Summary
यह लेख सार्स-सीओवी-2 संक्रमण या टीकाकरण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप समवर्ती रूप से दो इम्युनोग्लोबुलिन आइसोटाइप (या तो आईजीए, आईजीएम, या आईजीजी) के लिए एंटीबॉडी टाइटर्स में गतिशील परिवर्तनों की निगरानी के लिए एक सुविधाजनक विधि का वर्णन करता है। यह 'मल्टीएनालाइट कोविड-19 इम्यून रिस्पांस पैनल' कोडित माइक्रोस्फीयर पर निर्मित तीन अप्रत्यक्ष इम्यूनोसेस को नियोजित करता है जिन्हें 'डुअल-चैनल' क्षमता वाले प्रवाह-आधारित मल्टीप्लेक्स रीडर का उपयोग करके पढ़ा जाता है।
Abstract
कॉन्सर्ट में कई बायोमार्करों से पूछताछ के लिए मल्टीप्लेक्स प्रौद्योगिकियां कई दशकों से मौजूद हैं; हालाँकि, एक ही विश्लेषण पर कई एपिटोप्स का मूल्यांकन करने के तरीके सीमित रहते हैं। यह रिपोर्ट सार्स-सीओवी-2 संक्रमण या टीकाकरण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से जुड़े सामान्य इम्युनोग्लोबुलिन आइसोटाइप (जैसे, आईजीए, आईजीएम और आईजीजी) के सीरोलॉजिकल परीक्षण के लिए मल्टीप्लेक्स इम्यूनोबीड परख के विकास और अनुकूलन का वर्णन करती है। परख दोहरे चैनल क्षमता के साथ एक प्रवाह-आधारित, मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट रीडर का उपयोग करके पूरा किया गया था। अनुकूलन विश्लेषण कैप्चर समय, एंटीबॉडी एकाग्रता का पता लगाने और समय इनक्यूबेशन एंटीबॉडी का पता लगाने पर केंद्रित है। विश्लेषणात्मक परख प्रदर्शन विशेषताओं (जैसे, परख रेंज (मात्रात्मकता की निचली और ऊपरी सीमा सहित); और इंट्रा- और अंतर-परख परिशुद्धता) को 'दोहरी चैनल' मोड का उपयोग करके अग्रानुक्रम में आईजीजी / आईजीएम या आईजीएम सीरोटाइप संयोजन के लिए स्थापित किया गया था। आईजीजी के लिए 30 मिनट, आईजीएम के लिए 60 मिनट और आईजीए के लिए 120 मिनट के विश्लेषण कैप्चर समय अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त थे, जो परख प्रदर्शन और थ्रूपुट का संतुलन प्रदान करते थे। एमएल पर इष्टतम पहचान एंटीबॉडी ऊष्मायन मनाया गया था और सामान्य अनुप्रयोगों के लिए सिफारिश की जाती है, समग्र उत्कृष्ट परिशुद्धता (विचरण का प्रतिशत गुणांक (% सीवी) ≤ 20%) और संवेदनशीलता मूल्यों को देखते हुए। आईजीजी आइसोटाइप के लिए गतिशील रेंज प्रत्येक परख (स्पाइक एस 1, न्यूक्लियोकैप्सिड और मेम्ब्रेन ग्लाइकोप्रोटीन) के लिए परिमाण के कई आदेशों को फैलाती है, जो नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए 1: 500 कमजोर पड़ने वाले कारक पर मजबूत टिटर मूल्यांकन का समर्थन करती है। अंत में, अनुकूलित प्रोटोकॉल को सार्स-सीओवी-2 वैक्सीन आहार को पूरा करने वाले विषयों (एन = 4) के लिए स्पाइक एस 1 सीरोकनवर्जन की निगरानी के लिए लागू किया गया था। इस पलटन के भीतर, स्पाइक एस 1 आईजीजी स्तर दूसरी खुराक प्रशासन के बाद 14 दिनों में अधिकतम टाइटर्स तक पहुंचने के लिए मनाया गया था, आईजीएम या आईजीए आइसोटाइप की तुलना में बहुत अधिक (~ 40 गुना) सिग्नल तीव्रता पर। दिलचस्प बात यह है कि हमने अत्यधिक परिवर्तनशील स्पाइक एस 1 आईजीजी टिटर क्षय दरों को देखा जो काफी हद तक विषय-निर्भर थे, जो भविष्य के अध्ययनों का विषय होगा।
Introduction
जैविक नमूनों में कई रोग से संबंधित बायोमार्करों का एक साथ माप रोग प्रक्रियाओं में वर्णनात्मक और भविष्य कहनेवाला अंतर्दृष्टि की अनुमति देता है। जबकि पारंपरिक एकल विश्लेषण इम्यूनोलॉजिकल प्रक्रियाएं, जैसे एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसोरबेंट परख (एलिसा), नैदानिक और अनुसंधान दोनों सेटिंग्स में मात्रात्मक विश्लेषण की आधारशिला रही हैं, इन तकनीकों में थ्रूपुट, प्रत्येक माप के लिए आवश्यक नमूने की मात्रा और लागत-प्रभावशीलता के बारे में पर्याप्त सीमाएं हो सकती हैं जो कई जैविक तत्वों के अध्ययन को बहुत सीमित करती हैं जो अक्सर पूरे रोग पाठ्यक्रम में परस्पर जुड़ीहोती हैं 1 . माइक्रोस्फीयर-आधारित मल्टीप्लेक्सिंग तकनीक प्रयोगशाला थ्रूपुट को बढ़ाने, नमूना कमी को कम करने और लागत बचत 1,2,3,4 को अधिकतम करने के लिए दोहराए जाने वाले परीक्षण को कम करने के लिए परखको संयोजित करने की क्षमता के लिए नैदानिक और अनुसंधान सुविधाओं दोनों के लिए एक अनिवार्य मंच बन गई है। हाल ही में, दोहरी रिपोर्टर क्षमताओं वाले उपकरणों के साथ इस मल्टीप्लेक्सिंग पावर का और संवर्धन पेश किया गया है। दोहरी रिपोर्टर सुविधा का पता लगाने के लिए दो फ्लोरोसेंट चैनलों को लागू करता है, मल्टीप्लेक्सिंग के एक और आयाम की आपूर्ति करता है, जिससे एक ही विश्लेषण पर कई एपिटोप का पता लगाने की अनुमति मिलती है।
सीवियर एक्यूट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) वर्तमान कोरोनोवायरस बीमारी 2019 (सीओवीआईडी -19) महामारी5 के लिए जिम्मेदार रोगज़नक़ है। जबकि रोग पाठ्यक्रम की शुरुआत में संक्रमण की पुष्टि के लिए आरटी-पीसीआर परीक्षण महत्वपूर्ण है, एंटीबॉडी टाइटर्स की सीरोलॉजिकल परीक्षाएं पिछले जोखिम या वसूली के बारे में व्यक्तियों की सटीक और पूर्ण आलोचना के लिए अनिवार्य साबित हुई हैं; टीकाकरण के लिए एक प्रतिक्रिया; और / या कोविद -19 टीकाकरण प्रभावकारिता 6,7 का मूल्यांकन।
यह रिपोर्ट कई सार्स-सीओवी-2 वायरल एंटीजन के लिए सीरोकनवर्जन का आकलन करने के तरीकों को चित्रित करती है जो प्रवाह-आधारित, मल्टीप्लेक्स रीडर दोहरी-रिपोर्टिंग प्रणाली का उपयोग करते हैं। विशेष रूप से, 3-प्लेक्स सार्स-सीओवी-2 एंटीजन पैनल के लिए दो एंटीबॉडी उपप्रकारों (आईजीजी / आईजीएम या आईजीए / आईजीएम के रूप में कॉन्फ़िगर किया गया) का समवर्ती पता लगाना जिसमें स्पाइक एस 1, न्यूक्लियोकैप्सिड और मेम्ब्रेन (उर्फ मैट्रिक्स) ग्लाइकोप्रोटीन के लिए परख शामिल हैं, का वर्णन किया गया है। यह दृष्टिकोण अनुदैर्ध्य सीरोकनवर्जन पर कब्जा करने के लिए एक आदर्श उद्यम प्रदान करता है और कोविद -19 महामारी के खिलाफ शस्त्रागार में एक मूल्यवान उपकरण का योगदान देता है।
Protocol
नैतिक अनुसंधान आचरण के लिए सभी संस्थागत दिशानिर्देशों के साथ प्रोटोकॉल ओआरए 20101207 के तहत रश यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर के पूर्ण संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) अनुमोदन के साथ सभी विषयों को लिखित सूचित सहमति के साथ नामांकित किया गया था। लैवेंडर वेक्यूटेनर (के2ईडीटीए) में पारंपरिक फ्लेबोटॉमी के माध्यम से रक्त एकत्र किया गया था और अनुशंसित प्रोटोकॉल के साथ संसाधित किया गया था। परिणामी प्लाज्मा को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था जब तक कि आकलन नहीं किया गया था।
1. एंटीजन-संयुग्मित माइक्रोस्फीयर की तैयारी
- अद्वितीय मनका क्षेत्रों के साथ चुंबकीय माइक्रोस्फीयर के तीन अलग-अलग शीशियों का चयन करें, उपयोग की जाने वाली प्रत्येक शीशी के लिए मनका आईडी और बहुत सारी जानकारी रिकॉर्ड करें।
नोट: प्रत्येक विशिष्ट माइक्रोस्फीयर क्षेत्र के लिए निम्नलिखित चरणों का पालन किया जाएगा। माइक्रोस्फीयर प्रकाश संवेदनशील होते हैं और प्रकाश के लंबे समय तक संपर्क से संरक्षित किया जाना चाहिए। धोने के चरणों के दौरान, सावधान रहें कि माइक्रोस्फीयर को परेशान न करें। यदि परेशान है, तो दूसरे 60 एस पृथक्करण की अनुमति दें। - 60 एस के लिए माइक्रोस्फीयर स्टॉक भंवर और एकत्रित मोती को अलग करने के लिए उपयोग करने से पहले 5 मिनट के लिए सोनिकेट करें।
- 1.5 एमएल कम प्रोटीन बाध्यकारी माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में 1.0 x 106 मोती स्थानांतरित करें।
- ट्यूब को चुंबकीय विभाजक में डालें और 60 एस के लिए पृथक्करण होने की अनुमति दें। चुंबकीय विभाजक में अभी भी ट्यूब के साथ, मनका गोली परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को सावधानीपूर्वक हटा दें।
- चुंबकीय विभाजक से ट्यूब निकालें, एचपीएलसी-ग्रेड पानी के 100 μL के साथ मोती को फिर से निलंबित करें, और 30 एस के लिए भंवर। ट्यूब को 60 एस के लिए चुंबकीय विभाजक में वापस रखें, और बाद में सतह पर तैरनेवाला हटा दें। इस धोने प्रोटोकॉल को दो बार दोहराएं।
- चुंबकीय विभाजक से ट्यूब निकालें और 30 एस के लिए भंवर द्वारा 100 एमएम मोनोबेसिक सोडियम फॉस्फेट, पीएच 6.2 (सक्रियण बफर) के 90 μL में धोए गए माइक्रोस्फीयर को फिर से निलंबित करें।
- एमएल सल्फो-एनएचएस (सक्रियण बफर के साथ पतला) के 10 μL को माइक्रोस्फीयर और भंवर में धीरे-धीरे 10 एस के लिए जोड़ें। एमएल ईडीसी समाधान (सक्रियण बफर के साथ पतला) और 10 एस के लिए धीरे-धीरे भंवर के 10 μL जोड़ें। हर 10 मिनट में एक कोमल भंवर के साथ कमरे के तापमान (आरटी) पर 20 मिनट के लिए माइक्रोस्फीयर सेते हैं।
- एमएस-ग्रेड पानी के बदले 50 एमएम एमईएस, पीएच 5.0 (युग्मन बफर) के साथ कुल दो वॉश के लिए वॉश चरण 1.4-1.5 दोहराएं।
- चुंबकीय विभाजक से ट्यूब निकालें और प्रोटीन की वांछित मात्रा के अलावा तुरंत के बाद भंवर द्वारा युग्मन बफर के 100 μL के साथ मोती को फिर से निलंबित कर दिया।
- युग्मन बफर के साथ 150 μL करने के लिए कुल मात्रा लाओ। 30 एस के लिए भंवर द्वारा युग्मन प्रतिक्रिया मिश्रण और आरटी पर रोटेशन द्वारा 2 घंटे के लिए सेते हैं।
नोट: यहां परिभाषित परख के लिए, निम्नलिखित प्रोटीन सांद्रता के साथ संयुग्मन किए गए थे: स्पाइक एस 1: 5 μg; न्यूक्लियोकैप्सिड: 5 μg; झिल्ली: 12.5 μg. - एमएस-ग्रेड पानी के बदले फॉस्फेट बफर किए गए खारा (पीबीएस) -1% बकरी सीरम एल्बुमिन, 0.01% पॉलीसोर्बेट -20 (क्वेंच बफर) के साथ धोने के चरण 1.4 को दोहराएं। 30 एस के लिए भंवर द्वारा 0.05% सोडियम एजाइड युक्त क्वेंच बफर के 100 μL में धोए गए माइक्रोस्फीयर को फिर से निलंबित करें।
नोट: मोतियों को किसी भी अन्य प्रक्रिया के लिए आगे बढ़ने से पहले कम से कम 6 घंटे के लिए पूरी तरह से बुझाने की अनुमति दें। - एक स्वचालित सेल काउंटर या हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके पुनर्प्राप्त माइक्रोस्फीयर की संख्या की गणना करें। मनाया मनका एकाग्रता रिकॉर्ड करें।
- अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर युग्मित माइक्रोस्फीयर को ठंडा करें।
2. प्रक्रियाएं
- परख प्रदर्शन (आधार प्रोटोकॉल)
- 30 एस के लिए भंवर द्वारा युग्मित माइक्रोस्फीयर को फिर से निलंबित करें और ~ 60-90 एस के लिए सोनिकेट करें।
- संबंधित ट्यूब से प्रत्येक मनका कोलाइड की आवश्यक मात्रा निकालें और एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में मनका कोलाइड को मिलाएं।
- ट्यूब को चुंबकीय विभाजक में डालें और 60 सेकंड के लिए पृथक्करण होने की अनुमति दें। चुंबकीय विभाजक में अभी भी ट्यूब के साथ, मनका गोली परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को सावधानीपूर्वक हटा दें।
- विभाजक से मोती निकालें, पीबीएस -1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन, 0.01% पॉलीसोर्बेट -20 (परख बफर), और 30 एस के लिए भंवर के 100 μL के साथ मोतियों को फिर से निलंबित करें। ट्यूब को चुंबकीय विभाजक में रखें और 60 एस के लिए पृथक्करण होने दें। इस धोने प्रोटोकॉल दोहराएँ (यानी, चरण 2.1.3-2.1.4) दो बार
- प्रत्येक लक्ष्य के लिए प्रति 1 μL 100 माइक्रोस्फीयर की अंतिम एकाग्रता उत्पन्न करने के लिए परख बफर की एक उपयुक्त मात्रा जोड़कर 3-प्लेक्स काम कर रहे माइक्रोस्फीयर मिश्रण की एकाग्रता को समायोजित करें।
- चरण 2.1.5 में तैयार माइक्रोस्फीयर मिश्रण के विभाज्य 12.5 μL एक 384-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में या 25 μL एक 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में।
- परख बफर में प्लाज्मा/सीरम नमूनों को 500 गुना पतला करें। वांछित अनुमापन के अनुसार मानक नमूने तैयार करें।
- रिक्त नमूने के रूप में परख बफर के 12.5 μL जोड़ें और एक 384 अच्छी तरह से नमूना प्लेट या खाली, पतला नमूना या मानक के 25 μL के प्रत्येक नामित अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से नमूना प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से में पतला नमूना या मानक में से प्रत्येक जोड़ें।
- एक एल्यूमीनियम सील या पन्नी के साथ प्लेट को कवर करें और 700 आरपीएम पर सेट प्लेट शेकर पर आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
नोट: कमजोर पड़ने घटता के लिए योजनाबद्ध तालिका 1 में प्रदान की जाती है। - चरण 2.1.11 में निर्दिष्ट परख बफर के साथ 4 μg /एमएल पर एंटी-ह्यूमन डिटेक्शन एंटीबॉडी (माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान) का समाधान तैयार करें।
- बकरी-विरोधी मानव आईजीए, फाइकोएरिथ्रिन (पीई) संयुग्म एंटीबॉडी 4 μg / एमएल पर सुपर ब्राइट 436 (एसबी) / बकरी-विरोधी मानव आईजीए के साथ संयुग्मित तैयार करें; या बकरी-विरोधी मानव आईजीएम, एसबी संयुग्म / बकरी-विरोधी मानव आईजीजी, पीई संयुग्म का पता लगाने 4 μg / एमएल पर एंटीबॉडी का पता लगाता है।
नोट: 384-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप के लिए, तैयार माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 12.5 μL / अच्छी तरह से आवश्यक है, और 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप के लिए, 25 μL / - प्लेट को चुंबकीय विभाजक पर रखें, तेजी से धोएं, और कुओं से तरल निकालने के लिए एक बायोहाज़र्ड कंटेनर पर बलपूर्वक पलटें। प्लेट के साथ अभी भी उल्टा है, जबरदस्ती कागज की मोटी गड्डी के खिलाफ प्लेट नल।
- परख बफर के 100 μL के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें और एक जैव जोखिम कंटेनर पर सशक्त उलटा द्वारा तरल को हटा दें, जैसा कि पहले वर्णित है। कुल दो वॉश के लिए इन चरणों (2.1.12-2.1.13) को दोहराएं। कागज के सभी उपयोग किए गए वाडों को एक बायोहाज़र्ड कंटेनर में फेंक दें।
- एक 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए एक 384 अच्छी तरह से प्लेट या 25 μL के प्रत्येक कुएं के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी काम समाधान के 12.5 μL जोड़ें। एक एल्यूमीनियम सील या पन्नी के साथ प्लेट को कवर करें और 700 आरपीएम पर सेट प्लेट शेकर पर आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
- दोहराएँ धोने कदम 2.1.12-2.1.13
- एक 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक 384 अच्छी तरह से प्लेट या 100 μL के प्रत्येक कुएं में परख बफर के 75 μL जोड़ें। एक एल्यूमीनियम सील या पन्नी के साथ प्लेट को कवर करें और 700 आरपीएम पर सेट प्लेट शेकर पर आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
- सिस्टम मैनुअल के अनुसार साधन विश्लेषक के माध्यम से 60 μL का विश्लेषण करें।
- नमूना-कैप्चर इनक्यूबेशन समय का अनुकूलन
- चरण 2.1.9 में 30 मिनट, 60 मिनट और 120 मिनट के इनक्यूबेशन समय की अवधि का उपयोग करके अनुभाग 2.1 में चरणों का प्रदर्शन करें।
नोट: ऊष्मायन या तो अलग प्लेटों के साथ या चरण 2.1.6 पर रोककर किया जा सकता है जब तक कि चरण 2.1.9 पर आगे बढ़ने का समय न हो। वांछित इनक्यूबेशन समय की प्राप्ति के लिए। - निर्माता की सिफारिशों के अनुसार परख मिश्रण के 60 μL का उपयोग विश्लेषक पर प्लेट पढ़ने के साथ आगे बढ़ें।
- चरण 2.1.9 में 30 मिनट, 60 मिनट और 120 मिनट के इनक्यूबेशन समय की अवधि का उपयोग करके अनुभाग 2.1 में चरणों का प्रदर्शन करें।
- माध्यमिक एंटीबॉडी एकाग्रता का अनुकूलन
- माध्यमिक एंटीबॉडी कामकाजी समाधान में अभिकर्मकों की अंतिम सांद्रता के अपवाद के साथ धारा 2.1 में विस्तृत के रूप में इस प्रक्रिया को निष्पादित करें (चरण 2.1.10-2.1.11 में तैयार) निम्नानुसार संशोधित:
बकरी-विरोधी मानव (या खरगोश) आईजीएम, एसबी-संयुग्म का पता लगाने वाले एंटीबॉडी 8, 4, 2, 1 और 0.5 μg /
बकरी-विरोधी मानव (या खरगोश) आईजीए, पीई-संयुग्म का पता लगाने वाले एंटीबॉडी 8, 4, 2, 1 और 0.5 μg /
बकरी-विरोधी मानव (या खरगोश) आईजीजी, पीई-संयुग्म का पता लगाने वाले एंटीबॉडी 8, 4, 2, 1 और 0.5 μg /
बकरी-विरोधी मानव (या खरगोश) आईजीजी, पीई-संयुग्म / बकरी-विरोधी मानव (या खरगोश) आईजीएम, एसबी-संयुग्म का पता लगाने वाले एंटीबॉडी 8, 4, 2, 1 और 0.5 μg / एमएल पर।
बकरी-विरोधी मानव (या खरगोश) आईजीए, पीई-संयुग्म / बकरी-विरोधी मानव (या खरगोश) आईजीएम, एसबी-संयुग्म का पता लगाने वाले एंटीबॉडी 8, 4, 2, 1 और 0.5 μg / एमएल पर। - निर्माता की सिफारिशों के अनुसार परख मिश्रण के 60 μL का उपयोग विश्लेषक पर प्लेट पढ़ने के साथ आगे बढ़ें।
- माध्यमिक एंटीबॉडी कामकाजी समाधान में अभिकर्मकों की अंतिम सांद्रता के अपवाद के साथ धारा 2.1 में विस्तृत के रूप में इस प्रक्रिया को निष्पादित करें (चरण 2.1.10-2.1.11 में तैयार) निम्नानुसार संशोधित:
- समय के इनक्यूबेशन माध्यमिक एंटीबॉडी का अनुकूलन
- चरण 2.1.14 में परिभाषित इनक्यूबेशन अवधि के 15 मिनट, 30 मिनट, 60 मिनट और 120 मिनट के साथ अनुभाग 2.1 में विस्तृत के रूप में इस प्रक्रिया को निष्पादित करें।
- निर्माता की सिफारिशों के अनुसार परख मिश्रण के 60 μL का उपयोग विश्लेषक पर प्लेट पढ़ने के साथ आगे बढ़ें।
- अनुकूलित दोहरी चैनल परख के साथ विषय नमूनों का मूल्यांकन
- कोविड-19 वैक्सीन (यानी, दूसरी खुराक) प्रशासन के पूरा होने के सापेक्ष -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 और +120 दिनों में विषय प्लाज्मा नमूने (एन = 4) एकत्र करें।
नोट: दिन 0 उस समय बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है जिससे टीकाकरण पूरा हो गया था। - एक आईजीजी /आईजीएम या आईजीएम दोहरी चैनल परख के रूप में बेस प्रोटोकॉल (धारा 2.1.) का उपयोग करके सभी परख करें।
- प्रत्येक विशिष्ट इम्युनोग्लोबुलिन और परख के लिए अधिकतम मनाया औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) मूल्य के लिए परिणामों को सामान्य करें।
- कोविड-19 वैक्सीन (यानी, दूसरी खुराक) प्रशासन के पूरा होने के सापेक्ष -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 और +120 दिनों में विषय प्लाज्मा नमूने (एन = 4) एकत्र करें।
Representative Results
विशिष्ट परख परिणाम और प्रदर्शन मूल्यांकन
इम्यूनोबीड परख आमतौर पर परिमाण के कई (लॉग) आदेशों पर मूल्यांकन किए जाने पर एक सिग्मोइडल वक्र प्रदान करते हैं, जैसा कि चित्रा 1 में प्रस्तुत पैनलों में से प्रत्येक में सचित्र है। उपयोगकर्ता को मात्रात्मकता की पूरी श्रृंखला निर्धारित करने के लिए मल्टीप्लेक्स में प्रत्येक विश्लेषण के लिए इष्टतम एकाग्रता सीमा को प्रयोगात्मक रूप से परिभाषित करना चाहिए, यह सुनिश्चित करना कि चरम सीमाओं (मात्रात्मकता की निचली सीमा [एलएलओक्यू] या मात्रात्मकता की ऊपरी सीमा [यूएलओक्यू] तक पहुंचने वाले क्षेत्र) का अधिक नमूना न दें। एक परख के लिए आवश्यक वास्तविक सीमा, हालांकि, किसी दिए गए कमजोर पड़ने वाले कारक पर जैविक मैट्रिक्स (यानी, 'अज्ञात') में लक्ष्य विश्लेषण के वितरण से निर्धारित होती है। इसके अलावा, हालांकि मानक घटता आमतौर पर 4- या 5-पैरामीट्रिक फिट एल्गोरिथ्म के साथ रैखिक प्रतिगमन के माध्यम से व्याख्या की जाती है, किसी दिए गए वक्र का रैखिक भाग आमतौर पर मात्रात्मक सटीकता में सबसे बड़ा विश्वास प्रदान करता है रैखिक (वाई = एमएक्स + बी) मात्रात्मकता का मॉडल। किसी दिए गए कमजोर पड़ने कारक पर एक अज्ञात के लिए मनाया मूल्यों के लिए अंशांकन वक्र मिलान मात्रात्मक परख विकास में लक्ष्य होना चाहिए।
इस संबंध में, 1: 5 सीरियल कमजोर पड़ने की श्रृंखला के आधार पर एक 7-बिंदु मानक वक्र का मूल्यांकन स्पाइक एस 1, न्यूक्लियोकैप्सिड और मेम्ब्रेन एंटीबॉडी में से प्रत्येक के लिए किया गया था जो स्पाइक एस 1 और न्यूक्लियोकैप्सिड के लिए 1 μg / एमएल और 0.000064 μg / एमएल और झिल्ली के लिए 5 μg / एमएल और 0.00032 μg / एमएल के बीच है, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। प्रत्येक परख के लिए पता लगाने की निचली सीमा (एलएलओडी) को सबसे कम विश्लेषण एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया था जो इसकी पृष्ठभूमि से अलग सिग्नल प्राप्त करता था। एलएलओडी को पहलेवर्णित समीकरण द्वारा पहचाना जा सकता है 8,9, एलओओडी = एलओबी + 1.645 (एसडीकम एकाग्रता नमूना)। एलओबी रिक्त की निचली सीमा है, और यह विश्लेषण की "स्पष्ट" एकाग्रता है जो शून्य मान की उम्मीद होने पर रिक्त से उत्पन्न होती है, और इस समीकरण का उपयोग करके इसका पता लगाया जा सकता है एलओबी = मतलबरिक्त + 1.645 (एसडीरिक्त)8। इस पद्धति के आधार पर, स्पाइक एस 1 परख के लिए एमएफआई मान 134.38 से 20191.2 तक थे, जिसमें 134.38 एमएफआई 0.00024 μg / एमएल का प्रतिनिधित्व करता था और एलएलओडी के रूप में परिभाषित किया गया था। झिल्ली परख के लिए, व्यावहारिक एमएफआई रेंज 52.24 से 4764.9 थी, जिसमें 52.24 एमएफआई की गणना 0.004885 μg / एमएल थी और एलएलओडी के रूप में सौंपा गया था। न्यूक्लियोकैप्सिड परख के लिए एमएफआई रेंज 517.9 से 19666.34 थी, जिसमें 517.9 को 0.00024 μg / एमएल के रूप में निर्दिष्ट किया गया था, जो एलएलओडी था। पता लगाने की ऊपरी सीमा (यूएलओडी) को विश्लेषण की एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है जिसके बाद एमएफआई में परिवर्तन अब रैखिक नहीं है, और सिग्नल प्रतिक्रिया संतृप्त है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि न्यूक्लियोकैप्सिड वक्र के अपवाद के साथ परीक्षण किए गए मानकों के लिए इन वक्रों का पूर्ण सिग्मोइडल चरित्र अवलोकन योग्य नहीं है। हालांकि, आज तक परख किए गए सभी अज्ञात लोगों के लिए मनाया गया एमएफआई मान (1: 500 कमजोर पड़ने पर) प्रत्येक विश्लेषण के लिए प्रस्तुत वक्र सीमा के भीतर हैं और रैखिक प्रतिगमन के माध्यम से 4- या 5- पैरामीट्रिक फिट का उपयोग करके आसानी से मात्रा निर्धारित की जाती है।
परख परिशुद्धता
इंट्रा-परख परिशुद्धता: परख परिशुद्धता का आकलन करने के लिए एक ही प्लेट पर परख के चार प्रतिकृतियां की गईं, जिनकी गणना% सीवी के रूप में की गई, या मानक विचलन के भागफल और औसत 100 से गुणा किया गया। मानक अंक 2 और 5 को इन सारणीकरणों के लिए चुना गया था, तालिका 2 में सूचीबद्ध मानों के साथ। % सीवी मानों के लिए विशिष्ट स्वीकार्य ऊपरी सीमा थ्रेशोल्ड ≤20% है, जो इन डेटा के लिए मनाया गया था, झिल्ली आईजीजी के मानक 2 के अपवाद के साथ, जो संभवतः पृष्ठभूमि के स्तर से उत्पन्न होता है और बाहरी मूल्यों (डेटा नहीं दिखाया गया है) को समाप्त करके सुधारा जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि झिल्ली परख के लिए मूल्य पढ़ने के लिए एक स्पष्ट अस्थिरता देखी गई थी जहां एमएफआई मूल्य <200 थे, आमतौर पर आईजीए और आईजीएम आइसोटाइप के मामले में।
अंतर परख परिशुद्धता: मनका सेट के तीन अलग अलग बैचों प्रत्येक परख के लिए तैयार किए गए थे और परीक्षण किया, के रूप में इंट्रा परख परिशुद्धता के लिए परिभाषित (ऊपर और चित्रा 1 में देखा)। तालिका 3 में दिखाए गए अनुसार तीन बैचों में से प्रत्येक के लिए औसत परिणामों से % सीवी की गणना करके अंतर-परख परिवर्तनशीलता का मूल्यांकन किया गया था। फिर, स्वीकार्य % सीवी के लिए ऊपरी सीमा सीमा ≤20% पर सेट की गई है, जो परीक्षण की गई सभी स्थितियों के लिए मौजूद है (झिल्ली आईजीजी के मानक 2 के साथ एक समान प्रभाव के साथ, जैसा कि ऊपर देखा गया है)। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि शुद्ध एमएफआई मूल्यों में बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता आमतौर पर कस्टम परख विकास के दौरान एक ही इम्यूनोरेजेंट के कई बैचों के भीतर देखी जाती है। व्यावसायिक रूप से प्राप्त एंटी-टारगेट एंटीबॉडी (जैसे, खरगोश एंटी-स्पाइक एस 1) से निर्मित अंशांकन वक्र का उपयोग एक एंटी-प्रजाति डिटेक्शन एंटीबॉडी के बाद विश्लेषणात्मक परिणामों में स्थिरता प्रदान कर सकता है और विभिन्न अवधियों में कई बैचों के बीच तुलना की अनुमति दे सकता है।
मानव नमूनों के साथ अंतर-परख परिशुद्धता: सार्स-सीओवी-2 संक्रमण के लिए पहली बार रिपोर्ट किए गए लक्षणों के एक महीने के भीतर एकत्र किए गए मानव प्लाज्मा नमूनों (एन = 5) के साथ अंतर-परख परिशुद्धता का मूल्यांकन दोहराया गया था; परख के तीन अलग-अलग बैचों (यानी, मनका सेट की विभिन्न तैयारी) के साथ पूरा किया गया। इन परिणामों को तालिका 4 में दर्शाया गया है और ≤20% के विशिष्ट ऊपरी थ्रेशोल्ड सीमा मूल्य के साथ % सीवी मान के साथ सटीकता प्रदर्शित करते हैं। स्पाइक एस 1, न्यूक्लियोकैप्सिड और मेम्ब्रेन आईजीजी टाइटर्स के लिए औसत% सीवी मूल्यों की गणना क्रमशः 9.9% (रेंज 2.6% -18%), 11.0% (रेंज 3.5% -24.4%), और 7.6% (रेंज 3.2% -12.9%) की गई थी। इन तीन विश्लेषणों के आईजीएम और आईजीए टाइटर्स के साथ इसी तरह के अवलोकन किए गए थे, सभी% सीवी मान <20%) प्रदान करते हैं। इसका एकमात्र अपवाद झिल्ली प्रोटीन के लिए विषय 5 आईजीएम टाइटर्स था, जिसे बाद में एक बाहरी के रूप में बाहर रखा गया था। मानव विषय मूल्यांकन के लिए सटीक मूल्य खरगोश एंटीबॉडी के लिए ऊपर देखे गए लोगों के अनुरूप हैं, जो सुझाव देते हैं कि परख परिशुद्धता पर थोड़ा प्रभाव के साथ कई प्रजातियों में एंटीजन के टाइटर्स का मूल्यांकन करने के लिए इन परखों को आसानी से पुन: कॉन्फ़िगर किया जा सकता है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, झिल्ली परख के लिए देखे गए मूल्यों को पढ़ने के लिए एक स्पष्ट अस्थिरता थी जहां एमएफआई मूल्य <200 थे, आमतौर पर आईजीए और आईजीएम आइसोटाइप के मामले में।
प्राथमिक एंटीबॉडी एकाग्रता अनुकूलन
विश्लेषण 'कैप्चर टाइम' का मूल्यांकन एंटीजन-संयुग्मित मोतियों के साथ किया गया था, और प्लाज्मा नमूनों में या मानकों में एंटीबॉडी का परीक्षण प्राथमिक इनक्यूबेशन (30 मिनट, 1 घंटे, 2 घंटे और 4 घंटे) की लंबाई को संशोधित करके किया गया था। औसत एमएफआई में अंतर को एक विशिष्ट इनक्यूबेशन के भागफल और अधिकतम इनक्यूबेशन समय के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, जिसे चित्रा 2 में, 30 मिनट इनक्यूबेशन (न्यूनतम अवधि) और 4 घंटे इनक्यूबेशन (अधिकतम अवधि) के बीच कहा जाता है। 120 मिनट में मान स्पाइक एस 1, झिल्ली और न्यूक्लियोकैप्सिड एंटीबॉडी के लिए आईजीजी टाइटर्स के लिए इष्टतम थे, जो एक तेजी से प्राथमिक एंटीबॉडी बाध्यकारी कैनेटीक्स का संकेत देते हैं, जिससे लचीलापन परख थ्रूपुट बढ़ाने की अनुमति देता है। हालांकि, धीमी गति से कैनेटीक्स आईजीए और आईजीएम (डेटा नहीं दिखाया गया) आइसोटाइप के लिए मनाया गया था, 4 घंटे के समय बिंदु पर चोटी पर कब्जा स्तर का प्रदर्शन, जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है। कुल मिलाकर, वहाँ परख संतृप्ति और उत्पादन में (थ्रूपुट को अधिकतम करने के लिए) जब प्रत्येक परख चलाने के लिए व्यावहारिक समय समीचीनता के दृष्टिकोण के बीच एक संतुलन है। इसके साथ, आईजीजी के लिए 30 मिनट, आईजीएम के लिए 60 मिनट और आईजीए के लिए 120 मिनट के न्यूनतम इनक्यूबेशन समय पर मात्रात्मक उद्देश्यों के लिए उपयुक्त संकेत इन निष्कर्षों में देखे गए थे।
माध्यमिक एंटीबॉडी एकाग्रता अनुकूलन
माध्यमिक एंटीबॉडी की पांच सांद्रता (बकरी विरोधी मानव आईजीजी, पीई-संयुग्मित; बकरी विरोधी मानव आईजीए, पीई-संयुग्मित; बकरी विरोधी मानव आईजीएम, एसबी-संयुग्मित) का परीक्षण किया गया (0.5, 1, 2, 4, और 8 μg / सभी एंटीबॉडी ने सिग्नल की विस्तृत श्रृंखला का खुलासा किया, जिसमें किसी भी स्थिति में कोई स्पष्ट सिग्नल संतृप्ति नहीं थी, जिससे किसी भी सांद्रता के लिए रैखिक माप सुनिश्चित होता है। एक उदाहरण के रूप में, बकरी विरोधी मानव आईजीएम का उपयोग करके स्पाइक एस 1 परख से उत्पन्न औसत संकेत, 0.5 μg / एमएल पर एसबी-संयुग्मित अधिकतम सिग्नल (8 μg / एमएल) से उत्पन्न एमएफआई का 13.2% था, जबकि 4 μg / एमएल से उत्पन्न एमएफआई अधिकतम सिग्नल पर प्रकट एमएफआई का 73.3% था। अन्य स्पाइक एस 1 एंटीबॉडी आइसोटाइप, मेम्ब्रेन एंटीबॉडी और न्यूक्लियोकैप्सिड एंटीबॉडी से संकेतों की सीमा का विवरण तालिका 5 और चित्रा 3 में शामिल हैं। एक व्यावहारिक बिंदु के रूप में, इष्टतम माध्यमिक एंटीबॉडी एकाग्रता और पहले से कहा 4 μg / एमएल माध्यमिक एंटीबॉडी एकाग्रता के बीच प्राथमिक प्रभाव परख संवेदनशीलता और परख लागत के संदर्भ में परिलक्षित होता है। एमएल माध्यमिक एंटीबॉडी एकाग्रता कम एंटीबॉडी टाइटर्स या मूल्यवान नमूने की कम मात्रा के साथ आवेदन के लिए वांछनीय हो सकती है, लेकिन इन परखों से जुड़ी लागत पहले परिभाषित 4 μg / एमएल एकाग्रता के उपयोग की तुलना में काफी अधिक होगी। इसके विपरीत, ऐसे उदाहरण जिनमें उच्च एंटीबॉडी टाइटर्स देखे जाने थे (जैसे कि ऐसे व्यक्ति जिन्होंने कोविद -19 टीकाकरण का अनुभव किया है या सेरा की गैर-सीमित मात्रा के साथ) माध्यमिक एंटीबॉडी की कम मात्रा (जैसे, 1 μg / एमएल) के आवेदन के माध्यम से लागत-लाभ देखेंगे।
माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन अनुकूलन
माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन की अवधि के संभावित प्रभाव की भी इनक्यूबेशन (15, 30, 60 और 120 मिनट) की लंबाई को संशोधित करके जांच की गई थी। आम तौर पर, औसत एमएफआई में अंतर एक विशिष्ट इनक्यूबेशन के भागफल के रूप में प्रस्तुत किया जाता है और अधिकतम इनक्यूबेशन समय, जिसे % मैक्स कहा जाता है, 15 मिनट इनक्यूबेशन (न्यूनतम अवधि) और 120 मिनट इनक्यूबेशन (अधिकतम अवधि) के बीच क्रमशः स्पाइक एस 1, झिल्ली और न्यूक्लियोकैप्सिड एंटीबॉडी के लिए 30%, 55% और 50% से अधिक नहीं था, जो माध्यमिक एंटीबॉडी बाध्यकारी में एक तेज गतिज कदम और परख बढ़ाने के साधन का संकेत देता है। तालिका 6 में सभी इनक्यूबेशन समय के लिए सिग्नल परिवर्तनों पर विवरण शामिल हैं। इस विश्लेषण के विभिन्न ऊष्मायन से मनाया संकेतों के चित्र चित्रा 4 में दिखाए गए हैं।
दोहरे चैनल प्रदर्शन और विशिष्टता
प्रत्येक विश्लेषण के लिए, एक एकल रिपोर्टर प्रारूप रन (आईजीजी-पीई केवल, आईजीए-पीई केवल, या आईजीएम-एसबी केवल) की तुलना उसी विश्लेषण के लिए उत्पन्न सिग्नल से की गई थी जब इसे दोहरे रिपोर्टर प्रारूप में चलाया गया था (उदाहरण के लिए, स्पाइक एस 1 आईजीजी-पीई केवल स्पाइक एस 1 आईजीजी-पीई बनाम स्पाइक एस 1 आईजीजी-पीई दोहरे रिपोर्टर प्रारूप में)। दो प्रारूपों में बनाए गए संकेतों के लिए परख परिशुद्धता (% सीवी के रूप में व्यक्त) का उपयोग इस प्रयोग के निष्कर्षों में संबंधों का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। स्पाइक एस 1 परख के% सीवी मान क्रमशः आईजीएम, आईजीजी और आईजीए के लिए 6.19%, 16.4% और 23% थे। झिल्ली परख के लिए, आईजीएम, आईजीजी और आईजीए के लिए% सीवी मान क्रमशः 3.3%, 7.9% और 16.4% थे। अंत में, न्यूक्लियोकैप्सिड परख ने क्रमशः आईजीएम, आईजीजी और आईजीए के लिए 8.7%, 10.3% और 24.2% पर% सीवी मान प्रदान किए। आईजीएम और आईजीए आइसोटाइप के लिए देखे गए सटीक मूल्यों से पता चलता है कि इम्युनोग्लोबुलिन के इन वर्गों में ज्ञात बाध्यकारी गतिज मतभेदों के कारण लंबे समय तक इनक्यूबेशन बेहतर परख परिणाम प्रदान कर सकते हैं। चित्रा 4 माध्यमिक एंटीबॉडी के विभिन्न सांद्रता के प्रारूपों के बीच समझौते को दर्शाता है।
रिपोर्टर चैनलों की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए, एक समय में एक एकल रिपोर्टर चैनल का परीक्षण किया गया था, जबकि दूसरे चैनल को गैर-विशिष्ट सिग्नल (रक्तस्राव प्रभाव) के बारे में पूछताछ करने के लिए रिक्त स्थान के रूप में सौंपा गया था। इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि स्थितियों के स्पेक्ट्रम में उच्च विशिष्टता को देखते हुए, दो रिपोर्टर चैनलों के बीच नगण्य क्रॉस-सिग्नल संदूषण है। इन निष्कर्षों को चित्रा 5 में सचित्र किया गया है। कुल मिलाकर, हमने चैनल 1 से चैनल 2 में 6.45% हस्तक्षेप देखा। हालांकि, जब संकेतों के परिमाण का हिसाब लगाया गया था, तो हमने दोहरी रिपोर्टर मोड में निम्नलिखित संभावित हस्तक्षेप स्तरदेखे: 71.98% पर स्पाइक आईजीजी / आईजीएम, 28.11% पर स्पाइक आईजीए / आईजीएम; 7.41% पर झिल्ली आईजीजी / आईजीएम, 134.61% पर झिल्ली आईजीए / आईजीएम; और न्यूक्लियोकैप्सिड आईजीजी / आईजीएम 146.03%, न्यूक्लियोकैप्सिड आईजीए / आईजीएम 112.13% पर। निर्दिष्ट कॉन्फ़िगरेशन में, इसके लिए आईजीए आइसोटाइप के साथ संयोजन में स्पाइक आईजीएम, आईजीएम आइसोटाइप के साथ मेम्ब्रेन आईजीएम और दोहरे चैनल प्रारूप में नहीं किए गए न्यूक्लियोकैप्सिड माप की आवश्यकता होगी। इस खोज को लेबलिंग रणनीति के व्युत्क्रम की खोज की आवश्यकता हो सकती है जिससे आईजीए और आईजीजी को चैनल 2 में और आईजीएम को चैनल 1 में मापा जा सकता है।
कोविड-19 टीकाकरण के बाद सीरोकनवर्जन की घटनाओं का मूल्यांकन
कोविड-19 टीकाकरण श्रृंखला के पूरा होने के चार महीने बाद टीकाकरण से पहले के समय बिंदुओं पर स्पाइक एस 1 परख के साथ आईजीए, आईजीएम और आईजीजी के मूल्यांकन पर चार विषयों में सीरोकनवर्जन की निगरानी की गई थी। माप दोहरे चैनल मोड (आईजीजी / आईजीएम और आईजीए / आईजीएम, आईजीएम मूल्यों के साथ औसत) में पूरा किया गया था। सभी विषयों को पहली और दूसरी खुराक के बीच 21 दिनों के अंतराल के साथ, प्रति मानक अभ्यास के अनुसार 2-चरण टीकाकरण के रूप में टीका प्राप्त हुआ। प्रत्येक विषय की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के भूखंडों को चित्रा 6 ए-सी में दिखाया गया है। न्यूक्लियोकैप्सिड और मेम्ब्रेन एंटीजन के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मूल्यों का मूल्यांकन किए गए सभी इम्युनोग्लोबुलिन (डेटा नहीं दिखाया गया) के लिए पृष्ठभूमि के स्तर पर देखा गया था, जो टीकाकरण से पहले के समय में सार्स-सीओवी-2 संक्रमण से पहले कोई प्रलेखित नहीं होने वाले विषयों के अनुरूप था। कुल मिलाकर, मनाया गया स्पाइक एस 1 आईजीए और आईजीएम मान आईजीजी आइसोटाइप टाइटर्स की तुलना में लगभग 40 गुना कम थे, जिसमें आईजीएम और आईजीजी आइसोटाइप दोनों के लिए पीक टाइटर्स 14 दिनों के रूप में क्रेस्टिंग हो रहे थे और आईजीए आइसोटाइप दूसरी खुराक (दिन 0) और दूसरी खुराक के 14 दिनों के बीच पीक टाइटर्स तक पहुंच गया था, विषय के आधार पर। विशेष रूप से, स्पाइक एस 1 आईजीजी टाइटर्स विषय-निर्भर तरीके से अत्यधिक परिवर्तनशील दर पर टीकाकरण के पूरा होने के बाद चार महीनों के दौरान क्षय होने लगते हैं।
चित्रा 1: प्रतिनिधि 3-प्लेक्स मानक घटता। तीन विश्लेषणों के लिए प्रतिनिधि मानक घटता; 7-बिंदु, 1: 5 सीरियल कमजोर पड़ने वक्र के रूप में प्रस्तुत किया गया है जो (ए) स्पाइक एस 1 के लिए 1 μg / एमएल, (बी) झिल्ली के लिए 5 μg / एमएल, और (सी) न्यूक्लियोकैप्सिड और एंटीबॉडी के लिए 1 μg / एमएल से शुरू होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
नमूना इनक्यूबेशन समय अनुकूलन: मानकों 1-7 के लिए 30 मिनट से 4 घंटे तक प्राथमिक एंटीबॉडी /नमूने (एंटीबॉडी कैप्चर) के विभिन्न इनक्यूबेशन समय से उत्पादित औसत एमएफआई सिग्नल (जैसा कि तालिका 1 में दर्शाया गया है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: माध्यमिक एंटीबॉडी एकाग्रता अनुकूलन और दोहरी चैनल प्रदर्शन। घटता औसत एमएफआई (श्रृंखला में उच्चतम दर्ज मूल्य के लिए सामान्यीकृत) परीक्षण माध्यमिक एंटीबॉडी सांद्रता से उत्पादित, 0.5-8 μg / प्रत्येक उदाहरण प्रयोगात्मक प्रारूप में मतभेदों की सराहना करने के लिए एक एकल और दोहरी चैनल परख दोनों के रूप में प्रदर्शन किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन समय अनुकूलन, दोहरी चैनल प्रारूप। माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन के समय के संबंध में मनाया एमएफआई मूल्यों (श्रृंखला में उच्चतम दर्ज मूल्य के लिए सामान्यीकृत) के प्रतिनिधि भूखंड। प्रयोगों को (ए-सी) आईजीए / आईजीएम या (डी-एफ) आईजीजी / आईजीएम संयोजनों के रूप में दोहरे चैनल परख के रूप में किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: दोहरी चैनल परख के लिए विशिष्टता आकलन। क्रॉस-चैनल फ्लोरोसेंट या हस्तक्षेप की कमी को स्पष्ट करने के लिए रिक्त के रूप में नामित प्रत्येक संयोजन में से एक के साथ दोहरी चैनल परख प्रारूप के परख परिणाम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 6: कोविड-19 टीकाकरण के बाद सीरोकनवर्जन का चित्रण। कोविद -19 टीकाकरण के दौरान स्पाइक एस 1 एंटीजन के लिए (ए) आईजीजी, (बी) आईजीएम, और (सी) आईजीए एंटीबॉडी के सापेक्ष टाइटर्स को दर्शाने वाले भूखंड (पूर्व-टीकाकरण - पूरा होने के 4 महीने बाद); टीकाकरण श्रृंखला के पूरा होने के सापेक्ष दिनों में समय दिखाया गया है; टीका प्रशासन के सामान्य बिंदुओं को इंगित किया जाता है (लाल रेखाएं)। प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में प्रयोगों दोहरी चैनल मोड में प्रदर्शन किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| मानक संख्या | कमजोर पड़ने की श्रृंखला | एंटी-स्पाइक एस 1 या एन (μg / | विरोधी झिल्ली (μg / |
| कोरा | कोरा | - | - |
| 1 | एसटीडी 7 1:1 | 1 | 5 |
| 2 | एसटीडी 6 1:5 | 0.2 | 1 |
| 3 | एसटीडी 5 1:25 | 0.04 | 0.2 |
| 4 | एसटीडी 4 1:125 | 0.008 | 0.04 |
| 5 | एसटीडी 3 1:625 | 0.0016 | 0.008 |
| 6 | एसटीडी 2 1:3125 | 0.00032 | 0.0016 |
| 7 | एसटीडी 1 1:15625 | 0.000064 | 0.00032 |
तालिका 1: मानक घटता के लिए कमजोर पड़ने श्रृंखला: आईजीजी सीरोटाइप के लिए मानक घटता के लिए उपयोग किए जाने वाले कमजोर पड़ने वाले कारकों की तालिका; α-स्पाइक एस 1 और α-न्यूक्लियोकैप्सिड के लिए 1 μg / एमएल से शुरू होने वाले 7-बिंदु, 1: 5 सीरियल कमजोर पड़ने वक्र और α-झिल्ली एंटीबॉडी के लिए 5 μg / एमएल के रूप में प्रस्तुत किया गया है।
| विश्लेषण करें | नमूना | प्रतिनिधि 1 | प्रतिनिधि 2 | प्रतिनिधि 3 | प्रतिनिधि 4 | एवेन्यू | एसडी | %CV |
| स्पाइक एस 1 | एसटीडी 2 | 369.4 | 356.9 | 295.2 | 271.5 | 323.3 | 47.4 | 14.6 |
| एसटीडी 5 | 3869.1 | 3437 | 3970.2 | 4240.7 | 3879.3 | 334 | 8.6 | |
| झिल्ली | एसटीडी 2 | 40.6 | 37.7 | 49.9 | 27.8 | 39 | 9.1 | 23.3 |
| एसटीडी 5 | 733.2 | 731.3 | 724 | 678.1 | 716.7 | 26 | 3.6 | |
| न्यूक्लियोकैप्सिड | एसटीडी 2 | 1746.7 | 1790.8 | 1577.3 | 1664.8 | 1694.9 | 94.2 | 5.6 |
| एसटीडी 5 | 15598.1 | 14735.5 | 18369.5 | 17408.5 | 16527.9 | 1657.7 | 10 |
तालिका 2: इंट्रा-परख परिशुद्धता: विचरण का प्रतिशत गुणांक (% सीवी) एक ही प्रयोग में एक एकल परख बैच के साथ मानक 2 (एसटीडी 2) और मानक 5 (एसटीडी 5) पर मानक एंटीबॉडी मिश्रण के चार प्रतिकृतियों से गणना की जाती है। प्रतिकृति और औसत के लिए प्रदान किए गए मान देखे गए एमएफआई मानों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
| विश्लेषण करें | नमूना | बैच 1 | बैच 2 | बैच 3 | एवेन्यू | एसडी | %CV |
| स्पाइक एस 1 | एसटीडी 2 | 383.2 | 424.4 | 379.9 | 395.8 | 24.8 | 6.3 |
| एसटीडी 5 | 5639.7 | 6062.5 | 6384.3 | 6028.8 | 373.4 | 6.2 | |
| झिल्ली | एसटीडी 2 | 39.1 | 58.5 | 59.1 | 52.2 | 11.4 | 21.8 |
| एसटीडी 5 | 732.3 | 941.4 | 701.1 | 791.6 | 130.7 | 16.5 | |
| न्यूक्लियोकैप्सिड | एसटीडी 2 | 1342.6 | 1621 | 1718.2 | 1560.6 | 195 | 12.5 |
| एसटीडी 5 | 13543.9 | 14843.2 | 17883.4 | 15423.5 | 2227.2 | 14.4 |
तालिका 3: मानक नमूनों के साथ अंतर परख परिशुद्धता: विचरण का प्रतिशत गुणांक (% सीवी) परख के तीन अलग-अलग बैचों से गणना की जाती है, एक ही प्रयोग में मानक 2 और मानक 5 पर मूल्यांकन किया जाता है। प्रतिकृति और औसत के लिए प्रदान किए गए मान देखे गए एमएफआई मानों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
| आईजीजी-पीई | आईजीएम-एसबी | आईजीए-पीई | |||||
| एमएफआई | %CV | एमएफआई | %CV | एमएफआई | %CV | ||
| स्पाइक एस 1 | विषय 1 | 8002.3 | 17.7 | 1949.5 | 1.3 | 2045.8 | 5.5 |
| विषय 2 | 19155.8 | 7.3 | 918.6 | 4.1 | 1684.5 | 3.9 | |
| विषय 3 | 17865.6 | 18.0 | 549.4 | 3.8 | 961.3 | 8.1 | |
| विषय 4 | 11901.1 | 2.6 | 1603 | 4.8 | 8736.4 | 5.5 | |
| विषय 5 | 9801.8 | 4.0 | 1014.1 | 3.0 | 2747.6 | 9.3 | |
| न्यूक्लियोकैप्सिड | विषय 1 | 15097.8 | 11.3 | 1049.7 | 9.9 | 5276.5 | 3.9 |
| विषय 2 | 15204.3 | 12.1 | 265.9 | 5.2 | 6761.3 | 11.9 | |
| विषय 3 | 18471.7 | 24.4 | 329.1 | 4.5 | 14308 | 2.9 | |
| विषय 4 | 16424.7 | 3.5 | 2418.1 | 0.1 | 4234.7 | 4.2 | |
| विषय 5 | 13344.9 | 3.6 | 225.6 | 10.0 | 13436.5 | 9.7 | |
| झिल्ली | विषय 1 | 514.6 | 8.6 | 180.6 | 14.0 | 141.2 | 9.8 |
| विषय 2 | 196.8 | 5.2 | 57 | 20.7 | 55.5 | 13.0 | |
| विषय 3 | 553.7 | 12.9 | 54.5 | 21.2 | 191.2 | 18.6 | |
| विषय 4 | 377.9 | 3.2 | 68.1 | 22.1 | 62 | 2.3 | |
| विषय 5 | 325.4 | 8.2 | 11.4 | 91.6 | 74.6 | 20.8 |
तालिका 4: मानव नमूनों के साथ अंतर परख परिशुद्धता: सार्स-सीओवी-2 संक्रमण वाले पांच मानव विषयों से प्लाज्मा नमूनों (500 गुना पतला) के साथ परीक्षण किए गए परख के तीन बैचों से गणना की गई विचरण (% सीवी) का औसत प्रतिशत गुणांक।
| स्पाइक एस 1 | झिल्ली | न्यूक्लियोकैप्सिड | |||||
| μg/एमएल | एमएफआई | % अधिकतम। | एमएफआई | % अधिकतम। | एमएफआई | % अधिकतम। | |
| आईजीएम | 0.5 | 186 | 13.2 | 32 | 25.2 | 132.7 | 13.6 |
| 1 | 304.2 | 21.6 | 45.8 | 36 | 194.4 | 19.9 | |
| 2 | 664.5 | 47.2 | 78.8 | 61.9 | 458.2 | 47 | |
| 4 | 1032.1 | 73.3 | 101.3 | 79.6 | 707.8 | 72.6 | |
| 8 | 1407.1 | 100 | 127.2 | 100 | 975 | 100 | |
| आईजीजी | 0.5 | 809.7 | 4.9 | 27.5 | 15 | 1355.6 | 6.3 |
| 1 | 1696.9 | 10.2 | 40.6 | 22.2 | 2782.1 | 13 | |
| 2 | 4543.8 | 27.3 | 68.3 | 37.3 | 6661.2 | 31.2 | |
| 4 | 10003.5 | 60 | 110.7 | 60.5 | 12605.6 | 59 | |
| 8 | 16662.8 | 100 | 182.9 | 100 | 21360.6 | 100 | |
| आईजीए | 0.5 | 797.4 | 19.3 | 31.1 | 47.2 | 2056.5 | 16.1 |
| 1 | 1529.5 | 37 | 41.4 | 62.8 | 3869 | 30.4 | |
| 2 | 2261.3 | 54.7 | 48.6 | 73.3 | 6648.9 | 52.2 | |
| 4 | 2320.4 | 56.2 | 48.3 | 73.2 | 6548.1 | 51.4 | |
| 8 | 4132.2 | 100 | 65.9 | 100 | 12744.8 | 100 | |
तालिका 5: माध्यमिक एंटीबॉडी एकाग्रता अनुकूलन: औसत एमएफआई सिग्नल माध्यमिक एंटीबॉडी की विभिन्न सांद्रता से उत्पन्न होता है जो 0.5 μg / एमएल से 8 μg / एमएल तक होता है। प्रत्येक सिग्नल का मूल्य सापेक्ष सिग्नल परिमाण प्रदर्शित करने के लिए 8 μg / एमएल ("अधिकतम") पर सिग्नल के प्रतिशत के रूप में भी प्रस्तुत किया जाता है।
| स्पाइक एस 1 | झिल्ली | न्यूक्लियोकैप्सिड | |||||
| इनक्यूबेशन समय (न्यूनतम) | एमएफआई | % अधिकतम। | एमएफआई | % अधिकतम। | एमएफआई | % अधिकतम। | |
| आईजीएम | 15 | 1185 | 72.2 | 40.4 | 48.9 | 609.5 | 53.3 |
| 30 | 1416.6 | 86.3 | 58.4 | 70.7 | 894.2 | 78.2 | |
| 60 | 1324.8 | 80.7 | 73.6 | 89.1 | 945.6 | 82.7 | |
| 120 | 1641.2 | 100 | 82.6 | 100 | 1143.2 | 100 | |
| आईजीजी | 15 | 12917.6 | 80.5 | 244.4 | 44.9 | 15429.8 | 80.8 |
| 30 | 14915.4 | 92.9 | 434.7 | 79.9 | 18797 | 98.5 | |
| 60 | 15340.3 | 95.6 | 421.4 | 77.5 | 18694.4 | 97.9 | |
| 120 | 16050.3 | 100 | 544 | 100 | 19085.8 | 100 | |
| आईजीए | 15 | 3141.9 | 78.2 | 75 | 66.8 | 9103 | 86.6 |
| 30 | 3569.1 | 88.8 | 83.9 | 74.8 | 9563.8 | 91 | |
| 60 | 3539.1 | 88 | 86 | 76.6 | 9555.7 | 90.9 | |
| 120 | 4020 | 100 | 112.2 | 100 | 10512.9 | 100 |
तालिका 6: माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन समय अनुकूलन: औसत एमएफआई सिग्नल 15 मिनट से 120 मिनट तक माध्यमिक एंटीबॉडी के विभिन्न इनक्यूबेशन समय से उत्पन्न होता है। प्रत्येक सिग्नल के मूल्य को सापेक्ष सिग्नल परिमाण प्रदर्शित करने के लिए 120 मिनट ("मैक्स") पर सिग्नल के प्रतिशत के रूप में भी दर्शाया जाता है।
Discussion
संक्रमण की स्थिति की आरटी-पीसीआर-आधारित निगरानी के साथ सार्स-सीओवी-2 एक्सपोजर के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की सराहना को कोविड-19 से वसूली के पाठ्यक्रम को स्पष्ट करने, संभावित चिकित्सीय मूल्य के साथ प्लाज्मा की पहचान करने के साधन के रूप में काम करने और जनसंख्या-पैमाने के आधार पर10,11 पर संक्रमण दर का सर्वेक्षण करने के लिए एक नुस्खे के रूप में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है। मानव विषयों में सीरोकनवर्जन को समझने के विभिन्न उदाहरणों में प्रोटीन (एंटीजन) सरणियां12, इम्यूनोब्लॉट्स13, रैपिड इम्यूनोक्रोमैटोग्राफिक निर्माण14, और एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) 15,16,17 शामिल हैं। इनमें से प्रत्येक उपरोक्त तकनीक मामूली संशोधनों के साथ व्यक्तिगत रूप से कई इम्युनोग्लोबुलिन आइसोटाइप का आकलन कर सकती है। हालांकि, ये प्रक्रियाएं व्यावहारिक रूप से कई आइसोटाइप के समानांतर विश्लेषण की अनुमति देने में सक्षम नहीं हैं, जैसा कि इस पांडुलिपि में प्रस्तुत किया गया है, जनसंख्या-आधारित पैमाने पर परीक्षण रणनीति पर उनके प्रशासन के लिए सीमाओं के रूप में लागत और थ्रूपुट कारकों का प्रतिपादन। इनमें से कई अनुप्रयोग समानांतर में कई एंटीजन के स्तर को या तो प्रस्तुत या परिवर्तित प्रारूपों में संयोजित करने का अवसर प्रदान करते हैं, जैसे कि मल्टीप्लेक्स एलिसा18,19। अंत में, इम्यूनोबीड प्लेटफ़ॉर्म समानांतर20,21 में कई एंटीजन के स्तर का मूल्यांकन करने की संभावना की आपूर्ति करता है, लेकिन प्रति परख एक एकल एपिटोप (यानी, इम्युनोग्लोबुलिन आइसोटाइप) तक सीमित है, हालांकि, 'दोहरे चैनल' परख क्षमताओं के साथ हालिया उपकरण नियोजित नहीं किया जाता है।
इस रिपोर्ट में, प्रोटोकॉल की गणना की गई है जो कोविड-19-टीकाकरण वाले व्यक्तियों के सीरोकनवर्जन के केस स्टडी में 'डुअल-चैनल' मोड में उपकरण का उपयोग करके इम्यूनोबीड परख में कई एपिटोप्स के विश्वसनीय माप को स्थापित करते हैं। विधि ने प्रयोगशाला स्वचालित प्रणालियों के एकीकरण के साथ सुधार किया जा सकता है कि मैनुअल परख डिजाइन का उपयोग कर उत्कृष्ट परिशुद्धता (% सीवी मूल्यों आमतौर पर <20%) का प्रदर्शन किया। सभी चयनित विश्लेषणों और एपिटोप्स के लिए परख संवेदनशीलता और गतिशील रेंज नियमित मूल्यांकन के लिए उपयुक्त थे। यद्यपि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटी-एंटीजन आईजीए और आईजीएम इम्यूनोरेजेंट की कमी आईजीजी आइसोटाइप के लिए सीमित मात्रा में है, इस तरह का प्रतिबंध एक विशिष्ट नमूने के सापेक्ष अर्ध-मात्रात्मक आकलन या आकलन की पेशकश करने की क्षमता को बाधित नहीं करता है।
मान्य इम्यूनोबीड परख को कोविड -19 वैक्सीन के साथ प्रतिरक्षित व्यक्तियों के एक समूह में सीरोकनवर्जन की जांच के लिए आवंटित किया गया था। अन्य समान प्लेटफार्मों के विपरीत, इंस्ट्रूमेंटेशन का परिवार मैनुअल वर्कफ़्लो में प्रति दिन सैकड़ों व्यक्तियों में और एक स्वचालित योजना में प्रति दिन हजारों लोगों में सीरोकनवर्जन की पूर्वेक्षण की अनुमति देता है। कुल मिलाकर, ये निष्कर्ष पुष्टि करते हैं कि 'दोहरे चैनल' दृष्टिकोण में समान परख के लिए समानांतर में कई एपिटोप के विवरण के लिए उपयुक्त संवेदनशीलता है और एक बहुविश्लेषण संदर्भ में व्यवहार्य है। चैनल 1 और चैनल 2 के प्रति संवेदनशीलता में अंतर, जैसा कि क्रमशः फाइकोएरिथ्रिन और सुपर ब्राइट 436 फ्लोरोफोरस के साथ किया जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए एक विशिष्ट प्रयोग के डिजाइन को वारंट कर सकता है कि किसी दिए गए प्रयोग के लिए व्यवहार्य विश्लेषणात्मक परिणाम प्राप्त किए जाते हैं। यही है, कम प्रसार के एपिटोप्स या विश्लेषण के लिए चैनल 1 का आरक्षण परख की एक गतिशील सीमा को बनाए रखने के लिए आवश्यक हो सकता है जिसमें अज्ञात के देखे गए मूल्य शामिल हैं। इस विचार से परे, परख डिजाइन स्पष्ट था और सीमित विश्लेषणात्मक क्षमताओं के साथ प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से सुलभ होना चाहिए। निश्चित रूप से, चैनल 1 से चैनल 2 हस्तक्षेप पर विचार करते समय इस विचार को तौला जाना चाहिए, जैसा कि हमने चित्रा 5 के लिए नोट किया है, जिससे उच्च बहुतायत आइसोटाइप से हस्तक्षेप दोहरे चैनल प्रारूप में मापा जाने पर बहुत कम बहुतायत में उन लोगों के लिए भ्रामक विश्लेषणात्मक त्रुटियों का कारण बन सकता है। अत्यधिक अलग विश्लेषण सांद्रता के साथ स्थितियों के साथ हस्तक्षेप के लिए इस क्षमता दृष्टिकोण के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं अगर परख डिजाइन चरण में ठीक से संभाला नहीं है।
अंत में, कोविड -19 संक्रमण या टीकाकरण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से जुड़े प्रमुख इम्युनोग्लोबुलिन आइसोटाइप से एंटीबॉडी टाइटर्स को तेजी से मापने की एक विधि प्रस्तुत की गई थी। सीरोकनवर्जन का आकलन करने के लिए अनुदैर्ध्य फैशन में इस दृष्टिकोण को लागू करने से अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सकती है जिसका उपयोग बीमारी के पाठ्यक्रम का प्रबंधन और / या निगरानी करने के लिए बेहतर तरीके से किया जा सकता है या वैकल्पिक रूप से, संभावित कोविड -19 बूस्टर वैक्सीन कार्यक्रमों का मार्गदर्शन किया जा सकता है।
Disclosures
बोर्गिया इस पांडुलिपि में उपयोग किए जाने वाले सीरोलॉजिकल परीक्षण के आविष्कारक हैं जो पेटेंट लंबित है। लेख केवल वर्णनात्मक तरीके से प्रस्तुत किया गया है जिसमें लेखक संघर्ष द्वारा पेश किए गए संभावित पूर्वाग्रह से बचने के लिए कोई सांख्यिकीय विश्लेषण प्रस्तुत नहीं किया गया है।
Acknowledgments
लेखक अपनी सुविधाओं के उपयोग के लिए रश बायोमार्कर डेवलपमेंट कोर, विषय नामांकन और बायोस्पेशीमेन प्रसंस्करण के लिए रश बायोरिपोजिटरी, और वाल्डर फाउंडेशन के शिकागो कोरोनावायरस असेसमेंट नेटवर्क (शिकागो कैन) इनिशिएटिव अनुदान संख्या एससीआई 16 (जेआरएस और जेएबी) और 21-00147 (जेआरएस और जेएबी) और स्विम एक्रॉस अमेरिका फाउंडेशन (जेएबी) से एक पुरस्कार का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well black side polystyrene microtiter plates | Thermo Fisher | 12-565-346 | |
| Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Prepared in house | ||
| Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Bovine Serum Albumin, heat shock fraction | MilliporeSigma | A-7888-50G | |
| Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0) | Prepared in house | ||
| COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag) | MyBioSource | MBS8574735 | |
| Disposable pipette tips | |||
| EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher | PIA35391 | |
| Goat Albumin, Fraction V Powder | MilliporeSigma | A2514-1G | |
| IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB205009 | |
| IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB204009 | |
| IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB403009 | |
| IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB202009 | |
| IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4 | Thermo Fisher | 62999842 | |
| Instrument Analyzer | Luminex Corp. | INTELLIFLEX-RUO | |
| Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Thermo Fisher | 13-698-794 | |
| MagPlex-C Microspheres, Region XXX | Luminex Corp. | MC10XXX-01 | |
| MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate) | MilliporeSigma | M2933 | |
| Microplate aluminum sealing tape | Thermo Fisher | 07-200-683 | |
| Polysorbate-20 | Thermo Fisher | BP337-500 | |
| Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2 | Thermo Fisher | 50-751-7328 | |
| Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag) | Sino Biologicals | 40588-V08B | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag) | Sino Biologicals | 40591-V08H | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb | Sino Biologicals | 40592-T62 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb | Sino Biologicals | 40588-R0004 | |
| SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb | ProSci | 10-516 | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher | PIA39269 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Water, LC/MS grade | Thermo Fisher | W-64 |
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