Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

التصنيع الحيوي بمساعدة الأكسجين بمساعدة الأكسجين بأسعار معقولة للكرويات متعددة الخلايا

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63403
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1
1Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medical and Health Sciences, Ghent University, 2Health and Happiness (H&H) Group, National Food Innovation Hub, 3Institute of Analytical Chemistry and Food Chemistry, Graz University of Technology
* These authors contributed equally

Summary

يصف البروتوكول توليد كروي عالي الإنتاجية للطباعة الحيوية باستخدام التحليل متعدد المعلمات للأكسجين وموت الخلايا على مجهر فلوري قياسي. يمكن تطبيق هذا النهج للتحكم في صلاحية الكرويات وإجراء التوحيد القياسي ، وهو أمر مهم في نمذجة الأنسجة 3D ، والبيئة الدقيقة للورم ، والتصنيع الحيوي الناجح (الدقيق) للأنسجة.

Abstract

الكرويات متعددة الخلايا هي أدوات مهمة لدراسة فسيولوجيا الأنسجة والسرطان في 3D وكثيرا ما تستخدم في هندسة الأنسجة كوحدات تجميع الأنسجة للتصنيع الحيوي. في حين أن القوة الرئيسية للنموذج الكروي هي في محاكاة التدرجات الفيزيائية والكيميائية على مقياس الأنسجة المجهري ، فإن البيئة الفسيولوجية الحقيقية (بما في ذلك ديناميكيات النشاط الأيضي ، والأوكسجين ، وموت الخلايا ، والانتشار) داخل الكرويات يتم تجاهلها بشكل عام. في الوقت نفسه ، يتم توثيق آثار تكوين وسط النمو وطريقة التكوين على النمط الظاهري الكروي الناتج بشكل جيد. وبالتالي ، فإن توصيف وتوحيد النمط الظاهري الكروي مطلوبان لضمان قابلية تكرار نتائج البحث وشفافيتها. يمكن أن يكون تحليل متوسط الأوكسجين الكروي وقيمة تدرجات O2 في ثلاثة أبعاد (3D) طريقة بسيطة وعالمية لتوصيف النمط الظاهري الكروي ، مشيرا إلى نشاطها الأيضي ، وقابليتها للبقاء بشكل عام ، وإمكانية تلخيصها في البيئة الدقيقة للأنسجة الحية . يمكن بسهولة الجمع بين تصور الأوكسجين 3D مع التحليل متعدد المعلمات للمعلمات الفسيولوجية الإضافية (مثل موت الخلايا والانتشار وتكوين الخلية) وتطبيقها على مراقبة الأوكسجين المستمرة و / أو قياسات نقطة النهاية. يتم تحميل مسبار O2 خلال مرحلة تكوين كروي ومتوافق مع بروتوكولات مختلفة لتوليد كروية. يتضمن البروتوكول طريقة عالية الإنتاجية لتوليد كروية مع إدخال نسبة انبعاث الأشعة تحت الحمراء والقريبة من الأشعة تحت الحمراء ، ومستشعرات نانوية فلورية O2 ووصف تقييم متعدد المعلمات للأكسجة الكروية وموت الخلايا قبل وبعد الطباعة الحيوية. تظهر الأمثلة التجريبية تحليلا مقارنا لتدرجات O2 في الكرويات الخلوية المتجانسة وغير المتجانسة بالإضافة إلى التركيبات المطبوعة بيولوجيا القائمة على الكروية. البروتوكول متوافق مع المجهر الفلوري التقليدي الذي يحتوي على مرشحات فلورية متعددة وصود باعث للضوء كمصدر للضوء.

Introduction

الأكسجين الجزيئي (O2) هو واحد من المستقلبات الرئيسية التي تنظم بقاء الخلايا والأنسجة ووظيفتها وموتها. في ظل الظروف الفسيولوجية ، يتم تنظيم أكسجة الأنسجة المحلية ديناميكيا عن طريق الأوعية الدموية للأنسجة ، وتدفق الدم ، واستقلاب الخلايا ، مما يؤدي في بعض الحالات إلى تكوين تدرجات O 2 ، والبيئة الدقيقة الناقصة الأكسجين ، و / أو الإجهاد التأكسدي 1,2. تستشعر الخلايا تدرجات O 2 من خلال المشاركة المباشرة للجزيئي O 2 في وظيفة الإشارات (عن طريق إشارات العامل المستحث لنقص الأكسجة (HIF) ، و histone lysine demethylases KDM ، وبوسائل أخرى) ، والتغيرات في إمكانات الأكسدة والاختزال الخلوية (الأنواع التفاعلية O 2 التي تستشعر من خلال إشارات Nrf2 / Keap1 أو البروتينات المنظمة للحديد) ، ويمكنها لاحقا ضبط عملية التمثيل الغذائي ، والانتشار ، الفاعلية والتمايز3. وبالتالي ، فإن عدم تجانس أكسجة الخلايا والأنسجة ، وتدرجاتها ، والظواهر المرتبطة بها هي عوامل مهمة في تطوير الأنسجة والتوازن. غالبا ما تتطلب الأنسجة وأنواع الخلايا المختلفة مستويات فسيولوجية O 2 "طبيعية" مختلفة ، والتي تحدد بنية الأنسجة الخاصة مع الخلايا الموضوعة وفقا للأنسجة O2 microgradients4. بعض أنواع الخلايا حساسة لانخفاض O 2 (على سبيل المثال ، الخلايا العصبية أو خلايا الكبد أو خلايا جزيرة البنكرياس أو خلايا العضلات) 5,6 ، في حين أن البعض الآخر يمكن أن يتحمل نقص الأكسجة الشديد ويشكل تدرجات حادة O2 (على سبيل المثال ، في ظهارة الأمعاء والقولون)7. مع التقدم في الهندسة الحيوية للأنسجة والتصنيع الحيوي ، تصبح ضرورة تحديد كمية O2 في المجاميع الدقيقة وهياكل الأنسجة الكروية 3D مهمة. أحد المخاوف هو توحيد المعايير الفسيولوجية للنموذج الكروي متعدد الخلايا ، والتي تعتمد على طريقة توليد الكروية وظروف الثقافة8. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون التطبيق غير المنضبط للموادالحيوية التي تطلق O 2 أو تروية O2 في الأنسجة الدقيقة التي تفتقر إلى الأوعية الدموية الوظيفية ساما للخلايا ، ويؤدي إلى إعادة برمجة عملية التمثيل الغذائي الخاصة بها ، وانخفاض البقاء على قيد الحياة في فترة ما بعد الزرع 9,10. وقد أثبتت مؤخرا مصداقية نهج قياس O2 وتحسين بيئة الأوكسجين للوصول إلى الثقافة الفعالة للمجاميع الدقيقة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من خلال النمذجة الرياضية لكرويات الكبد المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستخدمة كمثال11. مجال آخر حيث يتم التعرف على معرفة مستويات الأنسجة O2 هو علاج السرطان12,13. يمكن أن يؤدي نقص الأكسجة غير المتجانس إلى إضعاف العلاج الناجح المضاد للسرطان. إن قياس مستويات الأوكسجين الدقيقة والتحكم فيها أثناء علاج المريض أو نمذجة نقص الأكسجة للورم من شأنه أن يسمح بتحسين استراتيجيات العلاج الفردية والشخصية14. وبالتالي ، فإن المراقبة الكمية للأكسجين الديناميكي في التركيبات المصنعة بيولوجيا ونماذج الأورام 3D هي أداة بارزة للتحليل الفسيولوجي لنشاط التنفس ، والتمثيل الغذائي ، وتحسين زراعة الأنسجة ، وظروف التصنيع ، أو الدراسات الأساسية للاستجابة العلاجية بوساطة نقص الأكسجة.

وهناك عدد من الطرق التي تمكن من التحليل متعدد الإرسال (أو متعدد المعلمات) لأوكسجين الخلايا في بنى الأنسجة الكروية والميكرومترات. رائد مع الغلاف العصبي والكرويات الورم15،16،17 ، يتيح النهج القائم على التصوير المجهري مدى الحياة (PLIM) الفسفور تحديد كمي مباشر لأكسجة الخلايا في الأنسجة الدقيقة الحية وإنشاء علاقتها مع بقاء الخلايا أو انتشارها أو توزيع أنواع الخلايا الوظيفية. على الرغم من قوة النهج ، لا تزال ترقية الفحص المجهري PLIM غير متوفرة على نطاق واسع حتى بين بائعي الفحص المجهري المشهورين18,19. لحسن الحظ ، يمكن أيضا استخدام عدد لا بأس به من مجسات الجسيمات النانوية الحساسة O2 التي تخترق الخلايا لوضع القياس المعياري القائم على كثافة التألق15،17،20،21،22،23،24. عادة ، سيعرض المسبار طولين موجيين للانبعاثات ، أي حساس وغير حساس O2 (مرجع) ، والذي يمكن قياسه على مجهر فلوري ، أو جهاز تصوير عالي المحتوى ، أو قارئ ميكروبليت. يمكن إنتاج هذه الجسيمات النانوية المستشعرة O 2 بواسطة تقنية هطول الأمطار باستخدام البوليمرات المتوافقة بيولوجيا ، والاستشعار O 2 ، والأصباغ المرجعية التي تغطي أطياف مرئية وقريبة من الأشعة تحت الحمراء ، أو يمكن شراؤها تجاريا 2,25. نظرا لأن تحليل الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد السميكة سيستفيد من استخدام أصباغ الفلورسنت ذات الانزياح الأحمر ، فإن مسبار الجسيمات النانوية O 2-sensing النسبي O 2-sensing متعدد الوسائط رقم 1 (MMIR1) ، الذي يتكون من O2-sensing PtTPTBPF 26 وأصباغ aza-BODIPY 27 المرجعية المشربة في بوليمر مشترك قائم على البولي ميثاكريلات إيجابيا الشحنة تم بناؤه28. مع هذا التصميم ، إشارة حساسة O2 (الأشعة تحت الحمراء القريبة ، الإثارة (استثناء) = 635 نانومتر ، الانبعاثات (em.) = 760 نانومتر ؛ Isens) يتأثر بتركيز [O2] عن طريق عملية التبريد الفوسفوري ، في حين أن كثافة الصبغة المرجعية الحمراء (باستثناء = 580 نانومتر ، em. = 650 نانومتر ؛ Iref) لا يزال غير متأثر (الشكل 1 أ). وبالتالي ، يمكننيالمرجع / أنانسبة الاستشعار (R) في الخلايا الملطخة تمكين معايرة O2 22.

هنا ، نصف نهجا شبه كمي لمراقبة أكسجة الخلايا الحية في الكرويات والتركيبات المطبوعة بيولوجيا ، مما يساعد على تقدير تدرجات O2 في نقطة النهاية والقياسات الحركية. يمكن إجراء هذا التصوير O 2 مع أنواع أخرى من مجسات O2 ذات النسب (الشكل 1B) واعتمادا على عدد مصادر الضوء المتاحة ومرشحات التألق ، يمكن استخدامها مع أصباغ أخرى للحصول على معلومات حول الخلايا الحية / الميتة ، ووظيفة الميتوكوندريا ، وتتبع أنواع الخلايا الأخرى. يمكن أيضا استخدام أوضاع القياس المتقدمة مثل الفحص المجهري التصويري الفلوري مدى الحياة (FLIM)19. التحدي الأكبر مع استخدام أصباغ تلطيخ الخلايا والجسيمات النانوية الحساسة O2 هو تحسين بروتوكول التلطيخ. في حالة مسبار MMIR1 والجسيمات النانوية ذات الصلة ، تكون الخلايا إما ملطخة مسبقا أو محتضنة أثناء عملية تكوين الكروية. في البروتوكول الموصوف ، تم إنشاء كرويات O 2 الملطخة بالمسبار على سطح الأغاروز منخفض الالتصاق29،30،31،32 (الشكل 1C) ، مما يتيح الطباعة الحيوية اللاحقة القائمة على الكروية والتحليل متعدد المعلمات ل O 2 وموت الخلايا. ولتوضيح إمكانية تطبيق هذا النهج، تمت مقارنة مستويات الأوكسجين في الخلايا المتجانسة أو غير المتجانسة (التي تشكلت مع إضافة الخلايا البطانية الوريدية السرية البشرية، HUVEC) والخلايا الجذعية لب الأسنان البشرية (hDPSC) قبل وبعد الطباعة الحيوية، باستخدام المجهر الفلوري التقليدي.

Protocol

1. توليد الإنتاجية العالية من الكرويات مع دمج O2 الحساسة التحقيق

  1. تحضير لوحة زراعة الأنسجة المغلفة بالأغاروز ذات النقوش الدقيقة
    ملاحظة: تستخدم ألواح زراعة الأنسجة المطلية بالأغاروز ذات النقوش الدقيقة للتوليد المتزامن لعدد كبير من الكرويات (1585 لكل طابع PDMS ، انظر جدول المواد) للطباعة الحيوية والتطبيقات الأخرى ، حيث تكون هناك حاجة إلى نسخ متماثلة تجريبية متعددة أو أعداد كروية كبيرة.
    1. تحضير جميع المواد والأدوات المعقمة (الملاعق والملقط) عن طريق التعقيم حيثما أمكن أو عن طريق التعقيم بالمرشح. تنظيف طوابع PDMS القابلة لإعادة التدوير33 من agarose وتخزينها بشكل معقم في 70٪ من الإيثانول. افعل ذلك قبل يوم واحد على الأقل من التوليد الكروي.
    2. انقل طوابع PDMS ذات النقوش الدقيقة من قارورة تخزين إلى طبق بتري معقم وجففها في الهواء مع السطح الأملس تحت ظروف تدفق الهواء الرقائقي المعقم لمدة 10 دقائق.
    3. ضع كل ختم بسطح صغير النقوش لأعلى (وسطح أملس لأسفل) في منتصف بئر لوحة زراعة الأنسجة المعقمة المكونة من 12 بئرا. يجف في الهواء لمدة 1-2 دقيقة مع غطاء مفتوح.
      ملاحظة: من المهم للغاية تبخير السائل الزائد لأن الطوابع الجافة فقط تلتصق تماما بالسطح البلاستيكي وتظل متصلة أثناء الإجراء.
    4. يزن 1.5 غرام من الأغاروز في زجاجة زجاجية نظيفة سعة 200 مل ، ويضاف 50 مل من الماء المقطر المعقم ، ويغطى بغطاء ويذوب في الميكروويف لصنع 50 مل من محلول الأغاروز المتجانس بنسبة 3٪.
      تحذير: محلول الأغاروز ساخن للغاية ويجب التعامل معه بحذر. إذا اهتز مباشرة بعد إجراء الذوبان ، يمكن أن يبدأ محلول الأغاروز الساخن في الفقاعات وينفجر من الوعاء. لتجنب الصدمات العرضية ، استخدم أوعية كبيرة بما فيه الكفاية مليئة بحد أقصى 50٪ من الحجم بمحلول الأغاروز.
    5. باستخدام ماصة مصلية معقمة ، أضف على الفور ~ 2 مل من محلول الأغاروز الساخن إلى كل بئر من ألواح زراعة الخلايا المكونة من 12 بئرا لتغطية ختم PDMS المدرج بالكامل. اترك الأغاروز ليتصلب لمدة 20 دقيقة عن طريق احتضانه تحت تدفق الهواء المعقم مع فتح غطاء اللوحة.
      ملاحظة: يجب أن تكون طبقة الأغاروز أكثر سمكا مرتين على الأقل من ختم PDMS لضمان سلامة آبار الأغاروز الدقيقة بعد إزالة ختم PDMS (الشكل 1C).
    6. باستخدام ملعقة صغيرة معقمة ، اقلب الأغاروز بدقة مع ختم PDMS المدمج رأسا على عقب في كل بئر للحصول على سطح الختم الأملس لأعلى. أضف ~ 200 ميكرولتر من الماء المعقم على الجانب العلوي الأملس من الختم ، وافصله بلطف عن الأغاروز باستخدام ملعقة ، وأخرجه من البئر. تجنب إتلاف الآبار الصغيرة.
    7. أضف 1 مل من وسائط زراعة الخلايا المعقمة المقابلة إلى طوابع الأغاروز للاستخدام المباشر. غطي اللوحة بالغطاء واحتضنيها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. استخدم حل PBS (بدلا من المتوسط) للتخزين على المدى الطويل (حتى 2 أسابيع عند 4 درجات مئوية). لا تدع الأغاروز يجف. قبل الاستخدام ، قم بتسخين الألواح ذات النقوش الدقيقة من الأغاروز لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 .
      ملاحظة: هناك حاجة إلى الحضانة لتحقيق التوازن وإزالة فقاعات الهواء من آبار الأغاروز الدقيقة. تابع خطوة البروتوكول 1.2.
  2. إعداد O2 كرويات محملة بالمسبار
    1. استخدم α-minimal essential medium (MEM) المكمل بمصل البقر الجنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، وعوامل النمو المكملة لوسط نمو الخلايا البطانية 2 لزراعة خطوط خلايا hDPSC و HUVEC ، على التوالي. قم بإعداد وسط نمو كروي غير متجانس الخلايا hDPSC / HUVEC عن طريق إضافة وسائط نمو HUVEC و hDPSC بنسبة 1: 1.
    2. إعداد 70٪ -90٪ من ثقافة الخلايا المتقاربة (~ 3-4 أيام من التحضير). لتوليد الكرويات غير المتجانسة ، قم بإعداد ثقافات hDPSC و HUVEC على التوالي.
      ملاحظة: يجب ألا يتجاوز رقم مرور HUVEC و hDPSC 8. لضمان النمو السريع لمزارع الخلايا ، تنقسم دائما عند 1/3 من إجمالي زراعة الخلايا (عند التقاء 70٪ -80٪) باستخدام قارورة جديدة كل 3 إلى 4 أيام.
    3. شطف 70٪ -90٪ من زراعة الخلايا المتقاربة مع الاحترار المسبق (37 درجة مئوية) PBS (10 مل لكل 75 سم2 قارورة). أضف محلول الإنزيم المنفصل (0.05٪ تريبسين و 1 mM EDTA ؛ 1 مل لكل 75 سم 2 قارورة) واحتضن لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 ، رطوبة 95٪ لانفصال الخلايا وتحقق من انفصال الخلايا تحت المجهر. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتحييد التربسين باستخدام وسائط زراعة الخلايا الكاملة التي تحتوي على 10٪ FBS (5 مل من الوسائط لكل 1 مل من محلول التفكيك).
      ملاحظة: منع التعرض المفرط للخلايا لمحلول الإنزيم الانفصالي لأن هذا يمكن أن يؤثر على بقائها.
    4. بالنسبة ل HUVEC المستزرعة في وسط FBS منخفض ، قم بإجراء تحييد التربسين عن طريق إضافة 0.5 مل من FBS بنسبة 100٪ إلى مزرعة الخلايا المعالجة بالتريبسين ، تليها الطرد المركزي لنقل الخلايا إلى وسط نموها.
      ملاحظة: يجب أن يحتوي تعليق (معلقات) الخلايا التي تم الحصول عليها على حوالي 1 مليون خلية لكل 1 مل. إذا لزم الأمر ، يمكن إضافة خطوة طرد مركزي إضافية إلى البروتوكول لتركيز تعليق الخلية.
    5. قم بفصل مجاميع الخلايا عن طريق السحب باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر أعلى ماصة مصلية 10 مل للحصول على تعليق أحادي الخلية. استخدم غرفة عد (مقياس الدم من نوع Neubauer أو البدائل) لحساب عدد الخلايا لكل 1 مل من تعليق الخلية34. قم بتخفيف تعليق الخلية إلى 500000 خلية لكل مل. بالنسبة ل hDPSC / HUVEC غير المتجانسة الخلايا بنسبة كروية 1: 1 ، أضف كميات متساوية من معلقات الخلايا المقابلة للحصول على تركيز خلية نهائي يبلغ 500000 خلية لكل مل.
      ملاحظة: يسمح تباين تركيز الخلية في التعليق المضاف إلى ختم الأغاروز ذي النقوش الدقيقة بتغيير متوسط حجم الكرويات المنتجة، والذي يعتمد على عدد الخلايا لكل بئر صغير من ختم الأغاروز. في الإعداد الموصوف ، يتم إنشاء كرويات من ~ 300 خلية من 1 مل تحتوي على 500000 خلية على ختم أغاروز مع 1585 ميكروويل.
    6. أضف محلول مسبار O2 المركز (الجسيمات النانوية ، مخزون 1 ملغم / مل) إلى تعليق الخلية المحضر إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل.
      ملاحظة: يوفر التكوين الكروي في وجود جسيمات نانوية مستشعرة O2 تلطيخا فعالا ، يتم الحفاظ عليه لمدة لا تقل عن 5 أيام (الشكل 1D). في المقابل ، فإن تلطيخ الكرويات متعددة الخلايا المشكلة مسبقا بالجسيمات النانوية سيكون أقل كفاءة15.
    7. تبادل 1 مل من الوسائط القديمة في بئر مجهري من 12 لوحة مستزرعة خلوية مغلفة بالأغاروز (انظر الخطوة 1.1.7) مقابل 1 مل من تعليق الخلية المحضر (500000 خلية لكل 1 مل ، مع مسبار 5 ميكروغرام / مل O2 ). استزرع الكرويات في حاضنة CO 2 لمدة 2-5 أيام في وجود مستمر لمسبار O2 لضمان تحميله أثناء تكوين الكروية وضغطها.
      ملاحظة: تجنب التبخر المتوسط المفرط في الثقافة الكروية. إذا لزم الأمر ، بعناية (لا تزعج الكرويات في microwells) أضف 0.2-0.5 مل من الوسائط الثقافية مع تخفيف مسبار O2 الإضافي.
    8. بعد التكوين الكروي ، استبدل وسائط النمو بأخرى جديدة بدون مسبار. سيتم الحفاظ على تلطيخ المسبار في الكرويات المتولدة لمدة 7-14 يوما أو أكثر ، مما يسمح بمراقبة إشاراته على المدى الطويل في الكرويات.

2. الطباعة الحيوية الكروية

ملاحظة: تتم طباعة الكرويات بيولوجيا في حبر حيوي معدل بالجيلاتين المعدل بالميثاكريلاميد (GelMA). فيما يلي وصف لمكونات الحبر الحيوي ، وإجراءات إعداد الحبر الحيوي ، والطباعة الحيوية.

  1. إعداد الحبر الحيوي
    1. قم بإعداد محلول GelMA بنسبة 10٪ (ث / v) (2 مل) في الوسط تحت تدفق الهواء الرقائقي 35 على النحو التالي: يزن 0.2 جم من GelMA المعقم بدرجة استبدال 78 في أنبوب 15 مل ، وأضف 1.9 مل من α-MEM واتركه يذوب عن طريق الخلط على شاكر دوار عند37 درجة مئوية (~ 2 ساعة).
      ملاحظة: لا تقم بإضافة الكمية الكاملة من الوسط، لأنه سيتم إضافة مركبات أخرى مثل الكرويات وبادئ الصور Li-TPO-L لاحقا.
    2. أعد تعليق الكرويات في الآبار ذات النقوش الدقيقة عن طريق السحب وجمعها في أنبوب 15 مل. قم بإجراء شطف إضافي باستخدام PBS لضمان جمع جميع الكرويات من آبار الأغاروز الصغيرة. تجنب لمس / إتلاف آبار الأغاروز الصغيرة لأن رقائق الأغاروز يمكن أن تسد الإبرة أثناء الطباعة الحيوية.
    3. اجمع الكرويات عن طريق الطرد المركزي في أنبوب 15 مل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية. شفط supernatant مع ماصة ، إضافة 50 ميكرولتر من الوسط إلى الكروية وإعادة تعليقها عن طريق السحب اللطيف.
    4. يضاف الخليط الكروي إلى محلول GelMA الدافئ ويخلط عن طريق السحب اللطيف. حافظ على تركيز كروي إلى 6340-12860 كروية (من 4-8 أنماط دقيقة) لكل مل من الحبر الحيوي للطباعة الحيوية. تجنب التركيزات العالية من الكرويات لأنها تسبب بسهولة انسداد إبرة الطباعة.
    5. أضف محلول مخزون Li-TPO-L المعقم بالصور المعقم بمرشح (32 مجم / مل) بتركيز نهائي قدره 2 مول٪ فيما يتعلق بعدد الروابط المزدوجة واخلطه عن طريق السحب اللطيف36,37.
      ملاحظة: يمكن حساب كمية Li-TPO-L وفقا للمعادلة:
      حجم البادئ الضوئي (PI) = (0.000385 mol NH 2- مجموعات / g من GelMA × 294.10 g Li-TPO-L / mol x 0.78 x 0.02) / 0.032 g Li-TPO-L / mL x0.2 g GelMA = 0.0107 mL Li-TPO-L stock
  2. إجراء الطباعة الحيوية
    1. انظر الخطوات الواردة في البروتوكول التكميلي 1 لتصميم السقالة في CAD. لطباعة التصميم بيولوجيا، اتبع الخطوات أدناه.
    2. أغلق نهاية خرطوشة 3 سم مكعب معقمة بغطاء طرف (قفل luer) واملأها بالحبر الحيوي عن طريق السحب. أدخل مكبس في الخرطوشة. أمسك الخرطوشة رأسا على عقب وقم بإزالة غطاء الطرف ، وادفع المكبس نحو الحبر الحيوي حتى تتم إزالة كل الهواء من الخرطوشة.
      ملاحظة: تجنب التلامس بين الحبر الحيوي GelMA وجوانب الخرطوشة، لأن ذلك قد يمنع حركة المكبس بسبب هلام الحبر الحيوي.
    3. دع الحبر الحيوي يبرد في عباءة التسخين للطابعة الحيوية عند 23 درجة مئوية (20-30 دقيقة). المسمار في محول الضغط في الجزء العلوي من خرطوشة. أغلق المشبك الموجود على أنبوب المدخل لمنع تسرب الحبر الحيوي ، وقم بتركيب إبرة PE مخروطية 22 جم على الخرطوشة. قم بتكييف حجم الإبرة وقطرها مع تصميم السقالة والقطر الكروي والتركيز.
      ملاحظة: ارتد قناع الفم والقفازات التي يتم رشها لمنع التلوث.
    4. رش الطابعة الحيوية بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسحها جافة بورق ممتص. قم بتركيب الخرطوشة في عباءة التسخين على رأس الطباعة القائم على البثق. قم بتوصيل مدخل الضغط وافتح المشبك الموجود على المدخل. قم بتحميل ملف G-code الخاص بتصميمك في برنامج الطباعة.
    5. ابدأ قياس طول الإبرة. قم بتنظيم ضغط الطباعة عن طريق توزيع القليل من الحبر الحيوي في طبق بتري معقم. ضغط الطباعة من 0.025-0.045 ميجا باسكال هو نموذجي لطباعة الأحبار الحيوية القائمة على GelMA38.
    6. قم بتثبيت لوحة من 6 آبار ، وافتح لوحة البئر ، وأغلق الغطاء ، وابدأ الطباعة. بعد الطباعة ، دع السقالات متقاطعة فعليا لمدة 10 دقائق عند 5 درجات مئوية وقم بتشعيع السقالات المطبوعة لمدة 60 ثانية باستخدام مصباح LED للأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر ؛ 500 ميجاوات وفقا للشركة المصنعة).
      ملاحظة: يعتمد وقت الربط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية على خصائص ضوء الأشعة فوق البنفسجية، ونوع البادئ الضوئي وتركيزه، ودرجة الربط المتقاطع للسقالة المطلوبة، والتورم، ومعامل المرونة.
    7. أضف على الفور وسائط النمو المقابلة التي تحتوي على 100 U / mL من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (P / S) إلى جميع الآبار ذات الشبكات المطبوعة بيولوجيا (2 مل لكل بئر من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 6 آبار).
    8. الثقافة في حاضنة CO2 37 درجة مئوية حتى تبدأ الفحص المجهري. بالنسبة للفحص المجهري للبنية المطبوعة بيولوجيا، انقل شبكة وافل مطبوعة إلى طبق مجهري، وقم بتغطيتها بوسائط تصوير، وتابع الخطوتين 3.2 و3.3.
      ملاحظة: في حالة التركيبات العائمة المطبوعة بيولوجيا ، يجب تثبيتها في طبق الفحص المجهري دون التأثير على صلاحية الخلية ، على سبيل المثال ، باستخدام الغراء المتوافق مع الخلايا. لنقل المجهر المقلوب، الطباعة الحيوية في طبق زجاجي سفلي مجهري وغطاء بوسائط تصوير (~ 200-500 ميكرولتر، انظر الملاحظة إلى الخطوة 3.1 لتكوين وسائط التصوير) لتجنب التعويم غير المرغوب فيه للعينة. يمكن إجراء التلطيخ باستخدام مجسات فلورسنت إضافية في طبق زراعة الخلايا قبل نقل التركيبات المطبوعة بيولوجيا إلى أطباق الفحص المجهري (انظر الخطوة 3.1.6).

3. نسبة التألق المجهري الحي للأكسجة الكروية في الأنسجة المصنعة بيولوجيا

ملاحظة: لتحويل استجابة الكثافة النسبية (R) لمسبار O2 إلى مستويات نقص الأكسجة الفعلية ، يجب معايرة استجابة المسبار باستخدام الإجراءات الموضحة في24. ومع ذلك ، نظرا لأن المعايرة النسبية خاصة بالأداة وتتطلب تركيب حاضنة يتم التحكم فيها بواسطة T / O2 / CO2 (غير متوفرة دائما) ، فإن استخدام الكشف عن النسبة شبه الكمية هو الخيار المفضل.

  1. إعداد الكرويات لتحليل التصوير الحي
    1. للربط الكروي خلال هذه الخطوة ، قم بتغطية أطباق الفحص المجهري المعقمة مسبقا بالكولاجين IV و / أو poly-D-lysine أو استخدم الأطباق المتوفرة تجاريا39. تحقق من توافق أطباق الفحص المجهري مع مسافة العمل والخصائص الأخرى لهدف المجهر الخاص بك.
      ملاحظة: في حالة التصوير متعدد المعلمات ، يجب إجراء جميع إجراءات التلطيخ الإضافية في أطباق لوحة الثقافة مع كمية كافية من الوسائط التي تحمي الخلايا من التبخر أو الصدمة التناضحية أو غيرها من الإجهاد. تحضير وتحميع وسط التصوير قبل الاستخدام: DMEM مكمل مع بيكربونات الصوديوم (1.2 جم / لتر) ، HEPES-Na ، الرقم الهيدروجيني 7.2 (10 mM) ، بيروفات الصوديوم (1 mM) ، L-glutamine (2 mM) ، والجلوكوز (5 mM) ، بدون أحمر الفينول.
    2. باستخدام ماصة 1 مل ، اغسل بلطف الكرويات الملطخة مسبقا بمسبار O2 من آبار الأغاروز الدقيقة. بينما لا تزال الكرويات تطفو في الوسائط ، قم بنقلها إلى أنبوب سفلي مخروطي 15 مل.
    3. لضمان جمع جميع الكرويات من بئر مجهري ، اشطف البئر من 1 إلى 3 مرات باستخدام 1 مل إضافية من وسائط الاستزراع ، مع الجمع بين جميع المعلقات الكروية في قارورة واحدة. اترك القارورة في وضع رأسي لمدة تصل إلى 10 دقائق للسماح للكرويات بالاستقرار في الجزء السفلي من القارورة لتشكيل حبيبات مرئية.
    4. قم بإزالة الوسائط بعناية من الأنبوب مع ترك الكرويات دون إزعاج. أعد تعليقها بلطف في كمية وسط الثقافة الطازجة التي ستكون كافية لما لا يقل عن 20 كرويا لكل طبق عينة مجهري. سيؤدي ذلك إلى تقليل استخدام الوسائط الثقافية وتبسيط تحديد موقع الكرويات أثناء التصوير.
      ملاحظة: استخدم جزء السيليكون القابل للتعقيم من لوحة μ المكونة من 12 بئرا (انظر جدول المواد) المرفقة بزجاج الغلاف كطبق عينة مجهري (24 × 60 مم ، سمك #1) مع الحد الأقصى لحجم الوسائط 300 ميكرولتر لكل بئر. يمكن تعقيم جزء السيليكون من غرفة الثقافة هذه وإعادة استخدامه مع أي أسطح بلاستيكية وزجاجية أخرى عند الالتزام بالطبق.
    5. أضف على الفور حجما متساويا من التعليق الكروي إلى كل طبق / بئر مجهري. اترك الكرويات لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 لتعلق على سطح طبق الفحص المجهري. لتحليل الأوكسجين إلى جانب استخدام الأصباغ الأخرى المضي قدما مع الخطوة 3.1.6. لتحليل الأوكسجين البسيط ، تابع الخطوة 3.1.7.
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي وقت الحضانة غير الكافي (<1 ساعة) إلى إزالة الكروية العرضية وفقدانها أثناء تبادل الوسائط، مما يؤدي إلى إجهاض تجربتك. في الوقت نفسه ، يمكن أن يؤدي الإفراط في الحضانة (>3 ساعة) إلى فقدان جزئي أو كامل لتنظيمها ثلاثي الأبعاد بسبب هجرة الخلايا من الكرويات إلى سطح طبق الفحص المجهري والتأثير على الأوكسجين في الوقت الفعلي.
    6. (اختياري) استبدل الوسط بعناية بمسبار (مسابير) يحتوي على فلورسنت مخفف إلى تركيز تلطيخ واستمر في الحضانة لمدة 1 ساعة إضافية للوصول إلى الكثافة المثلى. لتجنب إزالة الكرويات أثناء تبادل الوسائط ، قم بشفط الوسط بعناية باستخدام ماصة 200 ميكرولتر من حواف أطباق الفحص المجهري وقم بإجراء إضافة متوسطة جانبيا في طبق الفحص المجهري. تابع الخطوة 3.1.7.
      ملاحظة: للتلطيخ الفعال باستخدام المجسات ذات الانتشار الضعيف في المجاميع متعددة الخلايا ، قم بإطالة تركيز التحميل و / أو الوقت. قبل الاستخدام ، حدد معلمات تحميل المسبار الاختيارية في التجارب الأولية.
    7. قم بإزالة الوسط من طبق الفحص المجهري وشطفه مرة واحدة باستخدام وسائط التصوير. أضف الكمية الدقيقة من وسائط التصوير إلى العينة (على سبيل المثال، 300 ميكرولتر لكل بئر ميكروويل من μ حجرة من صفيحة استزراع 12 بئرا). تابع الخطوة 3.2.
  2. الحصول على الصور
    1. قم بتشغيل المجهر والأجهزة المتصلة (أي مصدر ضوء الإثارة والكاميرا والكمبيوتر والحاضنة وغيرها من الكتل الإلكترونية العاملة) قبل 30 دقيقة من التصوير للإحماء وتصبح متوازنة مع ظروف القياس (درجة الحرارة ، القيم المختلفة ل O 2 ، 5٪ CO2 ، الرطوبة إذا لزم الأمر). بدء تشغيل برنامج تشغيل الفحص المجهري المزود بإعداد المجهر الدقيق.
      ملاحظة: تم تكييف البروتوكول الموصوف لبرنامج CellSens Dimension الإصدار 3.
    2. حدد مرشحات الإثارة والانبعاثات المناسبة (المصدر والطاقة) ووقت التعرض لتحقيقات الفلورسنت (أو الفوسفورسنت) المختارة. بالنسبة للتحليلات المجهرية متعددة المعلمات و 3D والفاصل الزمني ، اكتب بروتوكول (بروتوكولات) تسلسل القياس الآلي في برنامج المجهر التشغيلي.
    3. تحديد إعدادات التصوير المثلى تجريبيا لكل مسبار ونموذج تجريبي وخط خلية في التجارب الأولية. تأكد من أن الإعدادات تحتوي على الحد الأدنى من التبييض الضوئي في قنوات الاستشعار المرجعية (I ref) و O2 (I sens) والحد الأدنى من التأثير على نسبة الكثافة (R = Iref / Isens) ، خاصة في تجارب قياس 3D والفاصل الزمني.
    4. قم بإعداد طبق الفحص المجهري باستخدام كرويات ملطخة على مرحلة الفحص المجهري. باستخدام هدف التكبير المنخفض ، قم بمعاينة العينة في ضوء الإرسال ، وقم بالتركيز الأولي على الكرويات وتحديد موقعها في وسط الصورة.
      ملاحظة: تكفي أهداف هواء التكبير القياسية من 4x إلى 10x للتركيز المسبق ، بينما بالنسبة للقياس الفعلي ، نوصي ب 20x إلى 40x مع فتحة رقمية (NA) تبلغ 0.6 أو أعلى (غمر الهواء أو الماء) الأهداف التي لها مسافة عمل كافية للكرويات المرفقة بالطبق.
    5. جلب الهدف مع التكبير العالي المطلوب إلى موقف العمل. ركز على وضع ضوء الإرسال في المقطع العرضي الأوسط (الاستوائي) من الكروي. الأوكسجين في كائنات 3D يعتمد بشكل مباشر على عمق قسم التصوير. لضمان ذلك، قم بتحليل المقاطع العرضية المماثلة داخل المجموعات وفيما بينها، على سبيل المثال، المقاطع العرضية الوسطى والعلوية / السفلية للكرويات.
      ملاحظة: لإجراء تحليل وإعادة بناء مفصل ودقيق لتدرجات O2 ، نوصي بمسح وإنتاج مكدسات Z باستخدام المجاهر المشوشة أو ورقة الضوء أو المجاهر ثنائية الفوتون (الخيار الأفضل). بالنسبة للفحص المجهري التقليدي واسع المجال ، حيث سيتم جمع الإشارة من جميع المقاطع العرضية في وقت واحد ، يمكن إجراء تقدير متوسط بواسطة المقطع العرضي الأوسط بدلا من التحليل الدقيق لتدرجات O2 . في هذه الحالة ، يتم تعريف المقطع العرضي الأوسط على أنه مقطع بؤري ، حيث يكون للكرويات قطر أقصى مع تركيز حاد على حدودها.
    6. اضبط الإعدادات لجمع إشارات التألق / الفسفور ذات المرجعية والقنوات الطيفية الحساسة لمسبار O2 وتحقيقات التألق الأخرى المطبقة على التصوير متعدد المعلمات.
    7. بالنسبة للمقارنة الكمية القائمة على الكثافة، قم بتطبيق نفس إعدادات التصوير المختارة لوقت التعرض، وطاقة مصدر الضوء المثير، والدقة، وسرعة المسح الضوئي، وحجم الثقب لجميع الكائنات المقاسة في مجموعات.
      ملاحظة: تتيح العديد من إصدارات برامج الفحص المجهري التي يوفرها المورد إجراء حسابات تلقائية لنسبة الكثافة. تطبيق دمج الوظائف على قياسات كثافة القنوات المرجعية والحساسة لمسبار O2 ، عند كتابة برنامج اكتساب التصوير في المدير التجريبي في برنامج التصوير المستخدم هنا.
    8. اجمع الصور من نفس القسم البصري للرجوع إليها والقنوات الطيفية الحساسة لمسبار O2 ، وإذا لزم الأمر ، قنوات التألق الإضافية. بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدم مسبار MMIR1 مع المرجع الأحمر (باستثناء = 580 نانومتر ، em. = 650 نانومتر) وبالقرب من الأشعة تحت الحمراء O2-sensitive (باستثناء = 635 نانومتر ، em. = 760 نانومتر).
    9. كرر الخطوات 3.2.5-3.2.8 لجمع عدد كاف من نقاط البيانات للتحليل الإحصائي. للتحليل الديناميكي للاستجابات الخلوية سريعة التطور عند العلاج بأدوية مختلفة أو مثبطات الميتوكوندريا أو مثبطات سلسلة نقل الإلكترونات وغيرها من المركبات سريعة المفعول، استخدم وضع قياس الفاصل الزمني (الخطوة 3.2.10).
    10. قم بإجراء القياسات في وسائط التصوير ، عند 37 درجة مئوية مع إضاءة دورية للعينة وجمع إشارات الفلوروفورات ذات الأهمية (على سبيل المثال ، مرجع مسبار O2 وقنوات الاستشعار) ، على سبيل المثال ، كل 10 ثانية لأكثر من دقيقتين.
    11. قم بإجراء فحص تركيز لكل كروي بمجرد إجراء القياس الدوري للتأكد من عدم وجود انحراف في التركيز البؤري أثناء التصوير. كرر إذا لزم الأمر. تابع الخطوة 3.3 لتحليل البيانات.
      ملاحظة: بدون تحفيز الخلايا وإضافة الدواء ، يمكن إجراء قياس الفاصل الزمني لتقييم الاستقرار الضوئي ، مقارنة بالصبغة المرجعية ، على سبيل المثال ، الفلوريسين ، الكالسين الأخضر AM أو رباعي ميثيل رهودامين استر.
  3. عرض الصور
    ملاحظة: هنا نصف كيفية حساب O تلقائيا2 نسبة كثافة المسبار (R) في الكرويات باستخدام وظيفة تحليل النسبة في برنامج التصوير وتطبيق حساب البكسل بواسطة البكسل R لإنشاء صور توزيع R ذات لون زائف لقسم المجهر الكروي. يمكن أيضا حساب R يدويا من بيانات كثافة القنوات الطيفية المرجعية والحساسة التي تم جمعها من نفس منطقة الاهتمام (ROI) للصورة الكروية عن طريق تطبيق الصيغة البسيطة R = Iالرقم المرجعي/Iحساس24,34. إذا لم يكن من الممكن استخراج بيانات الكثافة من الصورة الخام في برنامج الفحص المجهري المقابل ، فيمكن الحصول على بيانات الكثافة باستخدام برامج مثل ImageJ أو Fiji (انظر المناقشة).
    1. افتح ملف .vsi مع بيانات كثافة المسبار O2 من القنوات الطيفية المرجعية والحساسة التي تم إجراؤها في الوضع المدمج. افتح نافذة وظيفة تحليل النسبة من قائمة القياس. اختر شدة القناة المرجعية كبسط وشدة القناة الحساسة كمقام لحساب R.
      ملاحظة: النسبة المعكوسة للإشارات المرجعية والحساسة لحساب R ممكنة أيضا ، ولكن في هذه الحالة ، ستنخفض R مع الزيادة في O2.
    2. قم بتطبيق إعدادات عتبة الكثافة المقابلة على كل قناة طيفية لطرح الخلفية من صورة الكثافة المدمجة. استمر في زيادة قيم العتبة حتى تصبح خلفية الصورة سوداء بشكل موحد. تطبيق معلمة العتبة بالتساوي على جميع الصور الكروية في مجموعة البيانات المستخدمة في التحليل المقارن.
      ملاحظة: استخدم نافذة المعاينة لتحسين إعدادات العتبة من خلال مراقبة صورة R الملونة الزائفة المحسوبة الأولية للكرويات. ستتم إزالة جميع وحدات البكسل ذات الكثافة الأقل من القيمة الحالية في حقل العتبة من تحليل R وتقديمها كنقاط سوداء. بعد تطبيق العتبة ، يجب تصور المنطقة المقابلة للتألق الكروي فقط. ويبسط التقدير الأولي لمتوسط كثافة الخلفية (المناطق الخالية من الكرويات) للقنوات الطيفية المستقلة اختيار عتبة مناسبة للصورة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تطبيق حدود عائد الاستثمار الكروية، المحددة من الصورة الكروية لضوء الإرسال المقابل إلى صورة التألق المدمجة، يساعد على التحديد الدقيق لمعلمات العتبة لمنع الطرح المفرط لكثافة الإشارة غير الخلفية.
    3. احتفظ بإعدادات الخلفية لكثافة البسط والمقام عند 0 ، حيث تم طرح الخلفية بالفعل مع تطبيق العتبة.
    4. اضبط عامل القياس (المقياس) على صورة النسبة حتى توفر صورة المعاينة الدقة المطلوبة لتدرج R. تطبيق معلمة القياس بالتساوي على جميع الصور الكروية في مجموعة البيانات المستخدمة في التحليل المقارن.
      ملاحظة: يجب أن تكون معلمة القياس كبيرة بما يكفي (1000 على الأقل) للتأكد من أن صورة R تحتوي على أكبر قدر ممكن من المعلومات ويمكن عرضها كعامل دقة للبيانات الرقمية R.
    5. قم بتطبيق المعلمات المعدلة على الصورة الكروية، بالضغط على Apply. اضبط سطوع الصورة وتباينها في نافذة عرض الضبط من قائمة نوافذ الأداة.
    6. حدد يدويا حدود الربط وإلغاء الربط للرسم البياني لتوزيع النسبة باستخدام خيار القياس الثابت في النافذة ضبط العرض. سيحدد هذا نطاق شريط الألوان الزائفة لعرض المعلمة R.
      ملاحظة: لمقارنة الصور الكروية بين المجموعات المختلفة، من المهم الاحتفاظ بنطاق شريط ألوان مماثل لجميع العينات التحليلية. نظرا لأن مجموعة من التغييرات في معلمة R يمكن أن تكون مختلفة بين المجموعات ، يجب أن يكون نطاق شريط الألوان الزائف المختار عالميا لتوزيع المدرج التكراري في جميع المجموعات التحليلية.
    7. غالبا ما لا تكون الكروية كروية بشكل مثالي ، افترض أن القطر الكروي هو أطول خط مرسوم عبر المركز (غالبا ما يكون نواة نقص الأكسجة) للكروية. باستخدام دالة المسطرة الخطية من قائمة القياس، حدد القطر الكروي. تصدير البيانات كملف جدول بيانات.
    8. اختر عائد الاستثمار بالحجم المطلوب (أصغر ما يمكن) والشكل (على سبيل المثال ، مستدير) وقم بتطبيقه على المحيط وقلب نقص الأكسجين في الكروي. قم بتحويل عائد الاستثمار إلى كائن القياس لتحليل متوسط R (R-Rp الطرفي و R-Rc الأساسي) داخل عائد الاستثمار المختار. تصدير البيانات بتنسيق جدول متوافق مع جدول البيانات.
      ملاحظة: ليس للكرويات توزيع O2 متطابق بين المجموعة ولا تتشارك النوى الناقصة الأكسجين تماما مع المراكز الكروية. لتبسيط التحليل وتوحيده ، نفترض أن أكثر المناطق التي تعاني من نقص الأكسجة تتوافق مع النواة المثالية في وسط الكروية. يتم تطبيق R c المقاسة في هذه المناطق لحسابات نطاق التدرج O2 (R p-R c) والانحدار (Rp-R c) / r ، حيث r (من الناحية المثالية ، المسافة بين الأطراف و ROIs الأساسية الناقصة الأكسجين) هي نصف قطر تقريبي للكروية بالميكرومتر المحسوب من قياسات القطر. اختياريا ، يمكن تقديم تدرجات O2 الكروية كملفات تعريف خطية لتغيير معلمة R (نافذة ملف تعريف الخط في قائمة القياس) على طول القطر الكروي. يمكن أيضا تصدير هذه البيانات كملف جدول بيانات.
    9. تطبيق القياسات على كل قسم من أقسام الفحص المجهري من الكرويات للحصول على مجموعة بيانات الأقطار الكروية ، Rc و Rp لإجراء المزيد من الحسابات والمقارنة الإحصائية. دمج جميع البيانات في ملف جدول بيانات واحد.
    10. لتحليل الفاصل الزمني للتبييض الضوئي أو الاستجابات الديناميكية للمحفزات المختلفة، قم بتطبيق عائد الاستثمار المختار على نفس الإحداثيات على كل صورة في مجموعة. لمقارنة معلمات R، قم بتقديمها كنسبة مئوية من R للدورة الأولى في مجموعة صور بفاصل زمني.
    11. لتحليل التبييض الضوئي ، استخدم R من العديد من عائد الاستثمار لحساب متوسط R بالنسب المئوية لكل دورة زمنية وتتبع التغييرات.
    12. افترض أن تأثير التبييض الضوئي ليس حرجا إذا كان هناك انخفاض أقل من 5٪ في الكثافة الأولية بعد 12 دورة من الإضاءة المستمرة. قارن دائما التغيرات الديناميكية مع منحنى التبييض الضوئي كعنصر تحكم لضمان أهمية استجابة الفاصل الزمني لقياس النسبة (انظر الشكل 2A و B).
    13. من المعلمات التي تم الحصول عليها حساب r و (R p-R c) و (Rp-R c) / r للكرويات الفردية في مجموعة بيانات. تحليل الوضع الطبيعي لتوزيع البيانات بواسطة Kolmogorov-Smirnov أو الاختبارات ذات الصلة. اختر الطريقة الإحصائية المناسبة لتحليل البيانات وتابع أرقام عرض البيانات.
      ملاحظة: تم توزيع البيانات المعروضة هنا بشكل طبيعي وتم تنفيذ اختبار t مستقل عند p = 0.05 للمقارنة الإحصائية بين المجموعات الكروية.

Representative Results

إن الإنتاج عالي الإنتاجية للمسبار O2 من الكرويات الملطخة مسبقا باستخدام طريقة الأغاروز ذات الأنماط الدقيقة موضحة تخطيطيا في الشكل 1C الذي يوضح أمثلة على آبار الأغاروز الدقيقة بدون الكرويات الملطخة مسبقا ومعها. يمكن أن تكون كفاءة تكوين كروية على طلاء الأغاروز وشكلها / كرويتها خاصة بالخلية. على سبيل المثال ، لم تشكل خلايا القولون البشري HCT116 أبدا هياكل كروية مثالية باستخدام طريقة الأغاروز microwell ، على النقيض من السطح المغلف بالدهون17 ، في حين أن hDPSCs وحدها والمستزرعة بالاشتراك مع HUVEC أنتجت دائما كرويات ذات شكل وحجم قابلين للتكرار للغاية يتناسب مع تكوين الخلية وعدد الخلايا الأولي ومدة تكوين / نمو كروي. تراكمت جميع أنواع الخلايا المختبرة بكفاءة جسيمات O2 النانوية المسبار أثناء تكوين الكروية (الشكل 1B) وحافظت على هذا التلطيخ على مدى 5 أيام على الأقل ، مما سمح باستخدامها للطباعة الحيوية والمراقبة اللاحقة لأكسجة الأنسجة المطبوعة بيولوجيا (الشكل 1D).

Figure 1
الشكل 1: مبدأ وظيفة مسبار O2 وتطبيقه على تلطيخ كروي وطباعة حيوية. (أ) مخطط يابلونسكي مبسط، يشرح مبدأ استشعار O2 بواسطة مجسات الجسيمات النانوية الفوسفورية (NP). يؤدي نقل الطاقة إلى الجزيئي O 2 خلال حالة الإثارة الثلاثية المحظورة (T) إلى انخفاض شدة الفسفور بما يتناسب عكسيا مع عمر الفسفور tau ، τ (التغيرات من τ 1 عند 0٪ O 2 إلى τ 2 عند 21٪ O 2) ، وهو الوقت بين الإثارة إلى الحالة المفردة (S1) وعودتها إلى الحالة الأرضية (G0)42. يمكن إجراء القياس الكمي O2 عن طريق القياس النسبي أو عن طريق قياس τ (قياسات عمر الفسفور). (ب) مثال على تلطيخ الخلايا الجذعية لب الأسنان البشرية (hDPSC) كروية ملطخة بأنواع مختلفة من مجسات الجسيمات النانوية O 2 ، كما هو موضح في قنوات الإرسال الضوئية والمرجعية وقنوات تألق الصبغة الحساسة O2. شريط المقياس هو 100 ميكرومتر (C) مخططات مسبار O2 عالي الإنتاجية لتوليد كروي ملطخ مسبقا باستخدام طريقة الأغاروز المتناهية الصغر. من اليسار إلى اليمين: ختم السيليكون PDMS الموضوع في بئر من لوحة الثقافة، مثال على نمط microwell في agarose (تكبير 4x)، ومثال على MMIR1 كروية ملطخة مسبقا المنتجة من خلايا سرطان القولون البشرية HCT116 في اليوم 2 بعد البذر على agarose المجهري (تكبير 4x). شريط المقياس هو 100 ميكرومتر (D) من اليسار إلى اليمين: بناء وافل مطبوع بيولوجيا وتحليل مجهري للبنية المطبوعة بيولوجيا الكروية MMIR1 الملطخة مسبقا في اليومين 1 و 5 بعد الطباعة الحيوية. تتوافق إشارة التألق مع صبغة الفوسفور الحساسة O2 في الجسيمات النانوية MMIR1 (باستثناء = 635 نانومتر / em. = 760 نانومتر). شريط المقياس هو 400 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في إعداد الفحص المجهري الموصوف (المجهر الفلوري التقليدي واسع المجال المجهز بالصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) كمصدر للضوء) ، تم العثور على مسبار MMIR1 الأحمر / القريب من الأشعة تحت الحمراء باعتباره الأفضل من حيث الاستقرار الضوئي لمرجعه والأصباغ الحساسة مع انخفاض أقل من 5٪ في سطوع نسبة شدتها الأولية (R = Iref / Isens ) بعد 12 دورة من الإضاءة المستمرة. سمح ذلك باستخدام مسبار MMIR1 لإجراء دراسة ديناميكية في الوقت الفعلي للاستجابة التنفسية السريعة في الكرويات hDPSC عند العلاج باستخدام مفك الاقتران الميتوكوندريا (FCCP) ومثبط المركب I من سلسلة نقل الإلكترون (الروتينون) (الشكل 2A ، B). وجدنا أنه في الكرويات المشتقة من الخلايا الجذعية ، أظهر FCCP تأثيرا خفيفا فقط لفك الارتباط مع انخفاض طفيف في تنفس الخلايا في غضون 80 ثانية تقريبا بعد إضافة هذا الدواء ، بالاتفاق مع ميزات التمثيل الغذائي المبلغ عنها سابقا ل DPSC40. من ناحية أخرى ، ثبط الروتينون بقوة التنفس مما أدى إلى إعادة الأكسجين الكروي (ينعكس على أنه زيادة نسبة Rp - محيط كروي و Rc - نسبة القلب الكروي) وتبديد تدرجات O2 المحيطية إلى الأساسية في غضون ~ 80 ثانية بعد التحفيز (الشكل 2A). أكد نصف المعايرة شبه النقطتين لنسبة مسبار MMIR1 (R) عند الارتفاع (الغلاف الجوي) والمنخفض (في وجود كبريتيت الصوديوم وأوكسيديز الجلوكوز في وسائط التصوير) O2 انخفاض R ، المرتبط بانخفاض الأوكسجين في الكرويات مع التنفس المثبط الأولي بواسطة علاج كوكتيل antimycin A / rotenone (الشكل 2C )، موضحا كيف يمكن تطبيق قياس مسبار MMIR1 R للرصد شبه الكمي للحالة الثابتة طويلة الأجل واستجابات الأوكسجين السريعة في 3D.

Figure 2
الشكل 2: التحليل الحركي لاستجابة مسبار O2 للمحفزات المختلفة. (أ) نتيجة تمثيلية لتصوير الأوكسجين الكروي hDPSC أثناء الراحة واستجابة لعلاجات FCCP والروتينون. شريط المقياس هو 100 ميكرومتر (B) الاستجابة الحركية لنسبة كثافة MMIR1 إلى FCCP ومعالجة الروتينون مقارنة بحركية نسبة كثافة التبييض الضوئي الأولية (٪). (ج) التغيرات في صور نسبة الكثافة لمسبار MMIR1 في الكرويات hDPSC عند الأوكسجين (إضافة مضاد المايسين A + rotenone) وإزالة الأكسجين (إضافة أوكسيديز الجلوكوز). يمثل شريط الألوان نسبة كثافة المسبار O2 (R = Iref / Isens) التوزيع عبر الصورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لتوضيح تطبيق مسبار MMIR1 للتصوير الأيضي الحي ، تم إجراء التحليل المقارن لتدرجات O2 في hDPSC متجانسة الخلايا مقابل hDPSC / HUVEC (1: 1) غير المتجانسة. الاستفادة من توافر القنوات الطيفية الفلورية الزرقاء والخضراء المجانية المشتركة مع Hoechst 34580 (HXT) و SYTOX Green (SYTOX) تم إجراؤها لإثبات تطبيق مسبار O2 للدراسات متعددة المعلمات (الشكل 3). باستخدام البروتوكول الآلي لحسابات نسبة كثافة البكسل إلى البكسل التي يوفرها برنامج التصوير ، تم إنتاج صور نسبة الألوان الكاذبة لتوزيع R في الكرويات ، وتصور تدرجات المحيط إلى النواة O 2 المكتشفة في الوقت الفعلي في جميع أنواع الكرويات: مع المحيط المؤكسج ومنافذ نقص الأكسجين في الوسط (الشكل 2 والشكل 3A). ومع ذلك، اختلفت قيم Rp وRc، فضلا عن انحدار تدرج O2 في المقاطع العرضية الوسطى لأنواع كروية مختلفة: انظر ملامح خطوط المقاطع العرضية الوسطى في hDPSC مقابل كرويات hDPSC/HUVEC و hDPSC مقابل كرويات hDPSC المطبوعة بيولوجيا (الشكل 3B,C). نظرا لعدم وجود طريقة مقبولة على نطاق واسع لوصف تدرجات O 2 ، فقد أدخلنا العديد من المعلمات التي تسمح بسهولة المقارنة والوصف التفصيلي للأكسجة الكروية العامة: R p و R c ، وخصائص تدرجات O2 كفرق بين المناطق المؤكسجة ونقص الأكسجين مثل (R p-R c) ، ومتوسط التغيرات في الأوكسجين لكل ميكرومتر ك (R p-R c) / r ، حيث r هي مسافة بين المحيط وقلب نقص الأكسجة ، ترتبط في المقطع العرضي الأوسط بنصف قطر كروي (الشكل 3D). وقد ساعدتنا المقارنة الإحصائية لهذه المعلمات جنبا إلى جنب مع البيانات المستمدة من الخلايا الميتة الميتة الميتة التي تصورها SYTOX في الكرويات على استخلاص استنتاجات أولية حول أصل تدرجات توزيع O2 الخاصة بنوع الخلية الكروية.

Figure 3
الشكل 3: تحليل مقارن لتدرجات الأوكسجين في الكرويات. (أ) أمثلة تمثيلية للفحص المجهري الحي للأكسجين (المجهر الفلوري النسبي ل MMIR1) وتلطيخ الخلايا الحية / الميتة (Hoechst 34580 ، HXT ، Blue و SYTOX Green ، SYTOX) في الكرويات hDPSC متماثلة الخلايا قبل وبعد الطباعة ، و hDPSC / HUVEC غير المتجانسة الخلايا (1: 1) الكروية. كانت hDPSCs في جميع أنواع الكرويات من نفس مزرعة الخلايا. تم تلطيخ الكرويات مسبقا ب 5 ميكروغرام / مل من مسبار MMIR1 لمدة يومين أثناء تكوينها ، ثم استخدمت إما للتصوير أو الطباعة الحيوية (كرويات hDPSC فقط) ، مع تحليل التصوير اللاحق في اليوم 1 بعد الطباعة الحيوية. تتوافق الصور الملونة الزائفة لنسبة الكثافة (Iref / Isens) للكرويات الملطخة ب MMIR1 مع تدرجاتها الطرفية إلى الأساسية O2. شريط المقياس هو 100 ميكرومتر. يمثل شريط الألوان نسبة كثافة المسبار O2 (R = Iref / Isens) التوزيع عبر الصورة. يتوافق الرقمان 1 و 2 من المقاطع العرضية للقطر مع ملامح الكثافة الموضحة في B و C. (B ، C) مقارنة ملامح نسبة الكثافة بين hDPSC المتجانسة مقابل الكرويات hDPSC / HUVEC غير المتجانسة (B) والكرويات hDPSC المتجانسة قبل وبعد الطباعة الحيوية (C). تم قياس الملامح للمقاطع العرضية للكرويات الموضحة في (A). (د) التمثيل التخطيطي للبارامترات المستخدمة في وصف التدرجات المحيطية إلى النواة O2 في الكرويات، حيث r هو نصف قطر كروي وRp وRc هي نسب كثافة المحيط والمنطقة الأساسية من الكروية في المقابل. يمثل شريط الألوان تخطيطيا توزيع تدرج O2 من مستويات عالية (حمراء) إلى منخفضة (زرقاء) في كروية كروية مثالية. (E,F) تحليل مقارن لقيم التدرجات المحيطية إلى النواة O2 (Rp-R c) / r في hDPSC / HUVEC و hDPSC كروية (E) وفي كرويات hDPSC قبل وفي اليوم 1 بعد الطباعة الحيوية (F). تم إجراء تحليل إحصائي لتكرار تجريبي واحد (n = 18-23). تتوافق الصناديق مع الانحرافات المعيارية. تشير العلامات النجمية إلى الفرق الإحصائي بين المجموعات (عند p = 0.05) ؛ ** = ص < 0.0005. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالمقارنة مع الكرويات hDPSC متجانسة الخلايا، كان للكرويات hDPSC/HUVEC تدرجات أكثر حدة بكثير: قيم أعلى من (R p-R c) / r معلمة ونطاق (Rp-R c; الشكل 3 واو). وفي الوقت نفسه، أظهروا أكسجة أعلى في المحيط (Rp) والنواة (Rc) (الشكل 4A، الجدول 1). ومن المثير للاهتمام أنها كانت أيضا أكبر إحصائيا (الشكل 4 أ ، الجدول 1) ، مما يشير إلى أن هذه الاختلافات في الأوكسجين كانت ناجمة عن ملامحها المختلفة للطاقة الحيوية الخلوية. تتفق هذه البيانات مع السمات الأيضية المعروفة لخلايا HUVEC التي لديها نشاط تنفس أقل بشكل عام للخلايا مع الاعتماد القوي على تحلل السكر ومسارات البنتوز والفوسفات كمصادر الطاقة الحيوية الرئيسية ل ATP و NAD (P) H41. وفي الوقت نفسه، من المرجح أن يكون التدرج الواضح من المحيط إلى النواة O2 المتشكل في كرويات غير متجانسة ناتجا عن hDPSC في تكوينها، والذي يتميز بالميتوكوندريا مفرطة الاستقطاب وسلسلة نقل الإلكترونات النشطة40، ووفقا للنتائج المتعلقة بأكسجة الكرويات hDPSC، فإن لها نشاطا قويا في التنفس (الشكل 3، الشكل 4A، والجدول 1). ). وبالتالي ، فإن ارتفاع صلاحية الكرويات hDPSC / HUVEC التي تؤكدها الكثافة المنخفضة لخلاياها الميتة الملطخة ب SYTOX (الشكل 3A) من المحتمل أن يرتبط بارتفاع مستويات الأوكسجين لديها.

لتوضيح إمكانية تطبيق التصوير المجهري الحي للأكسجة الكروية في التصنيع الحيوي ، تم استخدام MMIR1 O 2-probe الكرويات الملطخة مسبقا للطباعة الحيوية في الحبر الحيوي GelMA مع المقارنة التالية لتدرجات O 2 في الكرويات hDPSC قبل وفي اليوم 1 بعد الطباعة الحيوية (الشكل 3A و C و F والشكل 4B والجدول 2). كان للكرويات المطبوعة بيولوجيا hDPSC محيط مؤكسج بشكل كبير (أعلى Rp) مقارنة بالكرويات ، التي تم قياسها قبل الطباعة الحيوية ، في حين أن الأوكسجين الأساسي لها قيم مماثلة (الشكل 4B). تؤثر التغيرات في الأوكسجين المحيطي بها على المدى (زيادة (R p-R c) والانحدار (زيادة (Rp-R c)/r) لتدرجات O2 من المحيط إلى النواة ، والتي كانت مختلفة إحصائيا عن الكرويات hDPSC التي تم قياسها قبل الطباعة الحيوية (الشكل 3F والشكل 4B). كانت تلطيخ الخلايا الميتة أكثر إشراقا بشكل عام في الكرويات المطبوعة بيولوجيا ، مما يشير إلى أن انخفاض الجدوى الكروية يشارك في تغيير الأوكسجين الكروي (الشكل 3A).

Figure 4
الشكل 4: تحليل مقارن لقطر الكرويات الملطخة ب MMIR1 ونسبة كثافتها . (أ) مقارنة بين الكرويات غير المتجانسة hDPSC / HUVEC و hDPSC متجانسة الخلايا. (ب) مقارنة بين الكرويات المتجانسة الخلايا hDPSC قبل وبعد الطباعة الحيوية. Rp و Rc - نسبة الكثافة في محيط وقلب الكرويات المقابلة ؛ (Rp-R c) - الفرق في نسبة الكثافة ، المقابلة لنطاق تدرج O2 في الكرويات. تم إجراء تحليل إحصائي لنسخة تجريبية واحدة (n = 18-23). تتوافق الصناديق مع الانحرافات المعيارية. تشير العلامات النجمية إلى الفرق الإحصائي بين المجموعات (عند p = 0.05) ، حيث * = p < 0.005 و ** = p < 0.0005. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

نوع الكروية (N) القطر [ميكرومتر] Rp [a.u.] Rc [a.u.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./μm]
hDPSC / HUVEC (18) 113.2 ± 10.6 0.779 ± 0.034 0.398 ± 0.055 0.982 ± 0.051 0.00677 ± 0.00091
إتش دي بي إس سي (18) 88.1 ± 9.9 0.558 ± 0.025 0.331 ± 0.034 0.227 ± 0.032 0.00520 ± 0.00090
قيمة p 1.5 × 10-8 * 1.5 × 10-21 * 1.3 × 10-4 * 1.4 × 10-12 * 9.2 × 10-6 *

الجدول 1. القطر الكروي، ونسبة الشدة في القلب (R c) ومحيط (R p) من الكرويات، والفرق في نسبة الكثافة (R p-R c) و (R p-R c) / r القيمة في hDPSC / HUVEC غير المتجانسة والكروية hDPSC المتجانسة. توضح القيمة p لاختبار t على الكرويات N الفرق الإحصائي ويشار إليها بعلامة نجمية أيضا.

نوع الكروية (N) القطر [ميكرومتر] Rp [a.u.] Rc [a.u.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./μm]
إتش دي بي إس سي (18) 88.1 ± 9.9 0.558 ± 0.025 0.331 ± 0.034 0.227 ± 0.032 0.00520 ± 0.00090
مطبوعة بيولوجيا hDPSC (23) 80.9 ± 12.5 0.584 ± 0.023 0.323 ± 0.038 0.261 ± 0.039 0.00658 ± 0.00144
قيمة p 0.054 0.0024 * 0.46 9.9 × 10-4 * 6.3 × 10-6 *

الجدول 2. القطر الكروي ، ونسبة الكثافة في القلب (R c) ومحيط (R p) من الكرويات ، والفرق في نسبة الكثافة (R p-R c) و (R p-R c) / r القيمة في كرويات hDPSC المتجانسة قبل وبعد الطباعة الحيوية. p-قيمة التحليل الإحصائي (N كروية). يشار إلى الفرق الإحصائي بعلامة نجمية.

Discussion

اهميه. يعطي قياس أكسجة الأنسجة نظرة ثاقبة على عملية التمثيل الغذائي الخاصة بالخلايا والأنسجة ، ونمو الأنسجة وتطورها ، والجدوى ، وتكوين الأورام وهجرة الخلايا ، والتفاعل مع الميكروبات ومسببات الأمراض الأخرى. تعطي الطريقة المقدمة أداة جديدة لفهم أفضل لفسيولوجيا الثقافات الكروية متعددة الخلايا: تحليل الأوكسجين باستخدام مجسات الجسيمات النانوية O2 ذات النسب اللونية وتوفر وسائل لتقييم نقص الأكسجة ، وتصور الاعتماد على مسارات إنتاج طاقة معينة وتكمل دراسات النمذجة ونهج التصوير الأيضي البديلة43,44 على المجهر الفلوري منخفض التكلفة المتاح على نطاق واسع. يمكن إجراء قياسات قياس النسبة على مجال واسع من التألق (يفضل إثارة LED النبضية) ، وخلط المسح الضوئي بالليزر ، وورقة الضوء ، والمجاهر ثنائية الفوتون ، المجهزة بشكل مثالي بغرف حاضنة T و O2. الأهم من ذلك ، يمكن بسهولة الجمع بين قياس المجهر O2 المقدم مع التحليل الحي متعدد المعلمات لمختلف المعلمات الفسيولوجية ومقتفيات الخلايا (في حالة الثقافات الكروية غير المتجانسة) ، والجدوى (تلطيخ حي / ميت) ، واستقلاب الدهون (تحقيقات الفلورسنت المستشعرة للدهون) ، وديناميات الرقم الهيدروجيني (الأصباغ ، الجسيمات النانوية ، والبروتينات الفلورية) أو [Ca2+ ]، يتم إجراؤه في القنوات الطيفية الفلورية المتاحة أو بالتوازي، مما يعطي رؤية موسعة لوظيفة الخلية في الوقت الفعلي في الكرويات، والتركيبات المطبوعة بيولوجيا، وعمليات زرع الأنسجة المحتملة.

تجد الثقافات الكروية استخداما في دراسات الخلايا السرطانية ، والبيئة الدقيقة المتخصصة في الورم والخلايا الجذعية ، والأورام ، وكفاءة الأدوية وفحص السمية ، وفي الواقع ككتل بناء الأنسجة للتصنيع الحيوي للأنسجة والتجميع الذاتي45. يمكن توليدها من أنواع متعددة من الخلايا بواسطة مجموعة متنوعة من الأساليب المختلفة46. تتطلب شعبية النموذج الكروي توحيدها من وجهة نظر نزاهة البحث وتحسين تحليل البيانات ، والتي تمت محاولتها مؤخرا من خلال تطوير أول قاعدة بيانات كروية8.

من المتوقع أن يساعد بروتوكولنا على فهم الأيض الكروي الحي بشكل أفضل ، وتوحيد هذا النموذج التجريبي ، وبالتالي تحسين استقرارها على المدى الطويل ، وقابليتها للتكرار ، وقابليتها للحياة داخل المواد المطبوعة بيولوجيا والقابلة للزرع.

التعديلات. يصف هذا البروتوكول استخدام سطح الأغاروز منخفض الالتصاق بالأنماط الدقيقة (التكوين القائم على العفن الدقيق29) لتوليد غلة عالية من الكرويات المحملة بمسبار O2 لتحليل الأكسجين. الطرق البديلة لإنتاج الكروية مثل الإسقاط المعلق ، أو تطبيق ألواح التعلق المنخفضة للغاية ، أو طلاء الدهون ، أو التكوين العائم الحر متوافقة أيضا مع بروتوكول تحميل مسبار O2 المقترح. تم تحسين البروتوكول المقدم للكرويات hDPSC وكرويات الاستزراع المشترك ل hDPSC مع HUVEC (1: 1). خطوط الخلايا الأخرى قابلة للتطبيق بالتأكيد15،17،47،48. ومع ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى بعض تحسين البروتوكول بسبب خصائص التصاق الخلايا المختلفة ، وظروف الثقافة ، ومتطلبات الركيزة الأيضية ، وتوافق الخلايا مع تلطيخ الجسيمات النانوية. يجب أن يتم اختيار مسبار حساس للجسيمات النانوية O 2 مناسب اعتمادا على نموذج خلية معين ووفقا لخصائص التبييض الضوئي للمجس في إعداد الفحص المجهري المستخدم (شدة ونوع مصدر الضوء ، والحساسية الطيفية للكاميرا) وتوافر مرشحات الإثارة / الانبعاثات المناسبة للمرجع المقابل والقنوات الطيفية الحساسة O2 للمسبار.

تتوفر بعض مجسات O 2 لقياس النسبة تجاريا2. بدلا من ذلك ، يمكن تحضيرها داخليا عن طريق الترسيب المشترك للأصباغ المرجعية والأصباغ الحساسة O2 مع البوليمر كما هو موضح في مكان آخر24،25،49. لكل نموذج على حدة ، يجب إجراء الاختبارات الأولية من أجل تحديد ظروف المسبار المناسبة والفحص المجهري الأمثل وتقليل تأثير التبييض الضوئي للمسبار أو استهلاك O2 المستحث ضوئيا أثناء القياسات النسبية. أظهرت الدراسات السابقة للجسيمات النانوية المستشعرة O2 سميتها الخلوية المنخفضة ، مما يسمح بالتطبيق في مجموعة واسعة من تركيزات التلطيخ (1-20 ميكروغرام / مل). نظرا لأن بعض الجسيمات النانوية الكاتيونية يمكن أن تتجمع ذاتيا أثناء التخزين ، فإننا نوصي بالحفاظ على تركيز تحميلها منخفضا قدر الإمكان لتقليل تأثيرها المحتمل على تكوين كروي. اختياريا، يمكن تصفية تعليق الجسيمات النانوية (0.2 ميكرومتر) أو تطهيره عن طريق الطرد المركزي (10000 × جم، 5 دقائق) قبل استخدامه لإزالة جميع الركام من التعليق.

على الرغم من أن برنامج BioCAD و HMI محددان للطابعة الحيوية المقدمة ، إلا أن هذا البروتوكول ينطبق على الطابعات الحيوية الأخرى ، حيث يتم توفير إعداد الحبر الحيوي والتجميع وملء خرطوشة قياسية وتصميم سقالة هيدروجيل مسامية. علاوة على ذلك ، يجب أن تكون معلمات الطباعة الحيوية مثل معدل الطباعة ودرجة الحرارة قابلة للمقارنة مع الطابعات الحيوية المختلفة القائمة على البثق. يعتمد ضغط الطباعة وقطر الدعامة على نوع الإبرة وقطرها وتكوين الحبر الحيوي ودرجة الحرارة واللزوجة الناتجة عنها ، ولكنها يمكن أن تكون نقطة انطلاق لتحسين معلمات الطباعة إلى الأحبار الحيوية المستندة إلى GelMA مع طابعات حيوية مختلفة ، على الرغم من أن بعض الطابعات الحيوية تستخدم المغزل بدلا من ضغط الهواء لبثق bioink50.

الخطوات الحاسمة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في اختيار مسبار O2 ، الذي يستند إلى الاعتبارات التالية: أولا ، إعداد المجهر الفلوري المتاح (أي مصدر ضوء الإثارة المتوافق ، ومرشحات الإثارة والانبعاث ، وحساسية الكاميرا والنفاذية الطيفية والفتحة العددية للهدف) ، والتي يمكن أن تحد من عدد المجسات المتاحة فيما يتعلق باستقرارها الضوئي ، السطوع والسمية الضوئية المحتملة. من المهم أيضا ملاحظة أن بعض أنواع زيت الغمر (في حالة أهداف غمر الزيت) يمكن أن تتداخل مع إشارات التألق الحمراء والأشعة تحت الحمراء. نحن نرى أن اختبارات الاستقرار الضوئي مهمة للغاية وأنه يجب إجراؤها أثناء الإعداد الأولي والاختبارات الأولية. يجب النظر في الحديث الطيفي المحتمل بين قنوات الفلورسنت والأصباغ المختلفة. في الواقع ، يجب تقييم السمية المظلمة والمستحثة ضوئيا المحتملة لمسبار O2 والأصباغ المختارة الأخرى ، فيما يتعلق بنموذج الخلية المحدد ، أثناء تحسين البروتوكول51. يمكن أن تكون المشكلة المحددة للجسيمات النانوية هي تجميعها الذاتي ، والذي يمكن تخفيفه عن طريق تحسين تركيز عملها ، وتكوين وسط التلطيخ (على سبيل المثال ، محتوى المصل) ، وصوتنة الجسيمات النانوية قبل الخلط مع الوسط أو باستخدام الخلايا الملطخة مسبقا والمغسولة بمسبار O2 لتشكيل كروي بدلا من تحميل المسبار أثناء تكوين الكروية وإجراء الضغط.

لم نلاحظ المشاكل المرتبطة بعمق اختراق الضوء مع النماذج الكروية الموصوفة ، ولكن يجب مراعاة ذلك عند اختيار إشارات الكثافة النسبية ، وحجم التركيبات الكروية والمصنعة بيولوجيا (ترقيع الأنسجة) وتحسين تلطيخ الخلايا بالأصباغ المعنية. من المتوقع أن يوفر مسبار MMIR1 الذي يتطابق بشكل وثيق مع الأطوال الموجية للانبعاثات الحمراء والقريبة من الأشعة تحت الحمراء أدنى خلفية وأفضل اختراق لضوء الأنسجة ، مقارنة بمجسات الاستشعار الحيوي الفلورية الأخرى التي تنبعث منها الأشعة الحمراء / الزرقاء أو الخضراء.

يمكن إنتاج الصور ذات النسبة ومعالجتها (ومن المحتمل أن تكون غير مختلطة طيفية أو فك الالتفاف) في برنامج مقدم من البائع أو في خيارات مفتوحة المصدر مثل ImageJ و Fiji52,53 و napari (https://napari.org) و MATLAB وغيرها. ستكون الخطوة الحاسمة في طرح الخلفية وقياس تغيرات شدة الإشارة في نطاق خطي.

معايرة مسبار O 2: الروتينون ومضاد المايسين A هما مثبطان للمجمعين I و III من سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا ، على التوالي ، مما يمنع تنفس الخلايا 54,55,15 ويحفز تبديد تدرجات O 2 في الكرويات وتوازنها مع O 2 البيئي. وبالتالي ، فإن تغيير تركيز O 2 البيئي (أي 20٪ ، 15٪ ، 10٪ ، 5٪ ، 2.5٪ ، 1٪ O 2) سيسمح بكثافة نسبية أو معايرة عمر الفسفور للمسبار الحساس O2 في الخلايا. عادة ، لا تستطيع الحاضنات التي يتم التحكم فيها O 2 تحقيق 0٪ O2 المطلق وفي حالات معينة ، يلزم إجراء اختبار سريع لاستجابة المسبار لإزالة الأكسجين. في مثل هذه الحالات ، يجب إضافة 25-100 ميكروغرام / مل من أوكسيديز الجلوكوزأو Na 2 SO3 / K2HPO4 خليط (50 ملغ / مل لكل مركب لمحلول 10x في الماء المقطر) إلى العينة. الأهم من ذلك ، إذا كان خط الخلية يحتوي على درجة كبيرة من استهلاك O2 غير الميتوكوندريا ، ففكر في ذلك عند إجراء تجارب تثبيط التنفس والمعايرة.

القيود والبحوث المستقبلية. القيد الرئيسي للطريقة المقترحة والكشف عن قياس النسبة بشكل عام ، هو معايرة وتحويل مستويات النسبة المرصودة إلى مستويات O2 الفعلية ، والتي بسبب الاختلافات الجوهرية في إعدادات الحصول على الأجهزة وصور المستخدم ستجعل أداة معايرة النسبة وخلية محددة. الأهم من ذلك ، بالنسبة للمجهر الفلوري واسع المجال والإعداد الموصوف ، تعكس صور النسبة إسقاطات مدمجة بدلا من المقاطع البصرية المثالية ولن يكون من المنطقي معايرة O2 . من ناحية أخرى ، نظهر أن قياسات النسبة شبه الكمية توفر نمطا ظاهريا مقارنا ذا دلالة إحصائية وسهلة القياس للكرويات المنتجة من مصادر مختلفة ولها اختلافات في الأكسجين.

إن الأبحاث المستقبلية في جعل مناهج الفحص المجهري التي يمكن الوصول إليها وبأسعار معقولة والمصممة للكائنات الحية ثلاثية الأبعاد مثل SPIM ، ورقة الضوء ، ثيتا ، التصوير ثنائي الفوتون والتلألؤ مدى الحياة جنبا إلى جنب مع التعلم الآلي56،57،58،59،19 ، ستساعد في جلب التصوير O2 متعدد المعلمات إلى تطبيقات أكثر كمية.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة صندوق البحوث الخاصة من جامعة غنت (BOF/STA/202009/003) وبرنامج الاتحاد الأوروبي FP7 ITN "Chebana"، اتفاق المنحة رقم 264772 (ل AVK). تتوفر البيانات عند الطلب. رمز G للطباعة الحيوية متاح للمشاركة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 Also available from Sigma
12 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 665-180 Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable Ibidi 81201 Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes Nerbe plus 02-502-3001 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3cc Cartridge, UV secure, luer lock RegenHU C-033CC-UV Also available from CelIink and others
3D Discovery Bioprinter RegenHU N/A Bioprinter equiped with an extrusion based printhead, heating mantle, UV-LED curing lamp, 3D Discovery HMI software (CAD/CAM software with direct machine control) and BioCAD software (version 1.1-12)
6 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 657160 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674-25MG Used as inhibitor of complex III of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
B-Braun Tip Cap, luer lock RegenHU TC-BB-B Also available from Regemat, Cellink and others
Cell view cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment, sterile Greiner bio-one 627861 For microscopy of bioprinted spheroids
Collagen from human placenta, type IV Sigma C5533 For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
D(+)-Glucose Merck 8342 Prepare 1M stock solution, 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free Sigma-Aldrich D5030-10X1L For preparation of imaging medium
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Also available from Lonza and others
Endothelial Growth SupplementMix PromoCell C-39216 Also available from Lonza and others
FCCP, Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920-10MG Used as mitochondrial uncoupler
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-098 Also available from Sigma
GelMA N/A N/A GelMA was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782] but are also available from Xpect Inx
Glucose-oxidase from Aspergillus nige (10000 u) Sigma-Aldrich G7141 Used to test the response of probe to deoxygenation
GlutaMAX 100x Supplement Gibco 35050-038 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 2mM)
HEPES (1M) Gibco 15630-080 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Hoechst 34580 Invitrogen (Life Technologies) H21486 Also available from Sigma, BDBiosciences and others
Human dental pulp stem cells (hDPSC) Lonza PT-5025 Also available from ATCC or other vendors
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2517 Also available from ATCC or other vendors
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) Merck 4873 For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
Li-TPO N/A N/A Li-TPO-L was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent)  [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97
8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] but comparable photo-initiators are available from Sigma
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium Gibco 32561-029 Also available from Sigma and others
Micro-patterned 3D-printed PDMS stamps, wells with a diameter 400 µm, thickness, total well numbers 1585 Self-fabricated These stamps were self-fabricated by the Centre for Microsystems Technology (Professor Dr Jan Vanfleteren, University of Gent) but can also be obtained commercially from Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit)
Na2SO3 (sodium sulfite) Sigma-Aldrich 239321-500G For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
O2 probes: MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+ N/A N/A Can be prepared ‘in-house’ using commercially available dyes, polymers and precipitation method [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Some nanoparticles are available commercially as discussed in [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x ]
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution Gibco 15140-122 Also available from Sigma . Apply in dilution 1:100
Petri dishes, sterile Greiner bio-one 633181 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Piston for 3cc cartridge RegenHU P-03CC-UV Also available from Cellink, Regemat and others
Poly-D-lysine Sigma P6407-5mg For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
PVDF syringe filter 0.22 µm Novolab A35149 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Rotenone Sigma-Aldrich R8875-1G Used as inhibitor of complex I of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SYTOX Green Invitrogen (Life Technologies) S7559 Also available from Sigma, Promega and others
Taper tip 22 gauge (conical PE needle Amada Myachi Europe 22K62222 Similar products are also available from RegenHU, Cellink, Regemat and others
Tissue culture flask (75 cm2) VWR 734-2313 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Ultrapure Agarose Invitrogen (Life Technologies) 16500-500 Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope Olympus N/A Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Biological detection by optical oxygen sensing. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8700-8732 (2013).
  2. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
  3. Cordeiro, I. R., Tanaka, M. Environmental oxygen is a key modulator of development and evolution: From molecules to ecology: Oxygen-sensitive pathways pattern the developing organism, linking genetic and environmental components during the evolution of new traits. BioEssays. 42 (9), 2000025 (2020).
  4. Wenger, R. H., Kurtcuoglu, V., Scholz, C. C., Marti, H. H., Hoogewijs, D. Frequently asked questions in hypoxia research. Hypoxia. 3, 35 (2015).
  5. Erecińska, M., Silver, I. A. Tissue oxygen tension and brain sensitivity to hypoxia. Respiration Physiology. 128 (3), 263-276 (2001).
  6. Gholipourmalekabadi, M., Zhao, S., Harrison, B. S., Mozafari, M., Seifalian, A. M. Oxygen-generating biomaterials: a new, viable paradigm for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 34 (12), 1010-1021 (2016).
  7. Zheng, L., Kelly, C. J., Colgan, S. P. Physiologic hypoxia and oxygen homeostasis in the healthy intestine. A review in the theme: cellular responses to hypoxia. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 309 (6), 350-360 (2015).
  8. Peirsman, A., et al. MISpheroID: a knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nature Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
  9. Suvarnapathaki, S., Wu, X., Lantigua, D., Nguyen, M. A., Camci-Unal, G. Breathing life into engineered tissues using oxygen-releasing biomaterials. NPG Asia Materials. 11 (1), 1-18 (2019).
  10. Salazar-Noratto, G. E., et al. Understanding and leveraging cell metabolism to enhance mesenchymal stem cell transplantation survival in tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells. 38 (1), 22-33 (2020).
  11. Leedale, J. A., et al. Mathematical modelling of oxygen gradients in stem cell-derived liver tissue. Plos One. 16 (2), 0244070 (2021).
  12. Sutherland, R., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
  13. Walenta, S., Dötsch, J., Bourrat-Flöck, B., Mueller-Klieser, W. Size-dependent oxygenation and energy status in multicellular tumor spheroids. Oxygen Transport to Tissue XII. , Springer. (1990).
  14. Hompland, T., Fjeldbo, C. S., Lyng, H. Tumor hypoxia as a barrier in cancer therapy: Why levels matter. Cancers. 13 (3), 499 (2021).
  15. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  16. Dmitriev, R. I., Borisov, S. M., Jenkins, J., Papkovsky, D. B. Multi-parametric imaging of tumor spheroids with ultra-bright and tunable nanoparticle O2 probes. Imaging, manipulation, and analysis of biomolecules, cells, and tissues XIII. , International Society for Optics and Photonics. (2015).
  17. Dmitriev, R. I., et al. Versatile conjugated polymer nanoparticles for high-resolution O2 imaging in cells and 3D tissue models. ACS Nano. 9 (5), 5275-5288 (2015).
  18. Okkelman, I. A., Puschhof, J., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Visualization of Stem Cell Niche by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. Intestinal Stem Cells. , Springer. 65-97 (2020).
  19. Dmitriev, R. I., Intes, X., Barroso, M. M. Luminescence lifetime imaging of three-dimensional biological objects. Journal of Cell Science. 134 (9), 1-17 (2021).
  20. Yasukagawa, M., Yamada, K., Tobita, S., Yoshihara, T. Ratiometric oxygen probes with a cell-penetrating peptide for imaging oxygen levels in living cells. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. 383, 111983 (2019).
  21. Xie, B. -R., et al. A near infrared ratiometric platform based π-extended porphyrin metal-organic framework for O2 imaging and cancer therapy. Biomaterials. 272, 120782 (2021).
  22. Düssmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O 2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death & Disease. 8 (6), 2853 (2017).
  23. Roussakis, E., et al. Theranostic biocomposite scaffold membrane. Biomaterials. 212, 17-27 (2019).
  24. Kondrashina, A. V., et al. A phosphorescent nanoparticle-based probe for sensing and imaging of (intra) cellular oxygen in multiple detection modalities. Advanced Functional Materials. 22 (23), 4931-4939 (2012).
  25. Borisov, S. M., et al. Precipitation as a simple and versatile method for preparation of optical nanochemosensors. Talanta. 79 (5), 1322-1330 (2009).
  26. Borisov, S., Nuss, G., Klimant, I. Red light-excitable oxygen sensing materials based on platinum (II) and palladium (II) benzoporphyrins. Analytical Chemistry. 80 (24), 9435-9442 (2008).
  27. Strobl, M., Rappitsch, T., Borisov, S. M., Mayr, T., Klimant, I. NIR-emitting aza-BODIPY dyes-new building blocks for broad-range optical pH sensors. Analyst. 140 (21), 7150-7153 (2015).
  28. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  29. Fukuda, J., et al. Micromolding of photocrosslinkable chitosan hydrogel for spheroid microarray and co-cultures. Biomaterials. 27 (30), 5259-5267 (2006).
  30. Thomsen, A. R., et al. A deep conical agarose microwell array for adhesion independent three-dimensional cell culture and dynamic volume measurement. Lab on a Chip. 18 (1), 179-189 (2018).
  31. Gevaert, E., et al. High throughput micro-well generation of hepatocyte micro-aggregates for tissue engineering. PloS One. 9 (8), 105171 (2014).
  32. De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
  33. Rivron, N. C., et al. Tissue deformation spatially modulates VEGF signaling and angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (18), 6886-6891 (2012).
  34. Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring phagosome pH by ratiometric fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (106), e53402 (2015).
  35. Billiet, T., Gevaert, E., De Schryver, T., Cornelissen, M., Dubruel, P. The 3D printing of gelatin methacrylamide cell-laden tissue-engineered constructs with high cell viability. Biomaterials. 35 (1), 49-62 (2014).
  36. Tytgat, L., et al. Photopolymerizable materials for cell encapsulation. 3D Printing and Biofabrication. Ovsianikov, A., Yoo, J., Mironov, V. , Springer International Publishing. Berlin. 353-396 (2018).
  37. Markovic, M., et al. Hybrid tissue engineering scaffolds by combination of three-dimensional printing and cell photoencapsulation. Journal of Nanotechnology in Engineering and Medicine. 6 (2), 0210011 (2015).
  38. De Moor, L., et al. Hybrid bioprinting of chondrogenically induced human mesenchymal stem cell spheroids. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 484 (2020).
  39. Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Hynes, J., Papkovsky, D. B. Kinetic analysis of local oxygenation and respiratory responses of mammalian cells using intracellular oxygen-sensitive probes and time-resolved fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 183-207 (2014).
  40. Uribe-Etxebarria, V., Agliano, A., Unda, F., Ibarretxe, G. Wnt signaling reprograms metabolism in dental pulp stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (8), 13068-13082 (2019).
  41. Vizán, P., et al. Characterization of the metabolic changes underlying growth factor angiogenic activation: identification of new potential therapeutic targets. Carcinogenesis. 30 (6), 946-952 (2009).
  42. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Quenched-phosphorescence detection of molecular oxygen: applications in life sciences. Royal Society of Chemistry. , (2018).
  43. Perottoni, S., et al. Intracellular label-free detection of mesenchymal stem cell metabolism within a perivascular niche-on-a-chip. Lab on a Chip. 21 (7), 1395-1408 (2021).
  44. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) and extracellular flux analyses. Redox Biology. 30, 101420 (2020).
  45. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  46. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), 20160877 (2017).
  47. Dmitriev, R. I., et al. Imaging oxygen in neural cell and tissue models by means of anionic cell-permeable phosphorescent nanoparticles. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (2), 367-381 (2015).
  48. Jenkins, J., Borisov, S. M., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Sulforhodamine nanothermometer for multiparametric fluorescence lifetime imaging microscopy. Analytical Chemistry. 88 (21), 10566-10572 (2016).
  49. Fercher, A., Borisov, S. M., Zhdanov, A. V., Klimant, I., Papkovsky, D. B. Intracellular O2 sensing probe based on cell-penetrating phosphorescent nanoparticles. ACS Nano. 5 (7), 5499-5508 (2011).
  50. Wagner, M., Karner, A., Gattringer, P., Buchegger, B., Hochreiner, A. A super low-cost bioprinter based on DVD-drive components and a raspberry pi as controller. Bioprinting. 23, 00142 (2021).
  51. Golub, A. S., Pittman, R. N. Monitoring parameters of Oxygen transport to cells in the microcirculation. Quenched-Phosphorescence Detection of Molecular Oxygen. , 193-204 (2018).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Huang, C., Becker, M. F., Keto, J. W., Kovar, D. Annealing of nanostructured silver films produced by supersonic deposition of nanoparticles. Journal of Applied Physics. 102 (5), 054308 (2007).
  54. Foster, K. A., Galeffi, F., Gerich, F. J., Turner, D. A., Müller, M. Optical and pharmacological tools to investigate the role of mitochondria during oxidative stress and neurodegeneration. Progress in Neurobiology. 79 (3), 136-171 (2006).
  55. Schmidt, C. A., Fisher-Wellman, K. H., Neufer, P. D. From OCR and ECAR to energy: perspectives on the design and interpretation of bioenergetics studies. The Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101140 (2021).
  56. Stelzer, E. H., Lindek, S. Fundamental reduction of the observation volume in far-field light microscopy by detection orthogonal to the illumination axis: confocal theta microscopy. Optics Communications. 111 (5-6), 536-547 (1994).
  57. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
  58. Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
  59. von Chamier, L., et al. Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 182 ، التصنيع الحيوي ، الطباعة الحيوية ، الفحص المجهري الفلوري ، نقص الأكسجة ، التمثيل الغذائي ، مسبار O2 الحساس ، الأوكسجين ، الخلايا الجذعية ، الكرويات
التصنيع الحيوي بمساعدة الأكسجين بمساعدة الأكسجين بأسعار معقولة للكرويات متعددة الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Okkelman, I. A., Vercruysse, C.,… More

Okkelman, I. A., Vercruysse, C., Kondrashina, A. V., Borisov, S. M., Dmitriev, R. I. Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids. J. Vis. Exp. (182), e63403, doi:10.3791/63403 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter