Journal
/
/
Метод количественного фракционирования микротрубочек для разделения стабильных микротрубочек, лабильных микротрубочек и свободного тубулина в тканях мышей
JoVE Journal
Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Biochemistry
Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues

Метод количественного фракционирования микротрубочек для разделения стабильных микротрубочек, лабильных микротрубочек и свободного тубулина в тканях мышей

1,742 Views

07:21 min

November 17, 2023

DOI:

07:21 min
November 17, 2023

20 Views
,

Transcript

Automatically generated

Наш новый протокол помогает различать и количественно оценивать три статуса трубчатых колец, таких как стабильные микротрубочки, лабильные микротрубочки и свободные канальцы в тканях животных. Этот метод состоит из простых шагов и позволяет оценить структурную стабильность трубок, которая не может быть обнаружена путем количественной оценки трубок после трансляционной модификации. Этот метод имеет важное значение для исследования и разработки терапевтических способов лечения заболеваний, где стабильность микротрубочек имеет решающее значение, таких как болезнь Альцгеймера и рак.

Начните процедуру с подготовки лабораторного белья к рассечению тканей. Наполните коробку колотым льдом и поставьте на нее две чашки Петри. Наполните одну посуду ледяным раствором фосфатного буфера или ПБС для кратковременного мытья и хранения рассеченных тканей.

На вторую посуду постелите фильтровальную бумагу, смоченную ПБС. Затем взвесьте 1,5-миллилитровые микропробирки, заполненные PBS, для хранения рассеченных тканей. После извлечения тканей из усыпленной мыши переложите их в пробирки и повторно взвесьте каждую микропробирку.

Переместите ткани в стеклянный гомогенизатор с ледяным стабилизирующим буфером из микротрубочек или MSB + среда и немедленно гомогенизируйте ткань с помощью охлажденного гомогенизатора. Теперь переложите гомогенат ткани в двухмиллилитровую микропробирку с помощью пипетки Пастера и центрифуги при 2,400 G в течение трех минут при двух градусах Цельсия. Перелейте надосадочную жидкость в новую микропробирку объемом 1,5 миллилитра для удаления мусора.

Вбейте надосадочную жидкость или фракцию S1 в новую микропробирку объемом 1,5 миллилитра. Сразу же пипетку 200 микролитров фракции S1 переложить в центрифугаторную микропробирку и центрифугировать при 100 000 G с помощью ротора TLA-55 в течение 20 минут при температуре два градуса Цельсия. После второго центрифугирования отделите надосадочную жидкость S2 от осадка P2.

Сразу же переложите все количество фракции S2 в центрифугируемую микропробирку и с помощью ротора TLA-120.2 открутите ее при 500 000 G в течение 60 минут при температуре два градуса Цельсия. После третьего центрифугирования отделите надосадочную жидкость S3 от осадка P3. Растворите всю фракцию S3 в 200 микролитрах 2X додецилсульфата натрия или буфера для образцов SDS.

Смешайте оставшиеся фракции S1 с равным объемом 2X буфера для образцов SDS для использования в качестве стандартной кривой для вестерн-блоттинга. Затем добавьте 400 микролитров буфера для образцов SDS в пробирки с фракциями P2 и P3. Затем кратковременно обработайте раствор ультразвуком, чтобы растворить осадок, прежде чем переложить образцы в новые 1,5-миллилитровые микропробирки и поместить их в холодильник.

Прокипятите все образцы при температуре 100 градусов Цельсия в течение трех минут. Микротрубочки во фракции P2 составляли 34,86% от общего количества альфа-тубулина в мозге мыши, в то время как микротрубочки во фракциях P3 и S3 составляли 56,13% и 9,01% соответственно. Процентное содержание бета-3 тубулина во фракциях Р2, Р3 и С3 достоверно не отличалось от содержания альфа-тубулина.

Фракция S2 показала ограниченное прохождение тубулина через ультрафильтрационную спиновую колонку мощностью 300 килодальтон, в то время как фракция S3 позволила полностью пройти тубулиновые комплексы. Хроматографическое разделение привело к 100-килодальтонному элюированию тубулина S3. В каждой фракции были обнаружены равные пропорции альфа- и бета-тубулина.

Фракции Р2 были значительно обогащены ацетилированным альфа-тубулином, в то время как тирозинированный альфа-тубулин доминировал во фракции Р3. Замораживание мозга перед гомогенизацией приводило к снижению концентрации альфа-тубулина во фракциях Р2. Однако альфа-тубулин увеличился во фракции Р3.

Замораживание также снижало уровень ацетилирования и повышало уровень тирозинизации альфа-тубулина во фракции Р2. Лечение нокодазолом снижало уровень альфа-тубулина во фракции Р2. В отличие от замораживания, нокодазол не влиял на посттрансляционные модификации Р2-тубулина.

В ткани головного мозга наблюдалась значительно более высокая концентрация Р2-тубулинов, тогда как Р3-тубулины были сконцентрированы в пролиферативной ткани. Вестерн-блоттинг показал, что Р2-тубулин, специфически обнаруженный в нервной системе, происходит из стабильных микротрубочек, а Р3-тубулин происходит из лабильных микротрубочек. Стабильность микротрубочек очень динамична.

Важно выполнить этот протокол быстро, без перерывов, в условиях низких температур. Также убедитесь, что ткани и фракции не были заморожены до растворения в буфере для образцов SDS. Ожидается, что сочетание иммунной презентации с использованием каждой фракции с протеомикой позволит выявить факторы, участвующие в динамике микротрубочек.

С помощью этого метода мы выявили, как нормальный тау существует на микротрубочках. Он также может быть использован для изучения того, как он становится ненормальным в старом мозге, чтобы идентифицировать новые лекарственные мишени деменции.

Summary

Automatically generated

Микротрубочки, которые являются полимерами тубулина, играют решающую роль в качестве компонента цитоскелета в эукариотических клетках и известны своей динамической нестабильностью. В этом исследовании был разработан метод фракционирования микротрубочек для разделения их на стабильные микротрубочки, лабильные микротрубочки и свободный тубулин для оценки стабильности микротрубочек в различных тканях мышей.

Read Article