Summary
توضح هذه المقالة طريقة ملائمة لمراقبة التغيرات الديناميكية في عيارات الأجسام المضادة لنمطين متماثلين من الغلوبولين المناعي في وقت واحد (إما IgA أو IgM أو IgG) الناتجة عن استجابة مناعية لعدوى SARS-CoV-2 أو التطعيم. تستخدم "لوحة الاستجابة المناعية ل Covid-19 متعددة التحليلات" ثلاثة اختبارات مناعية غير مباشرة مبنية على الميكروسفير المشفر الذي تتم قراءته باستخدام قارئ متعدد الإرسال قائم على التدفق مع إمكانية "القناة المزدوجة".
Abstract
والتكنولوجيات المتعددة الإرسال لاستجواب المؤشرات الحيوية المتعددة متضافرة موجودة منذ عدة عقود؛ ومع ذلك ، فإن طرق تقييم ظواهر متعددة على نفس التحليل لا تزال محدودة. يصف هذا التقرير تطوير وتحسين مقايسة الخرزة المناعية متعددة الإرسال للاختبار المصلي لأنماط الغلوبولين المناعي الشائعة (مثل IgA و IgM و IgG) المرتبطة بالاستجابة المناعية لعدوى SARS-CoV-2 أو التطعيم. تم إجراء الفحوصات باستخدام قارئ فلورسنت متعدد الإرسال قائم على التدفق مع إمكانية القناة المزدوجة. ركزت التحسينات على وقت التقاط التحليل ، وتركيز الأجسام المضادة للكشف ، ووقت حضانة الأجسام المضادة الكشف. تم تحديد خصائص أداء المقايسة التحليلية (على سبيل المثال ، نطاق الفحص (بما في ذلك الحدود الدنيا والعليا للقياس الكمي) ؛ والدقة داخل وبين المقايسة) إما لمجموعة النمط المصلي IgG / IgM أو IgA / IgM جنبا إلى جنب باستخدام وضع "القناة المزدوجة". كانت أوقات التقاط التحليل البالغة 30 دقيقة ل IgG و 60 دقيقة ل IgM و 120 دقيقة ل IgA مناسبة لمعظم التطبيقات ، مما يوفر توازنا بين أداء الفحص والإنتاجية. وقد لوحظت حضانات الأجسام المضادة المثلى للكشف عند 4 ميكروغرام/مل لمدة 30 دقيقة، وهي موصى بها للتطبيقات العامة، نظرا للدقة الممتازة عموما (النسبة المئوية لمعامل التباين (٪ CV) ≤ 20٪) وقيم الحساسية التي لوحظت. امتد النطاق الديناميكي للنمط النظيري IgG لعدة أوامر من الحجم لكل فحص (Spike S1 و Nucleocapsid و Membrane glycoproteins) ، والذي يدعم تقييمات عيار قوية عند عامل تخفيف 1: 500 للتطبيقات السريرية. وأخيرا، تم تطبيق البروتوكول الأمثل لرصد التحويل المصلي لسبايك S1 للأشخاص (n = 4) الذين أكملوا نظام لقاح SARS-CoV-2. ضمن هذه المجموعة ، لوحظت مستويات Spike S1 IgG للوصول إلى الحد الأقصى من العيار في 14 يوما بعد إعطاء الجرعة الثانية ، عند كثافة إشارة أعلى بكثير (~ 40 ضعفا) من الأنماط المتماثلة IgM أو IgA. ومن المثير للاهتمام ، لاحظنا أن معدلات اضمحلال عيار Spike S1 IgG المتغيرة للغاية والتي كانت تعتمد إلى حد كبير على الموضوع قد لوحظت ، والتي ستكون موضوع الدراسات المستقبلية.
Introduction
يسمح القياس المتزامن للمؤشرات الحيوية المتعددة المرتبطة بالأمراض في العينات البيولوجية برؤى وصفية وتنبؤية في العمليات المرضية. في حين أن الإجراءات المناعية التقليدية للتحليل الفردي، مثل مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs)، كانت حجر الزاوية في التحليلات الكمية في كل من الإعدادات السريرية والبحثية، يمكن أن يكون لهذه التقنيات قيود كبيرة فيما يتعلق بالإنتاجية، وكمية العينة المطلوبة لكل قياس، وفعالية التكلفة التي تحد إلى حد كبير من دراسة العناصر البيولوجية المتعددة التي غالبا ما تكون متشابكة طوال دورة المرض1 . أصبحت تقنية الإرسال المتعدد القائمة على الغلاف المجهري منصة لا غنى عنها لكل من مرافق التشخيص والبحث لقدرتها على الجمع بين الفحوصات لتعزيز الإنتاجية المختبرية ، والتخفيف من ندرة العينات ، والحد من الاختبارات المتكررة لتحقيق أقصى قدر من التوفير في التكاليف1،2،3،4. في الآونة الأخيرة ، تم إدخال المزيد من الزيادة في قوة الإرسال المتعدد هذه باستخدام أدوات تمتلك قدرات مراسل مزدوج. تنفذ ميزة المراسل المزدوج قناتين فلورسنتيتين للكشف ، مما يوفر بعدا آخر من الإرسال المتعدد ، مما يسمح بالكشف عن ظواهر متعددة على نفس التحليل.
فيروس كورونا 2 المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2) هو العامل الممرض المسؤول عن جائحة مرض فيروس كورونا الحالي 2019 (COVID-19)5. وفي حين أن اختبار RT-PCR أمر بالغ الأهمية لتأكيد العدوى في بداية دورة المرض، فقد ثبت أن الفحوص المصلية لعيارات الأجسام المضادة ضرورية للنقد الدقيق والكامل للأفراد فيما يتعلق بالتعرض السابق أو الشفاء؛ الاستجابة للتحصين؛ و / أو تقييم فعالية التطعيم ضد Covid-19 6,7.
يحدد هذا التقرير طرق قياس التحويل المصلي للمستضدات الفيروسية المتعددة ل SARS-CoV-2 التي تستخدم نظام الإبلاغ المزدوج القائم على التدفق والقارئ متعدد الإرسالات. على وجه التحديد ، يتم وصف الكشف المتزامن عن نوعين فرعيين من الأجسام المضادة (تم تكوينهما على أنهما IgG / IgM أو IgA / IgM) للوحة مستضدات SARS-CoV-2 3-plex التي تتضمن اختبارات للبروتينات السكرية Spike S1 و Nucleocapsid و Membrane (ويعرف أيضا باسم Matrix). يوفر هذا النهج مؤسسة مثالية لالتقاط التحويل المصلي الطولي ويساهم في أداة قيمة في الترسانة ضد جائحة Covid-19.
Protocol
تم تسجيل جميع المواد بموافقة خطية مستنيرة مع موافقة كاملة من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) على المركز الطبي بجامعة راش بموجب بروتوكول ORA 20101207 مع مراعاة جميع المبادئ التوجيهية المؤسسية لإجراء البحوث الأخلاقية. تم جمع الدم عن طريق الفصد التقليدي في فراغات الخزامى (K2EDTA) ومعالجتها بالبروتوكولات الموصى بها. تمت أرشفة البلازما الناتجة عند -80 درجة مئوية حتى تم إجراء التقييمات.
1. إعداد المجهرية المترافقة مع المستضدات
- حدد ثلاث قوارير مختلفة من الميكروسفير المغناطيسي مع مناطق خرزة فريدة من نوعها ، وتسجيل معرف الخرزة ومعلومات الكثير لكل قارورة مستخدمة.
ملاحظة: سيتم اتباع الخطوات التالية لكل منطقة ميكروسفير متميزة. الميكروسفير حساس للضوء ويجب حمايته من التعرض الطويل للضوء. أثناء خطوات الغسيل ، احرص على عدم إزعاج الميكروسفيرات. إذا كنت منزعجا ، فاسمح بفصل 60 ثانية ثانية. - دوامة مخزون المجهر لمدة 60 ثانية وسونيكات لمدة 5 دقائق قبل استخدامها لفصل الخرز المجمع.
- انقل 1.0 × 106 حبات إلى أنابيب أجهزة طرد مركزي دقيقة منخفضة البروتين.
- أدخل الأنبوب في فاصل مغناطيسي واسمح بحدوث الفصل لمدة 60 ثانية. مع بقاء الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة supernatant بعناية دون إزعاج حبيبات الخرزة.
- قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي ، وأعد تعليق الخرز ب 100 ميكرولتر من الماء HPLC ، والدوامة لمدة 30 ثانية. ضع الأنبوب مرة أخرى في الفاصل المغناطيسي لمدة 60 ثانية ، ثم قم بإزالة السوبرناتانت. كرر بروتوكول الغسيل هذا مرتين.
- قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الميكروسفير المغسول في 90 ميكرولتر من فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة 100 mM ، الرقم الهيدروجيني 6.2 (المخزن المؤقت للتنشيط) بواسطة دوامة لمدة 30 ثانية.
- أضف 10 ميكرولتر من 50 مجم / مل Sulfo-NHS (المخفف باستخدام Activation Buffer) إلى الميكروسفير والدوامة بلطف لمدة 10 ثوان. أضف 10 ميكرولتر من محلول EDC 50 ملغم / مل (مخفف مع المخزن المؤقت للتنشيط) ودوامة بلطف لمدة 10 ثوان. احتضان الميكروسفير لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع دوامة لطيفة كل 10 دقائق.
- كرر خطوات الغسيل 1.4-1.5 مع 50 mM MES ، الرقم الهيدروجيني 5.0 (المخزن المؤقت للاقتران) بدلا من الماء LC / MS من الدرجة الأولى لما مجموعه غسلتين.
- قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الخرز ب 100 ميكرولتر من Coupling Buffer بواسطة دوامة لمدة 30 ثانية تليها مباشرة إضافة الكمية المطلوبة من البروتين.
- ارفع الحجم الإجمالي إلى 150 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت للاقتران. امزج تفاعل الاقتران بواسطة الدوامة لمدة 30 ثانية واحتضن لمدة 2 ساعة عن طريق الدوران في RT.
ملاحظة: بالنسبة للمقايسات المحددة هنا، أجريت الاقترانات بتركيزات البروتين التالية: Spike S1: 5 ميكروغرام؛ و Spike S1: 5 ميكروغرام؛ و Spike S1: 5 ميكروغرام؛ و Spike S1: 5 ميكروغرام؛ و Spike S1: 5 ميكروغرام؛ و Spike S1: 5 ميكروغرام؛ و Spike S1: 5 ميكروغرام؛ و Nucleocapsid: 5 ميكروغرام ؛ الغشاء: 12.5 ميكروغرام. - كرر خطوة الغسيل 1.4 مع محلول ملحي مخزنة مؤقتا بالفوسفات (PBS) -1٪ ألبومين مصل الماعز ، 0.01٪ Polysorbate-20 (Quench Buffer) بدلا من الماء LC / MS من الدرجة الأولى لما مجموعه غسلتين. أعد تعليق الميكروسفير المغسول في 100 ميكرولتر من Quench Buffer الذي يحتوي على 0.05٪ من أزيد الصوديوم بواسطة الدوامة لمدة 30 ثانية.
ملاحظة: اسمح للخرز بالتبريد بالكامل لمدة 6 ساعات على الأقل قبل الشروع في أي إجراء آخر. - احسب عدد الميكروسفير المسترد باستخدام عداد خلية آلي أو مقياس دمية. سجل تركيز الخرزة المرصودة.
- قم بتبريد الميكروسفير المقترن عند 4 درجات مئوية في الظلام.
2. الإجراءات
- أداء الفحص (البروتوكول الأساسي)
- أعد تعليق الميكروسفير المقترن بواسطة دوامة لمدة 30 ثانية وسونيكات ل ~ 60-90 ثانية.
- قم بإزالة الكمية المطلوبة من كل غرواني خرزة من الأنبوب المعني ودمج غرويات الخرز في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد 1.5 مل.
- أدخل الأنبوب في فاصل مغناطيسي واسمح بحدوث الفصل لمدة 60 ثانية. مع بقاء الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة supernatant بعناية دون إزعاج حبيبات الخرزة.
- قم بإزالة الخرز من الفاصل ، وأعد تعليق الخرز ب 100 ميكرولتر من ألبومين مصل البقر PBS-1٪ ، و 0.01٪ Polysorbate-20 (اختبار المخزن المؤقت) ، والدوامة لمدة 30 ثانية. ضع الأنبوب في فاصل مغناطيسي واسمح بحدوث الفصل لمدة 60 ثانية. كرر بروتوكول الغسيل هذا (أي الخطوات 2.1.3-2.1.4) مرتين
- اضبط تركيز خليط المجهر العامل 3-plex عن طريق إضافة حجم مناسب من المخزن المؤقت للفحص لتوليد تركيز نهائي من 100 ميكروسفير لكل 1 ميكرولتر لكل هدف.
- Aliquot 12.5 ميكرولتر من خليط الغلاف المجهري المحضر في الخطوة 2.1.5 في كل بئر من صفيحة 384 بئر أو 25 ميكرولتر في كل بئر من صفيحة 96 بئرا.
- تمييع عينات البلازما / المصل 500 أضعاف في فحص المخزن المؤقت. إعداد العينات القياسية وفقا للمعايرة المطلوبة.
- أضف 12.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص كعينة فارغة وأضف كل عينة من العينات المخففة أو القياسية إلى كل بئر معين من لوحة عينة 384 بئرا أو 25 ميكرولتر من العينة الفارغة أو المخففة أو القياسية في كل بئر من لوحة عينة 96 بئرا.
- قم بتغطية اللوحة بختم أو رقائق معدنية من الألومنيوم واحتضنها لمدة 1 ساعة في RT على شاكر لوحة مضبوط على 700 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: يرد في الجدول 1 مخطط لمنحنيات التخفيف. - قم بإعداد محلول من الأجسام المضادة للكشف عن الإنسان (محاليل الأجسام المضادة الثانوية) عند 4 ميكروغرام / مل باستخدام المخزن المؤقت للفحص كما هو محدد في الخطوة 2.1.11.
- تحضير الماعز المضاد للإنسان IgM ، مقترنا ب Super Bright 436 (SB) / الماعز المضاد للإنسان IgA ، Phycoerythrin (PE) الأجسام المضادة المقترنة للكشف عند 4 ميكروغرام / مل ؛ أو الماعز المضاد للإنسان IgM ، SB Conjugate / الماعز المضاد للإنسان IgG ، PE Conjugate يكتشف الأجسام المضادة عند 4 ميكروغرام / مل.
ملاحظة: بالنسبة لتنسيق لوحة 384 بئرا ، يلزم وجود 12.5 ميكرولتر / بئر من محلول الأجسام المضادة الثانوي المحضر ، وبالنسبة لتنسيق لوحة 96 بئرا ، يلزم وجود 25 ميكرولتر / بئر. - ضع الصفيحة على فاصل مغناطيسي ، واغسلها بسرعة ، وانقلب بقوة فوق حاوية خطرة بيولوجيا لإزالة السائل من الآبار. مع بقاء اللوحة مقلوبة ، اضغط بقوة على اللوحة مقابل واد سميك من الورق.
- اغسل كل بئر ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص وقم بإزالة السائل عن طريق الانعكاس القوي فوق حاوية المخاطر البيولوجية ، كما هو موضح سابقا. كرر هذه الخطوات (2.1.12-2.1.13) لما مجموعه غسلتين. تخلص من جميع الوديان الورقية المستخدمة في حاوية للمخاطر البيولوجية.
- أضف 12.5 ميكرولتر من محلول عمل الأجسام المضادة الثانوي إلى كل بئر من صفيحة 384 بئرا أو 25 ميكرولتر إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا. قم بتغطية اللوحة بختم أو رقائق معدنية من الألومنيوم واحتضنها لمدة 30 دقيقة في RT على شاكر صفيحة مضبوط على 700 دورة في الدقيقة.
- كرر خطوات الغسيل 2.1.12-2.1.13
- أضف 75 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص في كل بئر من صفيحة 384 بئرا أو 100 ميكرولتر في كل بئر من صفيحة 96 بئرا. قم بتغطية اللوحة بختم أو رقائق معدنية من الألومنيوم واحتضنها لمدة 5 دقائق في RT على شاكر صفيحة مضبوط على 700 دورة في الدقيقة.
- تحليل 60 ميكرولتر عبر محلل الأداة وفقا لدليل النظام.
- تحسين وقت حضانة التقاط العينات
- قم بتنفيذ الخطوات الواردة في القسم 2.1 باستخدام مدة أوقات الحضانة البالغة 30 دقيقة و60 دقيقة و120 دقيقة في الخطوة 2.1.9.
ملاحظة: يمكن إجراء عمليات الحضانة إما باستخدام لوحات مميزة أو عن طريق التوقف مؤقتا عند الخطوة 2.1.6 حتى وقت المتابعة إلى الخطوة 2.1.9. لتحقيق أوقات الحضانة المطلوبة. - تابع قراءة اللوحة على المحلل باستخدام 60 ميكرولتر من خليط الفحص وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
- قم بتنفيذ الخطوات الواردة في القسم 2.1 باستخدام مدة أوقات الحضانة البالغة 30 دقيقة و60 دقيقة و120 دقيقة في الخطوة 2.1.9.
- تحسين تركيز الأجسام المضادة الثانوية
- نفذ هذا الإجراء على النحو المفصل في القسم 2.1 ، باستثناء التركيزات النهائية للكواشف في محلول عمل الأجسام المضادة الثانوي (المعد في الخطوة 2.1.10-2.1.11) المعدل على النحو التالي:
الماعز المضادة للإنسان (أو الأرنب) IgM ، SB-conjugate الكشف عن الأجسام المضادة في 8 و 4 و 2 و 1 و 0.5 ميكروغرام / مل.
الماعز المضاد للإنسان (أو الأرنب) IgA ، الأجسام المضادة للكشف عن PE المترافقة في 8 و 4 و 2 و 1 و 0.5 ميكروغرام / مل.
الماعز المضاد للإنسان (أو الأرنب) IgG ، الأجسام المضادة للكشف عن PE المترافقة في 8 و 4 و 2 و 1 و 0.5 ميكروغرام / مل.
الماعز المضاد للإنسان (أو الأرنب) IgG ، PE-conjugate / الماعز المضاد للإنسان (أو الأرنب) IgM ، SB-conjugate الكشف عن الأجسام المضادة في 8 و 4 و 2 و 1 و 0.5 ميكروغرام / مل.
الماعز المضاد للإنسان (أو الأرنب) IgA ، PE-conjugate / الماعز المضاد للإنسان (أو الأرنب) IgM ، SB-conjugate الكشف عن الأجسام المضادة في 8 و 4 و 2 و 1 و 0.5 ميكروغرام / مل. - تابع قراءة اللوحة على المحلل باستخدام 60 ميكرولتر من خليط الفحص وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
- نفذ هذا الإجراء على النحو المفصل في القسم 2.1 ، باستثناء التركيزات النهائية للكواشف في محلول عمل الأجسام المضادة الثانوي (المعد في الخطوة 2.1.10-2.1.11) المعدل على النحو التالي:
- تحسين وقت حضانة الأجسام المضادة الثانوية
- نفذ هذا الإجراء كما هو مفصل في القسم 2.1 مع 15 دقيقة و 30 دقيقة و 60 دقيقة و 120 دقيقة من مدة الحضانة المحددة في الخطوة 2.1.14.
- تابع قراءة اللوحة على المحلل باستخدام 60 ميكرولتر من خليط الفحص وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
- تقييم عينات الموضوع مع المقايسات المحسنة ثنائية القناة
- جمع عينات البلازما الخاضعة (n = 4) في الأيام -21 و -11 و -1/0 و +14 و +28 و +60 و +90 و +120 بالنسبة لإكمال إعطاء لقاح Covid-19 (أي الجرعة الثانية).
ملاحظة: يمثل اليوم 0 النقطة الزمنية التي تم فيها الانتهاء من التطعيم. - قم بإجراء جميع المقايسات باستخدام البروتوكول الأساسي (القسم 2.1.) إما كفحص ثنائي القناة IgG/IgM أو IgA/IgM.
- تطبيع النتائج إلى الحد الأقصى لقيمة كثافة الفلورسنت المتوسطة (MFI) المرصودة لكل غلوبولين مناعي محدد وفحص.
- جمع عينات البلازما الخاضعة (n = 4) في الأيام -21 و -11 و -1/0 و +14 و +28 و +60 و +90 و +120 بالنسبة لإكمال إعطاء لقاح Covid-19 (أي الجرعة الثانية).
Representative Results
نتائج الفحص النموذجية وتقييم الأداء
عادة ما توفر مقايسات الخرز المناعي منحنى سينيا عند تقييمه على عدة أوامر (سجل) من الحجم ، كما هو موضح في كل لوحة من اللوحات المعروضة في الشكل 1. يجب على المستخدم أن يحدد تجريبيا نطاق التركيز الأمثل لكل تحليل في الإرسال المتعدد لتحديد النطاق الكامل للقياس الكمي ، مما يضمن عدم الإفراط في أخذ عينات من التطرف (المناطق التي تقترب من الحد الأدنى للقياس الكمي [LLOQ] أو الحد الأعلى للكمية [ULOQ]). ومع ذلك، فإن النطاق الفعلي المطلوب للفحص يمليه توزيع التحليلات المستهدفة في مصفوفة بيولوجية (أي "المجهولات") عند عامل تخفيف معين. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن المنحنيات القياسية يتم تفسيرها عادة عن طريق الانحدار الخطي باستخدام خوارزمية تناسب 4 أو 5 معلمات ، فإن الجزء الخطي من منحنى معين يوفر عادة أكبر قدر من الثقة في الدقة الكمية مع نموذج خطي (y = mx + b) للكمية. يجب أن تكون مطابقة منحنى المعايرة مع القيم المرصودة لغير معروف عند عامل تخفيف معين هو الهدف في تطوير الفحص الكمي.
وفي هذا الصدد، تم تقييم منحنى قياسي من 7 نقاط يستند إلى سلسلة تخفيف تسلسلية بنسبة 1:5 لكل من الأجسام المضادة Spike S1 و Nucleocapsid و Membrane التي تتراوح بين 1 ميكروغرام/مل و 0.000064 ميكروغرام/مل لكل من سبايك S1 و Nucleocapsid و 5 ميكروغرام/مل و 0.00032 ميكروغرام/مل للغشاء، كما هو موضح في الشكل 1. تم تعريف الحد الأدنى للكشف (LLOD) لكل فحص على أنه أدنى تركيز تحليلي ينتج عنه إشارة يمكن تمييزها عن خلفيتها. يمكن تحديد LLOD من خلال المعادلة الموضحة سابقا 8,9 ، LLOD = LoB + 1.645 (عينة SDمنخفضة التركيز). LoB هو الحد الأدنى للفراغ ، وهو التركيز "الظاهر" للتحليل الذي يتم إنتاجه من الفراغ عندما يتم توقع قيمة صفرية ، ويمكن التحقق منه باستخدام هذه المعادلة LoB = Mean blank + 1.645 (SDblank)8. واستنادا إلى هذه الطريقة، تراوحت قيم MFI لفحص Spike S1 من 134.38 إلى 20191.2، مع 134.38 MFI تمثل 0.00024 ميكروغرام/مل وتعرف بأنها LLOD. وبالنسبة لفحص الغشاء، كان نطاق MFI العملي يتراوح بين 52.24 و 4764.9، مع حساب 52.24 MFI ليكون 0.004885 ميكروغرام/مل وتعيينه على أنه LLOD. كان نطاق MFI لفحص Nucleocapsid 517.9 إلى 19666.34 ، مع تحديد 517.9 على أنه 0.00024 ميكروغرام / مل ، وهو LLOD. يعرف الحد الأعلى للكشف (ULOD) بأنه تركيز التحليل وبعد ذلك لم يعد التغيير في MFI خطيا ، ويتم تشبع استجابة الإشارة. تجدر الإشارة إلى أن الطابع السيني الكامل لهذه المنحنيات لا يمكن ملاحظته للمعايير التي تم اختبارها ، باستثناء منحنى Nucleocapsid. ومع ذلك، وبالنظر إلى قيم مؤشر MFI المرصودة لجميع المجهولات التي تم فحصها حتى الآن (عند تخفيف 1:500) فهي ضمن نطاق المنحنى المعروض لكل تحليل ويمكن قياسها كميا بسهولة باستخدام تناسب بارامتري 4 أو 5 عن طريق الانحدار الخطي.
دقة الفحص
دقة الفحص الداخلي: تم إجراء أربع نسخ طبق الأصل من المقايسات على نفس اللوحة لتقييم دقة المقايسة ، محسوبة على أنها النسبة المئوية CV ، أو حاصل الانحراف المعياري والمتوسط مضروبا في 100. واختيرت النقطتان القياسيتان 2 و5 لهذه الجدولة، مع فهرسة القيم في الجدول 2. الحد الأعلى المقبول النموذجي لقيم ٪CV هو ≤20٪، والذي لوحظ لهذه البيانات، باستثناء المعيار 2 من Membrane IgG، والذي من المحتمل أن ينتج عن مستويات الخلفية ويمكن تصحيحه عن طريق إزالة القيم النائية (البيانات غير معروضة). وتجدر الإشارة إلى أنه لوحظ عدم استقرار واضح لقراءة القيمة بالنسبة لمقايسات الغشاء حيث كانت قيم MFI <200 ، والأكثر شيوعا في حالة الأنماط المتماثلة IgA و IgM.
دقة المقايسة البينية: تم إعداد ثلاث دفعات متميزة من مجموعات الخرز لكل فحص واختبارها ، كما هو محدد لدقة الفحص الداخلي (أعلاه وكما هو موضح في الشكل 1). وتم تقييم التباين بين المقايسات بحساب النسبة المئوية للسيرة الذاتية من متوسط النتائج لكل دفعة من الدفعات الثلاث، كما هو مبين في الجدول 3. مرة أخرى ، يتم تعيين عتبة الحد الأعلى ل ٪ CV مقبولة عند ≤20٪ ، والتي توجد لجميع الظروف التي تم اختبارها (مع تأثير مماثل مع المعيار 2 من Membrane IgG ، كما هو موضح أعلاه). وتجدر الإشارة إلى أن التباين من دفعة إلى أخرى في صافي قيم مؤسسات التمويل الأصغر يلاحظ عادة داخل دفعات متعددة من نفس الكواشف المناعية أثناء تطوير المقايسة المخصصة. إن استخدام منحنى معايرة مثبت من جسم مضاد مستهدف تم الحصول عليه تجاريا (على سبيل المثال ، أرنب مضاد ل Spike S1) متبوعا بجسم مضاد للكشف عن الأنواع يمكن أن يوفر الاتساق في النتائج التحليلية ويسمح بإجراء مقارنات بين دفعات متعددة في فترات زمنية مختلفة.
الدقة بين المقايسات مع العينات البشرية: تكرر تقييم دقة الفحص البيني مع عينات البلازما البشرية (n = 5) التي تم جمعها في غضون شهر من الأعراض المبلغ عنها لأول مرة لعدوى SARS-CoV-2 ؛ أنجزت مع ثلاث دفعات متميزة من المقايسات (أي الاستعدادات المختلفة لمجموعات الخرز). ويوضح الجدول 4 هذه النتائج بدقة مع قيمة ٪CV مع قيمة الحد الأدنى النموذجية البالغة ≤20٪. تم حساب متوسط قيم ٪CV لعيارات Spike S1 و Nucleocapsid و Membrane IgG لتكون 9.9٪ (النطاق 2.6٪ -18٪) و 11.0٪ (النطاق 3.5٪ -24.4٪) و 7.6٪ (النطاق 3.2٪ -12.9٪) ، على التوالي. تم إجراء ملاحظات مماثلة باستخدام عيارات IgM و IgA لهذه التحليلات الثلاثة ، وكلها توفر قيم CV ٪ <20٪. كان الاستثناء الوحيد لهذا هو عيار Subject 5 IgM لبروتين الغشاء ، والذي تم استبعاده لاحقا كشاذ. تتوافق قيم الدقة لتقييمات الموضوع البشري مع تلك التي شوهدت أعلاه للأجسام المضادة للأرانب ، مما يشير إلى أنه يمكن إعادة تكوين هذه الفحوصات بسهولة لتقييم عيارات المستضدات في أنواع متعددة مع تأثير ضئيل على دقة المقايسة. وكما ذكر أعلاه، كان هناك عدم استقرار واضح لقراءة القيم التي لوحظت لمقايسات الغشاء حيث كانت قيم مؤشر MFI <200، والأكثر شيوعا في حالة الأنماط المتماثلة IgA و IgM.
تحسين تركيز الأجسام المضادة الأولية
تم تقييم "وقت التقاط" التحليل باستخدام الخرز المقترن بالمستضدات ، وتم اختبار الأجسام المضادة في عينات البلازما أو في المعايير عن طريق تعديل طول الحضانة الأولية (30 دقيقة ، 1 ساعة ، 2 ساعة ، و 4 ساعات). يتم تقديم الفرق في متوسط MFI كحاصل حضانة معينة والحد الأقصى لوقت الحضانة ، المسمى ٪ Max. ، في الشكل 2 ، بين حضانة مدتها 30 دقيقة (الحد الأدنى للمدة) وحضانة 4 ساعات (الحد الأقصى للمدة). كانت القيم عند 120 دقيقة مثالية لعيارات IgG ل Spike S1 والغشاء والأجسام المضادة Nucleocapid ، مما يشير إلى حركيات ربط الأجسام المضادة الأولية السريعة ، مما يسمح بالمرونة لزيادة إنتاجية الفحص. ومع ذلك، لوحظت حركية أبطأ للنمطين المتماثلين IgA و IgM (البيانات غير معروضة)، مما يدل على مستويات التقاط الذروة عند النقطة الزمنية 4 ساعات، كما هو موضح في الشكل 2. بشكل عام ، هناك توازن بين الاقتراب من تشبع الفحص والملاءمة الزمنية العملية لتشغيل كل فحص عندما يكون في الإنتاج (لتحقيق أقصى قدر من الإنتاجية). مع هذا ، لوحظت إشارات مناسبة للأغراض الكمية في الحد الأدنى من أوقات الحضانة من 30 دقيقة ل IgG ، و 60 دقيقة ل IgM ، و 120 دقيقة ل IgA في هذه النتائج.
تحسين تركيز الأجسام المضادة الثانوية
تم اختبار خمسة تركيزات من الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضاد للإنسان IgG ، PE-conjugated ؛ الماعز المضاد للإنسان IgA ، PE-conjugated ؛ الماعز المضاد للإنسان IgM ، SB-conjugated) (0.5 ، 1 ، 2 ، 4 ، و 8 ميكروغرام / مل). كشفت جميع الأجسام المضادة عن نطاقات واسعة من الإشارات ، مع عدم وجود تشبع إشارة واضح في أي حالة ، مما يضمن قياسا خطيا لأي من التركيزات. وكمثال على ذلك، كان متوسط الإشارة المتولدة من فحص سبايك S1 باستخدام الماعز المضاد للإنسان IgM، SB-conjugated عند 0.5 ميكروغرام/مل 13.2 في المائة من مؤشر MFI المتولد من الإشارة القصوى (8 ميكروغرام/مل)، في حين أن مؤشر MFI المتولد من 4 ميكروغرام/مل كان 73.3 في المائة من مؤشر MFI الذي يظهر عند الإشارة القصوى. وترد تفاصيل نطاق الإشارات من الأنماط المتماثلة الأخرى للأجسام المضادة سبايك S1، والأجسام المضادة للغشاء، والأجسام المضادة للنيوكليوكابسيد في الجدول 5 والشكل 3. كنقطة عملية ، ينعكس التأثير الأساسي بين تركيز الأجسام المضادة الثانوي الأمثل وتركيز الأجسام المضادة الثانوي 4 ميكروغرام / مل المذكور سابقا من حيث حساسية المقايسة وتكلفة الفحص. أي أن تركيز الأجسام المضادة الثانوي البالغ 8 ميكروغرام/مل قد يكون مرغوبا فيه للتطبيق مع عيارات منخفضة للأجسام المضادة أو كميات منخفضة من العينات القيمة، ولكن التكلفة المرتبطة بهذه الفحوص ستكون أعلى بكثير من استخدام تركيز 4 ميكروغرام/مل المحدد سابقا. وعلى العكس من ذلك، فإن الحالات التي يجب فيها ملاحظة عيارات عالية للأجسام المضادة (مثل الأفراد الذين عانوا من لقاحات كوفيد-19 أو بكميات غير محدودة من الأمصال) ستشهد فائدة من حيث التكلفة من خلال تطبيق كميات أقل من الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال، 1 ميكروغرام/مل).
تحسين حضانة الأجسام المضادة الثانوية
كما تم التحقيق في التأثير المحتمل لمدة حضانة الأجسام المضادة الثانوية عن طريق تعديل طول الحضانة (15 و 30 و 60 و 120 دقيقة). بشكل عام ، لم يتجاوز الفرق في متوسط MFI كما هو موضح كحاصل حضانة معينة والحد الأقصى لوقت الحضانة ، المسمى ٪ Max ، بين حضانة مدتها 15 دقيقة (الحد الأدنى للمدة) وحضانة مدتها 120 دقيقة (المدة القصوى) 30٪ و 55٪ و 50٪ ل Spike S1 و Membrane و Nucleocapsid ، على التوالي ، مما يشير إلى خطوة حركية سريعة في ربط الأجسام المضادة الثانوية ووسيلة لزيادة إنتاجية الفحص. ويتضمن الجدول 6 تفاصيل عن التغيرات في الإشارات في جميع أوقات الحضانة. ويبين الشكل 4 رسوما توضيحية للإشارات المرصودة من مختلف حضانات هذا التحليل.
أداء ثنائي القناة وخصوصية
لكل تحليل، تمت مقارنة تنسيق مراسل واحد (IgG-PE فقط، IgA-PE فقط، أو IgM-SB فقط) بالإشارة التي تم إنشاؤها لنفس التحليل عندما تم تشغيله بتنسيق مراسل مزدوج (على سبيل المثال، Spike S1 IgG-PE فقط مقابل Spike S1 IgG-PE بالاقتران مع Spike S1 IgM-SB بتنسيق المراسل المزدوج). تم استخدام دقة الفحص (معبرا عنها ب ٪ CV) للإشارات التي تم إنشاؤها في التنسيقين لتحليل العلاقة في نتائج هذه التجربة. كانت قيم CV ٪ لاختبارات Spike S1 6.19٪ و 16.4٪ و 23٪ ل IgM و IgG و IgA ، على التوالي. بالنسبة لفحص الغشاء ، كانت قيم CV ٪ 3.3٪ و 7.9٪ و 16.4٪ ل IgM و IgG و IgA ، على التوالي. وأخيرا ، قدم فحص Nucleocapsid قيم CV ٪ بنسبة 8.7٪ و 10.3٪ و 24.2٪ ل IgM و IgG و IgA ، على التوالي. تشير قيم الدقة التي لوحظت للأنماط المتماثلة IgM و IgA إلى أن وقت الحضانة الأطول قد يمنح نتائج فحص متفوقة بسبب الاختلافات الحركية الملزمة المعروفة عبر هذه الفئات من الغلوبولين المناعي. يوضح الشكل 4 الاتفاق بين أشكال التركيزات المختلفة للأجسام المضادة الثانوية.
وللتأكد من خصوصية قنوات المراسلين، تم اختبار قناة مراسل واحدة في وقت واحد بينما تم تعيين القناة الأخرى كقناة فارغة للاستفسار عن الإشارة غير المحددة (تأثير النزيف). وتشير هذه النتائج إلى وجود تلوث ضئيل بالإشارات المتقاطعة بين قناتي المراسلين، نظرا للخصوصية العالية عبر طيف الظروف. ويوضح الشكل 5 هذه النتائج. بشكل عام، لاحظنا تداخلا بنسبة 6.45٪ عبر القناة 1 إلى القناة 2. ومع ذلك ، عندما تم حساب حجم الإشارات ، لاحظنا مستويات التداخل المحتملة التالية في وضع المراسل المزدوج: Spike IgG / IgM بنسبة 71.98٪ ، Spike IgA / IgM بنسبة 28.11٪ ؛ غشاء IgG / IgM عند 7.41 ٪ ، غشاء IgA / IgM عند 134.61 ٪ ؛ و Nucleocapsid IgG / IgM عند 146.03٪ ، Nucleocapsid IgA / IgM عند 112.13٪. في التكوين المحدد ، سيتطلب ذلك قياس Spike IgM بالاشتراك مع النمط المتماثل IgA ، والغشاء IgM مع النمط المتماثل IgM ، والقياسات النووية التي لا يتم إجراؤها بتنسيق ثنائي القناة. قد تتطلب هذه النتيجة استكشاف انعكاس استراتيجية وضع العلامات حيث يتم قياس IgA و IgG في القناة 2 و IgM في القناة 1.
تقييم أحداث التحويل المصلي بعد التطعيم ضد كوفيد-19
تمت مراقبة التحويل المصلي في أربعة مواضيع عند تقييم IgA و IgM و IgG باستخدام فحص Spike S1 في نقاط زمنية تتراوح من ما قبل التطعيم إلى أربعة أشهر بعد الانتهاء من سلسلة التطعيم Covid-19. تم إنجاز القياسات في وضع القناة المزدوجة (IgG / IgM و IgA / IgM ، مع متوسط قيم IgM). تلقى جميع الأشخاص اللقاح كتحصين على مرحلتين ، وفقا للممارسة القياسية ، مع فاصل زمني مدته 21 يوما بين الجرعتين الأولى والثانية. تظهر مخططات الاستجابة المناعية لكل شخص في الشكل 6A-C. لوحظت قيم الاستجابة المناعية لمستضدات Nucleocapsid و Membrane عند مستويات الخلفية لجميع الغلوبولين المناعي الذي تم تقييمه (البيانات غير المعروضة) ، والتي كانت متسقة مع الأشخاص الذين لم يسبق لهم توثيق عدوى SARS-CoV-2 في الوقت السابق للتطعيم. بشكل عام ، كانت قيم Spike S1 IgA و IgM المرصودة أقل بنحو 40 ضعفا من عيارات النمط المتماثل IgG ، مع وصول عيارات الذروة إلى ذروتها في أقرب وقت ممكن لمدة 14 يوما لكل من الأنماط المتماثلة IgM و IgG و IgA isotype التي تصل إلى عيارات الذروة بين وقت الجرعة الثانية (اليوم 0) و 14 يوما بعد الجرعة الثانية ، اعتمادا على الموضوع. والجدير بالذكر أن عيارات Spike S1 IgG تبدأ في التحلل خلال الأشهر الأربعة التالية لاكتمال التطعيم بمعدل متغير للغاية ، بطريقة تعتمد على الموضوع.
الشكل 1: منحنيات قياسية تمثيلية 3-plex. منحنيات قياسية تمثيلية للتحليلات الثلاثة؛ يتم تقديمه كمنحنى تخفيف تسلسلي من 7 نقاط ، 1: 5 يبدأ من (A) 1 ميكروغرام / مل ل Spike S1 ، (B) 5 ميكروغرام / مل للغشاء ، و (C) 1 ميكروغرام / مل للنيوكليوكابسيد والأجسام المضادة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحسين وقت حضانة الأجسام المضادة/العينات الأولية: متوسط إشارة MFI المنتجة من أوقات حضانة مختلفة/عينات من الأجسام المضادة الأولية (التقاط الأجسام المضادة) تتراوح بين 30 دقيقة و4 ساعات للمعايير 1-7 (كما هو مبين في الجدول 1). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحسينات تركيز الأجسام المضادة الثانوية وأداء القناة المزدوجة. توضح المنحنيات متوسط MFI (الذي تم تطبيعه إلى أعلى قيمة مسجلة في السلسلة) المنتج من تركيزات الأجسام المضادة الثانوية المختبرة ، والتي تتراوح بين 0.5-8 ميكروغرام / مل. تم إجراء كل مثيل كفحص أحادي القناة وثنائي القناة لتقدير الاختلافات في التنسيق التجريبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحسين وقت حضانة الأجسام المضادة الثانوية، تنسيق ثنائي القناة. مخططات تمثيلية لقيم MFI المرصودة (تم تطبيعها إلى أعلى قيمة مسجلة في السلسلة) فيما يتعلق بوقت الحضانة بالأجسام المضادة الثانوية. تم إجراء التجارب كمقايسات ثنائية القناة مثل مجموعات (A-C) IgA / IgM أو (D-F) IgG / IgM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تقييمات الخصوصية للمقايسات ثنائية القناة. نتائج الفحص لتنسيق الفحص ثنائي القناة مع تعيين واحد من كل مجموعة على أنه فارغ لتوضيح عدم وجود فلورسنت أو تداخل عبر القنوات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: رسم توضيحي للتحويل المصلي بعد التطعيم ضد كوفيد-19. قطع الأراضي التي توضح العيار النسبي للأجسام المضادة (A) IgG و (B) IgM و (C) IgA لمستضد Spike S1 أثناء التطعيم Covid-19 (قبل التطعيم - 4 أشهر بعد الانتهاء) ؛ يظهر الوقت بالأيام بالنسبة لإكمال سلسلة التطعيم ؛ يشار إلى النقاط العامة لإدارة اللقاح (الخطوط الحمراء). وأجريت التجارب في وضع القناة المزدوجة، على النحو المبين في البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الرقم القياسي | سلسلة التخفيف | مضاد للارتفاع S1 أو N (ميكروغرام / مل) | مضاد للأغشية (ميكروغرام / مل) |
| خلبي | خلبي | - | - |
| 1 | STD7 1:1 | 1 | 5 |
| 2 | STD6 1:5 | 0.2 | 1 |
| 3 | STD5 1:25 | 0.04 | 0.2 |
| 4 | STD4 01:125 | 0.008 | 0.04 |
| 5 | STD3 01:625 | 0.0016 | 0.008 |
| 6 | STD2 01:3125 | 0.00032 | 0.0016 |
| 7 | STD1 1:15625 | 0.000064 | 0.00032 |
الجدول 1: سلسلة التخفيف للمنحنيات القياسية: جدول عوامل التخفيف المستخدمة للمنحنيات القياسية للنمط المصلي IgG ؛ يتم تقديمه كمنحنى تخفيف تسلسلي من 7 نقاط و 1: 5 يبدأ من 1 ميكروغرام / مل ل α-Spike S1 و α-Nucleocapsid و 5 ميكروغرام / مل للأجسام المضادة α الغشاء.
| التحليل | عينة | مندوب 1 | مندوب 2 | مندوب 3 | مندوب 4 | افي | اس دي | ٪السيرة الذاتية |
| سبايك S1 | الأمراض المنقولة جنسيا2 | 369.4 | 356.9 | 295.2 | 271.5 | 323.3 | 47.4 | 14.6 |
| الأمراض المنقولة جنسيا5 | 3869.1 | 3437 | 3970.2 | 4240.7 | 3879.3 | 334 | 8.6 | |
| غشاء | الأمراض المنقولة جنسيا2 | 40.6 | 37.7 | 49.9 | 27.8 | 39 | 9.1 | 23.3 |
| الأمراض المنقولة جنسيا5 | 733.2 | 731.3 | 724 | 678.1 | 716.7 | 26 | 3.6 | |
| نيوكليوكابسيد | الأمراض المنقولة جنسيا2 | 1746.7 | 1790.8 | 1577.3 | 1664.8 | 1694.9 | 94.2 | 5.6 |
| الأمراض المنقولة جنسيا5 | 15598.1 | 14735.5 | 18369.5 | 17408.5 | 16527.9 | 1657.7 | 10 |
الجدول 2: دقة الفحص الداخلي: معامل التباين (٪ CV) المحسوب من أربعة نسخ متماثلة من مخاليط الأجسام المضادة القياسية في المعيار 2 (STD2) والمعيار 5 (STD5) مع دفعة فحص واحدة في نفس التجربة. تمثل القيم المقدمة للنسخ المتماثلة والمتوسطات قيم مؤسسات التمويل الأصغر المرصودة.
| التحليل | عينة | الدفعة 1 | الدفعة 2 | الدفعة3 | افي | اس دي | ٪السيرة الذاتية |
| سبايك S1 | الأمراض المنقولة جنسيا2 | 383.2 | 424.4 | 379.9 | 395.8 | 24.8 | 6.3 |
| الأمراض المنقولة جنسيا5 | 5639.7 | 6062.5 | 6384.3 | 6028.8 | 373.4 | 6.2 | |
| غشاء | الأمراض المنقولة جنسيا2 | 39.1 | 58.5 | 59.1 | 52.2 | 11.4 | 21.8 |
| الأمراض المنقولة جنسيا5 | 732.3 | 941.4 | 701.1 | 791.6 | 130.7 | 16.5 | |
| نيوكليوكابسيد | الأمراض المنقولة جنسيا2 | 1342.6 | 1621 | 1718.2 | 1560.6 | 195 | 12.5 |
| الأمراض المنقولة جنسيا5 | 13543.9 | 14843.2 | 17883.4 | 15423.5 | 2227.2 | 14.4 |
الجدول 3: دقة الفحص البيني مع العينات القياسية: النسبة المئوية لمعامل التباين (٪ CV) المحسوبة من ثلاث دفعات متميزة من المقايسات ، تم تقييمها في المعيار 2 والمعيار 5 في نفس التجربة. تمثل القيم المقدمة للنسخ المتماثلة والمتوسطات قيم مؤسسات التمويل الأصغر المرصودة.
| IgG-PE | IgM-SB | IgA-PE | |||||
| افي مؤسسة التمويل الأصغر | ٪السيرة الذاتية | افي مؤسسة التمويل الأصغر | ٪السيرة الذاتية | افي مؤسسة التمويل الأصغر | ٪السيرة الذاتية | ||
| سبايك S1 | المادة 1 | 8002.3 | 17.7 | 1949.5 | 1.3 | 2045.8 | 5.5 |
| المادة 2 | 19155.8 | 7.3 | 918.6 | 4.1 | 1684.5 | 3.9 | |
| المادة 3 | 17865.6 | 18.0 | 549.4 | 3.8 | 961.3 | 8.1 | |
| المادة 4 | 11901.1 | 2.6 | 1603 | 4.8 | 8736.4 | 5.5 | |
| المادة 5 | 9801.8 | 4.0 | 1014.1 | 3.0 | 2747.6 | 9.3 | |
| نيوكليوكابسيد | المادة 1 | 15097.8 | 11.3 | 1049.7 | 9.9 | 5276.5 | 3.9 |
| المادة 2 | 15204.3 | 12.1 | 265.9 | 5.2 | 6761.3 | 11.9 | |
| المادة 3 | 18471.7 | 24.4 | 329.1 | 4.5 | 14308 | 2.9 | |
| المادة 4 | 16424.7 | 3.5 | 2418.1 | 0.1 | 4234.7 | 4.2 | |
| المادة 5 | 13344.9 | 3.6 | 225.6 | 10.0 | 13436.5 | 9.7 | |
| غشاء | المادة 1 | 514.6 | 8.6 | 180.6 | 14.0 | 141.2 | 9.8 |
| المادة 2 | 196.8 | 5.2 | 57 | 20.7 | 55.5 | 13.0 | |
| المادة 3 | 553.7 | 12.9 | 54.5 | 21.2 | 191.2 | 18.6 | |
| المادة 4 | 377.9 | 3.2 | 68.1 | 22.1 | 62 | 2.3 | |
| المادة 5 | 325.4 | 8.2 | 11.4 | 91.6 | 74.6 | 20.8 |
الجدول 4: دقة الفحص البيني مع العينات البشرية: متوسط النسبة المئوية لمعامل التباين (٪ CV) محسوب من ثلاث دفعات من الفحوصات التي تم اختبارها باستخدام عينات البلازما (المخففة 500 ضعف) من خمسة أشخاص مصابين بعدوى SARS-CoV-2.
| سبايك S1 | غشاء | نيوكليوكابسيد | |||||
| ميكروغرام/مل | افي مؤسسة التمويل الأصغر | ٪ ماكس. | افي مؤسسة التمويل الأصغر | ٪ ماكس. | افي مؤسسة التمويل الأصغر | ٪ ماكس. | |
| IgM | 0.5 | 186 | 13.2 | 32 | 25.2 | 132.7 | 13.6 |
| 1 | 304.2 | 21.6 | 45.8 | 36 | 194.4 | 19.9 | |
| 2 | 664.5 | 47.2 | 78.8 | 61.9 | 458.2 | 47 | |
| 4 | 1032.1 | 73.3 | 101.3 | 79.6 | 707.8 | 72.6 | |
| 8 | 1407.1 | 100 | 127.2 | 100 | 975 | 100 | |
| IgG | 0.5 | 809.7 | 4.9 | 27.5 | 15 | 1355.6 | 6.3 |
| 1 | 1696.9 | 10.2 | 40.6 | 22.2 | 2782.1 | 13 | |
| 2 | 4543.8 | 27.3 | 68.3 | 37.3 | 6661.2 | 31.2 | |
| 4 | 10003.5 | 60 | 110.7 | 60.5 | 12605.6 | 59 | |
| 8 | 16662.8 | 100 | 182.9 | 100 | 21360.6 | 100 | |
| IgA | 0.5 | 797.4 | 19.3 | 31.1 | 47.2 | 2056.5 | 16.1 |
| 1 | 1529.5 | 37 | 41.4 | 62.8 | 3869 | 30.4 | |
| 2 | 2261.3 | 54.7 | 48.6 | 73.3 | 6648.9 | 52.2 | |
| 4 | 2320.4 | 56.2 | 48.3 | 73.2 | 6548.1 | 51.4 | |
| 8 | 4132.2 | 100 | 65.9 | 100 | 12744.8 | 100 | |
الجدول 5: تحسين تركيز الأجسام المضادة الثانوية: متوسط إشارة MFI المنتجة من تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة الثانوية تتراوح من 0.5 ميكروغرام / مل إلى 8 ميكروغرام / مل. يتم تقديم قيمة كل إشارة أيضا كنسبة مئوية من الإشارة عند 8 ميكروغرام / مل ("Max.") لإثبات حجم الإشارة النسبي.
| سبايك S1 | غشاء | نيوكليوكابسيد | |||||
| وقت الحضانة (دقيقة) | افي مؤسسة التمويل الأصغر | ٪ ماكس. | افي مؤسسة التمويل الأصغر | ٪ ماكس. | افي مؤسسة التمويل الأصغر | ٪ ماكس. | |
| IgM | 15 | 1185 | 72.2 | 40.4 | 48.9 | 609.5 | 53.3 |
| 30 | 1416.6 | 86.3 | 58.4 | 70.7 | 894.2 | 78.2 | |
| 60 | 1324.8 | 80.7 | 73.6 | 89.1 | 945.6 | 82.7 | |
| 120 | 1641.2 | 100 | 82.6 | 100 | 1143.2 | 100 | |
| IgG | 15 | 12917.6 | 80.5 | 244.4 | 44.9 | 15429.8 | 80.8 |
| 30 | 14915.4 | 92.9 | 434.7 | 79.9 | 18797 | 98.5 | |
| 60 | 15340.3 | 95.6 | 421.4 | 77.5 | 18694.4 | 97.9 | |
| 120 | 16050.3 | 100 | 544 | 100 | 19085.8 | 100 | |
| IgA | 15 | 3141.9 | 78.2 | 75 | 66.8 | 9103 | 86.6 |
| 30 | 3569.1 | 88.8 | 83.9 | 74.8 | 9563.8 | 91 | |
| 60 | 3539.1 | 88 | 86 | 76.6 | 9555.7 | 90.9 | |
| 120 | 4020 | 100 | 112.2 | 100 | 10512.9 | 100 |
الجدول 6: تحسين وقت حضانة الأجسام المضادة الثانوية: متوسط إشارة MFI المنتجة من أوقات حضانة مختلفة للأجسام المضادة الثانوية تتراوح من 15 دقيقة إلى 120 دقيقة. يتم تمثيل قيمة كل إشارة أيضا كنسبة مئوية من الإشارة عند 120 دقيقة ("Max.") لإثبات حجم الإشارة النسبي.
Discussion
وقد وصف تقدير الاستجابة المناعية للتعرض لفيروس سارس-كوف-2، بالاقتران مع الترصد القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل RT-PCR لحالة العدوى، بأنه وصفة طبية لتوضيح مسار التعافي من كوفيد-19، والعمل كوسيلة لتحديد بلازما النقاهة ذات القيمة العلاجية المحتملة، ومسح معدلات الإصابة على نطاق سكاني10,11. تشمل الأمثلة المختلفة لفهم التحويل المصلي لدى البشر صفائف البروتين (المستضد)12 ، والبقع المناعية 13 ، والتركيبات المناعية السريعة14 ، ومقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) 15،16،17. يمكن لكل من هذه التقنيات المذكورة أعلاه تقييم أنماط متعددة من الغلوبولين المناعي بشكل فردي مع تعديلات طفيفة. ومع ذلك، فإن هذه الإجراءات غير قابلة لإعادة استخدامها عمليا للسماح بإجراء تحليل مواز لأنماط متساوية متعددة، كما هو موضح في هذه المخطوطة، مما يجعل عوامل التكلفة والإنتاجية قيودا على إدارتها على استراتيجية اختبار على نطاق سكاني. توفر العديد من هذه التطبيقات أيضا الفرصة لتسلسل مستويات المستضدات المتعددة بالتوازي إما كما هو موضح أو في تنسيقات معدلة ، مثل ELISA18,19 متعدد الإرسال. وأخيرا، توفر منصة الخرزة المناعية إمكانية تقييم مستويات المستضدات المتعددة بالتوازي 20,21 ولكنها اقتصرت على ظهارة واحدة (أي النمط المتماثل للغلوبولين المناعي) لكل مقايسة ما لم يتم استخدام الأداة الحديثة ذات قدرات الفحص "ثنائية القناة".
في هذا التقرير ، يتم تعداد البروتوكولات التي تحدد القياس الموثوق به للظواهر المتعددة في فحص الخرز المناعي باستخدام الأداة في وضع "القناة المزدوجة" في دراسة حالة للتحويل المصلي للأفراد الذين تم تطعيمهم ب Covid-19. أظهرت الطريقة دقة ممتازة (قيم CV ٪ عادة <20٪) باستخدام تصميمات الفحص اليدوي التي يمكن تحسينها مع دمج الأنظمة الآلية المختبرية. وكانت حساسية الفحص والنطاق الديناميكي لجميع التحليلات والظواهر المختارة مناسبة للتقييمات الروتينية. على الرغم من أن عدم وجود كواشف مناعية مضادة للمستضد IgA و IgM متاحة تجاريا يحد من الكمية إلى النمط المتماثل IgG ، فإن مثل هذا التقييد لا يمنع القدرة على تقديم تقييمات أو تقييمات شبه كمية تتعلق بعينة معينة كعيار22,23.
تم تخصيص اختبار الخرزة المناعية التي تم التحقق منها للتحقيق في التحويل المصلي في مجموعة من الأفراد المحصنين بلقاح Covid-19. على النقيض من المنصات المماثلة الأخرى ، تسمح عائلة الأجهزة بالتنقيب عن التحويل المصلي في مئات الأفراد يوميا في سير عمل يدوي والآلاف يوميا في مخطط آلي. وعموما، تؤكد هذه النتائج أن نهج "القناة المزدوجة" لديه حساسية مناسبة لوصف ظواهر متعددة بالتوازي مع الفحص المطابق وهو قابل للتطبيق في سياق متعدد التحليلات. قد يبرر الاختلاف في الحساسيات تجاه القناة 1 والقناة 2 ، كما يتم إجراؤه باستخدام فلور phycoerythrin و Super Bright 436 ، على التوالي ، تصميم تجربة محددة لضمان الحصول على نتائج تحليلية قابلة للتطبيق لتجربة معينة. أي أن حجز القناة 1 للظواهر أو التحليلات ذات الانتشار المنخفض قد يكون ضروريا للحفاظ على نطاق ديناميكي للفحص يتضمن القيم المرصودة للمجهولين. وبعيدا عن هذا الاعتبار، كان تصميم الفحص واضحا وينبغي أن يكون متاحا بسهولة للمختبرات ذات القدرات التحليلية المحدودة. ومن المؤكد أنه ينبغي وزن هذا الاعتبار عند النظر في تداخل القناة 1 إلى القناة 2، كما أشرنا في الشكل 5، حيث قد يتسبب التداخل من الأنماط المتماثلة ذات الوفرة الأعلى في حدوث أخطاء تحليلية مضللة لأولئك الذين هم في وفرة أقل بكثير عند قياسها في نسق ثنائي القناة. وقد تمثل إمكانية التداخل هذه مع الحالات ذات التركيزات التحليلية المختلفة للغاية قيدا كبيرا على النهج إذا لم تعالج بشكل صحيح في مرحلة تصميم المقايسة.
في الختام ، تم تقديم طريقة لقياس عيارات الأجسام المضادة بسرعة من الأنماط المتماثلة الرئيسية للغلوبولين المناعي المرتبطة بالاستجابة المناعية لعدوى Covid-19 أو التطعيم. قد يوفر تطبيق هذا النهج بطريقة طولية لتقييم التحويل المصلي رؤى يمكن استخدامها بشكل أفضل لإدارة و / أو مراقبة مسار المرض أو ، بالتناوب ، توجيه برامج اللقاح المعززة ل Covid-19 المحتملة.
Disclosures
الدكتور بورجيا هو مخترع الاختبار المصلي المستخدم في هذه المخطوطة التي لا تزال بحاجة إلى براءة اختراع. يتم تقديم المقالة بطريقة وصفية فقط مع عدم تقديم تحليلات إحصائية لتجنب التحيز المحتمل الناجم عن صراع المؤلف.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا Rush Biomarker Development Core على استخدام مرافقهم ، ومستودع Rush Biorepository لتسجيل الموضوعات ومعالجة العينات الحيوية ، وأرقام منح مبادرة شبكة شيكاغو لتقييم فيروس كورونا (Chicago CAN) التابعة لمؤسسة Walder Foundation SCI16 (J.R.S. و J.A.B.) و 21-00147 (J.R.S. و J.A.B.) وجائزة من مؤسسة Swim Across America Foundation (J.A.B).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well black side polystyrene microtiter plates | Thermo Fisher | 12-565-346 | |
| Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Prepared in house | ||
| Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Bovine Serum Albumin, heat shock fraction | MilliporeSigma | A-7888-50G | |
| Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0) | Prepared in house | ||
| COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag) | MyBioSource | MBS8574735 | |
| Disposable pipette tips | |||
| EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher | PIA35391 | |
| Goat Albumin, Fraction V Powder | MilliporeSigma | A2514-1G | |
| IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB205009 | |
| IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB204009 | |
| IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB403009 | |
| IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB202009 | |
| IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4 | Thermo Fisher | 62999842 | |
| Instrument Analyzer | Luminex Corp. | INTELLIFLEX-RUO | |
| Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Thermo Fisher | 13-698-794 | |
| MagPlex-C Microspheres, Region XXX | Luminex Corp. | MC10XXX-01 | |
| MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate) | MilliporeSigma | M2933 | |
| Microplate aluminum sealing tape | Thermo Fisher | 07-200-683 | |
| Polysorbate-20 | Thermo Fisher | BP337-500 | |
| Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2 | Thermo Fisher | 50-751-7328 | |
| Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag) | Sino Biologicals | 40588-V08B | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag) | Sino Biologicals | 40591-V08H | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb | Sino Biologicals | 40592-T62 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb | Sino Biologicals | 40588-R0004 | |
| SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb | ProSci | 10-516 | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher | PIA39269 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Water, LC/MS grade | Thermo Fisher | W-64 |
References
- Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: potentials and pitfalls. Proteomics - Clinical Applications. 9, 406-422 (2015).
- Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4084 (2012).
- Powell, R. L., et al. A multiplex microsphere-based immunoassay increases the sensitivity of siv-specific antibody detection in serum samples and mucosal specimens collected from rhesus macaques infected with SIVmac239. BioResearch Open Access. 2 (3), 171-178 (2013).
- Volpetti, F., Garcia-Cordero, J., Maerkl, S. J. A microfluidic platform for high-throughput multiplexed protein quantitation. PLoS One. 10 (2), 0117744 (2015).
- Rabi, F. A., Al Zoubi, M. S., Kasasbeh, G. A., Salameh, D. M., Al-Nasser, A. D. SARS-CoV-2 and coronavirus disease 2019: What we know so far. Pathogens. 9 (3), 231 (2020).
- Asif, M., Xu, Y., Xiao, F., Sun, Y. Diagnosis of COVID-19, vitality of emerging technologies and preventive measures. Chemical Engineering Journal. 423, Lausanne, Switzerland. 130189 (2021).
- La Marca, A., Capuzzo, M., Paglia, T., Roli, L., Trenti, T., Nelson, S. M. Testing for SARS-CoV-2 (COVID-19): a systematic review and clinical guide to molecular and serological in-vitro diagnostic assays. Reproductive Biomedicine Online. 41 (3), 483-499 (2020).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. The Clinical Biochemist. Reviews. 29, Suppl 1 49-52 (2008).
- Tarhoni, I., et al. Relationship between circulating tumor-associated autoantibodies and clinical outcomes in advanced-stage NSCLC patients receiving PD-1/-L1 directed immune checkpoint inhibition. Journal of Immunological Methods. 490, 112956 (2021).
- Deeks, J. J., et al. Antibody tests for identification of current and past infection with SARS-CoV-2. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 6, 013652 (2020).
- Mahalingam, S., et al. Landscape of humoral immune responses against SARS-CoV-2 in patients with COVID-19 disease and the value of antibody testing. Heliyon. 7 (4), 06836 (2021).
- Ruano-Gallego, D., et al. A multiplex antigen microarray for simultaneous IgG and IgM detection against SARS-CoV-2 reveals higher seroprevalence than reported. Microbial Biotechnology. 14 (3), 1228-1236 (2021).
- Shah, J., et al. IgG and IgM antibody formation to spike and nucleocapsid proteins in COVID-19 characterized by multiplex immunoblot assays. BMC Infectious Diseases. 21 (1), 325 (2021).
- Gambino, C. M., et al. Comparison of a rapid immunochromatographic test with a chemiluminescence immunoassay for detection of anti-SARS-CoV-2 IgM and IgG. Biochemia Medica (Zagreb). 30 (3), 030901 (2020).
- Algaissi, A., et al. SARS-CoV-2 S1 and N-based serological assays reveal rapid seroconversion and induction of specific antibody response in COVID-19 patients. Scientific Reports. 10, 16561 (2020).
- Chiereghin, A., et al. Recent advances in the evaluation of serological assays for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection and COVID-19. Frontiers in Public Health. 8, 620222 (2020).
- Nicol, T., et al. Assessment of SARS-CoV-2 serological tests for the diagnosis of COVID-19 through the evaluation of three immunoassays: Two automated immunoassays (Euroimmun and Abbott) and one rapid lateral flow immunoassay (NG Biotech). Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104511 (2020).
- Butt, J., et al. From multiplex serology to serolomics-A novel approach to the antibody response against the SARS-CoV-2 proteome. Viruses. 13 (5), 749 (2021).
- Byrum, J. R., et al. multiSero: open multiplex-ELISA platform for analyzing antibody responses to SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
- Dobano, C., et al. Highly sensitive and specific multiplex antibody assays to quantify immunoglobulins m, a, and g against SARS-CoV-2 antigens. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 01731 (2021).
- Schultz, J. S., et al. Development and validation of a multiplex microsphere immunoassay using dried blood spots for SARS-CoV-2 seroprevalence: Application in first responders in first responders in Colorado, USA. Journal of Clinical Microbiology. 59 (6), 00290 (2021).
- Beavis, K. G., et al. Evaluation of the EUROIMMUN anti-SARS-CoV-2 ELISA assay for detection of IgA and IgG antibodies. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan Americal Society for Clinical Virology. 129, 104468 (2020).
- Jung, J., et al. Clinical performance of a semi-quantitative assay for SARS-CoV2 IgG and SARS-CoV2 IgM antibodies. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 510, 790-795 (2020).
