Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Studere membranproteinhandel i Drosophila Fotoreseptorceller ved hjelp av eGFP-taggede proteiner

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63375
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biology, Department of Biochemistry, University of Hohenheim

Summary

Her er ikke-invasive metoder beskrevet for lokalisering av fotoreseptormembranproteiner og vurdering av retinal degenerasjon i Drosophila sammensatt øye ved hjelp av eGFP fluorescens.

Abstract

Membranproteinhandel regulerer inkorporering og fjerning av reseptorer og ionkanaler i plasmamembranen. Denne prosessen er fundamentalt viktig for cellefunksjon og celleintegritet av nevroner. Drosophila fotoreseptorceller har blitt en modell for å studere membranproteinhandel. Foruten rhodopsin, som ved belysning blir internalisert fra fotoreseptormembranen og er degradert, viser den forbigående reseptorpotensiallignende (TRPL) ionkanalen i Drosophila en lysavhengig translokasjon mellom rhabdomeral fotoreseptormembran (hvor den ligger i mørket) og fotoreseptorcellekroppen (som den transporteres til ved belysning). Denne intracellulære transporten av TRPL kan studeres på en enkel og ikke-invasiv måte ved å uttrykke eGFP-merket TRPL i fotoreseptorceller. EGFP-fluorescensen kan deretter observeres enten i den dype pseudopupilen eller ved vanninnlevelsesmikroskopi. Disse metodene tillater deteksjon av fluorescens i det intakte øyet og er derfor nyttige for høygjennomstrømningsanalyser og genetiske skjermer for Drosophila-mutanter som er defekte i TRPL-translokasjon. Her forklares forberedelsen av fluer, mikroskopiske teknikker, samt kvantifiseringsmetoder som brukes til å studere denne lysutløste translokasjonen av TRPL i detalj. Disse metodene kan også brukes til menneskehandelstudier på andre Drosophila fotoreseptorproteiner, for eksempel rhodopsin. I tillegg, ved å bruke eGFP-merkede rabdomerale proteiner, kan disse metodene brukes til å vurdere degenerasjon av fotoreseptorceller.

Introduction

Ved å levere og fjerne proteiner til og fra plasmamembranen kontrollerer membranproteinhandel i nevroner plasmamembranutstyret med reseptorer samt ionkanaler og regulerer derfor nevronfunksjonen. Feilregulering eller defekter i proteinhandel har vanligvis skadelige effekter på celler og resulterer i nevronal degenerasjon. Hos mennesker kan dette forårsake nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers og Parkinsons sykdom eller Retinitis pigmentosa1. Fotoreseptorer i det sammensatte øyet til Drosophila melanogaster har blitt et in vivo-modellsystem for å studere membranproteinhandel2. Dette skyldes ikke bare den genetiske allsidigheten til Drosophila som tillater effektive genetiske skjermer, men også fordi alle viktige komponenter i den lysabsorberende fotoreseptormembranen er preget i detalj og effektive mikroskopiske teknikker er tilgjengelige som kan brukes på flueøyet. Disse teknikkene er fokus i denne artikkelen.

I Drosophila fotoreseptorceller danner den apikale plasmamembranen en tettpakket stabel med mikrovilli langs den ene siden av cellen, kalt rhabdomere. Rhabdomeres av fotoreseptorceller R1-6 er ordnet i et karakteristisk trapesformet mønster mens fotoreseptorceller R7 og R8 danner en enkelt rhabdomere i midten av denne trapesformet3. Membranproteinhandel er nødvendig for en regulert omsetning av rhabdomerale membranproteiner som rhodopsin og den lysaktiverte TRP (forbigående reseptorpotensial) og TRPL (TRP-lignende) ionkanaler for å sikre riktig mengde av disse fototransduksjonsproteinene i rhabdomere. Fotoreseptormembranproteiner syntetiseres i det endoplasmatiske retikulumet og transporteres via Golgi-apparatet til rhabdomere. Etter aktivering av rhodopsin ved lys, kan et rhodopsinmolekyl enten inaktiveres ved absorpsjon av en annen foton eller kan fjernes fra rhabdomere ved klarrinmediert endokytose. Endocytosed rhodopsin blir enten degradert i lysosomet eller resirkuleres tilbake til rhabdomere 4,5. Ionkanalen TRPL er også internalisert etter aktivering av fototransduksjonskaskaden og gjennomgår en lysavhengig translokasjon mellom rhabdomere (hvor den ligger når fluer holdes i mørket) og et ER-beriket oppbevaringsrom i cellekroppen (som den transporteres innen flere timer etter belysning) 6,7,8,9,10 . I motsetning til endokytosed rhodopsin, blir bare små mengder TRPL degradert via den endolysosomale banen, og flertallet lagres intracellulært i stedet og resirkuleres tilbake til rhabdomere ved mørk tilpasning6. TRPL kan dermed brukes til å analysere lysutløst smugling av plasmamembranproteiner. Drosophila fotoreseptorceller brukes også til å studere nevronal degenerasjon. Photoreceptor celle degenerasjon bestemmes ofte ved å vurdere strukturen av rabdomerer, som oppløses som følge av degenerative prosesser5.

For å studere subcellulær lokalisering av TRPL og rhodopsin i fotoreseptorceller eller fotoreseptorcelledegenerering, er det brukt to fluorescensmikroskopimetoder som varierer med hensyn til analysehastighet og oppløsning her. En veldig rask, ikke-invasiv metode som kan brukes til genetiske skjermer, men med en begrenset romlig oppløsning er påvisning av fluorescens i det dype pseudopupilet (DPP). DPP er et optisk fenomen av leddyr sammensatte øyne hvis geometriske opprinnelse har blitt forklart i detalj av Franceschini og Kirschfeld i 197111. Kort sagt, på flere optiske plan under netthinnen overlegg-bilder av rhabdomeres fra tilstøtende ommatidia kan observeres. På et fokalplan gjennom midten av øyets krumning danner disse overliggende projeksjonene et bilde som ligner den trapesformede utformingen av rhabdomeres i et enkelt ommatidium bare størrelsesorden større. Dette fenomenet kan også observeres uavhengig av eksogent uttrykk for fluorescensproteiner (f.eks. TRPL::eGFP8), noe som likevel gjør DPP enklere å oppdage (figur 1A-A')12. En annen ikke-invasiv metode er vanninnlevelsesmikroskopi som er avhengig av avbildning av fluorescerende merkede proteiner etter optisk nøytralisering av øynenes dioptriske apparat med vann (figur 1B-C')12. Ved hjelp av vann nedsenkningsmetoden kan den relative mengden TRPL::eGFP i rhabdomeres eller cellekropp vurderes kvantitativt for individuelle fotoreseptorceller. Videre kan ikke-translokerende fluorescensmerkede proteiner brukes til å evaluere rabdomeral integritet og for å bestemme tidsforløpet for en potensiell degenerasjon på en kvantitativ måte, som beskrevet her.

Mens opptak av DPP er den desidert enkleste og raskeste av disse metodene å utføre, er den romlige oppløsningen av data de genererer begrenset. I tillegg er det mange grunner til at en DPP kan være fraværende, som ikke nødvendigvis er merkbar av DPP-bildebehandling selv. Siden DPP representerer en oppsummering av flere ommatidia, går informasjon om individuelle celler tapt. Dermed tjener lavoppløselig DPP-avbildning en viktig funksjon i screening av et stort antall fluer, men bør generelt følges av opptak med høyere oppløsning ved hjelp av vanninnlevelsesmikroskopi. Vann nedsenkningsmikrografer tillater tolkninger om individuelle celler, utviklingsfeil, øyemorfologi, proteinfeillokalisering eller retinal degenerasjon samt kvantifisering av disse effektene. Denne protokollen beskriver disse to teknikkene i detalj.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over mikroskopivariasjoner for Drosophila-øyet presentert i denne protokollen. Skjematiske representasjoner og eksemplariske mikrografer av (A-A'') fluorescerende dyp pseudopupil (DPP) avbildning, (B-B'') dødelig vanninnlevelsesmikroskopi av fluorescerende rabdomerer, og (C-C'') ikke-dødelige vanndråpemikroskopi av fluorescerende rhabdomere. Skalastang (A''): 100 μm. Skalastolper (B''-C''): 10 μm. Tallet er endret fra referanse13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generelle hensyn

  1. Bruk Drosophila-lagre som uttrykker et permanent rabdomeralt plassert fluorescensprotein for morfologisk analyse (f.eks. TRP::eGFP, eGFP::NINAC) og translokasjon av proteiner for analyser om proteinhandel (f.eks.
  2. Predetermine lyseksponeringsforhold for utvalgte fluer for eksperimentell tilnærming.
    1. For mørk tilpasning, hold fluene i mørke bokser i ønsket periode ved 25 °C. For belysning opptil 16 timer i translokasjonseksperimenter (f.eks. TRPL::eGFP som uttrykker fluer), hold fluer under et fluorescerende rør ved romtemperatur.
    2. I eksperimenter som vurderer fotoreseptordegenerasjon (f.eks. TRP::eGFP som uttrykker fluer), hold fluene under et fluorescerende rør ved 25 °C i et 12 t lys / 12 timers mørk syklus for langvarig belysning på opptil 28 dager med hvitt lys.
    3. For å belyse fluer med farget lys, bruk forskjellige fargede gjennomsiktige plastbokser sammen med fluorescerende rør.
  3. Hvis flylagrer med pigmenterte øyne brukes, aldersdyr nettopp for komparativ analyse, siden øyepigmentering kan øke betydelig med alderen.
    MERK: For datatolkning er det viktig å merke seg at det finnes en signalbias på grunn av den optiske waveguiding-effekten av rhabdomeralstrukturen. Følgelig vil fluorescenssignalet fra rhabdomere alltid bli forsterket til en viss grad i DPP-avbildning og vanninnlevelsesmikroskopi i forhold til signaler hentet fra cellekroppen. Dette er mest fremtredende observert i pigmenterte øyne, hvor fluorescens fra utsiden av rhabdomeres absorberes av disse pigmentene og er spesielt viktig når intracellulært translokasjon av fusjonsproteiner skal oppdages. Når det gjelder kritiske skritt, vurderer denne studien derfor hvite og rødøyde fluer separat.
  4. Når det gjelder mikroskopi av vann nedsenking, beskrives to variasjoner. En raskere dødelig variasjon samt en ikke-dødelig variasjon som tillater utvinning for etterfølgende studier.

2. DPP-avbildning

  1. Klargjør arbeidsområdet med nødvendig utstyr og reagenser som vist i figur 2. Bedøve fluer (1-3 dager gammel) av en genotype som uttrykker et fluorescensprotein i fotoreseptorceller med CO2 på en flypad. Velg dyr for avbildning under et stereomikroskop med en konvensjonell lyskilde og lav forstørrelse (f.eks. 10x).

Figure 2
Figur 2: Arbeidsområdet DPP-avbildning. Nødvendige materialer er (A) CO2 anestesiapparat, (B) stereomikroskop med UV-lampe og fluorescensfiltersett, (C) lyskilde, (D) mikroskopmontert kamera med (E) programvare, (F) pensel, (G) svart papp og (H) fly hetteglass. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. For DPP-avbildning må du holde de valgte fluene bedøvet og plassere en av dem i midten av mikroskopmålet på siden, slik at enten venstre eller høyre øye vender mot målet nøyaktig radialt (figur 3A).
    MERK: Siden ommatidial layout av fotoreseptorceller viser speilsymmetri ved dorsoventral midtlinje, observeres DPP best litt over eller under øyets ekvator (figur 3B).

Figure 3
Figur 3: Plassering av fluen under stereomikroskopet for DPP-avbildning. (A) Illustrasjon av fluen på siden med ett øye vendt mot mikroskopets målradialt. (B) Flyhodet må dreies litt opp eller ned slik at målet fokuserer på et punkt litt over eller under øyets ekvator som angitt av de røde pilene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Øk forstørrelsen slik at den passer til hele øyet (f.eks. 100x) og midtstill øyets sentrale ommatidi. Reduser dybden på mikroskopet, for eksempel ved å justere dobbel-iris-membranen til en grunn innstilling (figur 4A-B').
  2. Slå av den konvensjonelle lyskilden og slå på UV-lampen på mikroskopet med maksimal intensitet og velg mikroskopets fluorescensfiltersett i henhold til fluorescensproteinet uttrykt i øynene (figur 4C-E). Still lysbanen mot det mikroskopmonterte kameraet.
  3. Bruk funksjonen for levende bildebehandling i programvaren til å justere lysstyrken i bildet til en innstilling som bare oppdager bestemte signaler fra øyet ved å justere eksponeringstiden og forsterkningsverdien (for eksempel 80 ms og 12x). Juster mikroskopfokuset "inn" i øyet (under hornhinnen) for å generere det overliggende bildet av DPP (figur 4C-E").).

Figure 4
Figur 4: Illustrasjon av DPP og fluorescerende DPP-avbildning. Eksemplariske bilder av Drosophila-øyne under konvensjonell og UV-belysning med GFP-filtersett, tatt med varierende fokusplan illustrert i skjematiske tverrsnitt gjennom øyet. (A) Mikrograf registrert med lyse innstillinger av en konvensjonell lyskilde, 30 ms eksponeringstid, 1x gevinst, dyp dybdeskarphet og fokusplan nær overflaten av hornhinnen som illustrert i (A'). (B) Mikrograf registrert med lyse innstillinger av en konvensjonell lyskilde, 30 ms eksponeringstid, 1x forsterkning, grunn dybdeskarphet og brennplan ca. 180 μm under overflaten av hornhinnen som illustrert i (B'). DPP angitt. (C-E) Mikrograf registrert med høyintensitetsinnstillinger av UV-lyskilde og GFP-filtersett, 80 ms eksponeringstid, 12x forsterkning, grunn dybdeskarphet og fokusplanet (C)nær, (D') litt under, eller (E') omtrent 180 μm under overflaten av hornhinnen. Fluorescerende DPP er indikert med en buet pil. Skalalinje 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Ta et øyeblikksbilde av den fluorescerende DPP. Sett mikroskopet tilbake til synlig lys og lysbanen tilbake mot okularet. Gjenopprett det avbildede dyret i et fluegenal for videre saksbehandling i henhold til DPP-fenotypen (f.eks. kryss). Fortsett med neste dyr i trinn 2.2.

3. Mikroskopi av vann nedsenking

  1. Klargjøring av fly
    1. Klargjør arbeidsområdet med nødvendig utstyr og reagenser som vist i figur 5. Overfør fluer med forhåndsbestemt alder og belysningsforhold til et forhåndskjølt 15 ml sentrifugerør og bedøvelse ved å inkubere dem på is i 15 til 30 minutter.
      MERK: Bær sammen 1 dag gamle, mørktilpassede fluer som referanse. Generelt bør mørktilpassede fluer overføres til en isboks med lokk i mørket. Lystilpassede fluer kan overføres til isen i romlys.

Figure 5
Figur 5: Mikroskopiarbeidsområde for vann nedsenking. Nødvendige materialer er: (A) 15 ml sentrifugerør, (B) isflak, (C) kjølt destillert vann, (D) stereomikroskop, (E) Petri-tallerken, (F) plasticine, (G) objektsklie, (H) insektpinner eller pipettespisser og skalpell, (I) fluorescensmikroskop med (J) programvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Velg riktig forberedelse fra de to som er beskrevet nedenfor (3.1.3 dødelig variasjon eller 3.1.7 ikke-dødelig variasjon), og når differensiering mellom pigmenterte og ikke-pigmenterte øyne er laget, følg de respektive trinnene.
  2. Forbered fluer for den dødelige variasjonen som følger.
  3. Fest et stykke plasticine på en objektsklie og et annet stykke inn i midten av en Petri-tallerken (f.eks. 94 mm Ø) og hold dem atskilt for nå. Fyll Petri-retten med iskjølt destillert vann og noen isflak (figur 6A).
  4. Legg en isbedøvelsesfly under et stereomikroskop på toppen av den plasticinebelagte gjenstandsskuffen. Snu fluen på ryggen og pierce en insektpinne gjennom midten av thoraxen (figur 6B). Fest pinnen horisontalt på den plasticinebelagte objektskuffen og orienter enten venstre eller høyre øye på fluen oppover (figur 6C).
  5. Fest forsiktig objektskuffen, med den plastinfrie siden vendt ned, i Petri-parabolen som forhindrer rotasjon av flyet. Pass på at flyøyet er dekket med vann (figur 6D). Bruk en tilberedningsnål til forsiktig å fjerne eventuelle luftbobler som kan ha dannet seg rundt øyet, og fortsett umiddelbart til bildeoppkjøp for best resultat.
    MERK: Betydelig forsinkelse i bildeanskaffelse resulterer i reawakening og bevegelser av fly som kan føre til uklare bilder.

Figure 6
Figur 6: Klargjøring av dødelig vann nedsenkingsmikroskopi. Illustrasjon av (A) plasticine-belagt objekt lysbilde og Petri parabolen, (B) pining en fly gjennom thorax på plasticine bakken, (C) fly orientering på plasticine-belagt objekt lysbilde, og (D) endelige eksperimentelle oppsett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Forbered fluer for den ikke-dødelige variasjonen som følger.
  2. Overfør en isbedøvelsesfly med hodet først inn i en 200 μL pipettespiss og skyv flyet forsiktig mot spissen med trykkluft.
  3. Klipp av pipettespissen rett foran hodet ved hjelp av en skalpell. Bruk pinsett, skyv forsiktig flyet noen få millimeter bort fra spissen. Klipp av pipettespissen igjen og skyv flyet tilbake mot spissen med trykkluft slik at bare flyets hode stikker ut fra pipettespissen.
  4. Fest et stykke plasticine på et objektsklie og trykk pipettespissen inn i den slik at enten venstre eller høyre øye på flyet vender oppover (figur 7A). Rett før bildeoppkjøp, bruk en laboratoriepipette for å feste en stor dråpe kjølt vann til undersiden av et vanninnlevelsesmål (figur 7B). Fortsett umiddelbart til bildeanskaffelse for best resultat.
    MERK: Betydelig forsinkelse i bildeanskaffelse resulterer i reawakening og bevegelser av fly som kan føre til uklare bilder.

Figure 7
Figur 7: Tilberedning av ikke-dødelig vanndråpemikroskopi. Illustrasjon av (A) en kaldbedøvelsesfly festet inne i en 200 μL pipettespiss montert på plasticine-belagt objektsklie og (B) anvendelsen av kjølt vann faller på undersiden av vanninnlevelsesmålet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Bildeanskaffelse
    1. Plasser Petri-retten forsiktig (trinn 3.1.3) eller gjenstandsskuffen (trinn 3.1.7) med den forberedte fluen på mikroskopstadiet og velg et vann nedsenkingsmål.
    2. Senk vanninnlevelsesmålet manuelt til det kommer i kontakt med vannoverflaten (trinn 3.1.3) eller fluens øye berører dråpen (trinn 3.1.7) (figur 8A,B).
    3. Slå på UV-lampen på mikroskopet og velg riktig filtersett. Bruk okularene til å plassere flyet under målet og fokuser mikroskopet på overflaten av øyet.
    4. Bytt lysbanen mot mikroskopkameraet og generer et levende bilde i den tilsvarende programvaren. Juster fokuset for kameraet og evaluer øyets retning, med tanke på at øyet må møte mikroskopmålet radialt som illustrert mer detaljert i figur 8C-E.

Figure 8
Figur 8: Plassering av fluen under fluorescensmikroskopet for vanninnlevelsesavbildning. Oppsett og endelig orientering for bildeanskaffelse ved hjelp av (A) dødelige eller (B) ikke-dødelige flyforberedelsesprotokoller. (C) Illustrasjon av flyretning for å oppnå best mulig resultat av mikroskopibilder av vann nedsenking. Det ideelle punktet å fokusere på øyet er ikke det nøyaktige senteret med hensyn til fremre / bakre og dorsale / ventrale akser, men er litt over øyets ekvator, som angitt av den røde pilen. (D) Eksempel på vanninnlevelsesbilde for et perfekt plassert øye. Alle tre symmetriaksene i den sekskantede ommatidiale flisleggingen vises som rette linjer, og maksimal mengde ommatidia kan være i fokus samtidig. (E) Eksempel på vanninnlevelsesbilde av et feil plassert øye. Bildet inneholder buede akser og en grunn dybdeskarphet. Skalalinje: 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Bruk riktig LUT (slå opp tabell) i bildebehandlingsprogramvaren for å oppdage overmetning (angitt som røde piksler).
  2. Når det gjelder ikke-pigmenterte fluer, juster eksponeringstiden slik at de lyseste pikslene er like under metningsgrensen for hvert bilde.
  3. Når det gjelder pigmenterte fluer og den dødelige variasjonen, juster eksponeringstiden slik at alle de lyseste pikslene er like under metningsgrensen i minst fem individuelle 1-dagers gamle, mørktilpassede fluer. Påfør beregnet gjennomsnittlig eksponeringstid på alle andre eksperimentelle forhold (genotyper, belysningsforhold, tidspunkter, etc.).
  4. Når det gjelder pigmenterte fluer (f.eks. rødøyde) og ikke-dødelige variasjoner, justerer du eksponeringstiden slik at alle de lyseste pikslene er like under metningsgrensen for hver 1-dagers gammel, mørktilpasset fly individuelt. Påfør denne eksponeringstiden på alle andre eksperimentelle forhold (belysningsforhold, tidspunkter, etc.) på denne fluen.
  5. Ta opp et bilde og lagre det som en rå fil for å arkivere alle tilsvarende metadata for innspillingen. Eksporter bildet i et .tif format for følgende kvantifisering.
    MERK: Når det gjelder den ikke-dødelige variasjonen, belys fluene i 5 minutter med rødt lys (f.eks. 630 nm) umiddelbart etter bildeinnhenting, hvis de er ment å brukes til ytterligere eksperimenter. Rødt lys deaktiverer fototransduksjonskaskaden som har blitt aktivert for mye av intenst kortvokst lys under bildeanskaffelse.

  1. Dataanalyse og kvantifisering av relativ eGFP-fluorescens i rhabdomeres av vanninnlevelsesmikrografer
    1. Last ned, installer og utfør programvaren ImageJ / Fiji.
    2. Juster ImageJ-innstillingene ved å klikke på Analyser > Angi målinger ... og merker bare av for Middelverdi grå verdi. Importer et .tif bilde ved å klikke på Fil > Åpne... eller ved å dra og slippe. Velg et representativt område i bildet som er i fokus, og forstørr det til 200%-300% ved å trykke Ctrl og + sammen gjentatte ganger .
    3. Velg ellipseverktøyet , og mens du trykker på Skift-tasten , genereres en sirkulær markering i bildet som er betydelig mindre enn én fluorescerende rhabdomere. Før du slipper museknappen, bør du se etter den nøyaktige størrelsen som vises under verktøylinjen i hovedvinduet i ImageJ. Bruk samme størrelse på sirkulært utvalg for alle analyser.
      MERK: Den nøyaktige størrelsen på den sirkulære markeringen i piksler eller mikron avhenger av det spesifikke oppsettet. Bruk en sirkel ca. 1/3 eller 1/4 av rhabdomeral diameter på 1 dag gamle, mørktilpassede kontrollfluer.
    4. Flytt det sirkulære merket område enten ved å museklikke inn i det og dra, eller ved å trykke piltastene på tastaturet.
    5. For å måle fluorescensintensitetene i det sirkulære utvalget, flytt sirkelen til den første rhabdomere (r1) og klikk på Analyser > Mål eller bruk snarveien Ctrl + M. Et resultatvindu som viser den målte grå verdien, vises.
    6. Fortsett med målinger av r2-r6 som gjentatte målinger og en måling av bakgrunnssignalet (b). Når det gjelder ikke-pigmenterte fluer, gjør du ytterligere målinger av de tilsvarende cellekroppsområdene (c1-c6) (figur 9).

Figure 9
Figur 9: Kvantifisering av relativ rabdomeral fluorescens for translokasjonsstudier. En illustrasjon om kvantifisering av relativ eGFP-fluorescens i rhabdomeres ved å måle fluorescensintensiteten til rhabdomere (r), cellekropp (c) og bakgrunn (b) av tre forskjellige representative ommatidia (hvite sirkler) i ett vanninnlevelsesmikroskopibilde; skala bar: 10 μm. Et forstørret ommatidium vises til høyre; skala bar: 2 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Gjenta trinn 3.3.5 og 3.3.6 for to ommatidia til, noe som resulterer i tre tekniske replikeringer. Merk den analyserte ommatidien ved hjelp av blyantverktøyet , og lagre dette bildet for dokumentasjon.
  2. Velg og kopier de målte grå verdiene fra Resultat-vinduet , og lim dem inn i regnearkprogramvaren for ytterligere beregninger. Sorter verdiene for fluorescensintensitet i henhold til opprinnelsen i kategoriene rhabdomere (r), cellekropp (c) og bakgrunn (b). Beregn gjennomsnittsintensiteten fra hver kategori (Ir, Ic, Ib).
  3. Beregn den relative mengden eGFP som finnes i rhabdomere (R), ved hjelp av følgende formel (1) for ikke-pigmentert og formel (2) for pigmenterte øyne:
    Equation 1(1)
    Equation 2(2)
  4. Fortsett med neste bilde i trinn 3.3.3. Det anbefales å bruke bilder fra minst fem personer i hver eksperimentell gruppe som biologiske replikerer for å få en pålitelig måling.
  1. Dataanalyse og kvantifisering av øyemorfologi ved eGFP-fluorescens i mikrografer for vanninnlevelse
    1. Last ned, installer og utfør ImageJ / Fiji-programvaren. Importer et .tif bilde ved å klikke på Fil > Åpne... eller ved å dra og slippe. Velg tre tilstøtende ommatidia i et representativt område av bildet som er i fokus.
    2. Evaluer de 18 rabdomere av utvalget individuelt i henhold til deres eGFP-intensitet, kantskarphet og kontrast med hensyn til det omkringliggende bakgrunnssignalet for å generere en degenerasjonsindeks. Skår godt synlige rhabdomeres med en verdi på 2, svakt synlige rabdomere med en verdi på 1, og fraværende rhabdomeres med en verdi på 0 (figur 10).
      MERK: Denne kvantifiseringsmåten resulterer i en poengsum på 36 for helt intakte øyne og en score på 0 for fullt degenererte øyne. Det anbefales å sette poengsummen på 36 til 100% på degenerasjonsindeksen.

Figure 10
Figur 10: Kvantifisering via rabdomerevaluering for degenerasjonsstudier. En illustrasjon om kvantifisering av øyemorfologi ved å skåre rhabdomeres av tre forskjellige representative ommatidia (hvite sirkler) i ett vann nedsenking mikroskopi bilde med verdier på 2 (tydelig synlig; blå sirkel), 1 (svakt synlig; oransje sirkel), eller 0 (fraværende; rød sirkel). Skala bar: 10 μm. Et forstørret ommatidium vises til høyre; skala bar: 2 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Åpne neste bilde og fortsett med trinn 3.4.2. Det anbefales å bruke bilder fra minst åtte personer i hver eksperimentell gruppe som biologiske replikerer for å få en pålitelig måling.
    MERK: Siden denne kvantifiseringsmetoden er mindre objektiv enn metoden for kvantifisering av translokasjon med fluorescensintensitet, er det anbefalte antallet replikeringer høyere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Transgene Drosophila-fluer som uttrykker et TRPL::eGFP-fusjonsprotein under kontroll av rhodopsin 1-promotoren, er generert. I disse fluene uttrykkes TRPL::eGFP i fotoreseptorceller R1-6 i det sammensatte øyet og viser en belysningsavhengig lokalisering. Når fluer holdes i mørket, er TRPL::eGFP innlemmet i ytre rhabdomeres. Etter belysning i flere timer translokaliserer TRPL inn i cellekroppen der den er lagret i et ER-beriket rom. 8,10 Når TRPL::eGFP er plassert i rhabdomeres, kan fluorescens observeres i DPP. Imidlertid forsvinner rabdomeral fluorescens i lyset som følge av translokasjon av TRPL::eGFP (figur 11A,B). Dette har blitt brukt til å utføre en genetisk skjerm for mutanter som er defekte i internaliseringen av TRPL::eGFP (Figur 11C,D)14,15. For å tillate isolering av potensielt homozygote dødelige mutasjoner, ble denne skjermen utført ved hjelp av gjær Flp / FRT-systemet for generering av somatiske cellekloner i det utviklende øyevevet (dvs. mosaikkøyne). Foruten enkelheten i DPP-analysen, er andre store fordeler med denne fluorescensdeteksjonsmetoden dens høye gjennomstrømning så vel som dens ikke-invasive karakter som tillater identifisering av mutasjoner i levende fluer og å bruke disse fluene til generering av stabile mutante fluelagre.

Figure 11
Figur 11: Representative resultater fra en genetisk skjerm på TRPL-translokasjonsfeil. Mannlige fluer ble mutagenisert med etylmetansulfat (EMS) og krysset til kvinner som uttrykte TRPL::eGFP i fotoreseptorceller R1-6. Den resulterende F1-generasjonen med homozygot mutant Flp/FRT-induserte mosaikkøyne ble screenet for defekter i TRPL-translokasjon ved å avbilde fluorescerende dype pseudopupiler (DPP) etter en periode med mørk tilpasning (venstre kolonne) samt lystilpasning (høyre kolonne). (A,B) Ikke-muterte fluer ble båret med som kontroll for vanlig lysindusert TRPL-translokasjon. Den ikke-fluorescerende DPP er indikert med en pil. (C,D) Et eksemplarisk resultat av isolerte mutanter som er defekte i lysutløst TRPL-translokasjon. Skalalinje: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

TRPL translokasjon defekte (ttd) mutanter som ble isolert fra denne genetiske skjermen har senere blitt identifisert og deres feil karakterisert mer detaljert ved hjelp av vann nedsenking bildebehandling. Vann nedsenking mikroskopi har blitt brukt til å vurdere lokalisering av proteiner i rhabdomeres og cellelegemer eller å spore feil i rhabdomeral struktur på grunn av fotoreseptor degenerasjon kvantitativt som skissert i protokollen. Figur 12A,B illustrerer kvantifisering av mengden TRPL::eGFP tilstede i rhabdomeres av fluer med ikke-mutant og lolattd12 mutant mosaikk øyne i mørket, i lys, og etter en andre mørk tilpasning. I kontroll (ikke-mutant) fluer, TRPL::eGFP translokaliserer ut av rhabdomeres inn i celle kroppen etter 16 h belysning resulterer i en reduksjon av rhabdomeral TRPL::eGFP til ca 45% sammenlignet med mørktilpasset tilstand. Den andre mørke inkubasjonen øker rhabdomeral fluorescens igjen til 95% av startverdien. Lolattd12 mutanten ble isolert av DPP-screening på grunn av TRPL-translokasjonsfeilen. Følgelig ser det ikke ut til at TRPL::eGFP-fluorescensmønsteret i vanninnlevelsesbilder av rabdomere endres like drastisk etter 16 timers belysning og påfølgende mørk tilpasning i 24 timer. Imidlertid avslører bildene også at lolattd12 mutanter er utviklingsmessig defekte, noe som fremgår av sporadisk fravær av fotoreseptorceller som beskrevet tidligere for andre lola mutanter16. Disse morfologiske feilene resulterer i manglende evne til å måle et gyldig bakgrunnssignal, noe som forhindrer riktig kvantifisering ved hjelp av formel (1). I motsetning er vps35MH20 en mutant som viser en TRPL-translokasjonsfeil uten å påvirke ommatidial morfologi på denne måten10. I denne mutanten kan kvantifiseringsmetoden som er beskrevet her, oppdage en statistisk svært signifikant resirkuleringsfeil (figur 12C,D).

Figure 12
Figur 12: Representative resultater av en TRPL-translokasjonsfeil i lola og vps35 mutantfluer og grenser for kvantifiseringsmetoden. (A) TRPL::eGFP-uttrykkende ikke-mutant og lolattd12 mutant mosaikkøyne fluer ble inkubert i mørket i 3 dager, opplyst med oransje lys i 16 timer, og mørktilpasset i 24 timer i sekundet. Bilder av fluorescerende rabdomerer ble tatt ved hjelp av vanninnlevelsesmikroskopi for å registrere subcellulær TRPL::eGFP-lokalisering som beskrevet i trinn 3.2.6. (B) Kvantifisering av rabdomeral fluorescens av ikke-mutant (grå) og lolattd12 mutant (grønne) dyr som beskrevet i trinn 3.3.9 ved hjelp av formel (1). Feilfelt representerer SEM. (C) TRPL::eGFP-uttrykkende ikke-mutant og vps35MH20 mutant mosaikkøyne fluer ble inkubert i mørket i 3 dager, opplyst med oransje lys i 16 timer, og mørktilpasset i 24 timer for andre gang. Bilder av fluorescerende rabdomerer ble tatt ved hjelp av vanninnlevelsesmikroskopi for å registrere subcellulær TRPL::eGFP-lokalisering som beskrevet i trinn 3.2.6. (D) Kvantifisering av rabdomeral fluorescens av ikke-mutant (grå) og vps35MH20 mutant (røde) dyr som beskrevet i trinn 3.3.9 ved hjelp av formel (1). Feilfelt representerer SEM. Statistisk signifikans ble beregnet som flere sammenligninger med Bonferroni-korreksjon etter ANOVA (ns, ikke signifikant; *, p ≤ 0,05; ***, p ≤ 0,001). Skala bar: 10 μm. Panelene C og D er endret fra referanse10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Som allerede nevnt i protokollen, påvirker øyepigmentering betydelig det resulterende vanninnlevelsesbildet. Hvite øyne fluer tillater påvisning av fluorescenssignaler fra både rhabdomere og cellelegemet, og muliggjør dermed en ganske presis bestemmelse av TRPL: : eGFP-distribusjonsforholdet. I derimot, i rødøyde fluer TRPL::eGFP signal er bare påviselig i rhabdomeres, men ikke i cellelegemer (Figur 13A). Dette skyldes pigmentmolekyler som absorberer det avgitte lyset fra TRPL::eGFP. Likevel, ved å bruke formel (2) for pigmenterte øyne, avslører kvantifisering pent TRPL: : eGFP translokasjonsadferd i hvite og rødøyde fluer. Følgelig reduseres de tilsvarende verdiene av rhabdomere fluorescens fra 100% i mørktilpasset tilstand til 25% og 5% etter belysning og øker igjen til 80% og 90% som følge av en annen mørk inkubasjon (figur 13B).

Figure 13
Figur 13: Representative resultater av TRPL::eGFP fluorescens i hvite og rødøyde fluer. (A) TRPL::eGFP-uttrykkende hvite og rødøyde fluer ble inkubert i mørket i 1 dag, opplyst med oransje lys i 16 timer og mørktilpasset i 24 timer i sekundet. Bilder av fluorescerende rabdomer ble tatt ved hjelp av ikke-dødelig vanndråpemikroskopi for å registrere subcellulær TRPL::eGFP lokalisering som beskrevet i trinn 3.2.6 (hviteøyde fluer) og 3.2.8 (rødøyde fluer). (B) Kvantifisering av rabdomeral fluorescens i hvite øyne (grå) og rødøyde (røde) fluer. Hvitøyde fluer ble kvantifisert ved hjelp av formel (1) og rødøyde fluer, ved hjelp av formel (2), som beskrevet i trinn 3.3.9. Feilfelt representerer SEM. Skalalinje: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For vurdering av fotoreseptordegenerering kan en degenerasjonsindeks basert på fluorescensen til TRP::eGFP i rabdomerene bestemmes (se Protokoll). Denne kvantifiseringsmetoden er illustrert i figur 10. I de representative resultatene her ble ikke-mutant og sdhAttd11 mutant mosaikkøyne fluer holdt i en 12 timers lys / 12 timers mørk syklus i 2 uker, og integriteten til rabdomerer ble undersøkt hver 2-4 dager ved å observere TRP: : eGFP ved hjelp av vanninnlevelsesmikroskopi (figur 14A). Den resulterende kurven viser en nedgang i degenerasjonsindeksen i mutanten, men ikke i kontrollfluer (figur 14B).

Figure 14
Figur 14: Representative resultater av lysindusert retinal degenerasjon i sdhA mutantfluer. (A) TRP::eGFP-uttrykkende ikke-mutant og sdhAttd11 mutant mosaikkøyne fluer ble inkubert i 14 dager i en 12 timers lys / 12 timers mørk syklus ved 25 °C. Bilder av fluorescerende rabdomerer ble tatt ved hjelp av vanninnlevelsesmikroskopi med jevne mellomrom for å registrere netthinnehelse. (B) Kvantifisering av rabdomeral fluorescens av vill type (grå) og sdhAttd11 mutant (oransje) flyr som beskrevet i trinn 3.4. Feilfelt representerer SEM. Skalalinje: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anvendelsen av fluorescensproteiner og enkelhet i screening ved DPP-avbildning og retinal vanninnlevelsesmikroskopi har vist seg å være vellykket av mange grupper12. Strategier som ligner på de som presenteres her har blitt brukt i flere genetiske skjermer for å oppdage defekter i rhodopsinuttrykksnivåer, homeostase, retinal organisasjon eller cellulær integritet ved hjelp av Rh1::eGFP 17,18,19,20,21. Som forklart ovenfor kan translokasjon av fusjonsproteiner som TRPL::eGFP brukes til å oppdage om proteinhandelsprosesser fra og til rhabdomere er svekket, for eksempel i mutageneseskjermer. På den annen side kan permanent rhabdomerale fusjonsproteiner som TRP::eGFP brukes til å undersøke rhabdomere morfologi. DPP og vanninnlevelsesmikroskopi anses som gode metoder for høygjennomstrømningsanalyser og skjermer innenfor modellen til Drosophila-øyet. Det anbefales imidlertid å til slutt utføre (immuno)histokjemiske analyser av isolert ommatidi eller kryo-seksjonert retinalvev for å bekrefte resultater oppnådd ved DPP eller vanninnlevelsesmikroskopi. Sammen med høyoppløselig fluorescensmikroskopi tillater disse teknikkene tolkninger mot presise subcellulære lokaliseringer. I det følgende tilbys noen retningslinjer for hvordan du feilsøker bildeprosessene til DPP og retinal vann nedsenkingsmikroskopi som er spesielt viktig for riktige kvantitative analyser.

Når det gjelder DPP, hvis superposisjonen av fluorescens er uklar eller utydelig, kan det hende at innstillingene ikke er riktige. En mulighet er at øyet ikke står overfor målet nøyaktig radialt eller at fokuset er satt til de perifere områdene i øyet. Siden ommatidial layout av fotoreseptorceller viser speilsymmetri ved dorsoventral midtlinje, kan et uvanlig mønster i DPP ses, hvis signalene oppdages fra begge halvkule av øyet. Kvaliteten på DPP er også sterkt avhengig av en grunn dybdeskarphet for å generere en optisk seksjon gjennom det sammensatte øyet. Hvis overflaten på flyflaten viser autofluorescence, kan flyet plasseres på et lite stykke svart ikke-fluorescerende papp på toppen av flyflaten. Manglende evne til å registrere en DPP kan være knyttet til en rekke underliggende årsaker, inkludert suboptimal flyposisjonering, lave uttrykksnivåer av det fluorescerende proteinet, en uorganisert retinal arkitektur eller degenerative prosesser. Ved avbildning av DPP bør det også bemerkes at cytoplasmatisk fluorescens i hvite øyne kan spre grensene til signalet fra rhabdomeres, og uttrykksnivåene av protein kan variere betydelig mellom individer og påvirke kvaliteten på den resulterende DPP. Således, når det gjelder fluorescerende DPP-avbildning, er det fordelaktig å bruke fluer med pigmenterte øyne. På grunn av absorpsjonen av fluorescenssignaler fra cellelegemene, kan den resulterende DPP virke skarpere enn i hvite øyne fluer.

For å unngå uskarpe bilder i mikroskopien for vanninnlevelse, må bildeanskaffelse utføres raskt etter flyforberedelse for å forhindre oppvåkning og bevegelser av fluen. For bilder av høy kvalitet må de lyseste fluorescenssignalene fra øyet nesten nå metning i alle bilder hvis du bruker hvite øyne fluer. Dette kan oppnås ved å justere eksponeringstiden under avbildning. Siden pigmentering hindrer påvisning av cytosolisk eGFP-fluorescens, vil den beskrevne tilnærmingen for hviteøyede fluer for å justere eksponeringstiden alltid resultere i sterke rhabdomerale fluorescenssignaler i pigmenterte øyne, forvrenge påfølgende tolkning og kvantifisering. I tillegg, ved å bruke pigmenterte øyne, kan fotobleaching på grunn av sterk eksponering for blått lys føre til svakere signaler og dermed feiltolkning av data. Avhengig av konteksten (dvs. dødelig eller ikke-dødelig), presenteres to alternative prosedyrer i protokollen for pigmenterte øyne. Generelt skal den ikke-dødelige variasjonen foretrekkes med pigmenterte øyne, siden den samme fluen kan måles gjentatte ganger, og vurderingen av en bestemt eksponeringstid for hver enkelt flue resulterer i mer presise kvantifikasjoner og høyere reproduserbarhet enn bestemmelsen av en gjennomsnittlig eksponeringstid generert fra en prøve. Imidlertid krever den ikke-dødelige variasjonen også mer omsorg i håndteringen av dyr for å sikre overlevelse under gjentatte målinger. Dette kan oppnås ved å bruke bare lavtrykksluft for å flytte fluer inn i pipettespissen og forsiktig bruke pinsett for å frigjøre flyet fra pipettespissen etter avbildning. Siden fluene ikke er nedsenket i iskjølt vann under prosedyren, er det økt risiko for reawakening. Som et resultat av de gjentatte målingene fra individuelle prøver, er hele serien med målinger bare gyldig hvis flyet forblir uskadd fra begynnelse til slutt. Som et resultat er den ikke-dødelige variasjonen svært arbeidsintensiv og tidkrevende. Den dødelige variasjonen tillater derimot en høyere gjennomstrømning siden flere fluer kan festes etter hverandre på samme insektpinne og registreres sekvensielt i en bildeoppkjøpsrunde. Imidlertid krever flere fluer på samme pinne også enda raskere bildebehandling for å unngå oppvåkning og bevegelser. En siste ulempe ved den dødelige variasjonen er åpenbart manglende evne til å gjenopprette dyrene etter avbildning for etterfølgende applikasjoner (f.eks. kryss, gjentatte målinger).

Når det gjelder kvantifisering av translokasjon, presenterer denne protokollen formel (1), som vurderer fluorescenssignaler fra rhabdomere så vel som cellekroppen og dermed genererer et veldig godt estimat for den relative fordelingen av det translokerende proteinet i cellen (figur 12D). På grunn av mangel på fluorescensmålinger fra cellekroppen når det gjelder pigmenterte øyne, tilbys formel (2), som fungerer bra for dette ofte oppståtte problemet (figur 13B). Bortsett fra øyepigmentering, er det andre omstendigheter som forhindrer kvantifisering med en av disse formlene. En av disse tilfellene er presentert i figur 12A,B i form av lolattd12 mutant. I denne mutanten, spesielt, påvirker fraværet av fotoreseptorcelle R7 ommatidial morfologi og dermed evnen til å skaffe seg rimelige intensitetsmålinger av bakgrunnsfluorescens fra denne regionen. Hvis den samme metoden for kvantifisering av translokasjon brukes til tross for disse problemene, viser resultatene høye variansmengder, er vanskelige å sammenligne med kontroller og kan potensielt feiltolkes. Eksempelet på lolattd12 mutanten illustrerer dermed grensene for denne kvantifiseringsmetoden som uunngåelig er avhengig av en "vill type"-lignende morfologi for riktige intensitetsmålinger. I sjeldne tilfeller der proteintranslokasjonsfeil skal kvantifiseres i morfologisk defekt ommatidia, svikter protokollen som presenteres her og må tilpasses tilsvarende. Dette inkluderer passende endringer i formelen for å utelukke målinger som ikke kan oppnås rimelig eller for å inkludere ytterligere målinger av andre representative regioner.

Ved kvantifisering av degenerative prosesser viste fluorescensintensitetster terskler seg å ikke være en god indikator, siden det er for mye varians i og mellom rabdomerene. Denne variansen er gjennomsnittet over alle 18 målte rabdomener i metoden for kvantifisering av translokasjon. På grunn av den individuelle evalueringen av hver rhabdomere i vurderingen av degenerasjon, kan imidlertid ikke variansen i fluorescensintensiteter beregnes ut. Videre er intensitet bare en av egenskapene som må vurderes. Andre viktige aspekter er kontrast og skarphet av kanter. Følgelig presenterer denne protokollen en kvantifiseringsmetode basert på kategorisering av morfologien til rhabdomeres i henhold til deres fluorescens for øyet. Dette er nødvendigvis subjektivt til en viss grad. Likevel, gitt nok erfaring, har denne protokollen vist seg å være en nyttig, rask og reproduserbar kvantifiseringsmetode for degenerasjon (figur 14) og har blitt publisert flere ganger22,10. Som med alle subjektive evalueringer, er det alltid tilrådelig å utføre dem i blindet sammenheng. Protokoller fra andre grupper bruker vanligvis bare to kategorier for å kvantifisere retinal degenerasjon i Drosophila (tilstedeværelse eller fravær av rabdomer), noe som kan være mindre subjektivt, men også mindre presist. I tillegg har denne kvantifiseringsmåten fortsatt spørsmålet om å definere et avskjæringspunkt mellom de to kategoriene, noe som kan være like vanskelig å definere objektivt.

Når det gjelder modifikasjoner og avanserte anvendelser av metodene som presenteres her, er det også mulig å vurdere den relative mengden av to fluorescerende fusjonsproteiner samtidig ved dobbel fargeavbildning. Ved å bruke TRPL::HcRed og TRP::eGFP er for eksempel TRPL::HcRed translokasjon vurdert med hensyn til rabdomeral integritet i samme flue23. Dobbel fargeavbildning brukes også i tomat/GFP-FLP/FRT-metoden, for eksempel for å identifisere faktorer som fremkaller apoptose24. Denne variasjonen gjør det mulig å visualisere degenerasjonen av fotoreseptorceller via ninaC::eGFP i fluorescerende merkede cellekloner merket med ninaC::tdTomato. En annen anvendelse av vanninnlevelsesmikroskopi er overvåking av fosfoinositidomsetning i fotoreseptorer. Til dette formål brukes fluorescerende merkede fosfoinositidbindingsdomener som pleckstrin homology (PH) -domenet fra PLCδ1. Disse fluorescenssondene tillater sporing av fosfoinositideforringelse over tid ved å oppdage reduksjonen av rhabdomeral fluorescens forårsaket av spredning av sonden fra rhabdomere til cytosol25,26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke våre studentforskere gjennom årene. Spesielt Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim og Laura Jaggy, hvis data har blitt brukt i denne protokollen som representative resultater. Forskningen til vår gruppe presentert her ble finansiert av tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) til Armin Huber.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Greiner Bio-One 188271
CO2 anaesthesia fly pad Flystuff 59-172
Cold light lamp (KL 1500 LCD) Zeiss
Fiji/ImageJ NIH
Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition) Zeiss
Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13)
[1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2]
and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2]		 Osram 4050300518039
Laboratory pipette (20-200 µL) Eppendorf
Object slide Roth 0656.1
Petri dish (94 mm) Greiner Bio-One 633102
Pipette tips (200 µL) Labsolute 7695844
Plasticine (Blu-Tack) Bostik 30811745
Stereo microscope (SMZ445) Nikon
Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12) Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration. Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).
  2. Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
  3. Hardie, R. C. The photoreceptor array of the dipteran retina. Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).
  4. Wang, T., Montell, C. Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).
  5. Xiong, B., Bellen, H. J. Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly. Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).
  6. Bähner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
  7. Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).
  8. Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade. Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).
  9. Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin. European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).
  10. Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum. Traffic. , (2021).
  11. Franceschini, N., Kirschfeld, K. Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila. Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).
  12. Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128 (6), 815-826 (2001).
  13. Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).
  14. Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2005).
  15. Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL. Fly. 2 (1), 36-46 (2008).
  16. Zheng, L., Carthew, R. W. Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye. Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).
  17. Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).
  18. Huang, Y., Xie, J., Wang, T. A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila. PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).
  19. Zhao, H., Wang, J., Wang, T. The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).
  20. Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
  21. Zhao, H., Wang, T. PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila. PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).
  22. Cerny, A. C., et al. The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells. PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).
  23. Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2007).
  24. Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).
  25. Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
  26. Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).

Tags

Biologi utgave 179
Studere membranproteinhandel i <em>Drosophila</em> Fotoreseptorceller ved hjelp av eGFP-taggede proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger,… More

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins. J. Vis. Exp. (179), e63375, doi:10.3791/63375 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter