Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Метод количественного фракционирования микротрубочек для разделения стабильных микротрубочек, лабильных микротрубочек и свободного тубулина в тканях мышей

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/63358
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Department of Neuropathology, Faculty of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 2Center for Research in Neurodegenerative Diseases, Doshisha University, 3Laboratory of Physiology and Anatomy, School of Pharmacy, Nihon University

Summary

Микротрубочки, которые являются полимерами тубулина, играют решающую роль в качестве компонента цитоскелета в эукариотических клетках и известны своей динамической нестабильностью. В этом исследовании был разработан метод фракционирования микротрубочек для разделения их на стабильные микротрубочки, лабильные микротрубочки и свободный тубулин для оценки стабильности микротрубочек в различных тканях мышей.

Abstract

Микротрубочки, состоящие из димеров α/β-тубулина, являются важнейшим компонентом цитоскелета в эукариотических клетках. Эти трубчатые полимеры демонстрируют динамическую нестабильность, поскольку субъединицы гетеродимера тубулина подвергаются повторяющейся полимеризации и деполимеризации. Точный контроль стабильности и динамики микротрубочек, достигаемый с помощью посттрансляционных модификаций тубулина и белков, ассоциированных с микротрубочками, имеет важное значение для различных клеточных функций. Дисфункции микротрубочек тесно связаны с патогенезом, в том числе с нейродегенеративными расстройствами. Текущие исследования сосредоточены на терапевтических агентах, нацеленных на микротрубочки, которые модулируют стабильность, предлагая потенциальные варианты лечения этих заболеваний и рака. Следовательно, понимание динамического состояния микротрубочек имеет решающее значение для оценки прогрессирования заболевания и терапевтических эффектов.

Традиционно динамику микротрубочек оценивали in vitro или в культивируемых клетках с помощью грубого фракционирования или иммуноанализа с использованием антител, нацеленных на посттрансляционные модификации тубулина. Однако точный анализ статуса тубулина в тканях с помощью таких процедур представляет собой проблему. В этом исследовании мы разработали простой и инновационный метод фракционирования микротрубочек для разделения стабильных микротрубочек, лабильных микротрубочек и свободного тубулина в тканях мышей.

Процедура включала гомогенизацию рассеченных тканей мышей в буфере, стабилизирующем микротрубочки, в объемном соотношении 19:1. Затем гомогенаты были фракционированы с помощью двухступенчатого процесса ультрацентрифугирования после первоначального медленного центрифугирования (2400 × г) для удаления мусора. Первая стадия ультрацентрифугирования (100 000 × г) осаждала стабильные микротрубочки, в то время как полученная надосадочная жидкость подвергалась второй стадии ультрацентрифугирования (500 000 × г) для фракционирования лабильных микротрубочек и растворимых димеров тубулина. Этот метод определял пропорции тубулина, составляющего стабильные или лабильные микротрубочки в мозге мыши. Кроме того, наблюдались различные тканевые вариации стабильности микротрубочек, которые коррелировали с пролиферативной способностью составляющих клеток. Эти результаты подчеркивают значительный потенциал этого нового метода для анализа стабильности микротрубочек при физиологических и патологических состояниях.

Introduction

Микротрубочки (МТ) представляют собой удлиненные трубчатые структуры, состоящие из протофиламентов, состоящих из α/β-тубулиновых гетеродимерных субъединиц. Они играют важную роль в различных клеточных процессах, таких как деление клеток, подвижность, поддержание формы и внутриклеточный транспорт, что делает их неотъемлемыми компонентами эукариотического цитоскелета. Минус-конец МТ, где экспонируется субъединица α-тубулина, относительно стабилен, тогда как плюс-конец, где экспонируется субъединица β-тубулина, подвергается динамической деполимеризации и полимеризации2. Этот непрерывный цикл присоединения и диссоциации димера тубулина на плюс-конце, называемый динамической нестабильностью, приводит к повторяющемуся процессу спасения икатастрофы. МТ демонстрируют фокальные домены с локализованными вариациями динамической неустойчивости, включая стабильные и лабильные домены4.

Точный контроль динамической нестабильности МТ имеет решающее значение для многих клеточных функций, особенно в нейронах, характеризующихся сложной морфологией. Адаптивность и долговечность МТ играют жизненно важную роль в развитии и правильном функционировании нервных клеток 5,6,7. Было обнаружено, что динамическая нестабильность МТ связана с различными посттрансляционными модификациями (ПТМ) тубулина, такими как ацетилирование, фосфорилирование, пальмитоилирование, детирозинирование, дельта2, окисление полиглутамина и полиглицилирование. Кроме того, связывание белков, ассоциированных с микротрубочками (MAP), служит регуляторным механизмом8. ПТМ, исключая ацетилирование, преимущественно встречаются в карбоксиконцевой области тубулина, расположенной на наружной поверхности МТ. Эти модификации создают разнообразные поверхностные условия на МТ, влияя на их взаимодействие с MAP и, в конечном счете, определяя устойчивость МТ9. Наличие карбокси-концевого остатка тирозина в α-тубулине свидетельствует о динамических МТ, которые быстро замещаются пулом свободного тубулина. И наоборот, детирозинация карбокси-конца и ацетилирование Lys40 означают стабильные МТ с пониженной динамической нестабильностью 9,10.

ПТМ тубулина широко использовались в экспериментах по оценке динамики и стабильности МТ 5,7,11,12,13,14,15. Например, в исследованиях клеточных культур тубулины могут быть разделены на два пула: пул свободного тубулина и пул МТ. Это достигается высвобождением свободного тубулина через пермеабилизацию клеток перед фиксацией оставшихся МТ 15,16,17,18,19. Биохимические методы включают использование химических стабилизаторов МТ, которые защищают МТ от катастрофы, позволяя отделять МТ и свободный тубулин путем центрифугирования20,21,22. Тем не менее, эти процедуры не различают стабильные и менее стабильные (лабильные) МТ, что делает невозможным количественное определение МТ или растворимого тубулина в тканях, таких как головной мозг. Следовательно, оценка стабильности МТ у организмов в физиологических и патологических условиях оказалась сложной задачей. Чтобы устранить это экспериментальное ограничение, мы разработали новый метод точного разделения МТ и свободного тубулина в тканях мыши23.

Этот уникальный метод фракционирования МТ включает в себя гомогенизацию тканей в условиях, поддерживающих статус тубулина в тканях, и двухступенчатое центрифугирование для разделения стабильных МТ, лабильных МТ и свободного тубулина. Эта простая процедура может быть применена к широким исследованиям, включая фундаментальные исследования МТ и МАП у живых организмов, физиологический и патологический анализ здоровья и заболеваний, связанных со стабильностью МТ, а также разработку лекарств и других терапевтических средств, нацеленных на МТ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Метод фракционирования МТ

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты, проведенные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по этике животных Университета Досися. Здесь использовали мышей C57BL/6J обоего пола в возрасте 3-4 месяцев. В этом протоколе препарированные ткани, например, мозг, печень или тимус, были немедленно гомогенизированы в ледяном буфере для стабилизации микротрубочек (MSB), который содержал таксол (стабилизатор MT) в концентрации, предотвращающей не только деполимеризацию, но и реполимеризацию MT. Гомогенат разделяли на три фракции с помощью двухступенчатого процесса ультрацентрифугирования (рис. 1). Все этапы этого протокола были выполнены без перерыва в среде с низкой температурой, а ткани и фракции не замораживались до тех пор, пока они не были растворены в буфере образца додецилсульфата натрия (SDS).

  1. Подготовка МСБ и микропробирок
    1. Для приготовления МСБ смешивают следующие реагенты: 0,1 М 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота (МЭС), рН 6,8 (нейтрализованный КОН), 10% глицерин, 0,1 мМ ДТТ, 1 мМMgSO4, 1 мМ EGTA, 0,5% Тритон Х-100, ингибиторы фосфатазы (1 мМ NaF, 1 мМ β-глицерофосфат, 1 мМ Na3VO4, 0,5 мкМ окадаиновой кислоты), 1x коктейль ингибиторов протеазы, и ингибиторы протеазы (0,1 мМ PMSF, 0,1 мМ DIFP, 1 мкг/мл пепстатина, 1 мкг/мл антиболи, 10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл лейпептина, 50 мкг/мл TLCK) (см. таблицу материалов) и обозначают как MSB(-).
    2. Непосредственно перед вскрытием тканей добавьте 10 мкМ таксола и 2 мМ ГТФ (см. таблицу материалов) в MSB(-). Этот буфер обозначается как MSB(+). Приготовьте буфер в день использования и держите его на льду.
    3. Подготовьте микропробирки для отбора проб. Пустая микропробирка объемом 2,0 мл для хранения гомогената; пустая микропробирка объемом 1,5 мл для хранения лизата надосадочной жидкости 1 (S1), образца преципитата2 (P2) и образца преципитата3 (P3); микропробирка объемом 1,5 мл с 1 мл ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS) для хранения рассеченных тканей; Микропробирка объемом 1,5 мл с 200 мкл 2x буфера для образцов SDS (0,16 M Tris pH 6,8; 20% глицерина; 2% 2-меркаптоэтанола; 4% SDS) для хранения образца S1 и надосадочной жидкости3 (S3); и центрифугирующие микропробирки для роторов центрифуг TLA55 и TLA120.2 (см. таблицу материалов). Промаркируйте все трубочки и положите их на лед.
  2. Гомогенизация тканей мыши
    1. Подготовьте охлажденный стол для вскрытия тканей. Сначала наполните коробку колотым льдом и поместите на лед две чашки Петри, одну внутренней стороной вверх, а другую внешней. Залейте ледяной ПБС в одну посуду для временного мытья и хранения рассеченных тканей. Разложите фильтровальную бумагу, смоченную ПБС, на другую перевернутую посуду.
    2. Чтобы принести в жертву мышь, выполните вывих шейки матки под глубоким наркозом со смешанным анестетиком из буторфанола, мидазолама и медетомидина. Затем немедленно препарируйте ткани, например, мозг, печень или тимус, и промойте их ледяным PBS в чашке Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этим методом можно анализировать любой тип мягких тканей. Однако размер ткани ограничен рекомендуемым диапазоном объема используемого гомогенизатора. Например, если используется гомогенизатор объемом 2 мл, рекомендуется 50-100 мг ткани.
    3. После взвешивания микропробирок объемом 1,5 мл, заполненных PBS для хранения препарированных тканей, вырежьте и храните ткани внутри микропробирок и повторно взвесьте каждую микропробирку. Влажный вес каждой ткани можно рассчитать, вычитая вес пробирки до и после добавления ткани.
    4. Немедленно гомогенизируйте ткань в ледяном MSB(+) с охлажденным гомогенизатором (см. Таблицу материалов). Объем MSB(+) в 19 раз (мкл) превышал влажную массу ткани (мг). Выполняйте гомогенизацию 20 движениями до тех пор, пока кусочки ткани не исчезнут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, 1 900 мкл MSB(+) используется для 100 мг ткани. Поскольку объем добавляемого MSB(+) должен быть скорректирован для каждого влажного веса анализируемых кусочков ткани, необходимо точно взвесить каждый кусочек ткани.
  3. Центрифугирование гомогенатов тканей мыши
    1. Переместите весь гомогенат в микропробирку объемом 2 мл с помощью пипетки Пастера и центрифуги при 2 400 × г в течение 3 мин при 2 °C, чтобы удалить мусор путем осаждения.
    2. Переложите всю надосадочную жидкость (фракцию S1) в новую микропробирку объемом 1,5 мл и вбейте в нее. Затем ферментируют 200 мкл фракции S1 в центрифугируемую микропробирку и центрифугируют при 100 000 × г с помощью ротора TLA-55 в течение 20 мин при 2 °C для получения относительно крупных молекулярных белков в виде осадка (фракция Р2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем образца, подвергнутого стадиям ультрацентрифугирования, влияет на радиус центрифугирования и эффективность осаждения молекул. После этого этапа объем образца должен быть не более 200 мкл, чтобы предотвратить неточное фракционирование.
    3. Далее центрифугируют всю результирующую надосадочную жидкость (фракция S2) при 500 000 × г с помощью ротора TLA-120.2 в течение 60 мин при 2 °C, чтобы отделить нерастворимые белковые комплексы в осадке (фракция P3) от растворимых белков в надосадочной жидкости (фракция S3).
    4. Добавьте 400 мкл 1x буфера для образцов SDS (0,08 M Tris pH 6,8; 10% глицерина; 1% 2-меркаптоэтанола; 2% SDS) в пробирки с фракциями P2 и P3 и кратковременно обработайте ультразвуком для растворения осадка. Переложите эти образцы фракций в пустую микропробирку объемом 1,5 мл.
    5. Растворите общую фракцию S3 в 200 мкл 2x буфера для образцов SDS.
    6. Смешайте оставшиеся фракции S1 с равным объемом 2-кратного буфера для образцов SDS для использования в качестве стандартной кривой для вестерн-блоттинга.
    7. Все эти образцы кипятят при 100 °C в течение 3 мин. После охлаждения образцов до комнатной температуры хранят при температуре -20 °C.
  4. Количественное определение белков в каждой фракции
    1. Количественное определение белков во фракциях P2, P3 и S3 методом вестерн-блоттинга. Во-первых, используйте 10%-ный электрофорез с полиакриламидным гелем (SDS-PAGE) для отделения белков от правильно разбавленных фракций P2, P3 и S3, а также последовательно разбавленного образца S1 от любого индивидуума в виде стандартной кривой. Затем электроблот образцов наносят на мембраны из поливинилиденфторида (см. таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент разведения каждой фракции зависит от концентрации объективного белка и реакционной способности антитела. (например, α-тубулин, TUBB3, β-тубулин и тирозинированный тубулин в ткани мозга: S3 = 1/400, P3 = 1/2000, P2 = 1/2000, S1 = 1/50,000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000; ацетилированный тубулин в мозговой ткани: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8 000, S1 = 1/100 000, 1/40 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/4 000; α-тубулин в печени: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000; α-тубулин в тимусе: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000 разбавление тканевой концентрации).
    2. Заблокируйте мембрану 5%-ным обезжиренным молоком в Tris-буферном физиологическом растворе (50 мМ Tris-HCl pH 7,6; 152 мМ NaCl) с 0,1% Tween 20 (TBS-T) в течение более 30 минут.
    3. Погрузите мембрану в TBS-T, содержащее первичные антитела (см. таблицу материалов), более чем на 2 ч. После этого промыть мембрану TBS-T в течение 3 мин (3 раза).
    4. Мечите первичные антитела с помощью HRP-конъюгированных вторичных антител (см. таблицу материалов) в TBS-T в течение более 1 ч. После этого промыть мембрану TBS-T в течение 3 мин (3 раза).
    5. Разработайте мембраны с помощью реагента Enhanced Chemiluminescence. Затем проанализируйте интересующие полосы с помощью люминесцентного анализатора изображений (см. таблицу материалов).
    6. Количественно оцените интенсивность белковых зон с помощью программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов) и создайте стандартную кривую, построив графики единиц разбавления разбавленных образцов S1, используемых для стандартной кривой вдоль оси X, и интенсивностей полос вдоль оси Y.
    7. Считывают концентрацию белка (единицу измерения), соответствующую разбавленной фракции образцов. Умножьте считанную концентрацию на коэффициент разбавления образца, чтобы получить единицу белка в каждой фракции. Разделите измеренную единицу каждой фракции на общую единицу белка (P2 + P3 + S3), чтобы получить процентное соотношение.

2. Оценка свойств тубулина в каждой фракции

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот биохимический метод позволяет выделить три группы тубулиновых комплексов, определяемых седиментационными свойствами. При этом определялся статус тубулиновых комплексов, полученных в этих фракциях, исходя из размеров комплекса и тубулин-ПТМ. Выполняйте все шаги этого протокола без перерыва в среде с низкой температурой, но не замораживайте образцы фракций до тех пор, пока они не растворятся в буфере образцов SDS.

  1. Анализ фильтрующих ловушек
    1. Отфильтруйте фракции S2 и S3 (по 500 мкл каждая) с помощью ультрафильтрационной спиновой колонки с давлением 300 кДа (см. таблицу материалов). Проводят центрифугирование 14 000 × г при 2 °C до тех пор, пока весь надосадочный раствор не будет отфильтрован, элюированные белки не будут собраны в приемные трубки, а захваченные белки останутся на фильтре резервуарных пробирок.
    2. Переведите целые фильтраты (примерно 500 мкл) в пробирках-приемниках в новые микропробирки объемом 1,5 мл и растворите их в 500 мкл 2-кратного буфера для образцов SDS.
    3. Солюбилизируйте остатки на фильтре резервуарных пробирок в 1 000 мкл буфера для 1x SDS-образца путем пипетирования и переноса образцов в новую микропробирку объемом 1,5 мл.
    4. Прокипятите образцы при 100 °C в течение 3 мин. После охлаждения образцов до комнатной температуры хранят при температуре -20 °C.
    5. Анализируют количество тубулина методом вестерн-блоттинга с DM1A (антитела к α-тубулину, см. таблицу материалов).
  2. Размерно-исключающая хроматография
    1. Приготовьте буфер-носитель (0,1 М MES, pH 6,8; 10% глицерина; 1 мМMgSO4; 1 мМ EGTA; 0,1 мМ DTT) с добавлением 1/10 концентрации ингибиторов протеазы и фосфатазы, как описано на этапе 1.1.1. Затем отфильтруйте раствор и храните его в холодном помещении.
    2. Подготовьте колонку гель-фильтрационной хроматографии, оснащенную препаративной системой жидкостной хроматографии, в хроматографической камере (см. таблицу материалов) при температуре 4 °C.
    3. Перед впрыском образцов в колонку пролейте 180 мл буфера-носителя для промывки колонки. Расход составляет 1 мл/мин в течение 3 ч.
    4. В качестве контроля вводят коммерчески доступный очищенный свиной тубулин (см. таблицу материалов) или фракцию S3 из мозга мыши (по 500 мкл каждый) в колонку.
    5. Элюируют при скорости потока 1,0 мл/мин с буфером-носителем. Собирайте фракции по 1,5 мл в течение 120 минут. Контролируйте элюированные белки по абсорбции при длине волны 280 нм. Поддерживайте максимальное давление ниже 0,3 МПа.
    6. После вихревания собранных фракций смешайте 50 мкл из них с 50 мкл 2-кратного буфера для образцов SDS в микропробирке объемом 1,5 мл. Кипятят все образцы при 100 °C в течение 3 мин. После охлаждения образцов до комнатной температуры хранят при температуре -20 °C.
    7. Анализируют количество тубулина методом вестерн-блоттинга с DM1A, антителами к α-тубулину и KMX-1, антителами к β-тубулину (см. таблицу материалов).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Количественное определение тубулина во фракциях P2, P3 и S3 из головного мозга мышей методом МТ-фракционирования
Тубулин в тканях мышей разделяли на фракции Р2, Р3 и S3 методом МТ-фракционирования и количественно определяли методом вестерн-блоттинга (рис. 1А). Осадок МТ, остававшийся во фракции Р2 при ультрацентрифугировании при 100 000 × г в течение 20 мин, составлял 34,86% ± 1,68% от общего количества тубулина в мозге мыши. Надосадочную жидкость (S2) дополнительно центрифугировали при 500 000 × г в течение 60 мин. Были получены осадок (фракция Р3) и надосадочная жидкость (фракция S3), на долю которых приходилось 56,13% ± 2,12% или 9,01% ± 0,68% от общего тубулина в мозге мышей соответственно (рис. 1Б).

Кора головного мозга, используемая в этом исследовании, содержит нейронные и ненейрональные клетки, такие как глия. Для селективной оценки стабильности МТ в нейронах мозга мышей мы количественно определили TUBB3, подтип тубулина, экспрессируемый исключительно в нейронах центральной и периферической нервной системы, методом вестерн-блоттинга с Tuj1 (антитела к TUBB3). Процентное содержание TUBB3 во фракциях P2, P3 или S3 составило 32,65% ± 2,20%, 59,31% ± 2,61% или 8,04% ± 0,74% соответственно. Они существенно не отличались от таковых у α-тубулина (рис. 1Б). Эти результаты свидетельствуют о том, что нейроны и глиальные клетки демонстрируют одинаковую стабильность МТ или что нейроны содержат гораздо большее количество тубулина, чем глиальные клетки in vivo.

Характеристика тубулина, извлеченного в каждой фракции
Здесь гомогенат ткани мыши был разделен на три фракции методом двухступенчатого ультрацентрифугирования с различными ускорениями свободного падения; Поэтому коэффициенты седиментации среди белков или их комплексов в каждой фракции отличались. Несмотря на то, что тубулин, осажденный при ультрацентрифугировании 100 000 × г , считался обычным методом МТ, следует выяснить, чем вновь полученный тубулин фракции Р3 отличается от тубулина фракций Р2 и S3.

Для характеристики тубулина S3 фракцию S2 (P3 + S3) или S3 подвергали ультрафильтрации и эксклюзионной хроматографии по размерам. Тубулиновые комплексы во фракции S3 могли полностью проходить через ультрафильтрационную спиновую колонку с молекулярной массой 300 кДа, в то время как почти весь тубулин во фракции S2 задерживался на фильтре (рис. 2А). Кроме того, молекулярную массу комплексов тубулина во фракции S3 измеряли методом эксклюзионной хроматографии. S3-тубулин элюируется на одном пике, соответствующем 100 кДа, что аналогично коммерчески доступным очищенным димерам тубулина (рис. 2B, C). Кроме того, доли α- и β-тубулина, извлеченные в каждой фракции методом МТ-фракционирования, были равны (рис. 2D). На самом деле, было показано, что α- и β-тубулин могут незначительно существовать в виде мономеров в живых клетках24. Однако, судя по расчетному значению kD (порядок нМ) и концентрации тубулина, восстановленного во фракции S3 (~11 мкМ), считается, что большая часть (> 98%) тубулина существует в виде α/β-димеров. Поэтому тубулин во фракции S3 является в первую очередь растворимым димером α/β-тубулина.

Полимеры тубулина были разделены на две фракции, Р2 и Р3, на основе их посттрансляционных модификаций (ПТМ). Для дифференциации этих фракций проводили вестерн-блоттинг с использованием специфических антител. Антиацетилированное антитело к α-тубулину, которое служит маркером стабильных МТ, продемонстрировало, что фракция Р2 была значительно обогащена 97,40% ± 0,52% ацетилированного α-тубулина (рис. 2E), в то время как общий α-тубулин был восстановлен во фракциях P3 и S3 (рис. 1B). И наоборот, антитирозинированное антитело α-тубулина, указывающее на лабильные МТ, показало, что 75,43% ± 2,69% тирозинированного α-тубулина присутствовали во фракции Р3 (рис. 2F). Эти данные подтверждают, что фракция Р2 в основном содержит тубулин в стабильных МТ, тогда как фракция Р3 состоит из тубулина в лабильных МТ.

Оценка стабильности МТ при замораживании и обработке нокодазолом
Было проанализировано влияние замораживания и обработки нокодазолом на стабильность внутримозговых МТ мышей, чтобы определить, можно ли выделить преходящие изменения стабильности МТ методом фракционирования МТ. МТ обычно разбираются при низких температурах, но некоторые МТ остаются стабильными на морозе. После взвешивания мозгов их замораживали в жидком азоте и помещали при температуре -80 °C на 30 минут. Переходный замороженный мозг и сырой мозг в качестве контроля были гомогенизированы и фракционированы на фракции P2, P3 и S3. Затем долю тубулина, содержащегося в трех фракциях, количественно определяли методом вестерн-блоттинга. После того, как мозг был заморожен перед гомогенизацией, α-тубулин во фракции Р2 уменьшился, а во фракции Р3 увеличился по сравнению с таковым во сыром мозге (рис. 3А). Блоттинг с 6-11B1 (ацетилированный α-тубулин) или 1A2 (тирозинированный α-тубулин) также показал, что замораживание мозга снижает уровень ацетилирования (рис. 3B) и повышает уровень тирозинирования (рис. 3C) α-тубулина во фракции P2.

Нокодазол является агентом, нацеленным на микротрубочки (МТА), который предотвращает полимеризацию МТ путем связывания с β-тубулином и способствует деполимеризации МТ. Мозг мышей гомогенизировали в безтаксоловом MSB (+) с 10 мкМ нокодазолом или без него и помещали при 4 °C на 20 мин. Необработанный или обработанный нокодазолом гомогенат добавляли к 10 мкМ таксолу, повторно гомогенизировали и фракционировали на фракции P2, P3 и S3. Затем долю тубулина, содержащегося в трех фракциях, количественно определяли методом вестерн-блоттинга. Блоттинг с DM1A (α-тубулином) показал, что α-тубулин во фракции Р2 снижался, а во фракции Р3 имел тенденцию к увеличению при лечении нокодазолом (рис. 3D). Эти результаты указывают на то, что Р2-тубулин был дестабилизирован в ответ на низкую температуру или нокодазол, и что фракция Р2 содержала устойчивые МТ, которые сопротивлялись условиям эксперимента. В отличие от замораживания, нокодазол не влиял на тубулиновые ПТМ (рис. 3E, F). На основании полученных результатов и приведенных выше данных этим методом можно оценить деполимеризацию МТ, которые не могут быть обнаружены с помощью ПТМ-анализа.

Сравнение соотношения стабильных МТ, лабильных МТ и свободного тубулина в тканях
Стабильность МТ варьируется в разных тканях, в зависимости от пролиферативной способности клеток в этих тканях. Примечательно, что стабильные МТ более распространены в нервной системе, которая в основном состоит из непролиферативных нейронов, по сравнению с другимитканями. Для оценки способности разработанного метода фракционирования МТ выявлять различия в стабильности МТ в различных тканях печень и тимими мышей были фракционированы, а восстановленный тубулин в каждой фракции количественно определен. Результаты показали, что, по сравнению с другими тканями, мозг демонстрировал значительно более высокий уровень P2-тубулинов, в то время как P3-тубулины были заметно обогащены тканями, содержащими пролиферативные клетки (рис. 4). Кроме того, вестерн-блоттинг с использованием антител 6-11B1 и 1A2 подтвердил наличие более высокой стабильности МТ в нервной системе. Отчетливые закономерности распределения тубулиновых ПТМ ясно указывали на то, что тубулин Р2, специфически обнаруженный в нервной системе, происходит из стабильных МТ (рис. 4). Эти результаты еще раз подтверждают представление о том, что фракции P2 и P3 соответствуют стабильным и лабильным МТ соответственно.

Figure 1
Рисунок 1: Количественное определение тубулина в тканях мышей с использованием метода фракционирования МТ. (A) Краткое описание метода фракционирования тканей методом МТ. Стабильные МТ (фракция Р2), лабильные МТ (фракция Р3) и свободный тубулин (фракция S3) в тканях могут быть разделены с помощью 2-ступенчатого ультрацентрифугирования в условиях, подавляющих полимеризацию и деполимеризацию МТ во время приготовления. (Б) МТ в коре головного мозга мыши осаждали обычным ультрацентрифугированием 100 000 × г с последующим ультрацентрифугированием 500 000 × г . Затем тубулины, разделенные на фракции P2, P3 и S3, количественно определяли методом вестерн-блоттинга с DM1A (α-тубулин) и анти-Tuj1 (TUBB3). Отношение белков в каждой фракции (P2, P3 или S3) к общей фракции (P2 + P3 + S3) рассчитывали, как описано в разделе «Протокол» (средние значения ± SD, n = 4). Эта цифра была изменена по данным Hagita et al.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Метод фракционирования МТ позволяет разделять стабильные МТ, лабильные МТ и свободный тубулин в коре головного мозга мыши. (A) Фракции S2 или S3 (входные) были проанализированы методом фильтрующей ловушки с использованием ультрафильтрационной спиновой колонки с давлением 300 кДа. Тубулины, полученные фильтрацией (ресивер) и улавливанием (резервуар), количественно определяли методом вестерн-блоттинга DM1A (α-тубулином). (B) Очищенные свиные тубулины подвергали методу МТ-фракционирования, и было обнаружено, что они в основном собраны во фракции S3. (C) Размер молекулы тубулина во фракции S3. Фракцию S3 разделяли методом эксклюзионной хроматографии с использованием колонки гель-фильтрационной хроматографии. Белки в каждой фракции количественно определяли методом вестерн-блоттинга с DM1A (α-тубулин) и KMX-1 (β-тубулин). Теоретическая молекулярная масса показана в верхней части панелей. (D) Пропорции α-тубулина и β-тубулина в каждой фракции были равны. Тубулины, разделенные на фракции P2, P3 и S3, количественно определяли методом вестерн-блоттинга с помощью KMX-1 (β-тубулина). Количественная оценка доли α-тубулина и β-тубулина в каждой дроби относительно суммы общей доли (средние ± SDs, n = 4). Статистический анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента. (Д,Ж) Модификации α-тубулина во фракциях P2, P3 и S3 верифицировали методом вестерн-блоттинга с 6-11B1 (ацетилированный α-тубулин: E) и 1A2 (тирозинированный α-тубулин: F). Количественная оценка доли тирозинированного или ацетилированного α-тубулина в каждой фракции по отношению к общей фракции (средние значения ± SDs, n = 4). (A-C) были модифицированы по Hagita et al.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Оценка деполимеризации МТ, индуцированной замораживанием или МТА. (А-С) Оценена стабильность МТ после 30 мин замораживания при -80 °С. Доли тубулина, содержащегося в трех фракциях сырого и замороженного мозга, количественно определяли методом вестерн-блоттинга с DM1A (α-тубулин: A), 1A2 (тирозинированный α-тубулин: B) и 6-11B1 (ацетилированный α-тубулин: C). (Д-Ж) Оценивали влияние нокодазола на стабильность МТ. Доли тубулина, содержащегося в трех фракциях нокодазола, не обработанного или обработанного мозга, количественно определяли методом вестерн-блоттинга с DM1A (α-тубулин: D), 1A2 (тирозинированный α-тубулин: E) и 6-11B1 (ацетилированный α-тубулин: F). Репрезентативные относительные уровни тирозинирования (B,E) или ацетилирования (C,F) нормировали к сумме общего α-тубулина (A,D ) (означает ± SD, n = 4). Статистический анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Пропорции стабильных МТ, лабильных МТ и свободного тубулина в головном мозге, печени и тимусе у мышей. Мозг, печень и тимий мышей препарировали и подвергали методу фракционирования МТ. Белки, разделенные на каждую фракцию, количественно определяли методом вестерн-блоттинга с DM1A (α-тубулин), 6-11B1 (ацетилированный α-тубулин) и 1A2 (тирозинированный α-тубулин). Отношение белков в каждой фракции (P2, P3 или S3) к общей фракции (P2 + P3 + S3) рассчитывали, как описано в разделе «Протокол» (средние значения ± SD, n = 4). Статистический анализ проводили с помощью одностороннего анализа ANOVA с последующим тестом Тьюки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Важнейшей задачей при исследовании состояния тубулина в тканях живых организмов является предотвращение случайной МТ-полимеризации или деполимеризации в процессе препарирования. На стабильность МТ в образцах влияют такие факторы, как концентрация таксола в MSB, доля тканевого количества в буфере и температура в течение всего процесса от удаления ткани до гомогенизации и центрифугирования. Поэтому были оптимизированы условия на каждом шаге протокола анализа ткани мыши с 20-кратным объемом гомогената. Более высокая концентрация таксола может индуцировать полимеризацию МТ in vitro даже в охлажденных условиях25. При анализе тканей со значительно отличающимися концентрациями тубулина или внесении существенных изменений в протокол каждый оператор должен оптимизировать этапы в соответствии с конкретными целями своих экспериментов.

В проведенном исследовании новая популяция МТ, получившая обозначение Р3, была получена из обычной «растворимой фракции» с помощью ультрацентрифугирования при 500 000 × г20. Теоретические расчеты, основанные на таких факторах, как К-фактор ротора, центробежная сила и продолжительность центрифугирования, позволяют предположить, что тубулины, присутствующие во фракции S3, скорее всего, представляют собой димеры 6S тубулина. И наоборот, тубулин во фракции Р3 может соответствовать МТ, которые короче по длине по сравнению с теми, которые содержатся во фракции Р2. Это наблюдение согласуется с результатом, показывающим, что замораживание тканей перед гомогенизацией, которое приводит к частичному коллапсуМТ26, привело к значительному увеличению тубулина во фракции Р3 и одновременному снижению фракции Р2 (рис. 3А). Кроме того, анализ тубулиновых ПТМ и связывающих свойств различных МАФ показывает, что фракция Р2 или Р3 содержит стабильные или лабильные МТ соответственно. Например, некоторые MAP, специфичные для стабильных МТ, в основном обнаруженные в нейронах, присутствовали исключительно в фракцииP2 23. Следовательно, можно предположить, что фракция Р3 состоит из МТ, которые являются более динамичными и лабильными по сравнению с фракцией Р2.

Согласно теории, лежащей в основе метода, неподходящие экспериментальные условия, связанные со стабилизацией или центрифугированием МТ, могут привести к плохому фракционированию. Например, низкая концентрация Таксола приводит к незначительному снижению Р2-тубулина, в то время как избыток Таксола увеличивает Р2-тубулин из-за образования МТ во время приготовления23. Аналогичным образом, неправильное нагревание тканей и образцов может привести к гиперполимеризации МТ и деградации или фрагментации тау-белка23. Более того, центробежные условия имеют решающее значение для разделения фракций Р3 и S3, а незначительное уменьшение ускорения свободного падения значительно снижает извлечение фракции Р3. Поэтому рекомендуется строго следовать шагам протокола, если наблюдаются какие-либо аномальные фракционирования.

Этот простой метод фракционирования может быть широко применен для анализа пропорций тубулинов среди стабильных МТ, лабильных МТ и свободных димеров в тканях. Этот метод имеет ряд преимуществ, так как он может обнаруживать тонкие изменения в статусе тубулина, которые могут быть незаметны при количественном определении ПТМ тубулина. Анализ стабильности МТ важен для понимания физиологического значения МТ, особенно в крупных и сложных нейрональных клетках, а также для исследования нарушений, связанных с дисрегуляцией МТ. Мутации или дисфункции в генах тубулина или MAP, например, связаны с нарушениями развития нервной системы и нейродегенеративными заболеваниями27,28. Известно, что при болезни Альцгеймера МТ снижаются, возможно, из-за функциональной потери тау-белка в пораженных нейронах 15,29,30,31,32,33. МТА, которые модулируют стабильность МТ и ингибируют деление клеток, были предложены в качестве потенциальных методов лечения неврологических расстройств13,34. Использование этого уникального метода фракционирования МТ для анализа стабильности и поведения МТ и МАП у животных с модельными заболеваниями может внести значительный вклад в выяснение патогенеза деменции, связанной с тау-ассоциацией, и определение новых терапевтических мишеней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, о котором они могли бы сообщить.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана JST, учреждением университетских стипендий для создания научно-технических инноваций (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid для стипендиатов JSPS (A.HT.; 23KJ2078), грант для научных исследований (B) JSPS KAKENHI (22H02946 для TM), грант для научных исследований в инновационных областях под названием «Старение белка мозга и контроль деменции» от MEXT (TM; 26117004) и исследовательская стипендия Уэхара от Мемориального фонда Уэхара (TM; 202020027). Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ML TUBE CASE OF 500 Beckman Coulter 357448
1A2 Sigma-Aldrich T9028 1:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Nacalai Tesque 02442-44
300 kDa ultrafiltration spin column Aproscience PT-1013
6-11B1 Sigma-Aldrich T7451 1:5,000 dilution
ÄKTAprime plus Cytiva 11001313
anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-035-146 1:5,000 dilution
antipain Peptide Institute Inc. 4062
aprotinin Nacalai Tesque 03346-84
Chemi-Lumi One L Nacalai Tesque 07880-54
Corning bottle-top vacuum filter system Corning 430758 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFP Sigma-Aldrich 55-91-4 
DIGITAL HOMOGENIZER HK-1 AS ONE 1-2050-11
DM1A Sigma-Aldrich T9026 1:5,000 dilution
DTT Nacalai Tesque 14128-46
EGTA Nacalai Tesque 37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll Pall Corporation BSP0161
glycerol Nacalai Tesque 17018-25
GTP Nacalai Tesque 17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman TOMY KITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column Cytiva 28-9893-35
Image Gauge Software  FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD  FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation 292-69903
KMX-1 Millipore MAB3408 1:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzer FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptin Peptide Institute Inc. 43449-62
MgSO4 Nacalai Tesque 21003-75
Na3VO4 Nacalai Tesque 32013-92
NaF Nacalai Tesque 31420-82
okadaic acid LC Laboratories O-2220 
OPTIMA MAX-XP Beckman Coulter 393315
pepstatin Nacalai Tesque 26436-52
PMSF Nacalai Tesque 27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 Beckman Coulter 343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free) Roche 11873580001
Purified tubulin  Cytoskeleton T240
QSONICA Q55 QSonica Q55
Taxol LC Laboratories P-9600
TLA-120.2 rotor Beckman Coulter 357656
TLA-55 rotor Beckman Coulter 366725
TLCK Nacalai Tesque 34219-94
Triton X-100 Nacalai Tesque 12967-45
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  2. Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).
  3. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  4. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
  5. Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue. Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).
  6. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the neuronal microtubule cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  7. Leo, L., et al. Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules. Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).
  8. Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  9. Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).
  10. Baas, P. W., Black, M. M. Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability. Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).
  11. Cartelli, D., et al. Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective. Scientific Reports. 3, 1837 (2013).
  12. Zhang, B., et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).
  13. Zhang, F., et al. Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease. Translational Neurodegeneration. 4, 9 (2015).
  14. Miyasaka, T., et al. Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes. Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).
  15. Fujiwara, H., et al. Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).
  16. Vielkind, U., Swierenga, S. H. A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell. Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).
  17. Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).
  18. Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules. Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).
  19. Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons. Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).
  20. Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).
  21. Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons. Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).
  22. Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation. FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).
  23. Hagita, A., et al. Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability. Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).
  24. Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources. Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).
  25. Vallee, R. B. A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs). Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).
  26. Bartolo, M. E., Carter, J. V. Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach. Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).
  27. Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration. Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).
  28. Fourel, G., Boscheron, C. Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function. FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).
  29. Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia. The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).
  30. Yoshida, H., Ihara, Y. Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau. Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).
  31. Cash, A. D., et al. Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation. The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).
  32. Hempen, B., Brion, J. P. Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).
  33. Miyasaka, T., et al. Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy. Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).
  34. Boiarska, Z., Passarella, D. Microtubule-targeting agents and neurodegeneration. Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 201 Тубулин лабильные микротрубочки стабильные микротрубочки посттрансляционная модификация белок ассоциированный с микротрубочками фракционирование агенты нацеленные на микротрубочки
Метод количественного фракционирования микротрубочек для разделения стабильных микротрубочек, лабильных микротрубочек и свободного тубулина в тканях мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagita-Tatsumoto, A., Miyasaka, T.… More

Hagita-Tatsumoto, A., Miyasaka, T. Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (201), e63358, doi:10.3791/63358 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter