Summary
ここでは、eGFP蛍光を用いた ショウジョウバエ 複眼における視細胞膜タンパク質の局在化および網膜変性の評価について、非侵襲的方法について説明する。
Abstract
膜タンパク質のトラフィッキングは、原形質膜への受容体およびイオンチャネルの取り込みおよび除去を調節する。このプロセスは、ニューロンの細胞機能および細胞完全性にとって根本的に重要である。 ショウジョウバエ の視細胞は、膜タンパク質の輸送を研究するためのモデルとなっている。照明時に感光膜から内在化して分解されるロドプシンの他に、 ショウジョウバエ の一過性受容器電位様(TRPL)イオンチャネルは、横紋体視細胞膜(暗所に位置する)と感光細胞体(照明時に輸送される)との間に光依存性の転座を示す。TRPLのこの細胞内輸送は、eGFPタグ付きTRPLを視細胞で発現させることによって、単純かつ非侵襲的な方法で研究することができる。eGFP蛍光は、その後、深い擬似瞳孔内または水浸漬顕微鏡によって観察することができる。これらの方法は、無傷の眼における蛍光の検出を可能にし、したがって、TRPL転座に欠損した ショウジョウバエ 変異体のハイスループットアッセイおよび遺伝子スクリーニングに有用である。ここでは、ハエの調製、顕微鏡的手法、ならびにTRPLのこの光誘発転座を研究するために使用される定量化方法が詳細に説明される。これらの方法は、他の ショウジョウバエ の感光体タンパク質、例えばロドプシンのトラフィッキング研究にも適用することができる。加えて、eGFPタグ付きラブドメラルタンパク質を使用することにより、これらの方法は、視細胞の変性を評価するために使用することができる。
Introduction
原形質膜との間でタンパク質を送達および除去することにより、ニューロンにおける膜タンパク質の輸送は、受容体およびイオンチャネルを有する原形質膜装置を制御し、その結果、ニューロン機能を調節する。タンパク質の輸送における調節ミスや欠陥は、通常、細胞に有害な影響を及ぼし、ニューロン変性をもたらす。ヒトでは、これはアルツハイマー病およびパーキンソン病または網膜色素変性症1などの神経変性疾患を引き起こし得る。ショウジョウバエの複眼における光受容体は、膜タンパク質のトラフィッキングを研究するためのin vivoモデル系となっている2。これは、効果的な遺伝子スクリーニングを可能にするショウジョウバエの遺伝的汎用性に起因するだけでなく、光吸収感光体膜のすべての必須成分が非常に詳細に特徴付けられ、フライアイに適用できる効率的な顕微鏡技術が利用可能であるためでもある。これらの手法は、この記事の焦点です。
ショウジョウバエの視細胞では、頂端原形質膜は、横紋と呼ばれる細胞の片側に沿って微絨毛の密集したスタックを形成する。視細胞R1-6のラブドメアは特徴的な台形パターンで配列され、視細胞R7およびR8はこの台形3の中心に単一のラブドメアを形成している。膜タンパク質のトラフィッキングは、ラブドーム内のこれらの光導入タンパク質の適切な量を保証するために、ロドプシンおよび光活性化TRP(一過性受容器電位)およびTRPL(TRP様)イオンチャネルなどのラブドメラ膜タンパク質の調節された代謝回転に必要である。光受容体膜タンパク質は小胞体で合成され、ゴルジ体を介して横紋岩に輸送される。光によるロドプシンの活性化に続いて、ロドプシン分子は、第2の光子の吸収によって不活性化されるか、またはクラスリン媒介性エンドサイトーシスによってラブドメアから除去され得る。エンドサイトーシスされたロドプシンは、リソソーム中で分解されるか、またはラブドミア4、5に戻ってリサイクルされる。イオンチャネルTRPLはまた、光伝達カスケードの活性化に続いて内在化され、ラブドミア(ハエが暗闇に保たれているときに位置する場所)と細胞体内のER富化貯蔵区画(照明時に数時間以内に輸送される)との間の光依存性転座を受ける6,7,8,9,10 .エンドサイトーシスされたロドプシンとは対照的に、少量のTRPLのみがエンドリソソーム経路を介して分解され、大部分は代わりに細胞内に貯蔵され、暗順応時にラブドミアにリサイクルされる6。したがって、TRPLは、原形質膜タンパク質の光トリガー輸送を分析するために使用することができる。ショウジョウバエの視細胞は、神経細胞の変性を研究するためにも使用されている。視細胞変性は、変性プロセスの結果として崩壊するラブドメアの構造を評価することによって頻繁に決定される5。
視細胞または視細胞変性におけるTRPLおよびロドプシンの細胞内局在を研究するために、ここでは分析速度および分解能に関して異なる2つの蛍光顕微鏡法が適用されてきた。遺伝子スクリーニングに使用できるが空間分解能が限られている非常に高速で非侵襲的な方法は、深い偽瞳孔(DPP)における蛍光の検出である。DPPは節足動物複眼の光学現象であり、その幾何学的起源は197111年にFranceschiniとKirschfeldによって詳細に説明されている。要するに、網膜オーバーレイの下のいくつかの光学面上に、隣接するオンマチジアからのラブドメアの画像が観察され得る。眼の湾曲の中心を通る焦点面上で、これらの重畳された投影は、わずか桁大きい単一のオンマチジウム内のラブドメアの台形レイアウトに似た画像を形成する。この現象は、蛍光タンパク質の外因性発現(例えばTRPL::eGFP8)とは無関係に観察することもでき、それにもかかわらずDPPの検出が容易になる(図1A-A'')12。第2の非侵襲的方法は、眼の視光学装置を水で光学的に中和した後、蛍光標識されたタンパク質を画像化することに依存する水浸漬顕微鏡法である(図1B-C'')12。水浸漬法を用いて、横筋腫または細胞体中のTRPL::eGFPの相対量を、個々の視細胞について定量的に評価することができる。さらに、非転座蛍光タグ付きタンパク質は、ここに記載されるように、横紋体の完全性を評価し、潜在的な変性の経時変化を定量的に決定するために利用することができる。
DPPの記録は、これらの方法の中で最も簡単で最速ですが、生成されるデータの空間分解能は限られています。さらに、DPPが存在しない理由は数多くありますが、DPPイメージング自体では必ずしも識別できません。DPPはいくつかのオンマチジアの総和を表すので、個々の細胞に関する情報は失われる。したがって、低解像度のDPPイメージングは、多数のハエをスクリーニングする上で重要な機能を果たすが、一般に、水浸漬顕微鏡による高解像度の記録が続くべきである。水浸漬顕微鏡写真は、個々の細胞、発生欠陥、眼の形態、タンパク質の誤局在化または網膜変性、ならびにこれらの影響の定量化に関する解釈を可能にする。このプロトコルでは、これら 2 つの手法について詳しく説明します。
図1:この議定書に提示されたショウジョウバエ眼の顕微鏡検査のバリエーションの概要。(A−A'')蛍光深部擬似瞳孔(DPP)画像化、(B−B'')蛍光ラブドメアの致死水浸漬顕微鏡、および(C−C'')蛍光ラブドメアの非致死水滴顕微鏡の概略表現および例示的な顕微鏡写真。スケールバー(A ́'):100μm。スケールバー(B''-C''):10μm。この図は参考文献13から修正されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
1. 留意すべき事項
- 形態学的解析には横紋体に恒久的に位置する蛍光タンパク質を発現する ショウジョウバエ 株(例:TRP::eGFP、eGFP::NINAC)を使用し、転座タンパク質はタンパク質のトラフィッキングに関する解析に使用(例:TRPL::eGFP、Arr2::eGFP)を使用します。
- 実験的アプローチのために選択されたハエの光露光条件を予め決定する。
- 暗順応のために、ハエを暗い箱に25°Cで所望の期間保管する。 転座実験(例えば、TRPL::eGFP発現ハエ)で最大16時間照明する場合は、室温で蛍光管の下にハエを保管してください。
- 感光体の変性(例えば、TRP::eGFP発現ハエ)を評価する実験では、ハエを25°Cの蛍光管の下に12時間の光/12時間の暗サイクルで保持し、白色光で最大28日間の長期照明を行う。
- 色のついた光でハエを照らすには、蛍光管と一緒に異なる色の透明なプラスチック製の箱を使用してください。
- 色素沈着した目を持つフライストックが使用される場合、目の色素沈着は年齢とともに有意に増加する可能性があるため、比較分析のために正確に年齢動物。
注:データの解釈のためには、横紋体構造の光導波効果による信号バイアスが存在することに注意することが重要です。したがって、ラブドミアからの蛍光シグナルは、細胞体から得られるシグナルに対してDPPイメージングおよび水浸漬顕微鏡において常にある程度増幅されるであろう。これは、ラブドメアの外側からの蛍光がこれらの色素によって吸収され、細胞内に転座する融合タンパク質が検出される場合に特に重要である色素沈着した眼において最も顕著に観察される。したがって、重要なステップに関して、この研究は白目と赤目のハエを別々に考慮する。 - 水浸漬顕微鏡法に関しては、2つの変形例が記載されている。より速い致死的変動と非致死的変動により、その後の研究のための回復を可能にする。
2. DPPイメージング
- 図 2 に示すように、必要な機器と試薬で作業スペースを準備します。フライパッド上のCO2を有する視細胞において蛍光タンパク質を発現する遺伝子型のハエ(1〜3日齢)を麻酔する。従来の光源および低倍率(例えば、10倍)を有する実体顕微鏡下で画像化するために動物を選択する。
図2:DPPイメージングワークスペース 必要な材料は、(A)CO2麻酔装置、(B)UVランプと蛍光フィルターセットを備えた実体顕微鏡、(C)光源、(D)ソフトウェア付き顕微鏡搭載カメラ、(F)ペイントブラシ、(G)黒い段ボール、および(H)フライバイアルです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- DPPイメージングでは、選択したハエを麻酔をかけたままにし、左目または右目のいずれかが対物レンズに正確に放射状に向くように、顕微鏡対物レンズの中央にそれらの1つをその側に置きます(図3A)。
注:視細胞のオンマチジウム配列は背側腹正中線で鏡面対称性を示すので、DPPは眼の赤道のわずかに上または下で最もよく観察される(図3B)。
図3:DPPイメージングのための実体顕微鏡下でのフライの位置決め。(A)片目を顕微鏡対物レンズ放射状に向けさせたフライの側面の図。(B)フライヘッドは、赤い矢印で示すように、目標が目の赤道の少し上または下の点に焦点を合わせるように、わずかに上または下に向ける必要があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 目全体に収まるように倍率を上げ(例えば、100倍)、眼の中央のオンマチディアを中央に配置します。顕微鏡の被写界深度を下げるには、例えば、二重虹彩絞りを浅い設定に調整します(図4A-B ́)。
- 従来の光源をオフにし、顕微鏡のUVランプを最大強度でオンにし、目に発現する蛍光タンパク質に応じて顕微鏡の蛍光フィルターセットを選択します(図4C-E)。顕微鏡に取り付けられたカメラに向かって光路を設定します。
- ソフトウェア内のライブイメージング機能を使用して、露出時間とゲイン値(それぞれ80ミリ秒と12倍)を調整して、目からの特定の信号のみを検出する設定に画像の明るさを調整します。顕微鏡の焦点を眼(角膜の下)の「内側」に再調整して、DPPの重畳画像を生成します(図4C-E ́)。
図4:DPPおよび蛍光DPPイメージングの説明図。 ショウジョウバエの眼の例示的な画像は、GFPフィルタセットを用いた従来のUV照明下で、眼を通る概略断面に図示される様々な焦点面で撮影される。(A)(A ́)に例示されているように、従来の光源の明るい設定、30msの露光時間、1倍のゲイン、深い被写界深度、および角膜の表面近くの焦点面で記録された顕微鏡写真。(B)(B ́)に示すように、従来の光源の明るい設定、露光時間30ms、ゲイン1倍、被写界深度が浅く、焦点面が角膜表面より約180μm低い位置で記録された顕微鏡写真。民進党が示された。(C-E)UV光源とGFPフィルターセットの高輝度設定、80ms露光時間、12倍ゲイン、浅い被写界深度、および焦点面(C ́)近傍、(D')わずかに下方、または(E')角膜表面の約180μm下に記録された顕微鏡写真。蛍光DPPは湾曲した矢印で示されている。スケール バー 100 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 蛍光DPPのスナップショットを撮ります。顕微鏡を可視光線に戻し、光路を眼球に戻します。画像化された動物をハエバイアルに回収し、そのDPP表現型(例えば、交配)に従ってさらなる手続を行う。ステップ 2.2 の次の動物に進みます。
3. 水浸漬顕微鏡
- フライの準備
- 図 5 に示すように、必要な機器と試薬で作業スペースを準備します。予め冷却された15mL遠沈管に所定の年齢および照明条件でハエを移し、氷上で15〜30分間インキュベートすることによって麻酔をかける。
注:1日齢の暗く適応したハエを参考にして持ち運んでください。一般的に、暗く適応したハエは、暗闇の中で蓋をしたアイスボックスに移されるべきです。光に適応したハエは、部屋の光の中で氷に移すことができます。
- 図 5 に示すように、必要な機器と試薬で作業スペースを準備します。予め冷却された15mL遠沈管に所定の年齢および照明条件でハエを移し、氷上で15〜30分間インキュベートすることによって麻酔をかける。
図5:水浸漬顕微鏡ワークスペース。 必要な材料は、(A)15mL遠沈管、(B)アイスフレーク、(C)チルド蒸留水、(D)実体顕微鏡、(E)ペトリ皿、(F)プラスティシン、(G)オブジェクトスライド、(H)昆虫ピンまたはピペットチップおよびメス、(I)ソフトウェア付き蛍光顕微鏡です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 以下に説明する2つの調製物(3.1.3致死的変動または3.1.7非致死的変動)から適切な調製物を選択し、色素沈着眼と非色素眼の区別が行われるときはいつでも、それぞれの手順に従ってください。
- 次のように致命的なバリエーションのためにハエを準備します。
- プラスティックの断片を物体のスライドに付着させ、別の部分をペトリ皿の中央(例えば、94mmØ)に接着し、今のところそれらを別々に保ちます。氷冷した蒸留水といくつかの氷フレークでペトリ皿を満たします(図6A)。
- 氷麻酔フライ1匹を実体顕微鏡下に置き、プラスティシンコーティングされた物体スライドの上に置きます。フライを背中に回し、胸郭の中心に昆虫のピンを突き刺します(図6B)。プラスティシンでコーティングされた物体スライドにピンを水平に固定し、フライの左目または右目を上向きにします(図6C)。
- プラスティックを含まない側を下に向けて、フライの回転を防ぐペトリ皿にオブジェクトスライドを慎重に固定します。フライアイが水で覆われていることを確認します(図6D)。準備針を使用して、目の周りに形成された可能性のある気泡を慎重に取り除き、最良の結果を得るためにすぐに画像取得に進みます。
注:画像取得が大幅に遅れると、ハエの再覚醒や動きが発生し、画像がぼやける可能性があります。
図6:致死水浸漬顕微鏡のための準備。 (A)プラスティシン被覆物体スライドおよびシャーレ、(B)プラスティック研磨地面に胸郭を通るフライの固定、(C)プラスティック被覆物体スライド上のフライ配向、および(D)最終実験セットアップの図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 次のように非致死的な変動のためにハエを準備してください。
- 氷麻酔をかけたハエ 1 匹をヘッドファーストで 200 μL のピペットチップに移し、圧縮空気でハエを先端に向かって慎重に押し込みます。
- 頭のすぐ前のピペットチップをメスで切り落とします。ピンセットを使用して、ハエを先端から数ミリメートル離して慎重に押します。ピペットチップを再び切断し、フライの頭部のみがピペットチップから突出するように、圧縮空気でフライを先端に向かって押し戻します。
- プラスティシン片を物体のスライドに付着させ、フライの左目または右目が上を向くようにピペットチップを押し込みます(図7A)。画像取得の直前に、実験用ピペットを使用して、水浸漬対物レンズの下側に大量の冷水滴を付着させます(図7B)。最良の結果を得るには、すぐに画像取得に進みます。
注:画像取得が大幅に遅れると、ハエの再覚醒や動きが発生し、画像がぼやける可能性があります。
図7:非致死的な水滴顕微鏡検査のための準備。 (A)プラスティシンコーティングされた物体スライドに取り付けられた200μLのピペットチップ内に固定された冷麻酔フライ、および(B)水浸漬対物の下側に冷水滴を塗布する図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 画像取得
- 準備したフライでペトリ皿(ステップ3.1.3)またはオブジェクトスライド(ステップ3.1.7)を顕微鏡ステージ上に慎重に置き、水浸漬対物レンズを選択します。
- 水浸対物レンズが水面に接触するまで(ステップ3.1.3)、フライズアイが落下物に触れるまで(ステップ3.1.7)、水没目標を手動で下げます(図8A、B)。
- 顕微鏡UVランプをオンにし、適切なフィルターセットを選択します。接眼レンズを使用してフライを対物レンズの下に置き、顕微鏡を目の表面に焦点を合わせます。
- 顕微鏡カメラへの光路を切り替え、対応するソフトウェアでライブ画像を生成します。カメラの焦点を再調整し、図8C-Eに詳細に示すように、目が顕微鏡の対物レンズを放射状に向けなければならないことを考慮して、目の向きを評価します。
図8:水浸漬イメージング用の蛍光顕微鏡下でのフライの位置決め。 (A)致死的または(B)非致死的なハエ準備プロトコルを使用した画像取得のセットアップと最終的な向き。(C)水浸漬顕微鏡画像の最良の結果を得るためのハエの向きの説明図。目に焦点を当てるのに理想的なポイントは、前/後軸および背/腹軸に対する正確な中心ではなく、赤い矢印で示すように、目の赤道よりわずかに上にあります。(d)完全に位置決めされた眼のための水浸漬画像の例。六角形オンマチジウムタイルの3つの対称軸はすべて直線として表示され、オンマチジアの最大量を同時に焦点を合わせることができます。(e)不適切に配置された眼の水浸漬画像の例。画像には、湾曲した軸と浅い被写界深度が含まれています。スケール バー: 20 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- イメージングソフトウェア内の適切なLUT(ルックアップテーブル)を使用して、過飽和(赤色ピクセルで表示)を検出します。
- 色素沈着していないハエの場合は、最も明るいピクセルがすべての画像の彩度制限のすぐ下になるように露光時間を調整します。
- 色素沈着したハエと致命的な変動の場合、最も明るいすべてのピクセルが少なくとも5匹の1日齢の暗い適応ハエの彩度限界のすぐ下になるように露光時間を調整します。計算された平均露光時間を他のすべての実験条件(遺伝子型、照明条件、時間点など)に適用します。
- 色素沈着したハエ(例えば、赤目)および非致死的な変動の場合、すべての最も明るいピクセルが、1日齢の暗く適応したハエごとに彩度限界をわずかに下回るように露光時間を調整する。この露光時間を、このハエの他のすべての実験条件(照明条件、時間点など)に適用します。
- 画像を記録し、生のファイルとして保存して、記録の対応するすべてのメタデータをアーカイブします。次の定量化のために、画像を.tif形式でエクスポートします。
注:致死的でない変動の場合、ハエがさらなる実験に使用することを意図している場合は、画像取得直後に赤色光(例えば、630nm)でハエを5分間照らす。赤色光は、画像取得時に強烈な短波光によって過度に活性化された光伝達カスケードを失活させる。
- 水浸漬顕微鏡写真の横紋体における相対eGFP蛍光のデータ分析と定量化
- ソフトウェアImageJ /Fijiをダウンロード、インストール、実行します。
- ImageJ の設定を調整するには、[ 分析] > [測定値の設定] をクリックします。 をクリックし、[ 平均グレー値] のボックスのみをオンにします。.tif画像をインポートするには、[ 開く] をクリックして>ます。 またはドラッグアンドドロップによって。ピントが合っている画像の代表的な領域を選択し、 Ctrl キー と + を同時に繰り返し押すことで 200% ~ 300% に拡大します。
- 楕円形ツールを選択し、Shift キーを押しながら、1 つの蛍光横紋より大幅に小さい円形の選択範囲を画像内に生成します。マウスボタンを放す前に、ImageJメインウィンドウのツールバーの下に表示される正確なサイズを探します。すべての解析に同じサイズの円形選択を使用します。
メモ: 円形選択範囲の正確なサイズ (ピクセルまたはミクロン単位) は、特定の設定によって異なります。1日齢の暗く適応した対照ハエの横紋体の直径の約1/3または1/4の円を使用する。 - 円形の選択範囲を移動するには、マウスキーを押しながら選択範囲内をドラッグするか、キーボードの矢印キーを押します。
- 円形選択範囲内の蛍光強度を測定するには、円を最初のラブドミア(r1)に移動し、[ 分析]>[測定] をクリックするか、ショートカット Ctrl + Mを使用します。測定されたグレー値を一覧表示する 結果 ウィンドウがポップアップ表示されます。
- r2-r6の測定をバックグラウンド信号の測定(b)と繰り返し測定として継続する。色素沈着していないハエの場合は、対応する細胞体領域(c1-c6)の追加測定を行います(図9)。
図9:転座研究のための相対的横紋蛍光の定量化。 1つの水浸漬顕微鏡画像において、3つの異なる代表的オンマチジウム(白丸)のラブドメア(r)、細胞体(c)、およびバックグラウンド(b)の蛍光強度を測定することによって、ラブドメアにおける相対的なeGFP蛍光の定量化に関する例示;スケールバー:10μm。拡大されたオンマチジウムが右側に示されています。スケール バー: 2 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 手順 3.3.5 と 3.3.6 をさらに 2 つのオンマチディアに対して繰り返し、3 つのテクニカル レプリケートを作成します。 鉛筆 ツールを使用して分析されたオンマティディアにマークを付け、この画像をドキュメント用に保存します。
- 結果ウィンドウから測定されたグレー値を選択してコピーし、スプレッドシートソフトウェアに貼り付けてさらに計算します。蛍光強度の値を、その起源に従って、ラブドメア(r)、細胞体(c)、およびバックグラウンド(b)のカテゴリにソートします。各カテゴリ(Ir、Ic、Ib)から平均強度を計算します。
- 非色素沈着眼については下記式(1)を使用し、ラブドメア(登録商標)中に存在するeGFPの相対量を計算する:
(1)
(2) - ステップ 3.3.3 の次のイメージに進みます。信頼性の高い測定値を得るためには、各実験群の少なくとも5人の個体からの画像を生物学的複製として使用することをお勧めします。
(1)
(2)- 水浸顕微鏡写真におけるeGFP蛍光による眼形態のデータ解析と定量化
- ImageJ/Fijiソフトウェアをダウンロード、インストール、実行します。.tif画像をインポートするには、[ 開く>ファイル ]をクリックするか、ドラッグアンドドロップします。焦点が合っている画像の代表的な領域で隣接する3つのオンマチジアを選択します。
- 選択対象の18個のラブドメアを、周囲のバックグラウンド信号に対するeGFP強度、エッジシャープネス、およびコントラストに従って個別に評価し、変性指数を生成します。値が2のはっきりと見えるラブドメア、値が1の弱く見えるラブドメア、および値が0の存在しないラブドメアにスコアを付けます(図10)。
注: この定量化方法では、完全に無傷の目でスコアが 36 になり、完全に退化した目ではスコアが 0 になります。変性指数のスコアを36〜100%に設定することをお勧めします。
図10:変性研究のためのラブドミア評価 による 定量化。 1つの水浸漬顕微鏡画像における3つの異なる代表的オンマチジウム(白丸)の横紋体を2(はっきりと見える;青い円)、1(弱く見える;オレンジの円)、または0(存在しない;赤い円)の値でスコアリングすることによって、眼形態の定量化に関する図。スケールバー:10μm。拡大されたオンマチジウムが右側に示されています。スケール バー: 2 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 次のイメージを開き、ステップ 3.4.2 に進みます。信頼性の高い測定値を得るためには、生物学的複製として各実験群の少なくとも8人の個人からの画像を使用することをお勧めします。
注:この定量化方法は、蛍光強度による転座を定量する方法よりも目的が低いため、推奨される反復数は高くなります。
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Representative Results
ロドプシン1プロモーターの制御下でTRPL::eGFP融合タンパク質を発現するトランスジェニックショウジョウバエが生成されている。これらのハエでは、TRPL::eGFPは複眼の視細胞R1-6に発現し、照明依存的な局在を示す。ハエが暗闇の中で飼われると、TRPL::eGFPは外側のラブドメアに組み込まれます。数時間の照明の後、TRPLは細胞体に転移し、そこでER濃縮コンパートメントに貯蔵される。8,10 TRPL::eGFPがラブドメアに位置する場合、その蛍光はDPPにおいて観察され得る。しかしながら、横紋体蛍光は、TRPL::eGFPの転座の結果として光の中で消失する(図11A、B)。これは、TRPL::eGFPのインターナリゼーションに欠損した変異体について遺伝子スクリーニングを行うために用いられた(図11C,D)14,15。潜在的にホモ接合性の致死的変異の単離を可能にするために、このスクリーニングは、発生中の眼組織(すなわち、モザイク眼)における体細胞クローンの生成のために酵母Flp/FRTシステムを用いて実施された。DPPアッセイの単純さに加えて、この蛍光検出方法の他の大きな利点は、その高いスループットと、生きているハエの突然変異の同定を可能にし、これらのハエを安定した突然変異ハエストックの生成に使用する非侵襲的な特性である。
図11:TRPL転座欠損に関する遺伝子スクリーニングからの代表的な結果。 オスのハエをエチルメタンスルホネート(EMS)で変異原化し、視細胞R1-6でTRPL::eGFPを発現するメスに交配した。ホモ接合的に変異したFlp/FRT誘導モザイク眼を有する得られたF1世代を、暗順応(左列)および光適応(右列)の期間後に蛍光深部偽瞳孔(DPP)をイメージングすることにより、TRPL転座の欠陥についてスクリーニングした。(A,B)非変異ハエを、規則的な光誘導TRPL転座のための対照として一緒に運んだ。非蛍光性DPPを矢印で示す。(C、D)光誘発TRPL転座において欠損した単離された変異体の例示的な結果である。スケール バー: 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
この遺伝子スクリーニングから単離されたTRPL転座欠損(ttd)変異体は、後に同定され、それらの欠陥は、水浸漬画像法の助けを借りてより詳細に特徴付けられる。水浸漬顕微鏡は、ラブドメアおよび細胞体におけるタンパク質の局在を評価するために、または議定書に概説されているように、光受容体変性による横紋体構造の欠陥を定量的に追跡するために適用されてきた。図12A、Bは、暗闇の中、光の中、および2回目の暗順応後に、非突然変異型およびlolattd12変異モザイク目を有するハエのラブドメア中に存在するTRPL::eGFPの量を定量化して示す。対照(非変異型)ハエでは、TRPL::eGFPは、16時間の照明後にラブドメアから細胞体に転移し、その結果、横紋TRPL::eGFPが暗適応状態と比較して約45%に減少する。2回目のダークインキュベーションは、ラブドメラ蛍光を再び初期値の95%に上昇させる。lolattd12変異体は、そのTRPL転座欠損のためにDPPスクリーニングによって単離された。したがって、ラブドメアの水浸漬画像におけるTRPL::eGFP蛍光パターンは、16時間の照明とその後の24時間の暗適応後ほど劇的に変化しないようである。しかしながら、画像はまた、lolattd12変異体が発達的に欠陥があることを明らかにしており、これは、他のlola変異体16について以前に記載したように、視細胞が時折存在しないことによって証明される。これらの形態学的欠陥は、有効なバックグラウンドシグナルを測定することができなくなり、式(1)を用いた正しい定量化を妨げる。これに対し、vps35MH20は、このようにommatidial morphologyに影響を与えることなくTRPL転座欠損を示す変異体である10。この変異体において、ここで説明する定量方法は、統計的に有意なリサイクル欠陥を検出することができる(図12C、D)。
図12:ローラおよびvps35変異体ハエにおけるTRPL転座欠損の代表的な結果および定量方法の限界。 (a)TRPL::eGFP発現非変異型およびlolattd12変異型モザイクアイブエを、暗闇の中で3日間インキュベートし、オレンジ色の光で16時間照らし、2回目に24時間暗適応させた。蛍光ラブドメアの画像を水浸漬顕微鏡法によって撮影し、ステップ3.2.6に記載されるように細胞内TRPL::eGFP局在化を記録した。(b)式(1)を用いた工程3.3.9に記載する非変異体(灰色)およびlolattd12変異体(緑色)動物の横紋体蛍光の定量。(C)TRPL::eGFP発現非変異体およびvps35MH20変異モザイクアイドハエを、暗所で3日間インキュベートし、オレンジ色の光で16時間照射し、2回目に24時間暗適応させた。蛍光ラブドメアの画像を水浸漬顕微鏡法によって撮影し、ステップ3.2.6に記載されるように細胞内TRPL::eGFP局在化を記録した。(d)式(1)を用いた工程3.3.9に記載する非変異体(灰色)およびvps35MH20変異体(赤色)動物の横紋体蛍光の定量。統計的有意性は、分散分析後のボンフェローニ補正との多重比較として計算された(ns、有意ではない;*、p≤0.05;***、p≤0.001)。スケールバー:10μm。パネルCおよびDは、参考文献10から修正されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
議定書ですでに述べたように、目の色素沈着は、結果として得られる水浸漬画像に大きく影響します。白い目のハエは、ラブドミアと細胞体の両方からの蛍光シグナルの検出を可能にし、TRPL::eGFP分布比のかなり正確な決定を可能にする。対照的に、アカミハエでは、TRPL::eGFPシグナルはラブドメアでのみ検出可能であり、細胞体では検出できない(図13A)。これは、色素分子がTRPL::eGFPから放出された光を吸収するためである。それにもかかわらず、色素沈着した目に式(2)を使用することによって、定量化は、白目および赤目のハエにおけるTRPL::eGFP転座行動をうまく明らかにする。したがって、ラブドミア蛍光の対応する値は、暗適応状態の100%から照明後に25%および5%に減少し、第2の暗インキュベーションの結果として80%および90%に再び増加する(図13B)。
(A)TRPL::eGFP発現白色および赤色目のハエを暗闇の中で1日間インキュベートし、オレンジ色の光で16時間照らし、2回目に24時間暗適応させた。蛍光性ラブドメアの画像を非致死的な水滴顕微鏡によって撮影し、ステップ3.2.6(白い目のハエ)および3.2.8(赤い目のハエ)に記載されているように、細胞内TRPL::eGFP局在化を記録した。(B)白目(灰色)および赤色目(赤色)のハエにおける横紋蛍光の定量化。白い目のハエは、ステップ3.3.9で説明したように、式(1)および式(2)を使用して赤い目のハエを使用して定量化しました。エラー バーは SEM を表します。スケール バー: 10 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
感光体変性を評価するために、ラブドメアにおけるTRP::eGFPの蛍光に基づいて変性指数を決定することができる(プロトコルを参照のこと)。この定量方法を 図10に例示する。ここでの代表的な結果では、非変異型および sdhAttd11 変異型モザイクアイドハエを12時間明/12時間の暗サイクルで2週間保持し、水浸漬顕微鏡を用いてTRP::eGFPを観察することによって2〜4日ごとにラブドメアの完全性を調査した(図14A)。得られた曲線は、変異体では変性指数の低下を示すが、対照ハエではそうではない(図14B)。
(A)TRP::eGFP発現非変異体およびsdhA ttd11変異モザイクアイドハエを、25°Cで12時間明/12時間暗サイクルで14日間インキュベートした。 蛍光性ラブドメアの画像は、網膜の健康状態を記録するために、一定の時間間隔で水浸漬顕微鏡によって撮影された。(b)ステップ3.4に記載する野生型(灰色)およびsdhAttd11変異型(オレンジ色)ハエのラブドメラ蛍光の定量。エラー バーは SEM を表します。スケール バー: 10 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
蛍光タンパク質の適用性とDPPイメージングおよび網膜水浸漬顕微鏡によるスクリーニングの単純さは、多くのグループによって成功していることが証明されています12。ここに提示されたものと同様の戦略は、Rh1::eGFP 17、18、19、20、21の助けを借りて、ロドプシン発現レベル、恒常性、網膜組織、または細胞完全性の欠陥を検出するために、いくつかの遺伝子スクリーニングで使用されている。上で説明したように、TRPL::eGFPのような転座融合タンパク質は、例えば突然変異誘発スクリーニングにおいて、ラブドミアとの間のタンパク質輸送プロセスが損なわれているかどうかを検出するために使用され得る。一方、TRP::eGFPのような永久的なラブドメラ融合タンパク質は、ラブドメアの形態を調べるために使用することができる。DPPおよび水浸漬顕微鏡は、ショウジョウバエの目のモデル内のハイスループット分析およびスクリーニングのための優れた方法と見なされています。しかし、DPPまたは水浸顕微鏡によって得られた結果を裏付けるために、単離されたオンマチジウムまたは凍結切片網膜組織の(免疫)組織化学的分析を最終的に行うことが推奨される。高分解能蛍光顕微鏡と組み合わせることで、これらの技術は正確な細胞内局在化に向けた解釈を可能にします。以下では、正しい定量分析に特に重要なDPPおよび網膜水浸漬顕微鏡のイメージングプロセスのトラブルシューティング方法について、いくつかのガイドラインを提供します。
DPPに関しては、蛍光の重ね合わせがぼやけていたり、不明瞭であったりすると、設定が正しくないことがあります。1つの可能性は、眼が対物レンズを正確に放射状に向いていないか、または焦点が眼の周辺領域に設定されていることです。視細胞の気体レイアウトは背側胸部正中線に鏡面対称性を示すので、眼の両半球からシグナルが検出されると、DPPに異常なパターンが見られることがある。DPPの品質は、複眼を通して光学セクションを生成するために、浅い被写界深度にも大きく依存しています。フライパッドの表面が自家蛍光を表示する場合、フライはフライパッドの上にある黒い非蛍光段ボールの小さな部分の上に置かれてもよい。DPPを記録できないことは、最適でないハエの位置決め、蛍光タンパク質の低発現レベル、無秩序な網膜構造、または変性プロセスを含む、さまざまな根底にある原因に関連している可能性があります。DPPをイメージングする場合、白い目のハエの細胞質蛍光は、ラブドメアからのシグナルの境界を拡散させる可能性があり、タンパク質の発現レベルは個体間で有意に異なり、結果として生じるDPPの品質に影響を与える可能性があることにも留意すべきである。したがって、蛍光DPPイメージングの場合には、色素沈着した目を有するハエを使用することが有利である。細胞体からの蛍光シグナルの吸収のために、結果として生じるDPPは、白い目のハエよりも鋭く見えることがある。
水浸顕微鏡で画像がぼやけないようにするには、ハエの再覚醒やハエの動きを防ぐために、ハエの準備後に画像取得を迅速に行う必要があります。高品質の画像の場合、白い目のハエを使用する場合、目からの最も明るい蛍光信号は、すべての画像でほぼ飽和に達する必要があります。これは、撮像中に露光時間を調整することによって達成することができる。色素沈着は細胞質eGFP蛍光の検出を妨げるので、曝露時間を調整するための白目ハエに対する記載されたアプローチは、色素沈着した眼において常に強い横紋体蛍光シグナルをもたらし、その後の解釈および定量を歪める。さらに、色素沈着した目を使用することにより、青色光への強い曝露によるフォトブリーチングは、信号が弱くなり、データの誤った解釈につながる可能性があります。文脈(すなわち、致死的または非致死的)に応じて、色素沈着眼についてのプロトコルにおいて、2つの代替手順が提示される。一般に、同じハエを繰り返し測定することができ、個々のハエの特定の曝露時間の評価は、サンプルから生成された平均曝露時間の決定よりも正確な定量化および高い再現性をもたらすため、色素沈着した目では非致死的変動が好ましい。しかし、非致死的な変動は、繰り返し測定中の生存を保証するために、動物の取り扱いにより多くの注意を必要とする。これは、低圧空気のみを使用してハエをピペットチップに移動し、ピンセットを慎重に使用してイメージング後にハエをピペットチップから解放することによって達成できます。ハエは処置中に氷冷水に沈まないので、再覚醒のリスクが高まる。個々の試料からの繰り返し測定の結果として、一連の測定全体は、ハエが最初から最後まで無傷のままである場合にのみ有効です。その結果、非致死的な変動は非常に労働集約的で時間がかかります。一方、致命的な変動は、複数のハエを同じ昆虫ピンに連続して固定し、1回の画像取得ラウンドで順番に記録できるため、より高いスループットを可能にします。ただし、同じピン上の複数のハエは、再覚醒や動きを避けるために、さらに迅速なイメージングも必要とします。致死的変動の最後の欠点は、明らかに、その後の適用(例えば、交差、反復測定)のための画像化後に動物を回収することができないことである。
転座の定量化に関して、この議定書は、ラブドメアおよび細胞体からの蛍光シグナルを考慮し、したがって細胞内の転座タンパク質の相対分布について非常に良好な推定値を生成する式(1)を提示する(図12D)。色素沈着した目の場合、細胞体からの蛍光測定がないため、式(2)が提供されており、これはこの頻繁に遭遇する問題に対してうまく機能します(図13B)。眼の色素沈着とは別に、これらの式のいずれかによる定量化を妨げる他の状況がある。これらの例の1つは、lolattd12変異体の形態で図12A、Bに提示される。この変異体において、具体的には、視細胞R7の非存在下は、気体形態、ひいてはこの領域からのバックグラウンド蛍光の妥当な強度測定値を取得する能力に有意に影響を及ぼす。これらの問題にもかかわらず、同じ転座定量法が使用されている場合、結果は大量の分散を示し、対照と比較することは困難であり、誤解される可能性がある。したがって、lolattd12変異体の例は、正しい強度測定のために必然的に「野生型」のような形態に依存するこの定量方法の限界を示しています。まれに、形態学的に欠陥のあるオンマチジアにおいてタンパク質転座欠損が定量化される場合、ここで提示された議定書は失敗し、それに応じて適合させなければならない。これには、合理的に取得できない測定値を除外するため、または他の代表的な地域の追加の測定値を含めるための式への適切な変更が含まれます。
変性プロセスの定量化の場合、蛍光強度閾値は、ラブドメア内およびハブドメア間にあまりにも多くの分散があるため、良好な指標ではないことが判明した。この分散は、転座を定量化する方法において測定された18個のラブドメアすべてにわたって平均化される。しかしながら、変性の評価における各ラブドミアの個々の評価のために、蛍光強度の分散を平均化することはできない。さらに、強度は考慮する必要がある特性の1つにすぎません。その他の重要な側面は、コントラストとエッジのシャープネスです。その結果、このプロトコルは、ラブドメアの形態を眼による蛍光に従って分類することに基づく定量化方法を提示する。これは必然的にある程度主観的です。それにもかかわらず、十分な経験を与えられて、このプロトコルは、変性のための定量化の有用で、速く、再現可能な方法であることが証明されており(図14)、複数回公開されている22,10。すべての主観的評価と同様に、盲目的な文脈でそれらを実行することが常に賢明です。他のグループのプロトコルは、通常、ショウジョウバエの網膜変性(ラブドメアの有無)を定量化するために2つのカテゴリーのみを使用し、主観的ではないが、精度も低い可能性がある。さらに、この定量化の方法には、2つのカテゴリ間のカットオフポイントを定義するという問題が依然としてあり、客観的に定義することは同様に難しいかもしれません。
ここで提示される方法の改変および高度な適用に関して、二重色画像化によって同時に2つの蛍光融合タンパク質の相対量を評価することも可能である。例えば、TRPL::HcRedおよびTRP::eGFPを用いて、TRPL::HcRed転座は、同じフライ23における横紋体の完全性を考慮して評価された。ダブルカラーイメージングは、トマト/GFP-FLP/FRT法においても、例えば、アポトーシス24を誘導する因子を同定するために用いられる。この変異により、ninaC::tdTomatoによってマークされた蛍光標識された細胞クローンにおけるninaC::eGFPを介した視細胞の変性を可視化することを可能にする。水浸漬顕微鏡の別の用途は、光受容体におけるホスホイノシチド代謝回転のモニタリングである。この目的のために、PLCδ1由来のプレクストリン相同性(PH)ドメインなどの蛍光標識ホスホイノシチド結合ドメインが使用される。これらの蛍光プローブは、ラブドメアから細胞質ゾル25、26へのプローブの拡散によって引き起こされるラブドメラ蛍光の減少を検出することによって、ホスホイノシチド分解の経時的な追跡を可能にする。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
私たちは長年にわたる学生研究者に感謝したいと思います。特に、ニーナ・マイヤー、シビル・メイヤー、ジュリアン・カイム、ローラ・ジャギーは、そのデータが代表的な結果としてこのプロトコルで利用されています。ここで紹介する私たちのグループの研究は、ドイツ連邦共和国(Hu 839/2-4, Hu 839/7-1)からArmin Huberへの助成金によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| CO2 anaesthesia fly pad | Flystuff | 59-172 | |
| Cold light lamp (KL 1500 LCD) | Zeiss | ||
| Fiji/ImageJ | NIH | ||
| Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition) | Zeiss | ||
| Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2] and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2] |
Osram | 4050300518039 | |
| Laboratory pipette (20-200 µL) | Eppendorf | ||
| Object slide | Roth | 0656.1 | |
| Petri dish (94 mm) | Greiner Bio-One | 633102 | |
| Pipette tips (200 µL) | Labsolute | 7695844 | |
| Plasticine (Blu-Tack) | Bostik | 30811745 | |
| Stereo microscope (SMZ445) | Nikon | ||
| Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12) | Leica |
References
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