Summary
Denna artikel beskriver en bekväm metod för att övervaka dynamiska förändringar i antikroppstitrar för två immunoglobulinisotyper samtidigt (antingen IgA, IgM eller IgG) till följd av ett immunsvar mot SARS-CoV-2-infektion eller vaccination. Denna "Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel" använder tre indirekta immunanalyser byggda på kodade mikrosfärer som läses med en flödesbaserad multiplexläsare med "dubbelkanal" -kapacitet.
Abstract
Multiplexteknik för att förhöra flera biomarkörer i samförstånd har funnits i flera decennier; metoder för att utvärdera flera epitoper på samma analyt förblir dock begränsade. Denna rapport beskriver utvecklingen och optimeringen av en multiplexerad immunobead-analys för serologisk testning av vanliga immunoglobulinisotyper (t.ex. IgA, IgM och IgG) associerade med ett immunsvar mot SARS-CoV-2-infektion eller vaccination. Analyser utfördes med hjälp av en flödesbaserad, multiplex fluorescerande läsare med dubbelkanalskapacitet. Optimeringar fokuserade på analytfångsttid, detektionsantikroppskoncentration och detektionsantikroppsinkubationstid. Analytiska analysprestandaegenskaper (t.ex. analysområde (inklusive nedre och övre kvantifieringsgränser) och precision mellan och mellan analyser) fastställdes för antingen IgG/IgM eller IgA/IgM serotypkombination tillsammans med hjälp av "dual channel"-läget. Analytinspelningstider på 30 minuter för IgG, 60 min för IgM och 120 min för IgA var lämpliga för de flesta applikationer, vilket gav en balans mellan analysprestanda och genomströmning. Optimala detektionsantikroppsinkubationer vid 4 μg/ml i 30 min observerades och rekommenderas för allmänna tillämpningar, med tanke på den övergripande utmärkta precisionen (procentvariationskoefficient (% CV) ≤ 20%) och känslighetsvärden som observerats. Det dynamiska området för IgG-isotypen sträckte sig över flera storleksordningar för varje analys (Spike S1, Nukleokapsid och membranglykoproteiner), vilket stöder robusta titerutvärderingar vid en utspädningsfaktor på 1:500 för kliniska tillämpningar. Slutligen tillämpades det optimerade protokollet för övervakning av Spike S1-serokonversion för försökspersoner (n = 4) som slutförde en SARS-CoV-2-vaccinregim. Inom denna kohort observerades Spike S1 IgG-nivåer för att nå maximala titrar vid 14 dagar efter administrering av andra dosen, vid en mycket högre (~ 40-faldig) signalintensitet än antingen IgM- eller IgA-isotyper. Intressant nog observerade vi mycket varierande Spike S1 IgG titer sönderfallshastigheter som till stor del var ämnesberoende observerades, vilket kommer att vara ämnet för framtida studier.
Introduction
Samtidig mätning av flera sjukdomsrelaterade biomarkörer i biologiska prover möjliggör beskrivande och prediktiva insikter i patologiska processer. Medan konventionella immunologiska förfaranden för enstaka analyter, såsom enzymbundna immunosorbentanalyser (ELISA), har varit hörnstenen i kvantitativa analyser i både kliniska och forskningsmiljöer, kan dessa tekniker ha betydande begränsningar när det gäller genomströmning, mängden prov som krävs för varje mätning och kostnadseffektivitet som i hög grad begränsar studien av flera biologiska element som ofta är sammanflätade under sjukdomsförloppet1 . Mikrosfärbaserad multiplexeringsteknik har blivit en oumbärlig plattform för både diagnos- och forskningsanläggningar för dess förmåga att kombinera analyser för att förbättra laboratoriegenomströmningen, mildra provbrist och minska repetitiva tester för att maximerakostnadsbesparingarna 1,2,3,4. Nyligen har ytterligare förstärkning av denna multiplexeringskraft introducerats med instrument som har dubbla reporterfunktioner. Dual-reporter-funktionen implementerar två fluorescerande kanaler för detektion, vilket ger en annan dimension av multiplexering, vilket möjliggör detektering av flera epitoper på samma analyt.
Allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) är den patogen som är ansvarig för den nuvarande coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) pandemi5. Medan RT-PCR-testning är avgörande för infektionsbekräftelse i början av sjukdomsförloppet, har serologiska undersökningar av antikroppstitrar visat sig vara avgörande för korrekt och fullständig kritik av individer angående en tidigare exponering eller återhämtning; ett svar på immunisering; och/eller en utvärdering av Covid-19 vaccinationseffekt 6,7.
Denna rapport avgränsar metoder för att mäta serokonversion för flera SARS-CoV-2 virala antigener som använder ett flödesbaserat, multiplexläsare dubbelrapporteringssystem. Specifikt beskrivs samtidig detektion av två antikroppsundertyper (konfigurerade som IgG / IgM eller IgA / IgM) för en 3-plex SARS-CoV-2-antigenpanel som inkluderar analyser för Spike S1, Nukleokapsid och membran (aka Matrix) glykoproteiner. Detta tillvägagångssätt ger ett idealiskt företag för att fånga longitudinell serokonversion och bidrar med ett värdefullt verktyg i arsenalen mot Covid-19-pandemin.
Protocol
Alla ämnen registrerades med skriftligt informerat samtycke med fullständigt godkännande från Institutional Review Board (IRB) av Rush University Medical Center enligt protokoll ORA 20101207 med alla institutionella riktlinjer för etiskt forskningsbeteende observerat. Blod samlades in via konventionell flebotomi till lavendelvacutainers (K2EDTA) och bearbetades med rekommenderade protokoll. Den resulterande plasman arkiverades vid -80 °C tills bedömningar utfördes.
1. Beredning av antigenkonjugerade mikrosfärer
- Välj tre olika injektionsflaskor med magnetiska mikrosfärer med unika pärlregioner, registrera pärl-ID och partiinformation för varje injektionsflaska som används.
OBS: Följande steg kommer att följas för varje distinkt mikrosfärregion. Mikrosfärer är ljuskänsliga och bör skyddas mot långvarig exponering för ljus. Var försiktig så att du inte stör mikrosfärerna under tvättstegen. Om du störs, tillåt en andra 60 s separation. - Vortex mikrosfärbeståndet för 60 s och ultraljudsbehandling i 5 minuter före användning för att dissociera aggregerade pärlor.
- Överför 1,0 x 106 pärlor till ett 1,5 ml lågproteinbindande mikrocentrifugrör.
- Sätt in röret i en magnetisk separator och låt separation ske i 60 s. Med röret fortfarande i magnetavskiljaren, ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pärlpelleten.
- Ta bort röret från magnetavskiljaren, återsuspendera pärlorna med 100 μL HPLC-vatten och virvel i 30 s. Placera röret tillbaka i magnetavskiljaren i 60 s och ta sedan bort supernatanten. Upprepa detta tvättprotokoll två gånger.
- Ta bort röret från magnetavskiljaren och återsuspendera de tvättade mikrosfärerna i 90 μL 100 mM monobasiskt natriumfosfat, pH 6,2 (aktiveringsbuffert) med virvel i 30 s.
- Tillsätt 10 μL 50 mg/ml Sulfo-NHS (utspädd med aktiveringsbuffert) till mikrosfärerna och virveln försiktigt i 10 s. Tillsätt 10 μl 50 mg/ml EDC-lösning (utspädd med aktiveringsbuffert) och virvel försiktigt i 10 s. Inkubera mikrosfärer i 20 min vid rumstemperatur (RT) med en mild virvel var 10: e minut.
- Upprepa tvättsteg 1,4-1,5 med 50 mM MES, pH 5,0 (kopplingsbuffert) i stället för vatten av LC/MS-kvalitet för totalt två tvättar.
- Ta bort röret från magnetavskiljaren och återsuspendera pärlorna med 100 μL kopplingsbuffert med virvel i 30 s följt omedelbart av tillsats av önskad mängd protein.
- Öka den totala volymen till 150 μL med kopplingsbuffert. Blanda kopplingsreaktionen med virvel i 30 s och inkubera i 2 timmar genom rotation vid RT.
OBS: För analyser som definieras häri utfördes konjugationer med följande proteinkoncentrationer: Spike S1: 5 μg; Nukleokapsid: 5 μg; Membran: 12,5 μg. - Upprepa tvättsteg 1.4 med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) -1% getserumalbumin, 0.01% polysorbat-20 (släckbuffert) i stället för LC / MS-kvalitet vatten för totalt två tvättar. Resuspendera de tvättade mikrosfärerna i 100 μL Quench Buffer innehållande 0,05% natriumazid med virvel i 30 s.
OBS: Låt pärlorna släcka helt i minst 6 timmar innan du fortsätter till något annat förfarande. - Räkna antalet återvunna mikrosfärer med hjälp av en automatiserad cellräknare eller en hemocytometer. Anteckna den observerade pärlkoncentrationen.
- Kyl de kopplade mikrosfärerna vid 4 °C i mörker.
2. Förfaranden
- Analysprestanda (basprotokoll)
- Resuspend de kopplade mikrosfärerna av virvel i 30 s och sonikat för ~ 60-90 s.
- Ta bort den erforderliga mängden av varje pärlkolloid från respektive rör och kombinera pärlkolloiderna i ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Sätt in röret i en magnetisk separator och låt separation ske i 60 sekunder. Med röret fortfarande i magnetavskiljaren, ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pärlpelleten.
- Ta bort pärlorna från separatorn, återsuspendera pärlorna med 100 μL PBS-1% bovint serumalbumin, 0,01% Polysorbat-20 (Analysbuffert) och virvel i 30 s. Placera röret i en magnetisk separator och låt separation ske i 60 s. Upprepa detta tvättprotokoll (dvs. steg 2.1.3-2.1.4) två gånger
- Justera koncentrationen av den 3-plex fungerande mikrosfärblandningen genom att tillsätta en lämplig volym analysbuffert för att generera en slutlig koncentration på 100 mikrosfärer per 1 μL för varje mål.
- Alikvot 12,5 μl av mikrosfärblandningen framställd i steg 2.1.5 i varje brunn på en 384-brunnsplatta eller 25 μL i varje brunn på en 96-brunnsplatta.
- Späd plasma-/serumproverna 500 gånger i Analysbuffert. Förbered standardprover enligt önskad titrering.
- Tillsätt 12,5 μl analysbuffert som blindprov och tillsätt var och en av de utspädda provkropparna eller standardproverna i varje bestämd brunn på en provplatta med 384 brunnar eller 25 μl av blindprovet, det utspädda provexemplaret eller standardprovet i varje brunn på en provplatta med 96 brunnar.
- Täck plattan med en aluminiumtätning eller folie och inkubera i 1 timme vid RT på en plattskakare inställd på 700 rpm.
ANMÄRKNING: Schematisk beräkning för utspädningskurvorna finns i tabell 1. - Bered en lösning av antikroppar mot människa (sekundära antikroppslösningar) vid 4 μg/ml med Assay Buffer enligt steg 2.1.11.
- Förbered Get-anti-human IgM, konjugerad med Super Bright 436 (SB)/Goat-anti-human IgA, Phycoerythrin (PE) Konjugatdetektionsantikroppar vid 4 μg/ml; eller Get-anti-human IgM, SB Konjugat / Get-anti-human IgG, PE-konjugatdetektion antikroppar vid 4 μg / ml.
OBS: För ett 384-brunnsplattformat krävs 12,5 μL / brunn av den beredda sekundära antikroppslösningen, och för ett 96-brunnsplattformat krävs 25 μL / brunn. - Placera plattan på en magnetisk separator, tvätta snabbt och vänd kraftigt över en biofarlig behållare för att ta bort vätska från brunnarna. Med plattan fortfarande inverterad, knacka plattan kraftigt mot en tjock pappersmassa.
- Tvätta varje brunn med 100 μL Analysbuffert och avlägsna vätskan genom kraftig inversion över en biofarlig behållare, som tidigare beskrivits. Upprepa dessa steg (2.1.12-2.1.13) för totalt två tvättar. Kasta alla använda pappersmassor i en biohazardbehållare.
- Tillsätt 12,5 μl av den sekundära antikroppsarbetslösningen till varje brunn på en 384-brunnsplatta eller 25 μl till varje brunn på en 96-brunnsplatta. Täck plattan med en aluminiumtätning eller folie och inkubera i 30 minuter vid RT på en plattskakare inställd på 700 rpm.
- Upprepa tvättstegen 2.1.12-2.1.13
- Tillsätt 75 μL analysbuffert i varje brunn på en 384-brunnsplatta eller 100 μl i varje brunn på en 96-brunnsplatta. Täck plattan med en aluminiumtätning eller folie och inkubera i 5 minuter vid RT på en plattskakare inställd på 700 rpm.
- Analysera 60 μL via instrumentanalysatorn enligt systemmanualen.
- Optimering av inkubationstiden för provfångst
- Utför stegen i avsnitt 2.1 med inkubationstiderna 30 min, 60 min och 120 min i steg 2.1.9.
ANMÄRKNING: Inkubationer kan utföras antingen med distinkta plattor eller genom paus i steg 2.1.6 tills det är dags att gå vidare till steg 2.1.9. för att uppnå de önskade inkubationstiderna. - Fortsätt med plattavläsningen på analysatorn med 60 μL av analysblandningen enligt tillverkarens rekommendationer.
- Utför stegen i avsnitt 2.1 med inkubationstiderna 30 min, 60 min och 120 min i steg 2.1.9.
- Optimering av sekundär antikroppskoncentration
- Utför denna procedur enligt beskrivningen i avsnitt 2.1, med undantag för de slutliga koncentrationerna av reagenser i den sekundära antikroppsarbetslösningen (beredd i steg 2.1.10-2.1.11) modifierad enligt följande:
Get-anti-human (eller kanin) IgM, SB-konjugatdetektionsantikroppar vid 8, 4, 2, 1 och 0,5 μg / ml.
Get-anti-human (eller kanin) IgA, PE-konjugatdetektionsantikroppar vid 8, 4, 2, 1 och 0,5 μg / ml.
Get-anti-human (eller kanin) IgG, PE-konjugatdetektionsantikroppar vid 8, 4, 2, 1 och 0,5 μg / ml.
Get-anti-human (eller kanin) IgG, PE-konjugat / Get-anti-human (eller kanin) IgM, SB-konjugatdetektionsantikroppar vid 8, 4, 2, 1 och 0,5 μg / ml.
Get-anti-human (eller kanin) IgA, PE-konjugat / Get-anti-human (eller kanin) IgM, SB-konjugatdetektionsantikroppar vid 8, 4, 2, 1 och 0,5 μg / ml. - Fortsätt med plattavläsningen på analysatorn med 60 μL av analysblandningen enligt tillverkarens rekommendationer.
- Utför denna procedur enligt beskrivningen i avsnitt 2.1, med undantag för de slutliga koncentrationerna av reagenser i den sekundära antikroppsarbetslösningen (beredd i steg 2.1.10-2.1.11) modifierad enligt följande:
- Optimering av sekundär antikroppsinkubationstid
- Utför denna procedur enligt beskrivningen i avsnitt 2.1 med 15 min, 30 min, 60 min och 120 min inkubationstid definierad i steg 2.1.14.
- Fortsätt med plattavläsningen på analysatorn med 60 μL av analysblandningen enligt tillverkarens rekommendationer.
- Utvärdering av motivprover med optimerade tvåkanalsanalyser
- Samla in plasmaprover från försökspersonen (n = 4) vid dagarna -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 och +120 i förhållande till slutförandet av Covid-19-vaccin (dvs. andra dosen) administrering.
OBS: Dag 0 representerar den tidpunkt då vaccinationen slutfördes. - Utför alla analyser med basprotokollet (avsnitt 2.1.) som antingen en IgG/IgM- eller IgA/IgM-analys med dubbla kanaler.
- Normalisera resultaten till det maximala observerade MFI-värdet (Median Fluorescent Intensity) för varje specifikt immunglobulin och analys.
- Samla in plasmaprover från försökspersonen (n = 4) vid dagarna -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 och +120 i förhållande till slutförandet av Covid-19-vaccin (dvs. andra dosen) administrering.
Representative Results
Typiska analysresultat och prestandautvärderingar
Immunobead-analyser ger vanligtvis en sigmoidal kurva när de utvärderas över flera (log) storleksordningar, vilket illustreras i var och en av panelerna som presenteras i figur 1. Användaren måste experimentellt definiera det optimala koncentrationsintervallet för varje analyt i multiplexen för att bestämma hela kvantifieringsområdet, vilket säkerställer att man inte överprovar ytterligheterna (områden som närmar sig den nedre kvantifieringsgränsen [LLOQ] eller den övre kvantifieringsgränsen [ULOQ]). Det faktiska intervall som krävs för en analys dikteras emellertid av fördelningen av målanalyterna i en biologisk matris (dvs. de "okända") vid en given utspädningsfaktor. Vidare, även om standardkurvor vanligtvis tolkas via linjär regression med en 4- eller 5-parametrisk anpassningsalgoritm, ger den linjära delen av en given kurva vanligtvis det största förtroendet för kvantitativ noggrannhet med en linjär (y = mx + b) kvantifieringsmodell. Att matcha kalibreringskurvan med de observerade värdena för en okänd vid en given utspädningsfaktor bör vara målet i kvantitativ analysutveckling.
I detta avseende utvärderades en 7-punkts standardkurva baserad på en 1:5 seriell utspädningsserie för var och en av Spike S1-, Nukleokapsid- och membranantikroppar som sträcker sig mellan 1 μg/ml och 0,000064 μg/ml för Spike S1 och Nukleokapsid och 5 μg/ml och 0,00032 μg/ml för membran, som visas i figur 1. Den nedre detektionsgränsen (LLOD) för varje analys definierades som den lägsta analytkoncentrationen som gav en signal som kunde särskiljas från dess bakgrund. LLOD kan identifieras med den ekvation som beskrivits tidigare 8,9, LLOD = LoB + 1,645 (SDlågkoncentrationsprov). LoB är den nedre gränsen för blank, och det är den "uppenbara" koncentrationen av analyt som produceras från ämnet när ett nollvärde förväntas, och det kan fastställas med hjälp av denna ekvation LoB =Medelämne + 1.645 (SDblank)8. Baserat på denna metod varierade MFI-värdena för Spike S1-analysen från 134,38 till 20191,2, med 134,38 MFI som representerade 0,00024 μg / ml och definierades som LLOD. För membrananalysen var det praktiska MFI-intervallet 52,24 till 4764,9, med 52,24 MFI beräknat till 0,004885 μg / ml och tilldelat som LLOD. MFI-intervallet för Nukleokapsidanalysen var 517,9 till 19666,34, med 517,9 specificerat som 0,00024 μg/ml, vilket var LLOD. Den övre detektionsgränsen (ULOD) definieras som koncentrationen av analyt varefter förändringen i MFI inte längre är linjär och signalresponsen är mättad. Det bör noteras att den fullständiga sigmoidala karaktären hos dessa kurvor inte är observerbar för de testade standarderna, med undantag för nukleokapsidkurvan. Med tanke på de observerade MFI-värdena för alla okända analyser hittills (vid en utspädning på 1:500) ligger de dock inom det presenterade kurvområdet för varje analyt och kvantifieras enkelt med hjälp av en 4- eller 5- parametrisk passform via linjär regression.
Analysprecision
Precision inom analysen: Fyra replikat av analyser utfördes på samma platta för att bedöma analysens precision, beräknad som %CV, eller kvoten av standardavvikelsen och medelvärdet multiplicerat med 100. Standardpunkterna 2 och 5 valdes för dessa tabeller, med värden katalogiserade i tabell 2. Den typiska acceptabla övre gränströskeln för % CV-värden är ≤20%, vilket observerades för dessa data, med undantag för standard 2 för membran IgG, som sannolikt härrör från bakgrundsnivåer och kan korrigeras genom att eliminera avlägsna värden (data visas inte). Det bör noteras att en uppenbar instabilitet i läsvärdet observerades för membrananalyser där MFI-värdena var <200, oftast när det gäller IgA- och IgM-isotyper.
Precision mellan analyser: Tre distinkta partier av pärluppsättningar förbereddes för varje analys och testades, enligt definitionen för intraanalysprecision (ovan och som ses i figur 1). Variabiliteten mellan analyserna bedömdes genom att % CV beräknades utifrån de genomsnittliga resultaten för var och en av tre satser, såsom visas i tabell 3. Återigen är den övre gränströskeln för ett acceptabelt% CV satt till ≤20%, vilket finns för alla testade förhållanden (med en liknande effekt med standard 2 för membran IgG, som ses ovan). Det bör noteras att batch-till-batch-variabilitet i netto MFI-värden vanligtvis observeras inom flera satser av samma immunreagenter under anpassad analysutveckling. Användningen av en kalibreringskurva uppbyggd från en kommersiellt erhållen anti-målantikropp (t.ex. kanin-spike S1) följt av en anti-artdetekteringsantikropp kan ge konsekvens i analysresultaten och möjliggöra jämförelser mellan flera satser vid olika tidsperioder.
Precision mellan analyser med humana prover: Utvärderingen av precisionen mellan analyserna upprepades med humana plasmaprover (n = 5) som samlats in inom en månad efter de första rapporterade symtomen för en SARS-CoV-2-infektion; åstadkoms med tre distinkta satser av analyser (dvs. olika beredningar av pärluppsättningarna). Dessa resultat visas i tabell 4 och visar precision med ett %CV-värde med det typiska övre tröskelvärdet på ≤20 %. De genomsnittliga % CV-värdena för Spike S1-, Nukleokapsid- och membran-IgG-titrarna beräknades till 9,9% (intervall 2,6% -18%), 11,0% (intervall 3,5% -24,4%) respektive 7,6% (intervall 3,2% -12,9%). Liknande observationer gjordes med IgM- och IgA-titrarna för dessa tre analyter, som alla gav % CV-värden <20%. Det enda undantaget från detta var ämne 5 IgM-titrar för membranproteinet, som därefter uteslöts som en outlier. Precisionsvärdena för utvärderingarna av försökspersoner överensstämmer med de som ses ovan för kaninantikropparna, vilket tyder på att dessa analyser lätt kan omkonfigureras för att utvärdera titrar av antigenerna hos flera arter med liten inverkan på analysprecisionen. Som nämnts ovan fanns det en uppenbar instabilitet att läsa värden som observerats för membrananalyser där MFI-värdena var <200, oftast när det gäller IgA- och IgM-isotyper.
Primär antikroppskoncentrationsoptimering
Analytens "fångsttid" utvärderades med de antigenkonjugerade pärlorna, och antikropparna i plasmaproverna eller i standarderna testades genom att modifiera längden på den primära inkubationen (30 min, 1 h, 2 h och 4 h). Skillnaden i genomsnittlig MFI presenteras som kvoten för en specifik inkubation och den maximala inkubationstiden, kallad % Max., i figur 2, mellan en 30 min inkubation (minsta varaktighet) och en 4-timmars inkubation (maximal varaktighet). Värdena vid 120 min var optimala för IgG-titrar för Spike S1, Membrane och Nucleocapsid-antikropparna, vilket indikerar en snabb-primär antikroppsbindande kinetik, vilket möjliggör flexibilitet för att öka analysgenomströmningen. Långsammare kinetik observerades dock för isotyperna IgA och IgM (data visas inte), vilket visar toppfångstnivåer vid 4-timmars tidpunkt, som visas i figur 2. Sammantaget finns det en balans mellan närmar sig analysmättnad och den praktiska tidslämpligheten för att köra varje analys när den är i produktion (för att maximera genomströmningen). Med detta observerades lämpliga signaler för kvantitativa ändamål vid minimala inkubationstider på 30 min för IgG, 60 min för IgM och 120 min för IgA i dessa fynd.
Sekundär antikroppskoncentrationsoptimering
Fem koncentrationer av sekundära antikroppar (get anti-human IgG, PE-konjugerad; get anti-human IgA, PE-konjugerad; get anti-human IgM, SB-konjugerad) testades (0,5, 1, 2, 4 och 8 μg / ml). Alla antikroppar avslöjade stora signalområden, utan uppenbar signalmättnad i något tillstånd, vilket säkerställde en linjär mätning för någon av koncentrationerna. Som ett exempel var den genomsnittliga signalen som genererades från Spike S1-analysen med get-anti-human IgM, SB-konjugerad vid 0,5 μg / ml 13,2% av MFI genererad från den maximala signalen (8 μg / ml), medan MFI genererad från 4 μg / ml var 73,3% av MFI som manifesterades vid maximal signal. Detaljer om signalintervallet från de andra Spike S1-antikroppsisotyperna, membranantikropparna och nukleokapsidantikropparna ingår i tabell 5 och figur 3. Som en praktisk punkt återspeglas den primära effekten mellan den optimala sekundära antikroppskoncentrationen och den tidigare angivna 4 μg / ml sekundära antikroppskoncentrationen i termer av analyskänslighet och analyskostnad. Det vill säga en sekundär antikroppskoncentration på 8 μg/ml kan vara önskvärd för applicering med låga antikroppstitrar eller låga mängder värdefullt prov, men kostnaden för dessa analyser skulle vara betydligt högre än användningen av den tidigare definierade koncentrationen på 4 μg/ml. Omvänt skulle fall där höga antikroppstitrar skulle observeras (såsom individer som har upplevt Covid-19-vaccinationer eller med icke-begränsande mängder serum) se en kostnadsfördel genom applicering av de lägre mängderna sekundära antikroppar (t.ex. 1 μg / ml).
Sekundär antikroppsinkubationsoptimering
Den potentiella påverkan av varaktigheten av den sekundära antikroppskubationen undersöktes också genom att modifiera inkubationens längd (15, 30, 60 och 120 min). I allmänhet översteg skillnaden i den genomsnittliga MFI som presenteras som kvoten för en specifik inkubation och den maximala inkubationstiden, kallad %Max, mellan en 15 min inkubation (minsta varaktighet) och en 120 min inkubation (maximal varaktighet) inte 30%, 55% och 50% för Spike S1, Membrane respektive Nukleokapsidantikropparna, vilket indikerar ett snabbt kinetiskt steg i sekundär antikroppsbindning och ett sätt att öka analysgenomströmningen. Tabell 6 innehåller uppgifter om signalförändringar för alla inkubationstider. Illustrationer av de observerade signalerna från olika inkubationer av denna analys visas i figur 4.
Prestanda och specificitet med dubbla kanaler
För varje analyt jämfördes en enda körning i reporterformat (endast IgG-PE, endast IgA-PE eller endast IgM-SB) med signalen som genererades för samma analyt när den kördes i ett dual-reporter-format (t.ex. Spike S1 IgG-PE endast jämfört med Spike S1 IgG-PE i kombination med Spike S1 IgM-SB i dual-reporter-formatet). Analysprecision (uttryckt som % CV) för signalerna som skapades i de två formaten användes för att analysera förhållandet i resultaten av detta experiment. %CV-värdena för Spike S1-analyserna var 6,19%, 16,4% och 23% för IgM, IgG respektive IgA. För membrananalysen var % CV-värdena 3,3%, 7,9% och 16,4% för IgM, IgG respektive IgA. Slutligen gav Nukleokapsidanalysen% CV-värden på 8,7%, 10,3% och 24,2% för IgM, IgG respektive IgA. De precisionsvärden som observerats för IgM- och IgA-isotyperna tyder på att en längre inkubationstid kan ge överlägsna analysresultat på grund av de kända bindande kinetiska skillnaderna mellan dessa klasser av immunglobuliner. Figur 4 visar överensstämmelsen mellan formaten för olika koncentrationer av sekundära antikroppar.
För att bekräfta reporterkanalernas specificitet testades en enda reporterkanal vid en tidpunkt medan den andra kanalen tilldelades som ett tomt för att fråga om den icke-specifika signalen (blödningseffekt). Dessa resultat indikerar att det finns försumbar korssignalkontaminering mellan de två reporterkanalerna, med tanke på den höga specificiteten över hela spektrumet av förhållanden. Dessa resultat illustreras i figur 5. Sammantaget observerade vi en störning på 6,45 % över kanal 1 till kanal 2. Men när signalernas storlek redovisades observerade vi följande potentiella störningsnivåer i dubbelt reporterläge: Spike IgG / IgM vid 71,98%, Spike IgA / IgM vid 28,11%; Membran IgG / IgM vid 7,41%, Membran IgA / IgM vid 134,61%; och Nukleokapsid IgG / IgM vid 146,03%, Nukleokapsid IgA / IgM vid 112,13%. I den angivna konfigurationen skulle detta kräva mätning av Spike IgM i kombination med IgA-isotypen, Membran IgM med IgM-isotypen och nukleokapsidmätningar som inte utförs i ett dubbelkanalformat. Detta resultat kan kräva undersökning av inversionen av märkningsstrategin där IgA och IgG mäts i kanal 2 och IgM i kanal 1.
Utvärdering av serokonversionshändelser efter covid-19-vaccination
Serokonversion övervakades hos fyra försökspersoner efter bedömning av IgA, IgM och IgG med Spike S1-analysen vid tidpunkter som sträcker sig från förvaccination till fyra månader efter slutförandet av Covid-19-vaccinationsserien. Mätningarna utfördes i tvåkanalsläge (IgG / IgM och IgA / IgM, med IgM-värden i genomsnitt). Alla försökspersoner fick vaccinet som en 2-stegs immunisering, enligt standardpraxis, med ett 21-dagars intervall mellan den första och andra dosen. Diagram över varje försökspersons immunsvar visas i figur 6A-C. Immunsvarsvärden för nukleokapsid- och membranantigen observerades vid bakgrundsnivåer för alla utvärderade immunglobuliner (data visades inte), vilket överensstämde med att försökspersonerna inte hade någon dokumenterad tidigare SARS-CoV-2-infektion under tiden före vaccinationen. Sammantaget var de observerade Spike S1 IgA- och IgM-värdena ungefär 40 gånger lägre än IgG-isotyptitrarna, med topptitrar som kröntes så snart som 14 dagar för både IgM- och IgG-isotyper och IgA-isotypen nådde topptitrare mellan tidpunkten för den andra dosen (dag 0) och 14 dagar efter andra dosen, beroende på ämnet. I synnerhet börjar Spike S1 IgG-titrarna förfalla under de fyra månaderna efter avslutad vaccination i en mycket varierande takt, på ett ämnesberoende sätt.
Figur 1: Representativa 3-plex standardkurvor. Representativa standardkurvor för de tre analyterna; presenteras som en 7-punkts, 1:5 seriell utspädningskurva som börjar vid (A) 1 μg/ml för Spike S1, (B) 5 μg/ml för membran och (C) 1 μg/ml för nukleokapsid och antikroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Optimering av primär antikropps-/provinkubationstid: Den genomsnittliga MFI-signalen som produceras från olika inkubationstider för primära antikroppar/prover (antikroppsinfångning) från 30 min till 4 timmar för standarderna 1–7 (som anges i tabell 1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Sekundära antikroppskoncentrationsoptimeringar och dubbelkanalsprestanda. Kurvor illustrerar den genomsnittliga MFI (normaliserad till det högsta registrerade värdet i serien) som produceras från testade sekundära antikroppskoncentrationer, från 0,5-8 μg / ml. Varje instans utfördes både som en en- och tvåkanalsanalys för att uppskatta skillnader i det experimentella formatet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Sekundär inkubationstidsoptimering av antikroppar, dubbelkanalformat. Representativa diagram över observerade MFI-värden (normaliserade till det högsta registrerade värdet i serien) med avseende på inkubationstid med sekundära antikroppar. Experiment utfördes som tvåkanalsanalyser som (A-C) IgA / IgM eller (D-F) IgG / IgM-kombinationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Specificitetsbedömningar för tvåkanalsanalyser. Analysresultat av dubbelkanalsanalysformatet med en av varje kombination betecknad som ämnet för att illustrera bristen på fluorescerande eller interferens över flera kanaler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Illustration av serokonversion efter Covid-19-vaccination. Diagram som illustrerar de relativa titrarna för (A) IgG, (B) IgM och (C) IgA-antikroppar för Spike S1-antigenet under Covid-19-vaccination (före vaccination - 4 månader efter slutförandet); tiden visas i dagar i förhållande till slutförandet av vaccinationsserien; allmänna punkter för vaccinadministrationen anges (röda linjer). Experiment utfördes i dubbelkanalläge, enligt beskrivningen i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Standardnummer | Utspädningsserie | Anti-Spike S1 eller N (μg / ml) | Antimembran (μg/ml) |
| Blank | Blank | - | - |
| 1 | STD7 1:1 | 1 | 5 |
| 2 | STD6 1:5 | 0.2 | 1 |
| 3 | STD5 1:25 | 0.04 | 0.2 |
| 4 | STD4 1:125 | 0.008 | 0.04 |
| 5 | STD3 1:625 | 0.0016 | 0.008 |
| 6 | STD2 1:3125 | 0.00032 | 0.0016 |
| 7 | STD1 1:15625 | 0.000064 | 0.00032 |
Tabell 1: Utspädningsserier för standardkurvor: Tabell över utspädningsfaktorer som används för standardkurvorna för IgG-serotypen. presenteras som en 7-punkts, 1:5 seriell utspädningskurva som börjar vid 1 μg/ml för α-Spike S1 och α-Nukleokapsid och 5 μg/ml för α-membranantikroppar.
| Analyt | Prov | Rep 1 | Rep 2 | Rep 3 | Rep 4 | Ave | Sd | %CV |
| Spik S1 | STD2 | 369.4 | 356.9 | 295.2 | 271.5 | 323.3 | 47.4 | 14.6 |
| STD5 | 3869.1 | 3437 | 3970.2 | 4240.7 | 3879.3 | 334 | 8.6 | |
| Membran | STD2 | 40.6 | 37.7 | 49.9 | 27.8 | 39 | 9.1 | 23.3 |
| STD5 | 733.2 | 731.3 | 724 | 678.1 | 716.7 | 26 | 3.6 | |
| Nukleokapsid | STD2 | 1746.7 | 1790.8 | 1577.3 | 1664.8 | 1694.9 | 94.2 | 5.6 |
| STD5 | 15598.1 | 14735.5 | 18369.5 | 17408.5 | 16527.9 | 1657.7 | 10 |
Tabell 2: Precision inom analysen: Procentvarianskoefficient (% CV) beräknad från fyra replikat av standardantikroppsblandningar vid standard 2 (STD2) och standard 5 (STD5) med en enda analyssats i samma experiment. Värden som anges för replikat och medelvärden representerar de observerade MFI-värdena.
| Analyt | Prov | Sats 1 | Sats 2 | Parti 3 | Ave | Sd | %CV |
| Spik S1 | STD2 | 383.2 | 424.4 | 379.9 | 395.8 | 24.8 | 6.3 |
| STD5 | 5639.7 | 6062.5 | 6384.3 | 6028.8 | 373.4 | 6.2 | |
| Membran | STD2 | 39.1 | 58.5 | 59.1 | 52.2 | 11.4 | 21.8 |
| STD5 | 732.3 | 941.4 | 701.1 | 791.6 | 130.7 | 16.5 | |
| Nukleokapsid | STD2 | 1342.6 | 1621 | 1718.2 | 1560.6 | 195 | 12.5 |
| STD5 | 13543.9 | 14843.2 | 17883.4 | 15423.5 | 2227.2 | 14.4 |
Tabell 3: Precision mellan analyserna med standardprover: Procentvarianskoefficient (% CV) beräknad från tre distinkta satser av analyser, utvärderade vid standard 2 och standard 5 i samma experiment. Värden som anges för replikat och medelvärden representerar de observerade MFI-värdena.
| IgG-PE | IgM-SB | IgA-PE | |||||
| Ave MFI | %CV | Ave MFI | %CV | Ave MFI | %CV | ||
| Spik S1 | Ämne 1 | 8002.3 | 17.7 | 1949.5 | 1.3 | 2045.8 | 5.5 |
| Ämne 2 | 19155.8 | 7.3 | 918.6 | 4.1 | 1684.5 | 3.9 | |
| Ämne 3 | 17865.6 | 18.0 | 549.4 | 3.8 | 961.3 | 8.1 | |
| Ämne 4 | 11901.1 | 2.6 | 1603 | 4.8 | 8736.4 | 5.5 | |
| Ämne 5 | 9801.8 | 4.0 | 1014.1 | 3.0 | 2747.6 | 9.3 | |
| Nukleokapsid | Ämne 1 | 15097.8 | 11.3 | 1049.7 | 9.9 | 5276.5 | 3.9 |
| Ämne 2 | 15204.3 | 12.1 | 265.9 | 5.2 | 6761.3 | 11.9 | |
| Ämne 3 | 18471.7 | 24.4 | 329.1 | 4.5 | 14308 | 2.9 | |
| Ämne 4 | 16424.7 | 3.5 | 2418.1 | 0.1 | 4234.7 | 4.2 | |
| Ämne 5 | 13344.9 | 3.6 | 225.6 | 10.0 | 13436.5 | 9.7 | |
| Membran | Ämne 1 | 514.6 | 8.6 | 180.6 | 14.0 | 141.2 | 9.8 |
| Ämne 2 | 196.8 | 5.2 | 57 | 20.7 | 55.5 | 13.0 | |
| Ämne 3 | 553.7 | 12.9 | 54.5 | 21.2 | 191.2 | 18.6 | |
| Ämne 4 | 377.9 | 3.2 | 68.1 | 22.1 | 62 | 2.3 | |
| Ämne 5 | 325.4 | 8.2 | 11.4 | 91.6 | 74.6 | 20.8 |
Tabell 4: Precision mellan tester med humanprover: Genomsnittlig procentuell varianskoefficient (% CV) beräknad från tre satser av analyser testade med plasmaprover (utspädda 500 gånger) från fem försökspersoner med SARS-CoV-2-infektioner.
| Spik S1 | Membran | Nukleokapsid | |||||
| μg/ml | Ave MFI | % Max. | Ave MFI | % Max. | Ave MFI | % Max. | |
| Igm | 0.5 | 186 | 13.2 | 32 | 25.2 | 132.7 | 13.6 |
| 1 | 304.2 | 21.6 | 45.8 | 36 | 194.4 | 19.9 | |
| 2 | 664.5 | 47.2 | 78.8 | 61.9 | 458.2 | 47 | |
| 4 | 1032.1 | 73.3 | 101.3 | 79.6 | 707.8 | 72.6 | |
| 8 | 1407.1 | 100 | 127.2 | 100 | 975 | 100 | |
| IgG | 0.5 | 809.7 | 4.9 | 27.5 | 15 | 1355.6 | 6.3 |
| 1 | 1696.9 | 10.2 | 40.6 | 22.2 | 2782.1 | 13 | |
| 2 | 4543.8 | 27.3 | 68.3 | 37.3 | 6661.2 | 31.2 | |
| 4 | 10003.5 | 60 | 110.7 | 60.5 | 12605.6 | 59 | |
| 8 | 16662.8 | 100 | 182.9 | 100 | 21360.6 | 100 | |
| IgA | 0.5 | 797.4 | 19.3 | 31.1 | 47.2 | 2056.5 | 16.1 |
| 1 | 1529.5 | 37 | 41.4 | 62.8 | 3869 | 30.4 | |
| 2 | 2261.3 | 54.7 | 48.6 | 73.3 | 6648.9 | 52.2 | |
| 4 | 2320.4 | 56.2 | 48.3 | 73.2 | 6548.1 | 51.4 | |
| 8 | 4132.2 | 100 | 65.9 | 100 | 12744.8 | 100 | |
Tabell 5: Optimering av sekundär antikroppskoncentration: Den genomsnittliga MFI-signalen som produceras från olika koncentrationer av sekundära antikroppar från 0,5 μg / ml till 8 μg / ml. Värdet för varje signal presenteras också som en procentandel av signalen vid 8 μg / ml ("Max.") för att visa relativ signalstorlek.
| Spik S1 | Membran | Nukleokapsid | |||||
| Inkubationstid (min.) | Ave MFI | % Max. | Ave MFI | % Max. | Ave MFI | % Max. | |
| Igm | 15 | 1185 | 72.2 | 40.4 | 48.9 | 609.5 | 53.3 |
| 30 | 1416.6 | 86.3 | 58.4 | 70.7 | 894.2 | 78.2 | |
| 60 | 1324.8 | 80.7 | 73.6 | 89.1 | 945.6 | 82.7 | |
| 120 | 1641.2 | 100 | 82.6 | 100 | 1143.2 | 100 | |
| IgG | 15 | 12917.6 | 80.5 | 244.4 | 44.9 | 15429.8 | 80.8 |
| 30 | 14915.4 | 92.9 | 434.7 | 79.9 | 18797 | 98.5 | |
| 60 | 15340.3 | 95.6 | 421.4 | 77.5 | 18694.4 | 97.9 | |
| 120 | 16050.3 | 100 | 544 | 100 | 19085.8 | 100 | |
| IgA | 15 | 3141.9 | 78.2 | 75 | 66.8 | 9103 | 86.6 |
| 30 | 3569.1 | 88.8 | 83.9 | 74.8 | 9563.8 | 91 | |
| 60 | 3539.1 | 88 | 86 | 76.6 | 9555.7 | 90.9 | |
| 120 | 4020 | 100 | 112.2 | 100 | 10512.9 | 100 |
Tabell 6: Optimering av sekundär antikroppsinuationstid: Den genomsnittliga MFI-signalen som produceras från olika inkubationstider för sekundära antikroppar som sträcker sig från 15 min till 120 min. Värdet för varje signal representeras också som en procentandel av signalen vid 120 min ("Max.") för att visa relativ signalstorlek.
Discussion
Uppskattningen av ett immunsvar mot SARS-CoV-2-exponering, i kombination med RT-PCR-baserad övervakning av infektionsstatus, har beskrivits väl som ett recept för att klargöra förloppet för återhämtning från Covid-19, för att fungera som ett sätt att identifiera konvalescentplasma med potentiellt terapeutiskt värde och för att kartlägga infektionshastigheter på befolkningsskala10,11. Olika exempel för att förstå serokonversion hos försökspersoner inkluderar protein (antigen) arrays12, immunoblots13, snabba immunokromatografiska konstruktioner14 och enzymbundna immunosorbentanalyser (ELISA)15,16,17. Var och en av dessa ovannämnda tekniker kan bedöma flera immunoglobulinisotyper individuellt med mindre modifieringar. Dessa förfaranden kan emellertid inte praktiskt återanvändas för att möjliggöra parallell analys av flera isotyper, som presenteras i detta manuskript, vilket gör kostnads- och genomströmningsfaktorer som begränsningar för deras administration på en populationsbaserad skala teststrategi. Flera av dessa applikationer ger också möjlighet att sammanfoga nivåer av flera antigener parallellt antingen som presenterade eller i förändrade format, såsom en multiplex ELISA18,19. Slutligen ger immunbeadplattformen möjlighet att utvärdera nivåer av flera antigener parallellt20,21 men har begränsats till en enda epitop (dvs. immunoglobulinisotyp) per analys, såvida inte det senaste instrumentet med "dubbelkanals" analysförmåga används.
I denna rapport räknas protokoll upp som fastställer tillförlitlig mätning av flera epitoper i en immunbeadanalys med hjälp av instrumentet i "dubbelkanalläge" i en fallstudie av serokonversion av Covid-19-vaccinerade individer. Metoden visade utmärkt precision (% CV-värden vanligtvis <20%) med hjälp av manuella analysdesigner som kan förbättras med integrationen av laboratorieautomatiserade system. Analyskänslighet och dynamiskt omfång för alla utvalda analyter och epitoper var lämpliga för rutinutvärderingar. Även om avsaknaden av kommersiellt tillgängliga antiantigen-IgA- och IgM-immunreagenter begränsade kvantifieringen till IgG-isotypen, utesluter en sådan begränsning inte möjligheten att erbjuda semikvantitativa bedömningar eller bedömningar i förhållande till ett specifikt prov som en kalibrant22,23.
Den validerade immunobead-analysen tilldelades för att undersöka serokonversion i en kohort av individer som immuniserats med Covid-19-vaccinet. I motsats till andra liknande plattformar möjliggör instrumentfamiljen prospektering av serokonversion hos hundratals individer per dag i ett manuellt arbetsflöde och tusentals per dag i ett automatiserat schema. Sammantaget bekräftar dessa resultat att "tvåkanalsmetoden" har lämplig känslighet för beskrivningen av flera epitoper parallellt för samma analys och är livskraftig i ett multianalytsammanhang. En skillnad i känslighet för kanal 1 och kanal 2, som utförs med phycoerythrin respektive Super Bright 436 fluoroforer, kan motivera utformningen av ett specifikt experiment för att säkerställa att livskraftiga analysresultat förvärvas för ett givet experiment. Det vill säga reservationen av kanal 1 för epitoper eller analyter med lägre prevalens kan vara nödvändig för att upprätthålla ett dynamiskt omfång av analysen som inkluderar de observerade värdena för okända. Utöver detta övervägande var analysdesign uppenbar och bör vara lättillgänglig för laboratorier med begränsad analytisk kapacitet. Visst bör detta övervägande vägas när man överväger kanal 1 till kanal 2-störningar, som vi noterade för figur 5, varigenom störningar från isotyper med högre överflöd kan orsaka vilseledande analysfel för dem i mycket lägre överflöd när de mäts i ett dubbelkanalformat. Denna potential för interferens i situationer med mycket olika analytkoncentrationer kan utgöra en betydande begränsning av tillvägagångssättet om det inte hanteras korrekt i analysdesignfasen.
Sammanfattningsvis presenterades en metod för att snabbt mäta antikroppstitrar från de stora immunoglobulinisotyperna associerade med ett immunsvar mot Covid-19-infektion eller vaccination. Att tillämpa detta tillvägagångssätt på ett longitudinellt sätt för att bedöma serokonversion kan ge insikter som bättre kan användas för att hantera och / eller övervaka sjukdomsförloppet eller, alternativt, vägleda potentiella Covid-19-boostervaccinprogram.
Disclosures
Dr Borgia är uppfinnaren av det serologiska testet som används i detta manuskript som är patentsökt. Artikeln presenteras på ett beskrivande sätt endast utan några statistiska analyser presenterade för att undvika potentiell partiskhet som introduceras av författarkonflikt.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Rush Biomarker Development Core för användningen av deras anläggningar, Rush Biorepository för ämnesregistrering och biospecimenbehandling, och Walder Foundations Chicago Coronavirus Assessment Network (Chicago CAN) Initiative bidragsnummer SCI16 (JRS och J.A.B.) och 21-00147 (JRS och J.A.B.) och en utmärkelse från Swim Across America Foundation (J.A.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well black side polystyrene microtiter plates | Thermo Fisher | 12-565-346 | |
| Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Prepared in house | ||
| Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Bovine Serum Albumin, heat shock fraction | MilliporeSigma | A-7888-50G | |
| Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0) | Prepared in house | ||
| COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag) | MyBioSource | MBS8574735 | |
| Disposable pipette tips | |||
| EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher | PIA35391 | |
| Goat Albumin, Fraction V Powder | MilliporeSigma | A2514-1G | |
| IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB205009 | |
| IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB204009 | |
| IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB403009 | |
| IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB202009 | |
| IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4 | Thermo Fisher | 62999842 | |
| Instrument Analyzer | Luminex Corp. | INTELLIFLEX-RUO | |
| Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Thermo Fisher | 13-698-794 | |
| MagPlex-C Microspheres, Region XXX | Luminex Corp. | MC10XXX-01 | |
| MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate) | MilliporeSigma | M2933 | |
| Microplate aluminum sealing tape | Thermo Fisher | 07-200-683 | |
| Polysorbate-20 | Thermo Fisher | BP337-500 | |
| Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2 | Thermo Fisher | 50-751-7328 | |
| Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag) | Sino Biologicals | 40588-V08B | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag) | Sino Biologicals | 40591-V08H | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb | Sino Biologicals | 40592-T62 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb | Sino Biologicals | 40588-R0004 | |
| SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb | ProSci | 10-516 | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher | PIA39269 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Water, LC/MS grade | Thermo Fisher | W-64 |
References
- Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: potentials and pitfalls. Proteomics - Clinical Applications. 9, 406-422 (2015).
- Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4084 (2012).
- Powell, R. L., et al. A multiplex microsphere-based immunoassay increases the sensitivity of siv-specific antibody detection in serum samples and mucosal specimens collected from rhesus macaques infected with SIVmac239. BioResearch Open Access. 2 (3), 171-178 (2013).
- Volpetti, F., Garcia-Cordero, J., Maerkl, S. J. A microfluidic platform for high-throughput multiplexed protein quantitation. PLoS One. 10 (2), 0117744 (2015).
- Rabi, F. A., Al Zoubi, M. S., Kasasbeh, G. A., Salameh, D. M., Al-Nasser, A. D. SARS-CoV-2 and coronavirus disease 2019: What we know so far. Pathogens. 9 (3), 231 (2020).
- Asif, M., Xu, Y., Xiao, F., Sun, Y. Diagnosis of COVID-19, vitality of emerging technologies and preventive measures. Chemical Engineering Journal. 423, Lausanne, Switzerland. 130189 (2021).
- La Marca, A., Capuzzo, M., Paglia, T., Roli, L., Trenti, T., Nelson, S. M. Testing for SARS-CoV-2 (COVID-19): a systematic review and clinical guide to molecular and serological in-vitro diagnostic assays. Reproductive Biomedicine Online. 41 (3), 483-499 (2020).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. The Clinical Biochemist. Reviews. 29, Suppl 1 49-52 (2008).
- Tarhoni, I., et al. Relationship between circulating tumor-associated autoantibodies and clinical outcomes in advanced-stage NSCLC patients receiving PD-1/-L1 directed immune checkpoint inhibition. Journal of Immunological Methods. 490, 112956 (2021).
- Deeks, J. J., et al. Antibody tests for identification of current and past infection with SARS-CoV-2. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 6, 013652 (2020).
- Mahalingam, S., et al. Landscape of humoral immune responses against SARS-CoV-2 in patients with COVID-19 disease and the value of antibody testing. Heliyon. 7 (4), 06836 (2021).
- Ruano-Gallego, D., et al. A multiplex antigen microarray for simultaneous IgG and IgM detection against SARS-CoV-2 reveals higher seroprevalence than reported. Microbial Biotechnology. 14 (3), 1228-1236 (2021).
- Shah, J., et al. IgG and IgM antibody formation to spike and nucleocapsid proteins in COVID-19 characterized by multiplex immunoblot assays. BMC Infectious Diseases. 21 (1), 325 (2021).
- Gambino, C. M., et al. Comparison of a rapid immunochromatographic test with a chemiluminescence immunoassay for detection of anti-SARS-CoV-2 IgM and IgG. Biochemia Medica (Zagreb). 30 (3), 030901 (2020).
- Algaissi, A., et al. SARS-CoV-2 S1 and N-based serological assays reveal rapid seroconversion and induction of specific antibody response in COVID-19 patients. Scientific Reports. 10, 16561 (2020).
- Chiereghin, A., et al. Recent advances in the evaluation of serological assays for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection and COVID-19. Frontiers in Public Health. 8, 620222 (2020).
- Nicol, T., et al. Assessment of SARS-CoV-2 serological tests for the diagnosis of COVID-19 through the evaluation of three immunoassays: Two automated immunoassays (Euroimmun and Abbott) and one rapid lateral flow immunoassay (NG Biotech). Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104511 (2020).
- Butt, J., et al. From multiplex serology to serolomics-A novel approach to the antibody response against the SARS-CoV-2 proteome. Viruses. 13 (5), 749 (2021).
- Byrum, J. R., et al. multiSero: open multiplex-ELISA platform for analyzing antibody responses to SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
- Dobano, C., et al. Highly sensitive and specific multiplex antibody assays to quantify immunoglobulins m, a, and g against SARS-CoV-2 antigens. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 01731 (2021).
- Schultz, J. S., et al. Development and validation of a multiplex microsphere immunoassay using dried blood spots for SARS-CoV-2 seroprevalence: Application in first responders in first responders in Colorado, USA. Journal of Clinical Microbiology. 59 (6), 00290 (2021).
- Beavis, K. G., et al. Evaluation of the EUROIMMUN anti-SARS-CoV-2 ELISA assay for detection of IgA and IgG antibodies. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan Americal Society for Clinical Virology. 129, 104468 (2020).
- Jung, J., et al. Clinical performance of a semi-quantitative assay for SARS-CoV2 IgG and SARS-CoV2 IgM antibodies. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 510, 790-795 (2020).
