Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

eGFP Etiketli Proteinler Kullanarak Drosophila Fotoreseptör Hücrelerinde Membran Protein Kaçakçılığının İncelenmesi

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63375
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biology, Department of Biochemistry, University of Hohenheim

Summary

Burada, fotoreseptör membran proteinlerinin lokalizasyonu ve eGFP floresan kullanılarak Drosophila bileşik gözünde retinal dejenerasyonun değerlendirilmesi için non-invaziv yöntemler tanımlanmıştır.

Abstract

Membran proteini kaçakçılığı, reseptörlerin ve iyon kanallarının plazma zarına dahil edilmesini ve uzaklaştırılmasını düzenler. Bu süreç, nöronların hücre fonksiyonu ve hücre bütünlüğü için temel olarak önemlidir. Drosophila fotoreseptör hücreleri, membran protein kaçakçılığını incelemek için bir model haline gelmiştir. Aydınlatma üzerine fotoreseptör zarından içselleştirilen ve parçalanan rodopsinin yanı sıra, Drosophila'daki geçici reseptör potansiyeli benzeri (TRPL) iyon kanalı, rabdomeral fotoreseptör membranı (karanlıkta bulunduğu yer) ile fotoreseptör hücre gövdesi (aydınlatma üzerine taşındığı) arasında ışığa bağımlı bir translokasyon sergiler. TRPL'nin bu hücre içi transportu, fotoreseptör hücrelerinde eGFP etiketli TRPL'yi eksprese ederek basit ve invaziv olmayan bir şekilde incelenebilir. eGFP floresansı daha sonra derin psödopupilde veya suya daldırma mikroskobu ile gözlemlenebilir. Bu yöntemler, sağlam gözde floresan tespitine izin verir ve bu nedenle TRPL translokasyonunda kusurlu Drosophila mutantları için yüksek verimli testler ve genetik ekranlar için yararlıdır. Burada, sineklerin hazırlanması, mikroskobik teknikler ve TRPL'nin bu ışıkla tetiklenen translokasyonunu incelemek için kullanılan niceleme yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bu yöntemler, rodopsin gibi diğer Drosophila fotoreseptör proteinleri üzerindeki kaçakçılık çalışmaları için de uygulanabilir. Ek olarak, eGFP etiketli rabdomeral proteinler kullanılarak, bu yöntemler fotoreseptör hücrelerinin dejenerasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir.

Introduction

Proteinleri plazma zarına ve plazma zarından uzaklaştırarak, nöronlardaki membran proteini kaçakçılığı, plazma zarı ekipmanını reseptörlerin yanı sıra iyon kanallarıyla kontrol eder ve sonuç olarak nöronal fonksiyonu düzenler. Protein kaçakçılığındaki yanlış düzenleme veya kusurlar tipik olarak hücreler üzerinde zararlı etkilere sahiptir ve nöronal dejenerasyona neden olur. İnsanlarda bu, Alzheimer ve Parkinson hastalığı veya Retinitis pigmentosa1 gibi nörodejeneratif hastalıklara neden olabilir. Drosophila melanogaster'in bileşik gözündeki fotoreseptörler, membran proteini kaçakçılığını incelemek için in vivo bir model sistemi haline gelmiştir2. Bu sadece etkili genetik taramalara izin veren Drosophila'nın genetik çok yönlülüğünden değil, aynı zamanda ışık emici fotoreseptör membranın tüm temel bileşenlerinin çok ayrıntılı bir şekilde karakterize edilmesinden ve sinek gözüne uygulanabilecek verimli mikroskobik tekniklerin mevcut olmasından kaynaklanmaktadır. Bu teknikler bu makalenin odak noktasıdır.

Drosophila fotoreseptör hücrelerinde, apikal plazma zarı, hücrenin bir tarafı boyunca rabdomere adı verilen yoğun bir şekilde paketlenmiş bir mikrovillus yığını oluşturur. Fotoreseptör hücreler R1-6'nın rabdomerleri karakteristik bir yamuk paterninde düzenlenirken, fotoreseptör hücreleri R7 ve R8 bu yamuk3'ün merkezinde tek bir rabdomere oluşturur. Membran proteini kaçakçılığı, rabdopsin ve ışıkla aktive edilen TRP (geçici reseptör potansiyeli) ve TRPL (TRP benzeri) iyon kanalları gibi rabdomeral membran proteinlerinin düzenlenmiş bir devri için, rabdomaverdeki bu fototransdüksiyon proteinlerinin uygun miktarını sağlamak için gereklidir. Fotoreseptör membran proteinleri endoplazmik retikulumda sentezlenir ve Golgi aparatı aracılığıyla rabdomere taşınır. Rodopsinin ışıkla aktivasyonunu takiben, bir rodopsin molekülü ya ikinci bir fotonun emilimi ile inaktive olabilir ya da klatrin aracılı endositoz ile rabdomere'den çıkarılabilir. Endositozlu rodopsin lizozomda bozulur veya rabdomere 4,5'e geri dönüştürülür. İyon kanalı TRPL, fototransdüksiyon kaskadının aktivasyonunu takiben de içselleştirilir ve rabdomere (sinekler karanlıkta tutulduğunda bulunduğu yer) ile hücre gövdesindeki ER ile zenginleştirilmiş bir saklama bölmesi (aydınlatmadan sonra birkaç saat içinde taşındığı) arasında ışığa bağımlı bir translokasyona uğrar6,7,8,9,10 . Endositozlu rodopsinin aksine, endolizozomal yol yoluyla sadece az miktarda TRPL parçalanır ve çoğunluğu hücre içi olarak depolanır ve karanlık adaptasyon6 üzerine rabdomere geri dönüştürülür. TRPL böylece plazma membran proteinlerinin ışıkla tetiklenen trafiğini analiz etmek için kullanılabilir. Drosophila fotoreseptör hücreleri ayrıca nöronal dejenerasyonu incelemek için de kullanılır. Fotoreseptör hücre dejenerasyonu sıklıkla dejeneratif süreçlerin bir sonucu olarak parçalanan rabdomerlerin yapısının değerlendirilmesiyle belirlenir5.

Fotoreseptör hücrelerde TRPL ve rodopsinin hücre altı lokalizasyonunu veya fotoreseptör hücre dejenerasyonunu incelemek için, analiz hızı ve çözünürlüğü açısından farklılık gösteren iki floresan mikroskopi yöntemi burada uygulanmıştır. Genetik ekranlar için kullanılabilecek, ancak sınırlı bir uzamsal çözünürlüğe sahip çok hızlı, invaziv olmayan bir yöntem, derin psödopupilla (DPP) floresan tespitidir. DPP, geometrik kökeni Franceschini ve Kirschfeld tarafından 1971'de ayrıntılı olarak açıklanan eklembacaklı bileşik gözlerin optik bir fenomenidir11. Kısacası, retina kaplamasının altındaki birkaç optik düzlemde, bitişik ommatidiadan rabdomerlerin görüntüleri gözlenebilir. Gözün eğriliğinin merkezinden geçen bir odak düzleminde, üst üste binen bu projeksiyonlar, tek bir ommatidiyumda rabdomerlerin yamuk düzenine benzeyen bir görüntü oluşturur. Bu fenomen, floresan proteinlerinin (örneğin TRPL::eGFP8) eksojen ekspresyonundan bağımsız olarak da gözlemlenebilir, bu da DPP'nin tespit edilmesini kolaylaştırır (Şekil 1A-A'')12. İkinci bir non-invaziv yöntem, gözlerin diyoptrik aparatını suyla optik olarak nötralize ettikten sonra floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin görüntülenmesine dayanan su daldırma mikroskopisidir (Şekil 1B-C '')12. Suya daldırma yöntemi kullanılarak, rabdomerlerdeki veya hücre gövdesindeki göreceli TRPL::eGFP miktarı, bireysel fotoreseptör hücreler için kantitatif olarak değerlendirilebilir. Ayrıca, yer değiştirmeyen floresan etiketli proteinler, rabdomeral bütünlüğü değerlendirmek ve burada açıklandığı gibi potansiyel bir dejenerasyonun zaman seyrini nicel bir şekilde belirlemek için kullanılabilir.

DPP'nin kayıtları, bu yöntemlerin gerçekleştirilmesi en kolay ve en hızlısı olsa da, ürettikleri verilerin uzamsal çözünürlüğü sınırlıdır. Ek olarak, bir DPP'nin bulunmamasının birçok nedeni vardır, bunlar DPP görüntülemenin kendisi tarafından mutlaka fark edilemez. DPP birkaç ommatidinin toplamını temsil ettiğinden, bireysel hücreler hakkındaki bilgiler kaybolur. Bu nedenle, düşük çözünürlüklü DPP görüntüleme, çok sayıda sineğin taranmasında önemli bir işlev görür, ancak genellikle suya daldırma mikroskobu yoluyla daha yüksek çözünürlüklü kayıtlar tarafından takip edilmelidir. Suya daldırma mikrografları, bireysel hücreler, gelişimsel kusurlar, göz morfolojisi, protein yanlış lokalizasyonu veya retina dejenerasyonu hakkında yorumlara ve bu etkilerin nicelleştirilmesine izin verir. Bu Protokol bu iki tekniği ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

Figure 1
Şekil 1: Bu Protokolde sunulan Drosophila gözü için mikroskopi varyasyonlarına genel bakış. (A-A'') floresan derin psödopupil (DPP) görüntüleme, (B-B'') floresan rabdomerlerin ölümcül suya daldırma mikroskobu ve (C-C'') floresan rabdomerlerin ölümcül olmayan su damlası mikroskopisinin şematik gösterimleri ve örnek mikrografları. Ölçek çubuğu (A''): 100 μm. Ölçek çubukları (B''-C''): 10 μm. Şekil referans13'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Genel hususlar

  1. Morfolojik analiz için kalıcı rabdomeral olarak yerleştirilmiş bir floresan proteinini ifade eden Drosophila stoklarını kullanın (örneğin, TRP::eGFP, eGFP::NINAC) ve protein kaçakçılığı ile ilgili analizler için proteinleri yer değiştiren (örneğin, TRPL::eGFP, Arr2::eGFP).
  2. Deneysel yaklaşım için seçilen sineklerin ışığa maruz kalma koşullarını önceden belirleyin.
    1. Karanlık adaptasyon için, sinekleri 25 ° C'de istenen süre boyunca karanlık kutularda saklayın. Translokasyon deneylerinde 16 saate kadar aydınlatma için (örneğin, TRPL::eGFP sinekleri ifade eden), sinekleri oda sıcaklığında bir floresan tüpün altında tutun.
    2. Fotoreseptör dejenerasyonunu değerlendiren deneylerde (örneğin, TRP::eGFP sinekleri ifade eder), beyaz ışıkla 28 güne kadar uzun süreli aydınlatma için sinekleri 12 saatlik bir ışık / 12 saatlik karanlık döngüde 25 ° C'de bir floresan tüpün altında tutun.
    3. Sinekleri renkli ışıkla aydınlatmak için, floresan tüp ile birlikte farklı renkli şeffaf plastik kutular kullanın.
  3. Pigmentli gözlü sinek stokları kullanılırsa, göz pigmentasyonu yaşla birlikte önemli ölçüde artabileceğinden, karşılaştırmalı analiz için hayvanları tam olarak yaşlandırın.
    NOT: Veri yorumlama için, rabdomeral yapının optik dalga yönlendirme etkisinden dolayı bir sinyal yanlılığı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Buna göre, rabdomere'den gelen floresan sinyali, DPP görüntüleme ve su daldırma mikroskobunda hücre gövdesinden elde edilen sinyallere göre her zaman belirli bir dereceye kadar yükseltilecektir. Bu, en belirgin şekilde, rabdomerlerin dışından floresanın bu pigmentler tarafından emildiği pigmentli gözlerde görülür ve hücre içi olarak yer değiştiren füzyon proteinleri tespit edildiğinde özellikle önemlidir. Bu nedenle, kritik adımlarla ilgili olarak, bu çalışma beyaz ve kırmızı gözlü sinekleri ayrı ayrı ele almaktadır.
  4. Suya daldırma mikroskobu ile ilgili olarak, iki varyasyon tanımlanmıştır. Daha hızlı bir ölümcül varyasyonun yanı sıra sonraki çalışmalar için iyileşmeye izin veren ölümcül olmayan bir varyasyon.

2. DPP görüntüleme

  1. Çalışma alanını Şekil 2'de gösterildiği gibi gerekli ekipman ve reaktiflerle hazırlayın. Bir flypad üzerinde CO2 ile fotoreseptör hücrelerde bir floresan proteini eksprese eden bir genotipin sineklerini (1-3 günlük) anestezi altına alın. Geleneksel bir ışık kaynağına ve düşük büyütmeye (örneğin, 10x) sahip bir stereo mikroskop altında görüntüleme için hayvanları seçin.

Figure 2
Şekil 2: DPP görüntüleme çalışma alanı. İhtiyaç duyulan malzemeler (A) CO2 anestezi aparatı, (B) UV lambalı ve floresan filtre setli stereo mikroskop, (C) ışık kaynağı, (D) (E) yazılımlı mikroskopa monte kamera, (F) boya fırçası, (G) siyah karton ve (H) sinek şişesidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. DPP görüntüleme için, seçilen sinekleri anestezi altında tutun ve bunlardan birini mikroskop hedefinin merkezine yan tarafına yerleştirin, böylece sol veya sağ göz hedefe tam olarak radyal olarak bakar (Şekil 3A).
    NOT: Fotoreseptör hücrelerin ommatidiyal düzeni, dorsoventral orta hatta ayna simetrisi gösterdiğinden, DPP en iyi gözün ekvatorunun biraz üstünde veya altında gözlenir (Şekil 3B).

Figure 3
Şekil 3: DPP görüntüleme için sineğin stereomikroskop altında konumlandırılması . (A) Sineğin yan tarafında, bir gözü mikroskop hedefine radyal olarak bakacak şekilde gösterilmesi. (B) Sinek başının hafifçe yukarı veya aşağı çevrilmesi gerekir, böylece hedef, kırmızı oklarla gösterildiği gibi gözün ekvatorunun biraz üstünde veya altında bir noktaya odaklanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Büyütmeyi tüm göze uyacak şekilde artırın (örneğin, 100x) ve gözün merkezi ommatidisini ortalayın. Mikroskopun alan derinliğini azaltın, örneğin çift iris diyaframını sığ bir ayara ayarlayarak (Şekil 4A-B').
  2. Geleneksel ışık kaynağını kapatın ve mikroskop UV lambasını maksimum yoğunlukta açın ve mikroskopun floresan filtre setini gözlerde ifade edilen floresan proteinine göre seçin (Şekil 4C-E). Işık yolunu mikroskopa monte edilmiş kameraya doğru ayarlayın.
  3. Pozlama süresini ayarlayarak ve değer kazanarak (örneğin, sırasıyla 80 ms ve 12x) görüntüdeki parlaklığı yalnızca belirli sinyalleri algılayan bir ayara ayarlamak için yazılımdaki canlı görüntüleme özelliğini kullanın. DPP'nin üst üste binmiş görüntüsünü oluşturmak için mikroskop odağını gözün içine (korneanın altından) "re" ayarlayın (Şekil 4C-E').

Figure 4
Şekil 4: DPP ve floresan DPP görüntüleme çizimi. GFP filtre seti ile geleneksel ve UV aydınlatması altında Drosophila gözlerinin örnek görüntüleri, göz yoluyla şematik kesitlerde gösterilen değişen odak düzlemleriyle çekilmiştir. (A) Geleneksel bir ışık kaynağının parlak ayarları, 30 ms pozlama süresi, 1x kazanç, derin alan derinliği ve (A') da gösterildiği gibi kornea yüzeyine yakın odak düzlemi ile kaydedilen mikrograf. (B) Geleneksel bir ışık kaynağının parlak ayarları, 30 ms pozlama süresi, 1x kazanç, sığ alan derinliği ve odak düzlemi ile kaydedilen mikrograf, (B') de gösterildiği gibi kornea yüzeyinin yaklaşık 180 μm altında. DPP belirtti. (C-E) UV ışık kaynağı ve GFP filtre setinin yüksek yoğunluklu ayarları, 80 ms maruz kalma süresi, 12x kazanç, sığ alan derinliği ve kornea yüzeyinin yaklaşık 180 μm altında (D') yakın, (D') veya (E') odak düzlemi (C') ile kaydedilen mikrograf. Floresan DPP kavisli bir okla gösterilir. Ölçek çubuğu 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Floresan DPP'nin anlık görüntüsünü alın. Mikroskopu tekrar görünür ışığa ve ışık yolunu okülerlere doğru geri çevirin. DPP fenotipine (örneğin, haçlar) göre daha fazla işlem için görüntülenen hayvanı bir sinek şişesinde kurtarın. Adım 2.2'deki bir sonraki hayvanla devam edin.

3. Su daldırma mikroskobu

  1. Sinek hazırlığı
    1. Çalışma alanını Şekil 5'te gösterildiği gibi gerekli ekipman ve reaktiflerle hazırlayın. Önceden belirlenmiş yaş ve aydınlatma koşullarına sahip sinekleri önceden soğutulmuş 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 15 ila 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ederek anestezi yapın.
      NOT: 1 günlük, karanlığa adapte olmuş sinekleri referans olarak yanınızda taşıyın. Genel olarak, karanlığa adapte olmuş sinekler, karanlıkta kapaklı bir buz kutusuna aktarılmalıdır. Işığa adapte olmuş sinekler oda ışığında buza aktarılabilir.

Figure 5
Şekil 5: Suya daldırma mikroskobu çalışma alanı. İhtiyaç duyulan malzemeler şunlardır: (A) 15 mL santrifüj tüpü, (B) buz gevreği, (C) soğutulmuş damıtılmış su, (D) stereomikroskop, (E) Petri kabı, (F) hamuru, (G) nesne slaytı, (H) böcek pimleri veya pipet uçları ve neşter, (I) (J) yazılımlı floresan mikroskop. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Aşağıda açıklanan ikisinden uygun preparatı seçin (3.1.3 ölümcül varyasyon veya 3.1.7 ölümcül olmayan varyasyon) ve pigmentli ve pigmentsiz gözler arasında ayrım yapıldığında, ilgili adımları izleyin.
  2. Sinekleri ölümcül varyasyon için aşağıdaki gibi hazırlayın.
  3. Bir parça hamuru bir nesne kaydırağına ve başka bir parçayı Petri kabının ortasına (örneğin, 94 mm Ø) yapıştırın ve şimdilik ayrı tutun. Petri kabını buzla soğutulmuş damıtılmış su ve biraz buz gevreği ile doldurun (Şekil 6A).
  4. Hamuru kaplı nesne slaytının üzerine bir stereomikroskop altına buz anestezili bir sinek koyun. Sineği sırtına çevirin ve göğüs kafesinin ortasından bir böcek iğnesini delin (Şekil 6B). Pimi hamuru kaplı nesne sürgüsüne yatay olarak sabitleyin ve sineğin sol veya sağ gözünü yukarı doğru yönlendirin (Şekil 6C).
  5. Hamuru içermeyen tarafı aşağı bakacak şekilde nesne kızağını Petri kabına dikkatlice sabitleyin ve sineğin dönmesini önleyin. Sinek gözünün suyla kaplı olduğundan emin olun (Şekil 6D). Göz çevresinde oluşmuş olabilecek hava kabarcıklarını dikkatlice çıkarmak için bir hazırlama iğnesi kullanın ve en iyi sonuçlar için hemen görüntü almaya devam edin.
    NOT: Görüntü yakalamadaki önemli gecikme, sineğin yeniden uyanmasına ve hareketlerine neden olur ve bu da bulanık görüntülere neden olabilir.

Figure 6
Şekil 6: Ölümcül suya daldırma mikroskobu için hazırlık. (A) hamuru kaplı nesne slaytının ve Petri kabının çizimi, (B) bir sineğin toraks boyunca hamuru zemine sabitlenmesi, (C) hamuru kaplı nesne slaytı üzerinde sinek oryantasyonu ve (D) son deney düzeneği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Sinekleri ölümcül olmayan varyasyon için aşağıdaki gibi hazırlayın.
  2. Buzla uyuşturulmuş bir sineği kafa kafaya 200 μL'lik bir pipet ucuna aktarın ve sineği basınçlı hava ile dikkatlice uca doğru itin.
  3. Pipet ucunu başın hemen önünde bir neşter kullanarak kesin. Cımbız kullanarak, sineği uçtan birkaç milimetre uzağa dikkatlice itin. Pipet ucunu tekrar kesin ve sineği basınçlı hava ile uca doğru geri itin, böylece sineğin başı pipet ucundan sadece çıkıntı yapar.
  4. Bir parça hamuru bir nesne sürgüsüne yapıştırın ve pipet ucunu sineğin sol veya sağ gözü yukarı bakacak şekilde içine bastırın (Şekil 7A). Görüntü elde etmeden hemen önce, suya daldırma hedefinin alt tarafına büyük bir damla soğutulmuş su yapıştırmak için bir laboratuvar pipeti kullanın (Şekil 7B). En iyi sonuçlar için hemen görüntü alımına geçin.
    NOT: Görüntü yakalamadaki önemli gecikme, sineğin yeniden uyanmasına ve hareketlerine neden olur ve bu da bulanık görüntülere neden olabilir.

Figure 7
Şekil 7: Ölümcül olmayan su damlası mikroskobu için hazırlık. (A) hamuru kaplı nesne sürgüsü üzerine monte edilmiş 200 μL'lik bir pipet ucunun içine sabitlenmiş soğuk anestezili bir sineğin ve (B) suya daldırma hedefinin alt tarafına soğutulmuş su damlası uygulamasının gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Görüntü alma
    1. Petri kabını (adım 3.1.3) veya nesne kaydırağını (adım 3.1.7) hazırlanan sinekle mikroskop aşamasına dikkatlice yerleştirin ve bir suya daldırma hedefi seçin.
    2. Su daldırma hedefini, su yüzeyine temas edene kadar (adım 3.1.3) veya sineğin gözü damlaya dokunana kadar (adım 3.1.7) manuel olarak alçaltın (Şekil 8A, B).
    3. Mikroskop UV lambasını açın ve uygun filtre setini seçin. Sineği hedefin altına konumlandırmak için göz merceklerini kullanın ve mikroskopu gözün yüzeyine odaklayın.
    4. Işık yolunu mikroskop kamerasına doğru değiştirin ve ilgili yazılımda canlı bir görüntü oluşturun. Kamera için odağı yeniden ayarlayın ve gözün yönünü değerlendirin, gözün Şekil 8C-E'de daha ayrıntılı olarak gösterildiği gibi mikroskop hedefine radyal olarak bakması gerektiğini göz önünde bulundurun.

Figure 8
Şekil 8: Suya daldırma görüntüleme için sineğin floresan mikroskobu altında konumlandırılması. (A) ölümcül veya (B) ölümcül olmayan sinek hazırlama protokollerini kullanarak görüntü yakalama için kurulum ve son oryantasyon. (C) Suya daldırma mikroskobu görüntülerinin en iyi sonuçlarını elde etmek için sinek oryantasyonunun gösterilmesi. Göze odaklanmak için ideal nokta, anterior / posterior ve dorsal / ventral eksenlere göre tam merkez değil, kırmızı okla gösterildiği gibi gözün ekvatorunun biraz üzerindedir. (D) Mükemmel konumlandırılmış bir göz için suya daldırma görüntüsü örneği. Altıgen ommatidial döşemenin üç simetri ekseni de düz çizgiler olarak görünür ve maksimum ommatidia miktarı aynı anda odakta olabilir. (E) Yanlış konumlandırılmış bir gözün suya daldırma görüntüsü örneği. Görüntü kavisli eksenler ve sığ bir alan derinliği içerir. Ölçek çubuğu: 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Aşırı doygunluğu (kırmızı pikseller olarak belirtilir) algılamak için görüntüleme yazılımında uygun LUT'u (arama tablosu) kullanın.
  2. Pigmentli olmayan sinekler söz konusu olduğunda, pozlama süresini, en parlak pikseller her görüntü için doygunluk sınırının hemen altında olacak şekilde ayarlayın.
  3. Pigmentli sinekler ve ölümcül varyasyon durumunda, maruz kalma süresini, en parlak piksellerin tümü, en az beş bireysel 1 günlük, karanlığa adapte olmuş sineklerde doygunluk sınırının hemen altında olacak şekilde ayarlayın. Hesaplanan ortalama maruz kalma süresini diğer tüm deneysel koşullara (genotipler, aydınlatma koşulları, zaman noktaları vb.) uygulayın.
  4. Pigmentli sinekler (örneğin, kırmızı gözlü) ve ölümcül olmayan varyasyon durumunda, pozlama süresini, en parlak piksellerin her 1 günlük, koyu renkli uyarlanmış sinek için doygunluk sınırının hemen altında olacak şekilde ayarlayın. Bu maruz kalma süresini, bu sineğin diğer tüm deneysel koşullarına (aydınlatma koşulları, zaman noktaları vb.) uygulayın.
  5. Bir görüntü kaydedin ve kaydın ilgili tüm meta verilerini arşivlemek için ham dosya olarak kaydedin. Aşağıdaki nicelik için görüntüyü .tif bir biçimde dışa aktarın.
    NOT: Ölümcül olmayan varyasyon durumunda, daha fazla deney için kullanılmak isteniyorsa, görüntü elde edildikten hemen sonra sinekleri 5 dakika boyunca kırmızı ışıkla (örneğin, 630 nm) aydınlatın. Kırmızı ışık, görüntü yakalama sırasında yoğun kısa dalgalı ışık tarafından aşırı derecede etkinleştirilen fototransdüksiyon kaskadını devre dışı bırakır.

  1. Su daldırma mikrograflarının rabdomerlerinde bağıl eGFP floresansının veri analizi ve nicelleştirilmesi
    1. ImageJ/Fiji yazılımını indirin, kurun ve çalıştırın.
    2. ImageJ ayarlarını Analiz Et > Ölçümleri Ayarla... tıklayın ve yalnızca Ortalama Gri Değer kutusunu işaretleyin. Dosya .tif Aç'a tıklayarak > bir resmi içe aktarın... veya sürükleyip bırakarak. Görüntünün odakta olan temsili bir bölgesini seçin ve Ctrl ve + tuşlarına art arda basarak %200-%300 oranında büyütün.
    3. Oval aracı seçin ve Shift tuşuna basarken görüntüde bir floresan rabdomere'den önemli ölçüde daha küçük olan dairesel bir seçim oluşturun. Fare düğmesini bırakmadan önce, ImageJ ana penceresindeki araç çubuğunun altında görüntülenen tam boyutu arayın. Tüm analizler için aynı boyutta dairesel seçim kullanın.
      NOT: Dairesel seçimin piksel veya mikron cinsinden tam boyutu, belirli kuruluma bağlıdır. 1 günlük, karanlığa adapte olmuş kontrol sineklerinin rabdomeral çapının yaklaşık 1/3 veya 1/4'ü kadar bir daire kullanın.
    4. Dairesel seçimi, fareyle tıklatıp sürükleyerek veya klavyedeki Ok Tuşlarına basarak hareket ettirin.
    5. Dairesel seçim içindeki floresan yoğunluklarını ölçmek için, daireyi ilk rabdomere (r1) taşıyın ve Analiz Et > Ölç'e tıklayın veya Ctrl + M kısayolunu kullanın. Ölçülen gri değeri listeleyen bir Sonuç penceresi açılır.
    6. Tekrarlanan ölçümler olarak r2-r6 ölçümleri ve arka plan sinyalinin (b) ölçümü ile devam edin. Pigmentli olmayan sinekler söz konusu olduğunda, karşılık gelen hücre vücut alanlarının (c1-c6) ek ölçümlerini yapın (Şekil 9).

Figure 9
Şekil 9: Translokasyon çalışmaları için bağıl rabdomeral floresanın miktarı. Bir su daldırma mikroskobu görüntüsünde üç farklı temsili ommatidianın (beyaz daireler) rabdomerin (r), hücre gövdesinin (c) ve arka planının (b) floresan yoğunluğunu ölçerek rabdomerlerdeki nispi eGFP floresansının nicelleştirilmesine ilişkin bir örnek; ölçek çubuğu: 10 μm. Sağda büyütülmüş bir ommatidyum gösterilir; ölçek çubuğu: 2 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. İki ommatidia daha için 3.3.5 ve 3.3.6 adımlarını yineleyin ve üç teknik çoğaltma elde edin. Kurşun Kalem aracını kullanarak analiz edilen ommatidiayı işaretleyin ve bu görüntüyü dokümantasyon için kaydedin.
  2. Sonuç penceresinden ölçülen gri değerleri seçip kopyalayın ve daha fazla hesaplama için bunları elektronik tablo yazılımına yapıştırın. Floresan yoğunluğunun değerlerini kökenlerine göre rabdomere (r), hücre gövdesi (c) ve arka plan (b) kategorilerine göre sıralayın. Her kategoriden ortalama yoğunluğu hesaplayın (I r, Ic, Ib).
  3. Pigmentli olmayanlar için aşağıdaki formülü (1) ve pigmentli gözler için formülü (2) kullanarak rabdomerde ( R ) bulunan göreceli eGFP miktarını hesaplayın:
    Equation 1(1)
    Equation 2(2)
  4. 3.3.3 adımındaki bir sonraki görüntüyle devam edin. Güvenilir bir ölçüm elde etmek için her deney grubunun en az beş bireyinden gelen görüntülerin biyolojik kopyalar olarak kullanılması önerilir.
  1. Suya daldırma mikrograflarında eGFP floresan ile göz morfolojisinin veri analizi ve nicelleştirilmesi
    1. ImageJ/Fiji yazılımını indirin, kurun ve çalıştırın. Dosya .tif Aç'a tıklayarak veya sürükleyip bırakarak > bir resmi içe aktarın. Odakta olan görüntünün temsili bir bölgesinde üç bitişik ommatidia seçin.
    2. Bir dejenerasyon indeksi oluşturmak için seçimin 18 rabdomerini eGFP yoğunluğuna, kenar keskinliğine ve çevredeki arka plan sinyaline göre kontrastına göre ayrı ayrı değerlendirin. 2 değeri ile açıkça görülebilen rabdomeleri, 1 değeri ile zayıf görünür rabdomereleri ve 0 değeri ile eksik rabdomereleri puanlayın (Şekil 10).
      NOT: Bu niceleme yöntemi, tamamen bozulmamış gözler için 36 puan ve tamamen dejenere gözler için 0 puan ile sonuçlanır. Dejenerasyon indeksinde puanın% 36 ila% 100 olarak ayarlanması önerilir.

Figure 10
Şekil 10: Dejenerasyon çalışmaları için rabdomere değerlendirmesi yoluyla niceleme. Bir suya daldırma mikroskobu görüntüsünde üç farklı temsili ommatidianın (beyaz daireler) rabdomerlerinin 2 (açıkça görülebilir; mavi daire), 1 (zayıf görünür; turuncu daire) veya 0 (yok; kırmızı daire) değerleriyle puanlanarak göz morfolojisinin nicelleştirilmesi ile ilgili bir örnek. Ölçek çubuğu: 10 μm. Sağda büyütülmüş bir ommatidyum gösterilir; ölçek çubuğu: 2 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Sonraki görüntüyü açın ve adım 3.4.2 ile devam edin. Güvenilir bir ölçüm elde etmek için her deney grubunun en az sekiz bireyinden gelen görüntülerin biyolojik kopyalar olarak kullanılması önerilir.
    NOT: Bu niceleme yöntemi, floresan yoğunluğu ile translokasyonu ölçme yönteminden daha az objektif olduğundan, önerilen replika sayısı daha yüksektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Transgenik Drosophila sinekleri bir TRPL::eGFP füzyon proteinini eksprese ederek rodopsin 1 promotörünün kontrolü altında üretilmiştir. Bu sineklerde, TRPL::eGFP, bileşik gözün fotoreseptör hücreleri R1-6'da eksprese edilir ve ışığa bağımlı bir lokalizasyon gösterir. Sinekler karanlıkta tutulduğunda, TRPL::eGFP dış rabdomerlere dahil edilir. Birkaç saat aydınlatıldıktan sonra, TRPL, ER ile zenginleştirilmiş bir bölmede saklandığı hücre gövdesine taşınır. 8,10 TRPL::eGFP rabdomerlerde bulunduğunda, floresansı DPP'de gözlemlenebilir. Bununla birlikte, rabdomeral floresan, TRPL::eGFP'nin translokasyonu sonucu ışıkta kaybolur (Şekil 11A,B). Bu, TRPL::eGFP'nin içselleştirilmesinde kusurlu olan mutantlar için genetik bir tarama yapmak için kullanılmıştır (Şekil 11C,D)14,15. Potansiyel olarak homozigot ölümcül mutasyonların izolasyonuna izin vermek için, bu tarama, gelişmekte olan göz dokusunda (yani mozaik gözlerde) somatik hücre klonlarının üretilmesi için maya Flp / FRT sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. DPP testinin basitliğinin yanı sıra, bu floresan tespit yönteminin diğer büyük avantajları, canlı sineklerdeki mutasyonların tanımlanmasına ve bu sineklerin kararlı mutant sinek stoklarının üretilmesi için kullanılmasına izin veren yüksek veriminin yanı sıra invaziv olmayan karakteridir.

Figure 11
Şekil 11: TRPL translokasyon defektlerindeki genetik taramadan elde edilen temsili sonuçlar. Erkek sinekler etil metansülfonat (EMS) ile mutajenize edildi ve fotoreseptör hücrelerinde R1-6'da TRPL::eGFP eksprese eden dişilere geçti. Homozig mutant Flp / FRT kaynaklı mozaik gözlerle ortaya çıkan F1 jenerasyonu, karanlık adaptasyon (sol sütun) ve ışık adaptasyonu (sağ sütun) döneminden sonra floresan derin psödopupiller (DPP) görüntülenerek TRPL translokasyonundaki kusurlar açısından tarandı. (A,B) Mutasyona uğramamış sinekler, düzenli ışık kaynaklı TRPL translokasyonu için kontrol olarak taşındı. Floresan olmayan DPP bir okla gösterilir. (C,D) Işık tarafından tetiklenen TRPL translokasyonunda kusurlu izole mutantların örnek bir sonucu. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu genetik ekrandan izole edilen TRPL translokasyon kusurlu (ttd) mutantlar daha sonra tanımlanmış ve defektleri suya daldırma görüntülemesi yardımıyla daha ayrıntılı olarak karakterize edilmiştir. Su daldırma mikroskobu, rabdomerlerde ve hücre cisimlerinde proteinlerin lokalizasyonunu değerlendirmek veya Protokolde belirtildiği gibi fotoreseptör dejenerasyonuna bağlı rabdomeral yapıdaki kusurları kantitatif olarak izlemek için uygulanmıştır. Şekil 12A,B, karanlıkta, ışıkta ve ikinci bir karanlık adaptasyondan sonra mutant olmayan ve lolattd12 mutant mozaik gözlü sineklerin rabdomerlerinde bulunan TRPL::eGFP miktarının niceliğini göstermektedir. Kontrol altındaki (mutant olmayan) sineklerde, TRPL::eGFP, 16 saatlik aydınlatmadan sonra rabdomerlerden hücre gövdesine geçer ve rabdomeral TRPL::eGFP'nin karanlığa adapte olmuş duruma kıyasla yaklaşık% 45'e düşmesine neden olur. İkinci karanlık inkübasyon, rabdomeral floresanı tekrar başlangıç değerinin% 95'ine yükseltir. Lolattd12 mutantı TRPL translokasyon defekti nedeniyle DPP taraması ile izole edildi. Buna göre, rabdomeerlerin suya daldırma görüntülerindeki TRPL::eGFP floresan paterni, 16 saatlik aydınlatma ve ardından 24 saat boyunca karanlık adaptasyondan sonra büyük ölçüde değişmiyor gibi görünmektedir. Bununla birlikte, görüntüler aynı zamanda lola ttd12 mutantlarının gelişimsel olarak kusurlu olduğunu ortaya koymaktadır, bu da diğer lola mutantları16 için daha önce tarif edildiği gibi fotoreseptör hücrelerinin ara sıra yokluğu ile kanıtlanmıştır. Bu morfolojik kusurlar, geçerli bir arka plan sinyalinin ölçülememesine neden olur ve formül (1) kullanılarak doğru bir nicelemeyi önler. Buna karşılık, vps35MH20, ommatidial morfolojiyi etkilemeden bir TRPL translokasyon defekti gösteren bir mutanttır10. Bu mutantta, burada açıklanan niceleme yöntemi, istatistiksel olarak oldukça anlamlı bir geri dönüşüm kusurunu tespit edebilir (Şekil 12C, D).

Figure 12
Şekil 12: Lola ve vps35 mutant sineklerde TRPL yer değiştirme kusurunun temsili sonuçları ve niceleme yönteminin sınırları. (A) TRPL::eGFP eksprese eden mutant olmayan ve lolattd12 mutant mozaik gözlü sinekler karanlıkta 3 gün boyunca kuluçkaya yatırıldı, 16 saat boyunca turuncu ışıkla aydınlatıldı ve ikinci kez 24 saat boyunca karanlığa adapte edildi. Floresan rabdomerlerin görüntüleri, adım 3.2.6'da açıklandığı gibi hücre altı TRPL::eGFP lokalizasyonunu kaydetmek için suya daldırma mikroskobu yoluyla alınmıştır. (B) Adım 3.3.9'da açıklandığı gibi (1) formül kullanılarak mutant olmayan (gri) ve lolattd12 mutant (yeşil) hayvanların rabdomeral floresansının miktarı. Hata çubukları SEM. (C) TRPL::eGFP eksprese eden mutant olmayan ve vps35MH20 mutant mozaik gözlü sinekler karanlıkta 3 gün boyunca kuluçkaya yatırılmış, 16 saat boyunca turuncu ışıkla aydınlatılmış ve ikinci kez 24 saat boyunca karanlığa adapte edilmiştir. Floresan rabdomerlerin görüntüleri, adım 3.2.6'da açıklandığı gibi hücre altı TRPL::eGFP lokalizasyonunu kaydetmek için suya daldırma mikroskobu yoluyla alınmıştır. (D) Adım 3.3.9'da açıklandığı gibi (1) formül kullanılarak mutant olmayan (gri) ve vps35MH20 mutant (kırmızı) hayvanların rabdomeral floresansının miktarı. İstatistiksel anlamlılık, ANOVA sonrası Bonferroni düzeltmesi ile çoklu karşılaştırmalar olarak hesaplanmıştır (ns, anlamlı değil; *, p ≤ 0.05; ***, p ≤ 0.001). Ölçek çubuğu: 10 μm. C ve D panelleri referans10'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokolde daha önce de belirtildiği gibi, göz pigmentasyonu ortaya çıkan suya daldırma görüntüsünü önemli ölçüde etkiler. Beyaz gözlü sinekler, hem rabdomere hem de hücre gövdesinden gelen floresan sinyallerinin algılanmasına izin verir, böylece TRPL:: eGFP dağılım oranının oldukça hassas bir şekilde belirlenmesini sağlar. Buna karşılık, kırmızı gözlü sineklerde TRPL::eGFP sinyali sadece rabdomerlerde tespit edilebilir, ancak hücre cisimlerinde tespit edilemez (Şekil 13A). Bunun nedeni, TRPL::eGFP'den yayılan ışığı emen pigment molekülleridir. Bununla birlikte, pigmentli gözler için formül (2) kullanarak, niceliklendirme, beyaz ve kırmızı gözlü sineklerde TRPL::eGFP translokasyon davranışını güzel bir şekilde ortaya koymaktadır. Buna göre, rabdomere floresansının karşılık gelen değerleri, karanlık adapte olmuş durumda% 100'den, aydınlatmadan sonra% 25 ve% 5'e düşer ve ikinci bir karanlık inkübasyonun bir sonucu olarak tekrar% 80 ve% 90'a yükselir (Şekil 13B).

Figure 13
Şekil 13: Beyaz ve kırmızı gözlü sineklerde TRPL::eGFP floresansının temsili sonuçları. (A) TRPL::eGFP eksprese eden beyaz ve kırmızı gözlü sinekler karanlıkta 1 gün boyunca inkübe edildi, 16 saat boyunca turuncu ışıkla aydınlatıldı ve ikinci kez 24 saat boyunca karanlığa adapte edildi. Floresan rabdomerlerin görüntüleri, 3.2.6 (beyaz gözlü sinekler) ve 3.2.8 (kırmızı gözlü sinekler) adımlarında açıklandığı gibi hücre altı TRPL::eGFP lokalizasyonunu kaydetmek için ölümcül olmayan su damlası mikroskobu yoluyla alınmıştır. (B) Beyaz gözlü (gri) ve kırmızı gözlü (kırmızı) sineklerde rabdomeral floresanın miktarı. Beyaz gözlü sinekler, adım 3.3.9'da açıklandığı gibi, formül (1) ve kırmızı gözlü sinekler, formül (2) kullanılarak ölçülmüştür. Hata çubukları SEM'i temsil eder. ölçek çubuğu: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Fotoreseptör dejenerasyonunu değerlendirmek için, rabdomerlerdeki TRP::eGFP'nin floresansına dayanan bir dejenerasyon indeksi belirlenebilir (bkz. Bu niceleme yöntemi Şekil 10'da gösterilmiştir. Buradaki temsili sonuçlarda, mutant olmayan ve sdhAttd11 mutant mozaik gözlü sinekler 2 hafta boyunca 12 saat ışık / 12 saat karanlık döngüde tutulmuş ve su daldırma mikroskobu kullanılarak TRP::eGFP gözlenerek her 2-4 günde bir rabdomerlerin bütünlüğü araştırılmıştır (Şekil 14A). Ortaya çıkan eğri, mutanttaki dejenerasyon indeksinin azaldığını gösterir, ancak kontrol sineklerinde değildir (Şekil 14B).

Figure 14
Şekil 14: SdhA mutant sineklerde ışığa bağlı retinal dejenerasyonun temsili sonuçları. (A) TRP::eGFP eksprese eden mutant olmayan ve sdhAttd11 mutant mozaik gözlü sinekler, 25 °C'de 12 saat ışık / 12 saat karanlık döngüde 14 gün boyunca inkübe edildi. Floresan rabdomerlerin görüntüleri, retina sağlığını kaydetmek için düzenli zaman aralıklarında suya daldırma mikroskobu ile alındı. (B) Adım 3.4'te açıklandığı gibi vahşi tip (gri) ve sdhAttd11 mutant (turuncu) sineklerin rabdomeral floresansının miktarı. Hata çubukları SEM'i temsil eder. ölçek çubuğu: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Floresan proteinlerinin uygulanabilirliği, DPP görüntüleme ve retinal su daldırma mikroskobu ile taramanın basitliği birçok grup tarafından başarılı olduğu kanıtlanmıştır12. Burada sunulanlara benzer stratejiler, Rh1::eGFP 17,18,19,20,21 yardımıyla rodopsin ekspresyon seviyeleri, homeostaz, retinal organizasyon veya hücresel bütünlükteki kusurları tespit etmek için çeşitli genetik ekranlarda kullanılmıştır. Yukarıda açıklandığı gibi, TRPL::eGFP gibi füzyon proteinlerinin yer değiştirmesi, örneğin mutagenez ekranlarında, rabdomerden ve rabdomere'ye protein kaçakçılığı işlemlerinin bozulup bozulmadığını tespit etmek için kullanılabilir. Öte yandan, TRP::eGFP gibi kalıcı rabdomeral füzyon proteinleri, rabdomere morfolojisini araştırmak için kullanılabilir. DPP ve suya daldırma mikroskopisi, Drosophila göz modelinde yüksek verimli analizler ve ekranlar için mükemmel yöntemler olarak kabul edilir. Bununla birlikte, DPP veya suya daldırma mikroskobu ile elde edilen sonuçları doğrulamak için izole ommatidia veya kriyoseksiyonlu retina dokusunun nihai olarak (immüno) histokimyasal analizlerinin yapılması önerilir. Yüksek çözünürlüklü floresan mikroskopi ile eşleştirilen bu teknikler, hassas hücre altı lokalizasyonlara yönelik yorumlara izin verir. Aşağıda, DPP ve retinal suya daldırma mikroskobunun görüntüleme süreçlerinin nasıl giderileceğine dair doğru kantitatif analizler için özellikle önemli olan birkaç kılavuz sunulmaktadır.

DPP ile ilgili olarak, floresanın üst üste binmesi bulanık veya belirsizse, ayarlar doğru olmayabilir. Bir olasılık, gözün hedefe tam olarak radyal olarak bakmaması veya odağın gözün periferik bölgelerine ayarlanmış olmasıdır. Fotoreseptör hücrelerin ommatidiyal düzeni, dorsoventral orta hatta ayna simetrisi gösterdiğinden, sinyaller gözün her iki yarım küresinden algılanırsa, DPP'de alışılmadık bir desen görülebilir. DPP'nin kalitesi aynı zamanda bileşik göz boyunca optik bir bölüm oluşturmak için sığ bir alan derinliğine de dayanır. Flypad'in yüzeyi otofloresan gösteriyorsa, sinek, flypad'in üstündeki küçük bir siyah floresan olmayan karton parçası üzerine yerleştirilebilir. Bir DPP'nin kaydedilememesi, optimal olmayan sinek konumlandırması, floresan proteininin düşük ekspresyon seviyeleri, düzensiz bir retinal mimari veya dejeneratif süreçler dahil olmak üzere çeşitli altta yatan nedenlere bağlı olabilir. DPP'yi görüntülerken, beyaz gözlü sineklerde sitoplazmik floresansın, sinyalin sınırlarını rabdomerlerden yayabileceği ve proteinin ekspresyon seviyelerinin bireyler arasında önemli ölçüde değişebileceği ve ortaya çıkan DPP'nin kalitesini etkileyebileceği de belirtilmelidir. Bu nedenle, floresan DPP görüntüleme durumunda, pigmentli gözlü sineklerin kullanılması avantajlıdır. Hücre gövdelerinden floresan sinyallerinin emilimi nedeniyle, ortaya çıkan DPP beyaz gözlü sineklerden daha keskin görünebilir.

Suya daldırma mikroskobunda bulanık görüntüleri önlemek için, sineğin yeniden uyanmasını ve hareketlerini önlemek için sinek hazırlığından sonra görüntü alımının hızlı bir şekilde yapılması gerekir. Yüksek kaliteli görüntüler için, beyaz gözlü sinekler kullanılıyorsa, gözden gelen en parlak floresan sinyallerinin neredeyse tüm görüntülerde doygunluğa ulaşması gerekir. Bu, görüntüleme sırasında maruz kalma süresini ayarlayarak elde edilebilir. Pigmentasyon, sitozolik eGFP floresansının saptanmasını engellediğinden, beyaz gözlü sineklerin maruz kalma süresini ayarlaması için tarif edilen yaklaşım, pigmentli gözlerde her zaman güçlü rabdomeral floresan sinyalleri ile sonuçlanacak ve sonraki yorumlama ve nicelemeyi bozacaktır. Ek olarak, pigmentli gözler kullanılarak, mavi ışığa güçlü bir şekilde maruz kalma nedeniyle fotobeyazlatma, daha zayıf sinyallere ve dolayısıyla verilerin yanlış yorumlanmasına neden olabilir. İçeriğe bağlı olarak (yani, ölümcül veya ölümcül olmayan), pigmentli gözler için protokolde iki alternatif prosedür sunulmaktadır. Genel olarak, ölümcül olmayan varyasyon pigmentli gözlerle tercih edilmelidir, çünkü aynı sinek tekrar tekrar ölçülebilir ve her bir sinek için belirli bir maruz kalma süresinin değerlendirilmesi, bir numuneden üretilen ortalama maruz kalma süresinin belirlenmesinden daha kesin nicelemeler ve daha yüksek tekrarlanabilirlik ile sonuçlanır. Bununla birlikte, ölümcül olmayan varyasyon, tekrarlanan ölçümler sırasında hayatta kalmalarını sağlamak için hayvanların taşınmasında daha fazla özen gerektirir. Bu, sinekleri pipet ucuna taşımak için yalnızca düşük basınçlı hava kullanılarak ve görüntülemeden sonra sineği pipet ucundan serbest bırakmak için cımbız dikkatli bir şekilde kullanılarak sağlanabilir. Sinekler işlem sırasında buzla soğutulmuş suya batırılmadığından, yeniden uyanma riski artar. Tek tek örneklerden tekrarlanan ölçümlerin bir sonucu olarak, tüm ölçüm serisi yalnızca sinek baştan sona zarar görmeden kalırsa geçerlidir. Sonuç olarak, ölümcül olmayan varyasyon çok emek yoğun ve zaman alıcıdır. Öte yandan, ölümcül varyasyon, daha yüksek bir verime izin verir, çünkü birden fazla sinek aynı böcek pimine art arda sabitlenebilir ve bir görüntü elde etme turunda sırayla kaydedilebilir. Bununla birlikte, aynı pimdeki birden fazla sinek, yeniden uyanmayı ve hareketleri önlemek için daha hızlı görüntüleme gerektirir. Ölümcül varyasyonun son bir dezavantajı, sonraki uygulamalar için görüntülemeden sonra hayvanların kurtarılamamasıdır (örneğin, haçlar, tekrarlanan ölçümler).

Translokasyonun nicelleştirilmesi ile ilgili olarak, bu Protokol, rabdomerden ve hücre gövdesinden gelen floresan sinyallerini dikkate alan ve böylece hücre içindeki yer değiştiren proteinin göreceli dağılımı için çok iyi bir tahmin üreten formül (1) sunar (Şekil 12D). Pigmentli gözlerde hücre gövdesinden floresan ölçümlerinin olmaması nedeniyle, sık karşılaşılan bu sorun için iyi çalışan formül (2) sunulmaktadır (Şekil 13B). Göz pigmentasyonunun yanı sıra, bu formüllerden herhangi biriyle nicelleştirmeyi engelleyen başka durumlar da vardır. Bu örneklerden biri Şekil 12A,B'de lolattd12 mutantı şeklinde sunulmuştur. Bu mutantta, özellikle, fotoreseptör hücre R7'nin yokluğu, ommatidial morfolojiyi ve dolayısıyla bu bölgeden arka plan floresansının makul yoğunluk ölçümlerini elde etme yeteneğini önemli ölçüde etkiler. Bu sorunlara rağmen aynı translokasyon niceleme yöntemi kullanılıyorsa, sonuçlar yüksek miktarda varyans gösterir, denetimlerle karşılaştırılması zordur ve potansiyel olarak yanlış yorumlanabilir. Lolattd12 mutantının örneği, doğru yoğunluk ölçümleri için kaçınılmaz olarak "vahşi tip" benzeri bir morfolojiye dayanan bu niceleme yönteminin sınırlarını göstermektedir. Morfolojik olarak kusurlu ommatidiada protein translokasyon defektlerinin ölçülmesi gereken nadir durumlarda, burada sunulan Protokol başarısız olur ve buna göre uyarlanması gerekir. Bu, makul bir şekilde elde edilemeyen ölçümleri hariç tutmak veya diğer temsili bölgelerin ek ölçümlerini dahil etmek için formülde uygun değişiklikleri içerir.

Dejeneratif işlemlerin nicelleştirilmesi durumunda, floresan yoğunluk eşiklerinin iyi bir gösterge olmadığı ortaya çıktı, çünkü rabdomerlerin içinde ve arasında çok fazla varyans var. Bu varyans, translokasyonu ölçme yönteminde ölçülen 18 rabdomerin tümü üzerinde ortalamasını alır. Bununla birlikte, dejenerasyonun değerlendirilmesinde her rabdomerin bireysel olarak değerlendirilmesi nedeniyle, floresan yoğunluklarındaki varyansın ortalaması alınamaz. Ayrıca, yoğunluk dikkate alınması gereken özelliklerden sadece bir tanesidir. Diğer önemli hususlar kontrast ve kenarların keskinliğidir. Sonuç olarak, bu protokol, rabdomerlerin morfolojisini gözle floresanlarına göre kategorize etmeye dayanan bir niceleme yöntemi sunmaktadır. Bu mutlaka bir dereceye kadar özneldir. Bununla birlikte, yeterli deneyim göz önüne alındığında, bu protokol dejenerasyon için yararlı, hızlı ve tekrarlanabilir bir niceleme yöntemi olduğunu kanıtlamıştır (Şekil 14) ve22,10 kez yayınlanmıştır. Tüm öznel değerlendirmelerde olduğu gibi, bunları kör bir bağlamda gerçekleştirmeniz her zaman tavsiye edilir. Diğer gruplardan gelen protokoller genellikle Drosophila'da retinal dejenerasyonu (rabdomerlerin varlığı veya yokluğu) ölçmek için sadece iki kategori kullanır, bunlar daha az öznel olabilir, ancak aynı zamanda daha az kesin olabilir. Ek olarak, bu niceleme şekli hala iki kategori arasında nesnel olarak tanımlanması eşit derecede zor olabilecek bir kesme noktası tanımlama sorununa sahiptir.

Burada sunulan yöntemlerin modifikasyonları ve ileri uygulamaları ile ilgili olarak, iki floresan füzyon proteininin nispi miktarını aynı anda çift renkli görüntüleme ile değerlendirmek de mümkündür. Örneğin, TRPL::HcRed ve TRP::eGFP kullanılarak, TRPL::HcRed translokasyonu aynı sinek23'teki rabdomeral bütünlük göz önünde bulundurularak değerlendirilmiştir. Çift renkli görüntüleme ayrıca Domates / GFP-FLP / FRT yönteminde, örneğin apoptozu indükleyen faktörleri tanımlamak için kullanılır24. Bu varyasyon, ninaC::tdDomates tarafından işaretlenmiş floresan etiketli hücre klonlarında fotoreseptör hücrelerin ninaC::eGFP yoluyla dejenerasyonunu görselleştirmeyi mümkün kılar. Su daldırma mikroskobunun bir başka uygulaması, fotoreseptörlerde fosfoinositid döngüsünün izlenmesidir. Bu amaçla, PLCδ1'den plekstrin homolojisi (PH) alanı gibi floresan etiketli fosfoinositid bağlayıcı alanlar kullanılır. Bu floresan problar, probun rabdomere'den sitosol 25,26'ya difüzyonundan kaynaklanan rabdomeral floresan azalmasını tespit ederek zaman içinde fosfoinositid bozunumunun izlenmesini sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Yıllar boyunca öğrenci araştırmacılarımıza teşekkür ederiz. Özellikle, verileri bu protokolde temsili sonuçlar olarak kullanılan Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim ve Laura Jaggy. Burada sunulan grubumuzun araştırması, Deutsche Forschungsgemeinschaft'tan (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) Armin Huber'e yapılan hibelerle finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Greiner Bio-One 188271
CO2 anaesthesia fly pad Flystuff 59-172
Cold light lamp (KL 1500 LCD) Zeiss
Fiji/ImageJ NIH
Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition) Zeiss
Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13)
[1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2]
and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2]		 Osram 4050300518039
Laboratory pipette (20-200 µL) Eppendorf
Object slide Roth 0656.1
Petri dish (94 mm) Greiner Bio-One 633102
Pipette tips (200 µL) Labsolute 7695844
Plasticine (Blu-Tack) Bostik 30811745
Stereo microscope (SMZ445) Nikon
Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12) Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration. Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).
  2. Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
  3. Hardie, R. C. The photoreceptor array of the dipteran retina. Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).
  4. Wang, T., Montell, C. Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).
  5. Xiong, B., Bellen, H. J. Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly. Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).
  6. Bähner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
  7. Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).
  8. Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade. Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).
  9. Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin. European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).
  10. Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum. Traffic. , (2021).
  11. Franceschini, N., Kirschfeld, K. Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila. Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).
  12. Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128 (6), 815-826 (2001).
  13. Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).
  14. Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2005).
  15. Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL. Fly. 2 (1), 36-46 (2008).
  16. Zheng, L., Carthew, R. W. Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye. Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).
  17. Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).
  18. Huang, Y., Xie, J., Wang, T. A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila. PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).
  19. Zhao, H., Wang, J., Wang, T. The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).
  20. Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
  21. Zhao, H., Wang, T. PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila. PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).
  22. Cerny, A. C., et al. The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells. PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).
  23. Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2007).
  24. Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).
  25. Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
  26. Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).

Tags

Biyoloji Sayı 179
eGFP Etiketli Proteinler Kullanarak <em>Drosophila</em> Fotoreseptör Hücrelerinde Membran Protein Kaçakçılığının İncelenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger,… More

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins. J. Vis. Exp. (179), e63375, doi:10.3791/63375 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter