 | 27.8 | 39 | 9.1 | 23.3 |
| 성병5 | 733.2 | 731.3 | 724 | 678.1 | 716.7 | 26 | 3.6 | |
| 뉴클레오캡시드 | 성병2 | 1746.7 | 1790.8 | 1577.3 | 1664.8 | 1694.9 | 94.2 | 5.6 |
| 성병5 | 15598.1 | 14735.5 | 18369.5 | 17408.5 | 16527.9 | 1657.7 | 10 |
표 2: 인트라-어세이 정밀도: 분산의 퍼센트 계수 (%CV)는 동일한 실험에서 단일 분석 배치를 갖는 표준 2 (STD2) 및 표준 5 (STD5)에서의 표준 항체 혼합물의 네 번의 반복실험으로부터 계산된다. 반복실험 및 평균에 대해 제공된 값은 관찰된 MFI 값을 나타냅니다.
| 분석물 | 견본 | 배치 1 | 배치 2 | 일괄 처리 3 | 애비뉴 | 증권 시세 표시기 | %CV |
| 스파이크 S1 | 성병2 | 383.2 | 424.4 | 379.9 | 395.8 | 24.8 | 6.3 |
| 성병5 | 5639.7 | 6062.5 | 6384.3 | 6028.8 | 373.4 | 6.2 | |
| 양피지 | 성병2 | 39.1 | 58.5 | 59.1 | 52.2 | 11.4 | 21.8 |
| 성병5 | 732.3 | 941.4 | 701.1 | 791.6 | 130.7 | 16.5 | |
| 뉴클레오캡시드 | 성병2 | 1342.6 | 1621 | 1718.2 | 1560.6 | 195 | 12.5 |
| 성병5 | 13543.9 | 14843.2 | 17883.4 | 15423.5 | 2227.2 | 14.4 |
표 3: 표준 샘플을 사용한 인터 어세이 정밀도: 분산의 퍼센트 계수(%CV)는 분석의 세 개의 별개의 배치로부터 계산되고, 동일한 실험에서 표준 2 및 표준 5에서 평가되었다. 반복실험 및 평균에 대해 제공된 값은 관찰된 MFI 값을 나타냅니다.
| IgG-PE | IgM-SB | 이가-PE | |||||
| 애비뉴 MFI | %CV | 애비뉴 MFI | %CV | 애비뉴 MFI | %CV | ||
| 스파이크 S1 | 주제 1 | 8002.3 | 17.7 | 1949.5 | 1.3 | 2045.8 | 5.5 |
| 주제 2 | 19155.8 | 7.3 | 918.6 | 4.1 | 1684.5 | 3.9 | |
| 주제 3 | 17865.6 | 18.0 | 549.4 | 3.8 | 961.3 | 8.1 | |
| 주제 4 | 11901.1 | 2.6 | 1603 | 4.8 | 8736.4 | 5.5 | |
| 주제 5 | 9801.8 | 4.0 | 1014.1 | 3.0 | 2747.6 | 9.3 | |
| 뉴클레오캡시드 | 주제 1 | 15097.8 | 11.3 | 1049.7 | 9.9 | 5276.5 | 3.9 |
| 주제 2 | 15204.3 | 12.1 | 265.9 | 5.2 | 6761.3 | 11.9 | |
| 주제 3 | 18471.7 | 24.4 | 329.1 | 4.5 | 14308 | 2.9 | |
| 주제 4 | 16424.7 | 3.5 | 2418.1 | 0.1 | 4234.7 | 4.2 | |
| 주제 5 | 13344.9 | 3.6 | 225.6 | 10.0 | 13436.5 | 9.7 | |
| 양피지 | 주제 1 | 514.6 | 8.6 | 180.6 | 14.0 | 141.2 | 9.8 |
| 주제 2 | 196.8 | 5.2 | 57 | 20.7 | 55.5 | 13.0 | |
| 주제 3 | 553.7 | 12.9 | 54.5 | 21.2 | 191.2 | 18.6 | |
| 주제 4 | 377.9 | 3.2 | 68.1 | 22.1 | 62 | 2.3 | |
| 주제 5 | 325.4 | 8.2 | 11.4 | 91.6 | 74.6 | 20.8 |
표 4: 인간 샘플과의 상호 분석 정밀도: SARS-CoV-2 감염이 있는 5명의 인간 피험자로부터 혈장 샘플(500배 희석)로 시험한 분석의 세 배치로부터 계산된 분산의 평균 퍼센트 계수(%CV).
| 스파이크 S1 | 양피지 | 뉴클레오캡시드 | |||||
| μg/mL | 애비뉴 MFI | % 최대. | 애비뉴 MFI | % 최대. | 애비뉴 MFI | % 최대. | |
| IgM | 0.5 | 186 | 13.2 | 32 | 25.2 | 132.7 | 13.6 |
| 1 | 304.2 | 21.6 | 45.8 | 36 | 194.4 | 19.9 | |
| 2 | 664.5 | 47.2 | 78.8 | 61.9 | 458.2 | 47 | |
| 4 | 1032.1 | 73.3 | 101.3 | 79.6 | 707.8 | 72.6 | |
| 8 | 1407.1 | 100 | 127.2 | 100 | 975 | 100 | |
| IgG | 0.5 | 809.7 | 4.9 | 27.5 | 15 | 1355.6 | 6.3 |
| 1 | 1696.9 | 10.2 | 40.6 | 22.2 | 2782.1 | 13 | |
| 2 | 4543.8 | 27.3 | 68.3 | 37.3 | 6661.2 | 31.2 | |
| 4 | 10003.5 | 60 | 110.7 | 60.5 | 12605.6 | 59 | |
| 8 | 16662.8 | 100 | 182.9 | 100 | 21360.6 | 100 | |
| 이가 | 0.5 | 797.4 | 19.3 | 31.1 | 47.2 | 2056.5 | 16.1 |
| 1 | 1529.5 | 37 | 41.4 | 62.8 | 3869 | 30.4 | |
| 2 | 2261.3 | 54.7 | 48.6 | 73.3 | 6648.9 | 52.2 | |
| 4 | 2320.4 | 56.2 | 48.3 | 73.2 | 6548.1 | 51.4 | |
| 8 | 4132.2 | 100 | 65.9 | 100 | 12744.8 | 100 | |
표 5: 이차 항체 농도 최적화: 0.5 μg/mL에서 8 μg/mL에 이르는 다양한 농도의 이차 항체로부터 생성된 평균 MFI 신호. 또한 각 신호의 값은 상대적인 신호 크기를 보여주기 위해 8μg/mL("최대")에서 신호의 백분율로 표시됩니다.
| 스파이크 S1 | 양피지 | 뉴클레오캡시드 | |||||
| 인큐베이션 시간(분) | 애비뉴 MFI | % 최대. | 애비뉴 MFI | % 최대. | 애비뉴 MFI | % 최대. | |
| IgM | 15 | 1185 | 72.2 | 40.4 | 48.9 | 609.5 | 53.3 |
| 30 | 1416.6 | 86.3 | 58.4 | 70.7 | 894.2 | 78.2 | |
| 60 | 1324.8 | 80.7 | 73.6 | 89.1 | 945.6 | 82.7 | |
| 120 | 1641.2 | 100 | 82.6 | 100 | 1143.2 | 100 | |
| IgG | 15 | 12917.6 | 80.5 | 244.4 | 44.9 | 15429.8 | 80.8 |
| 30 | 14915.4 | 92.9 | 434.7 | 79.9 | 18797 | 98.5 | |
| 60 | 15340.3 | 95.6 | 421.4 | 77.5 | 18694.4 | 97.9 | |
| 120 | 16050.3 | 100 | 544 | 100 | 19085.8 | 100 | |
| 이가 | 15 | 3141.9 | 78.2 | 75 | 66.8 | 9103 | 86.6 |
| 30 | 3569.1 | 88.8 | 83.9 | 74.8 | 9563.8 | 91 | |
| 60 | 3539.1 | 88 | 86 | 76.6 | 9555.7 | 90.9 | |
| 120 | 4020 | 100 | 112.2 | 100 | 10512.9 | 100 |
표 6: 이차 항체 배양 시간 최적화: 이차 항체의 상이한 인큐베이션 시간으로부터 생성된 평균 MFI 신호는 15분 내지 120분 범위이다. 각 신호의 값은 상대적인 신호 크기를 보여주기 위해 120분("Max.")에서의 신호의 백분율로도 표시됩니다.
Discussion
감염 상태에 대한 RT-PCR 기반 감시와 함께 SARS-CoV-2 노출에 대한 면역 반응의 인식은 Covid-19로부터의 회복 과정을 명확히하고, 잠재적 인 치료 가치를 지닌 회복기 혈장을 확인하고, 인구 규모 기준으로 감염률을 조사하는 수단으로 작용하기위한 처방으로 잘 설명되었습니다10,11. 인간 피험자에서 혈청 전환을 이해하기 위한 상이한 예는 단백질(항원) 어레이 12, 면역블롯13, 신속한 면역크로마토그래피 구축물 14, 및 효소-결합 면역흡착 분석(ELISAs)15,16,17을 포함한다. 이들 전술한 기술들 각각은 사소한 변형으로 개별적으로 다수의 면역글로불린 이소형을 평가할 수 있다. 그러나 이러한 절차는이 원고에 제시된 바와 같이 여러 이소 타입의 병렬 분석을 허용하도록 실질적으로 용도를 변경할 수 없으므로 비용 및 처리량 요인을 인구 기반 규모 테스트 전략에 대한 관리의 한계로 간주합니다. 이러한 응용 프로그램 중 일부는 또한 멀티플렉스 ELISA18,19와 같이 제시되거나 변경된 형식으로 여러 항원의 수준을 병렬로 연결할 수 있는 기회를 제공합니다. 마지막으로, 면역비드 플랫폼은 병렬로20,21개의 다중 항원의 수준을 평가할 수 있는 가능성을 제공하지만, 분석당 단일 에피토프(즉, 면역글로불린 이소형)로 제한되어 왔지만, '이중 채널' 분석 능력을 갖는 최근의 계기가 채용되고 있다.
이 보고서에서는 Covid-19 예방 접종을받은 개인의 혈청 전환에 대한 사례 연구에서 '이중 채널'모드의 도구를 사용하여 면역 비드 분석에서 다중 에피토프의 신뢰할 수있는 측정을 확립하는 프로토콜이 열거되어 있습니다. 이 방법은 실험실 자동화 시스템의 통합으로 개선 될 수있는 수동 분석 설계를 사용하여 우수한 정밀도 (일반적으로 <20 %)를 입증했습니다. 선택된 모든 분석물 및 에피토프에 대한 분석 감도 및 동적 범위는 일상적인 평가에 적합하였다. 상업적으로 이용가능한 항항원 IgA 및 IgM 면역시약의 결여가 IgG 이소형에 대한 제한된 정량화이지만, 이러한 제한은 교정제22,23으로서 특정 표본에 대하여 반정량적 평가 또는 평가를 제공하는 능력을 배제하지 않는다.
검증된 면역비드 분석은 Covid-19 백신으로 면역화된 개인의 코호트에서 혈청 전환을 조사하기 위해 할당되었다. 다른 유사한 플랫폼과 대조적으로, 계측 제품군은 수동 워크 플로에서 하루에 수백 명의 개인과 자동화 된 체계로 하루에 수천 명의 개인에서 혈청 변환의 전망을 가능하게합니다. 전반적으로, 이러한 발견은 '이중 채널'접근법이 동일한 검정에 대해 병렬로 다중 에피토프의 설명에 대한 적절한 민감성을 가지며 다중 분석물 맥락에서 실행 가능하다는 것을 확인시켜준다. 피코에리트린과 슈퍼 브라이트 436 형광단으로 각각 수행된 채널 1 및 채널 2에 대한 민감도의 차이는 주어진 실험에 대해 실행 가능한 분석 결과를 얻기 위해 특정 실험의 설계를 보증할 수 있습니다. 즉, 더 낮은 유병률의 에피토프 또는 분석물에 대한 채널 1의 예약은 미지의 관찰된 값을 포함하는 분석의 동적 범위를 유지하기 위해 필요할 수 있다. 이러한 고려 사항 외에도 분석 설계는 분명했으며 제한된 분석 기능을 가진 실험실에서 쉽게 접근 할 수 있어야합니다. 물론, 그림 5에서 언급했듯이 채널 1에서 채널 2까지의 간섭을 고려할 때 이러한 고려 사항을 고려해야 하며, 이에 따라 더 높은 풍부도 이소형으로부터의 간섭은 이중 채널 형식으로 측정될 때 훨씬 낮은 풍부도에 있는 사람들에게 오해의 소지가 있는 분석 오류를 야기할 수 있습니다. 매우 상이한 분석물 농도를 갖는 상황과의 간섭에 대한 이러한 잠재성은 분석 설계 단계에서 적절하게 처리되지 않을 경우 접근법에 상당한 제한을 나타낼 수 있다.
결론적으로, Covid-19 감염 또는 백신접종에 대한 면역 반응과 관련된 주요 면역글로불린 이소형으로부터의 항체 역가를 신속하게 측정하는 방법이 제시되었다. 혈청 전환을 평가하기 위해 종적 방식으로이 접근법을 적용하면 질병의 경과를 관리 및 / 또는 모니터링하거나 장래의 Covid-19 부스터 백신 프로그램을 안내하는 데 더 잘 사용될 수있는 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
Disclosures
Borgia 박사는 특허 출원 중인이 원고에 사용 된 혈청 학적 테스트의 발명가입니다. 이 기사는 저자 갈등에 의해 도입 된 잠재적 인 편향을 피하기 위해 통계 분석이 제시되지 않은 경우에만 설명 적 방식으로 제시됩니다.
Acknowledgments
저자들은 시설 사용에 대한 Rush Biomarker Development Core, 피험자 등록 및 생물 표본 처리를위한 Rush Biorepository, Walder Foundation의 Chicago Coronavirus Assessment Network (Chicago CAN) 이니셔티브 보조금 번호 SCI16 (J.R.S. 및 J.A.B.) 및 21-00147 (J.R.S. 및 J.A.B.) 및 Swim Across America Foundation (J.A.B.)의 상에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well black side polystyrene microtiter plates | Thermo Fisher | 12-565-346 | |
| Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Prepared in house | ||
| Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Bovine Serum Albumin, heat shock fraction | MilliporeSigma | A-7888-50G | |
| Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0) | Prepared in house | ||
| COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag) | MyBioSource | MBS8574735 | |
| Disposable pipette tips | |||
| EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher | PIA35391 | |
| Goat Albumin, Fraction V Powder | MilliporeSigma | A2514-1G | |
| IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB205009 | |
| IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB204009 | |
| IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB403009 | |
| IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB202009 | |
| IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4 | Thermo Fisher | 62999842 | |
| Instrument Analyzer | Luminex Corp. | INTELLIFLEX-RUO | |
| Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Thermo Fisher | 13-698-794 | |
| MagPlex-C Microspheres, Region XXX | Luminex Corp. | MC10XXX-01 | |
| MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate) | MilliporeSigma | M2933 | |
| Microplate aluminum sealing tape | Thermo Fisher | 07-200-683 | |
| Polysorbate-20 | Thermo Fisher | BP337-500 | |
| Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2 | Thermo Fisher | 50-751-7328 | |
| Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag) | Sino Biologicals | 40588-V08B | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag) | Sino Biologicals | 40591-V08H | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb | Sino Biologicals | 40592-T62 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb | Sino Biologicals | 40588-R0004 | |
| SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb | ProSci | 10-516 | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher | PIA39269 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Water, LC/MS grade | Thermo Fisher | W-64 |
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