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Bioengineering

सस्ती ऑक्सीजन माइक्रोस्कोपी-बहुकोशिकीय गोलाकार के सहायक Biofabrication

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63403
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1
1Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medical and Health Sciences, Ghent University, 2Health and Happiness (H&H) Group, National Food Innovation Hub, 3Institute of Analytical Chemistry and Food Chemistry, Graz University of Technology
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल एक मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर उनके ऑक्सीकरण और सेल मृत्यु के बहु-पैरामीट्रिक विश्लेषण का उपयोग करके बायोप्रिंटिंग के लिए उच्च-थ्रूपुट गोलाकार पीढ़ी का वर्णन करता है। इस दृष्टिकोण को गोलाकार व्यवहार्यता को नियंत्रित करने और मानकीकरण करने के लिए लागू किया जा सकता है, जो मॉडलिंग 3 डी ऊतक, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट और सफल (सूक्ष्म) ऊतक बायोफैब्रिकेशन में महत्वपूर्ण है।

Abstract

बहुकोशिकीय गोलाकार 3 डी में ऊतक और कैंसर शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं और अक्सर ऊतक इंजीनियरिंग में बायोफैब्रिकेशन के लिए ऊतक असेंबलिंग इकाइयों के रूप में उपयोग किए जाते हैं। जबकि गोलाकार मॉडल की मुख्य शक्ति ऊतक माइक्रोस्केल पर भौतिक-रासायनिक ग्रेडिएंट की नकल करने में है, गोलाकार के अंदर वास्तविक शारीरिक वातावरण (चयापचय गतिविधि, ऑक्सीकरण, सेल मृत्यु और प्रसार की गतिशीलता सहित) को आमतौर पर अनदेखा किया जाता है। उसी समय, विकास माध्यम संरचना के प्रभाव और परिणामी गोलाकार फेनोटाइप पर गठन विधि को अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है। इस प्रकार, शोध परिणामों की पुनरुत्पादन और पारदर्शिता सुनिश्चित करने के लिए गोलाकार फेनोटाइप के लक्षण वर्णन और मानकीकरण की आवश्यकता होती है। औसत गोलाकार ऑक्सीकरण का विश्लेषण और तीन आयामों (3 डी) में ओ2 ग्रेडिएंट का मूल्य गोलाकार फेनोटाइप लक्षण वर्णन के लिए एक सरल और सार्वभौमिक तरीका हो सकता है, जो उनकी चयापचय गतिविधि, समग्र व्यवहार्यता और विवो ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट में पुनरावृत्ति करने की क्षमता की ओर इशारा करता है। 3 डी ऑक्सीकरण के विज़ुअलाइज़ेशन को आसानी से अतिरिक्त शारीरिक मापदंडों (जैसे सेल मृत्यु, प्रसार और सेल संरचना) के मल्टीपैरामीट्रिक विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है और निरंतर ऑक्सीकरण निगरानी और / या अंत-बिंदु माप के लिए लागू किया जा सकता है। ओ2 जांच का लोडिंग गोलाकार गठन के चरण के दौरान किया जाता है और गोलाकार पीढ़ी के विभिन्न प्रोटोकॉल के साथ संगत है। प्रोटोकॉल में लाल और निकट-अवरक्त उत्सर्जक रेशियोमेट्रिक फ्लोरोसेंट ओ2 नैनोसेंसर के साथ गोलाकार पीढ़ी की एक उच्च-थ्रूपुट विधि शामिल है और बायोप्रिंटिंग से पहले और बाद में गोलाकार ऑक्सीकरण और सेल मृत्यु के बहु-पैरामीटर मूल्यांकन का विवरण शामिल है। प्रयोगात्मक उदाहरण होमो- और हेटरो-सेलुलर गोलाकार के साथ-साथ गोलाकार-आधारित बायोप्रिंटेड निर्माणों में तुलनात्मक ओ2 ग्रेडिएंट विश्लेषण दिखाते हैं। प्रोटोकॉल एक पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ संगत है जिसमें कई प्रतिदीप्ति फिल्टर और प्रकाश स्रोत के रूप में एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड होता है।

Introduction

आणविक ऑक्सीजन (ओ2) सेल और ऊतक व्यवहार्यता, कार्य और मृत्यु को विनियमित करने वाले प्रमुख चयापचयों में से एक है। शारीरिक परिस्थितियों के तहत, स्थानीय ऊतक ऑक्सीकरण को ऊतक संवहन, रक्त प्रवाह और सेल चयापचय द्वारा गतिशील रूप से विनियमित किया जाता है, कुछ मामलों में ओ2 ग्रेडिएंट, हाइपोक्सिक माइक्रोएन्वायरमेंट और / या ऑक्सीडेटिव तनाव 1,2 के गठन के लिए अग्रणी होता है। कोशिकाएं सिग्नलिंग फ़ंक्शन में आणविक ओ2 की प्रत्यक्ष भागीदारी के माध्यम से ओ2 ग्रेडिएंट को महसूस करती हैं (हाइपोक्सिया-इनड्यूसिबल फैक्टर (एचआईएफ) के माध्यम से- मध्यस्थता सिग्नलिंग, हिस्टोन लाइसिन डिमेथिलेस केडीएम, और अन्य तरीकों से), सेलुलर रेडॉक्स क्षमता में परिवर्तन (प्रतिक्रियाशील ओ 2 प्रजातियां एनआरएफ2 / केएपी 1 सिग्नलिंग या लौह-नियामक प्रोटीन के माध्यम से संवेदन करती हैं), और बाद में अपने चयापचय, प्रसार को समायोजित कर सकती हैं, शक्ति, और भेदभाव3. इस प्रकार, कोशिका और ऊतक ऑक्सीकरण की विषमता, इसके ग्रेडिएंट, और संबंधित घटनाएं ऊतक विकास और होमियोस्टैसिस में महत्वपूर्ण खिलाड़ी हैं। विभिन्न ऊतकों और सेल प्रकारों को अक्सर अलग-अलग 'सामान्य' शारीरिक ओ2 स्तरों की आवश्यकता होती है, जो ऊतक ओ2 माइक्रोग्रेडिएंट्स4 के अनुसार स्थित कोशिकाओं के साथ विशेष ऊतक वास्तुकला को परिभाषित करते हैं। कुछ सेल प्रकार ओ2 कमी के प्रति संवेदनशील होते हैं (उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स, हेपेटोसाइट्स, अग्नाशयी आइलेट कोशिकाएं, या मांसपेशियों की कोशिकाएं)5,6, जबकि अन्य अत्यधिक हाइपोक्सिया का सामना कर सकते हैं और खड़ी ओ2 ग्रेडिएंट (उदाहरण के लिए, आंतों और बृहदान्त्र एपिथेलिया में) बना सकते हैं। ऊतक bioengineering और biofabrication में प्रगति के साथ, microaggregates और गोलाकार 3 डी ऊतक निर्माणों में O2 परिमाणीकरण की आवश्यकता महत्वपूर्ण हो जाती है। चिंताओं में से एक बहुकोशिकीय गोलाकार मॉडल शारीरिक मापदंडों का मानकीकरण है, जो गोलाकार पीढ़ी और संस्कृति की स्थिति की विधि पर निर्भरकरता है। इसके अलावा, कार्यात्मक संवहनीकरण की कमी वाले माइक्रोटिस्यूज़ में ओ2 रिलीजिंग बायोमैटेरियल्स या ओ2 परफ्यूजन का अनियंत्रित अनुप्रयोग कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकता है, जिससे उनके चयापचय को फिर से प्रोग्राम किया जा सकता है, और प्रत्यारोपण के बाद की अवधि 9,10 में जीवित रहने में कमी आई है। ओ2 माप दृष्टिकोण की विश्वसनीयता और शारीरिक रूप से प्रासंगिक माइक्रोएग्रीगेट्स की कुशल संस्कृति तक पहुंचने के लिए ऑक्सीकरण वातावरण के अनुकूलन को हाल ही मेंएक उदाहरण के रूप में उपयोग किए जाने वाले प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न यकृत गोलाकार के गणितीय मॉडलिंग द्वारा साबित किया गया था। एक और क्षेत्र जहां ऊतक ओ2 के स्तर का ज्ञान मान्यता प्राप्त है, वह कैंसर थेरेपी12,13 है। विषम ट्यूमर हाइपोक्सिया सफल एंटीकैंसर थेरेपी को खराब कर सकता है। रोगी उपचार या ट्यूमर हाइपोक्सिया मॉडलिंग के दौरान सटीक ऑक्सीकरण के स्तर को मापने और नियंत्रित करने से व्यक्तिगत और व्यक्तिगत चिकित्सा रणनीतियोंमें सुधार की अनुमति मिलेगी। इस प्रकार, बायोफैब्रिकेटेड निर्माणों और 3 डी ट्यूमर मॉडल में गतिशील ऑक्सीकरण की मात्रात्मक निगरानी उनकी श्वसन गतिविधि, चयापचय, और ऊतक संस्कृति के अनुकूलन, विनिर्माण स्थितियों, या हाइपोक्सिया-मध्यस्थता चिकित्सीय प्रतिक्रिया के बुनियादी अध्ययन के शारीरिक विश्लेषण के लिए एक प्रमुख उपकरण है।

गोलाकार और माइक्रोएग्रीगेट ऊतक निर्माणों में सेल ऑक्सीकरण के मल्टीप्लेक्स (या बहु-पैरामीटर) विश्लेषण के लिए कई विधियां सक्षम होती हैं। neurospheres और ट्यूमर गोलाकार 15,16,17 के साथ अग्रणी, फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (PLIM) -आधारित दृष्टिकोण लाइव माइक्रोटिस्यूज़ में सेल ऑक्सीजनेशन के प्रत्यक्ष परिमाणीकरण के लिए सक्षम बनाता है और सेल व्यवहार्यता, प्रसार, या कार्यात्मक सेल प्रकारों के वितरण के साथ अपने सहसंबंध की स्थापना करता है। दृष्टिकोण की शक्ति के बावजूद, PLIM माइक्रोस्कोपी उन्नयन अभी भी लोकप्रिय माइक्रोस्कोपी विक्रेताओं18,19 के बीच भी व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं है। सौभाग्य से, सेल-मर्मज्ञ ओ2-संवेदनशील नैनोपार्टिकल जांच की एक अच्छी संख्या का उपयोग प्रतिदीप्ति तीव्रता-आधारित रेशियोमेट्रिक माप मोड 15,17,20,21,22,23,24 के लिए भी किया जा सकता है। आमतौर पर, जांच दो उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य प्रदर्शित करेगी, यानी, ओ2-संवेदनशील और असंवेदनशील (संदर्भ), जिसे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, उच्च सामग्री स्क्रीनिंग इमेजर, या माइक्रोप्लेट रीडर पर मापा जा सकता है। इस तरह के ओ 2-सेंसिंग नैनोकणों को बायोकंपैटिबल पॉलिमर, ओ2-सेंसिंग, और दृश्यमान और निकट-अवरक्त स्पेक्ट्रा में फैले संदर्भ रंजक के साथ वर्षा तकनीक द्वारा उत्पादित किया जा सकता है, या उन्हें व्यावसायिक रूप से2,25 खरीदा जा सकता है। चूंकि मोटी 3 डी माइक्रोटिश्यूज़ के विश्लेषण को लाल-स्थानांतरित फ्लोरोसेंट रंजक के उपयोग से लाभ होगा, इसलिए रेशियोमेट्रिक ओ 2-सेंसिंग नैनोपार्टिकल प्रोब मल्टी-मोडल इन्फ्रारेड नंबर 1 (एमएमआईआर 1), जिसमें ओ2-सेंसिंग पीटीपीटीबीपीएफ26 और संदर्भ अजा-बोडीपी27 रंजक शामिल हैं, जो सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए पॉलीमेथेक्रिलेट-आधारित कॉपोलीमर में गर्भवती हैं,का निर्माण किया गया था। इस डिजाइन के साथ, एक O2-संवेदनशील संकेत (निकट-अवरक्त, उत्तेजना (exc.) = 635 nm, उत्सर्जन (em.) = 760 nm; Isens) स्फुरदीप्ति शमन प्रक्रिया के माध्यम से [O2] एकाग्रता से प्रभावित होता है, जबकि लाल संदर्भ डाई तीव्रता (exc. = 580 nm, em. = 650 nm; मैंरेफरी) अप्रभावित रहता है (चित्रा 1 ए)। इस प्रकार, मैंसंदर्भ / मैंसेंस अनुपात (आर) दाग कोशिकाओं में ओ2 अंशांकन 22 सक्षम कर सकते हैं.

यहां, हम गोलाकार और बायोप्रिंटेड निर्माणों में लाइव सेल ऑक्सीकरण की निगरानी के लिए एक अर्ध-मात्रात्मक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, जिससे समापन बिंदु और गतिज माप में ओ2 ग्रेडिएंट का अनुमान लगाने में मदद मिलती है। इस तरह के ओ2 इमेजिंग को अन्य प्रकार के रेशियोमेट्रिक ओ2 प्रोब (चित्रा 1 बी) के साथ किया जा सकता है और उपलब्ध प्रकाश स्रोतों और प्रतिदीप्ति फिल्टर की संख्या के आधार पर, जीवित / मृत कोशिकाओं, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और अन्य सेल प्रकारों का पता लगाने के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए अन्य रंगों के साथ उपयोग किया जा सकता है। प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (एफएलआईएम) जैसे उन्नत माप मोड का भी उपयोग किया जा सकताहै। सेल धुंधला रंगों और ओ2-संवेदनशील नैनोकणों के उपयोग के साथ सबसे बड़ी चुनौती धुंधला प्रोटोकॉल का अनुकूलन है। MMIR1 जांच और संबंधित नैनोकणों के मामले में, कोशिकाओं को गोलाकार गठन की प्रक्रिया के दौरान या तो पूर्व-दाग या सह-ऊष्मायन किया जाता है। वर्णित प्रोटोकॉल में, ओ2 प्रोब-दाग वाले गोलाकार कम-अनुयायी एगारोज़ सतह29,30,31,32 (चित्रा 1 सी) पर उत्पन्न हुए थे, जो बाद के गोलाकार-आधारित बायोप्रिंटिंग और ओ2 और सेल मृत्यु के बहु-पैरामीटर विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है। दृष्टिकोण की प्रयोज्यता को स्पष्ट करने के लिए, होमो- या हेटरो-सेलुलर (मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं, एचयूवीईसी के अलावा के साथ गठित) मानव दंत लुगदी स्टेम सेल (एचडीपीएससी) गोलाकार में ऑक्सीकरण के स्तर की तुलना पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बायोप्रिंटिंग से पहले और बाद में की गई थी।

Protocol

1. शामिल ओ2-संवेदनशील जांच के साथ गोलाकार की उच्च थ्रूपुट पीढ़ी

  1. माइक्रो पैटर्न वाले agarose लेपित ऊतक संस्कृति प्लेट की तैयारी
    नोट: माइक्रो-पैटर्न वाले एगारोज़ लेपित ऊतक संस्कृति प्लेटों का उपयोग बायोप्रिंटिंग और अन्य अनुप्रयोगों के लिए उच्च संख्या में गोलाकार (1585 प्रति पीडीएमएस स्टैंप, सामग्री तालिका देखें) की एक साथ पीढ़ी के लिए किया जाता है, जहां कई प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां या बड़ी गोलाकार संख्याओं की आवश्यकता होती है।
    1. जहां संभव हो ऑटोक्लेविंग द्वारा या फ़िल्टर नसबंदी द्वारा सभी बाँझ सामग्री और उपकरणों (स्पैटुला और चिमटी) तैयार करें। agarose से recyclable PDMS टिकटों33 को साफ करें और उन्हें 70% इथेनॉल में aseptically स्टोर करें। गोलाकार पीढ़ी से कम से कम 1 दिन पहले ऐसा करें।
    2. एक भंडारण शीशी से एक बाँझ पेट्री डिश में माइक्रो-पैटर्न वाले पीडीएमएस टिकटों को स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए बाँझ लैमिनर एयरफ्लो स्थितियों के तहत चिकनी सतह के साथ एयर-ड्राई करें।
    3. एक 12-अच्छी तरह से बाँझ ऊतक संस्कृति प्लेट के कुएं के बीच में एक सूक्ष्म पैटर्न वाली सतह के साथ प्रत्येक टिकट को ऊपर (और चिकनी सतह नीचे) रखें। एक खुले ढक्कन के साथ 1-2 मिनट के लिए हवा सूखी।
      नोट: अतिरिक्त तरल को वाष्पित करना अत्यधिक महत्वपूर्ण है क्योंकि केवल सूखे टिकट पूरी तरह से प्लास्टिक की सतह से चिपके रहते हैं और प्रक्रिया के दौरान संलग्न रहते हैं।
    4. एक साफ 200 मिलीलीटर कांच की बोतल में agarose के 1.5 ग्राम वजन, बाँझ आसुत पानी के 50 मिलीलीटर जोड़ें, एक ढक्कन के साथ कवर और 3% सजातीय agarose समाधान के 50 मिलीलीटर बनाने के लिए एक माइक्रोवेव में पिघला।
      सावधानी: agarose समाधान बेहद गर्म है और सावधानी के साथ संभाला जाना चाहिए। यदि पिघलने की प्रक्रिया के तुरंत बाद हिलाया जाता है, तो गर्म एगरोज समाधान बुदबुदाना शुरू कर सकता है और पोत से बाहर निकल सकता है। कभी-कभी आघात से बचने के लिए, एगारोज़ समाधान के साथ अधिकतम 50% मात्रा से भरे पर्याप्त रूप से बड़े जहाजों का उपयोग करें।
    5. एक बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके तुरंत 12-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों के प्रत्येक कुएं के लिए गर्म agarose समाधान के ~ 2 एमएल जोड़ें पूरी तरह से डाला PDMS टिकट को कवर करने के लिए। प्लेट ढक्कन के साथ बाँझ हवा के प्रवाह के नीचे incubating द्वारा 20 मिनट के लिए solidify करने के लिए agarose छोड़ दो।
      नोट: Agarose परत PDMS स्टांप हटाने (चित्रा 1C) के बाद agarose microwells की अखंडता सुनिश्चित करने के लिए PDMS स्टाम्प की तुलना में कम से कम दो गुना मोटा होना चाहिए।
    6. एक बाँझ छोटे स्पैटुला का उपयोग करके, चिकनी टिकट सतह को ऊपर उठाने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से एम्बेडेड पीडीएमएस स्टैंप के साथ एगारोज़ को उल्टा करें। स्टैंप के चिकनी टॉपसाइड पर बाँझ पानी के ~ 200 μL जोड़ें, धीरे से इसे स्पैटुला के साथ agarose से अलग करें, और इसे कुएं से हटा दें। माइक्रोवेल को नुकसान पहुंचाने से बचें।
    7. प्रत्यक्ष उपयोग के लिए agarose टिकटों के लिए इसी बाँझ सेल संस्कृति मीडिया के 1 mL जोड़ें. ढक्कन के साथ प्लेट को कवर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए पीबीएस समाधान (मध्यम के बजाय) का उपयोग करें (4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक)। Agarose सूखने मत दो. उपयोग करने से पहले, एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एगारोज़ माइक्रो-पैटर्न वाली प्लेटोंको गर्म करें।
      नोट: इनक्यूबेशन को संतुलित करने और agarose microwells से हवा के बुलबुले को हटाने के लिए आवश्यक है। प्रोटोकॉल चरण 1.2 के साथ आगे बढ़ें।
  2. O तैयार कर रहा है2 प्रोब-लोडेड गोलाकार
    1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक α-न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) का उपयोग करें, और विकास कारकों ने क्रमशः एचडीपीएससी और एचयूवीईसी सेल लाइनों की खेती के लिए एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम 2 को पूरक किया। HDPSC / HUVEC हेटरोसेलुलर गोलाकार विकास माध्यम को 1: 1 अनुपात में HUVEC और hDPSC विकास मीडिया जोड़कर तैयार करें।
    2. 70% -90% confluent सेल संस्कृति (~ तैयारी के 3-4 दिन) तैयार करें। हेटरोसेलुलर गोलाकार की पीढ़ी के लिए, क्रमशः hDPSC और HUVEC संस्कृतियों को तैयार करें।
      नोट:: HUVEC और hDPSC की मार्ग संख्या 8 से अधिक नहीं होना चाहिए। सेल संस्कृतियों की तेजी से वृद्धि सुनिश्चित करने के लिए हमेशा कुल सेल संस्कृति के 1/3 पर विभाजित (70% -80% confluency पर) हर 3 से 4 दिनों में एक नया फ्लास्क का उपयोग करके।
    3. कुल्ला 70% -90% confluent सेल संस्कृति prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) PBS (10 mL प्रति 75 सेमी2 फ्लास्क) के साथ। पृथक्करण एंजाइम समाधान जोड़ें (0.05% ट्रिप्सिन और 1 mM EDTA; 1 mL प्रति 75 सेमी 2 फ्लास्क) और 5% CO 2 में 37 °C पर 3-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, सेल टुकड़ी के लिए 95% आर्द्रता और माइक्रोस्कोप के तहत सेल टुकड़ी की जांच करें। एक बार हो जाने के बाद, 10% एफबीएस युक्त पूर्ण सेल संस्कृति मीडिया के साथ ट्रिप्सिन को बेअसर करें (पृथक्करण समाधान के प्रति 1 एमएल मीडिया के 5 एमएल)।
      नोट: विघटित एंजाइम समाधान के लिए कोशिकाओं के overexposure को रोकें क्योंकि यह उनकी व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है।
    4. कम एफबीएस माध्यम में सुसंस्कृत एचयूवीईसी के लिए, ट्रिप्सिन-उपचारित सेल संस्कृति में 100% एफबीएस के 0.5 एमएल को जोड़कर ट्रिप्सिन न्यूट्रलाइजेशन करें, इसके बाद कोशिकाओं को उनके विकास माध्यम में स्थानांतरित करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन करें।
      नोट: प्राप्त सेल निलंबन (ओं) में प्रति 1 एमएल ~ 1 मिलियन सेल होना चाहिए। यदि आवश्यक हो, तो सेल निलंबन को केंद्रित करने के लिए प्रोटोकॉल में एक अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूजेशन चरण जोड़ा जा सकता है।
    5. एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए 10 mL सीरोलॉजिकल पिपेट के शीर्ष पर 1000 μL पिपेट टिप का उपयोग करके पिपेटिंग द्वारा सेल समुच्चय को अलग करें। सेल निलंबन34 के प्रति 1 मिलीलीटर कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए एक गिनती कक्ष (न्यूबाउर-प्रकार हेमोसाइटोमीटर या विकल्प) का उपयोग करें। सेल निलंबन को प्रति एमएल 500,000 कोशिकाओं तक पतला करें। 1: 1 गोलाकार अनुपात में हेटरोसेलुलर hDPSC / HUVEC के लिए, प्रति एमएल 500,000 कोशिकाओं की अंतिम सेल एकाग्रता रखने के लिए संबंधित सेल निलंबन के बराबर वॉल्यूम जोड़ें।
      नोट: एक माइक्रो-पैटर्न वाले एगारोज़ स्टैंप में जोड़े गए निलंबन में सेल एकाग्रता की भिन्नता उत्पादित गोलाकार के औसत आकार को बदलने की अनुमति देती है, जो एक एगारोज़ स्टैंप के प्रति माइक्रोवेल सेल संख्या पर निर्भर करती है। वर्णित सेट-अप में, ~ 300 कोशिकाओं के गोलाकार 1 mL से उत्पन्न होते हैं जिसमें 1585 माइक्रोवेल के साथ एक agarose टिकट पर 500,000 कोशिकाएं होती हैं।
    6. 5 μg / mL की अंतिम एकाग्रता के लिए तैयार सेल निलंबन के लिए केंद्रित O2 जांच (नैनोकणों, 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक) समाधान जोड़ें।
      नोट: ओ 2-सेंसिंग नैनोकणों की उपस्थिति में गोलाकार गठन कुशल धुंधला प्रदान करता है, जिसे कम से कम 5 दिनों (चित्रा 1 डी) के लिए संरक्षित किया जाता है। इसके विपरीत, नैनोकणों के साथ पूर्वनिर्मित बहुकोशिकीय गोलाकार का धुंधला होना कम कुशल15 होगा।
    7. तैयार सेल निलंबन के 1 एमएल (500,000 कोशिकाओं प्रति 1 एमएल, 5 μg / mL O 2 जांच के साथ) के 1 mL के लिए 12-अच्छी तरह से agarose-लेपित सेल संस्कृति प्लेटों (चरण 1.1.7 देखें) के माइक्रोपैटर्ड कुएं में पुराने मीडिया के 1 एमएल का आदान-प्रदानकरें । गोलाकार गठन और संघनन के दौरान इसकी लोडिंग सुनिश्चित करने के लिए ओ2 जांच की निरंतर उपस्थिति में2-5 दिनों के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में गोलाकार को संस्कृति करें।
      नोट: गोलाकार संस्कृति में अत्यधिक मध्यम वाष्पीकरण से बचें। यदि आवश्यक हो, तो ध्यान से (माइक्रोवेल में गोलाकार को परेशान न करें) अतिरिक्त ओ 2 जांच कमजोर पड़ने के साथ संस्कृति मीडिया के 0.2-0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    8. गोलाकार गठन के बाद, जांच के बिना एक ताजा के साथ विकास मीडिया का आदान-प्रदान करें। जांच धुंधला 7-14 दिनों या उससे अधिक समय के लिए उत्पन्न गोलाकार में संरक्षित किया जाएगा, जिससे गोलाकार में इसके संकेतों की दीर्घकालिक निगरानी की अनुमति मिलती है।

2. गोलाकार bioprinting

नोट: गोलाकार एक methacrylamide-संशोधित जिलेटिन (GelMA) आधारित bioink में bioprinted हैं। नीचे बायोइंक सामग्री, बायोइंक तैयारी की प्रक्रिया और बायोप्रिंटिंग का विवरण दिया गया है।

  1. Bioink तैयारी
    1. एक लैमिनर एयर-फ्लो 35 के तहत माध्यम में 10% (डब्ल्यू / वी) गेलएमए समाधान (2 एमएल) तैयार करें:15 एमएल ट्यूब में 78 के प्रतिस्थापन की डिग्री के साथ बाँझ जेलएमए के 0.2 ग्राम वजन करें, 1.9 मिलीलीटर α-एमईएम जोड़ें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस (~ 2 एच) पर रोटरी शेकर पर मिश्रण करके भंग होने दें।
      नोट:: माध्यम की पूरी मात्रा को न जोड़ें, क्योंकि अन्य यौगिकों जैसे कि गोलाकार और फोटो-प्रारंभकर्ता Li-TPO-L को बाद में जोड़ा जाएगा।
    2. माइक्रोपैटर्न्ड कुओं में पिपेटिंग द्वारा गोलाकार को फिर से निलंबित कर दिया गया और उन्हें 15 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा किया गया। यह सुनिश्चित करने के लिए पीबीएस के साथ एक अतिरिक्त कुल्ला करें कि सभी गोलाकार agarose microwells से एकत्र किए जाते हैं। एगरोज माइक्रोवेल को छूने / नुकसान पहुंचाने से बचें क्योंकि एगरोज के गुच्छे बायोप्रिंटिंग के दौरान सुई को अवरुद्ध कर सकते हैं।
    3. 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर एक 15 mL ट्यूब में centrifugation द्वारा गोलाकार इकट्ठा करें। एक पिपेट के साथ supernatant aspirate, गोलाकार करने के लिए माध्यम के 50 μL जोड़ें और कोमल pipetting द्वारा उन्हें resuspend.
    4. गर्म GelMA समाधान के लिए गोलाकार मिश्रण जोड़ें और कोमल pipetting द्वारा मिश्रण. बायोप्रिंटिंग के लिए बायोइंक के प्रति एमएल 6340-12860 गोलाकार (4-8 माइक्रोपैटर्न से) तक गोलाकार एकाग्रता बनाए रखें। गोलाकार की उच्च सांद्रता से बचें क्योंकि यह आसानी से मुद्रण सुई के अवरुद्ध होने का कारण बनता है।
    5. डबल बांड की संख्या के संबंध में 2 mol% की अंतिम एकाग्रता में फ़िल्टर-स्टरलाइज्ड फोटो-सर्जक Li-TPO-L स्टॉक समाधान (32 mg/mL) जोड़ें और36,37 को कोमल पिपेटिंग द्वारा मिश्रण करें।
      नोट:: Li-TPO-L की मात्रा समीकरण के अनुसार गणना की जा सकती है:
      फोटोइनिशिएटर (PI) का आयतन = (0.000385 mol NH2- समूह / g of GelMA x 294.10 g Li-TPO-L / mol x 0.78 x 0.02) / 0.032 g Li-TPO-L / mL x 0.2 g GelMA = 0.0107 mL Li-TPO-L स्टॉक
  2. बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया
    1. CAD में पाड़ के डिजाइन के लिए अनुपूरक प्रोटोकॉल 1 में दिए गए चरणदेखें। डिजाइन bioprint करने के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    2. एक टिप कैप (luer ताला) के साथ एक बाँझ 3 सीसी कारतूस के अंत को बंद करें और pipetting द्वारा bioink के साथ भरें। कारतूस में एक प्लंजर डालें। कारतूस को उल्टा पकड़ो और टिप कैप को हटा दें, कारतूस से सभी हवा को हटा दिए जाने तक प्लंजर को बायोइंक की ओर धकेलें।
      नोट: GelMA bioink और कारतूस के किनारों के बीच संपर्क से बचें, क्योंकि यह bioink के जेलेशन के कारण प्लंजर के आंदोलन को बाधित कर सकता है।
    3. बायोइंक को 23 डिग्री सेल्सियस (20-30 मिनट) पर बायोप्रिंटर के हीटिंग मेंटल में ठंडा होने दें। कारतूस के शीर्ष पर एक दबाव एडाप्टर में पेंच. इनलेट ट्यूब पर क्लिप बंद करने के लिए लीक से bioink को रोकने के लिए, कारतूस पर एक 22 जी शंक्वाकार पीई सुई माउंट. पाड़ डिजाइन और गोलाकार व्यास और एकाग्रता के लिए सुई आकार और व्यास अनुकूलित करें।
      नोट: संदूषण को रोकने के लिए मुंह का मुखौटा पहनें और दस्ताने का छिड़काव करें।
    4. बायोप्रिंटर को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और इसे अवशोषित कागज के साथ सूखा पोंछें। बाहर निकालना आधारित printhead पर हीटिंग मेंटल में कारतूस स्थापित करें. दबाव इनलेट को प्लग करें और इनलेट पर क्लिप खोलें। मुद्रण सॉफ़्टवेयर में अपने डिज़ाइन की G-कोड फ़ाइल लोड करें.
    5. सुई लंबाई माप प्रारंभ करें। एक बाँझ पेट्री पकवान में थोड़ा bioink वितरण द्वारा मुद्रण दबाव को विनियमित. 0.025-0.045 MPa का मुद्रण दबाव GelMA आधारित bioinks38 मुद्रण के लिए विशिष्ट है।
    6. एक 6-अच्छी तरह से प्लेट स्थापित करें, अच्छी तरह से प्लेट खोलें, हुड को बंद करें, और मुद्रण शुरू करें। मुद्रण के बाद, scaffolds शारीरिक रूप से 5 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए crosslinked किया जा सकता है और एक यूवी एलईडी लैंप (365 एनएम; निर्माता के अनुसार 500 mW) के साथ 60 s के लिए मुद्रित scaffolds विकिरणित करें।
      नोट: यूवी क्रॉसलिंकिंग समय यूवी प्रकाश, फोटो-प्रारंभकर्ता प्रकार और एकाग्रता, वांछित पाड़ क्रॉसलिंकिंग डिग्री, सूजन और लोच मापांक के गुणों पर निर्भर करता है।
    7. तुरंत इसी विकास मीडिया पेनिसिलिन के 100 यू / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के 100 μg / mL को बायोप्रिंटेड ग्रिड (6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट के प्रति अच्छी तरह से 2 एमएल) के साथ सभी कुओं में जोड़ें।
    8. जब तक आप माइक्रोस्कोपी शुरू नहीं करते हैं तब तक 37 डिग्री सेल्सियस सीओ2 इनक्यूबेटर में संस्कृति। बायोप्रिंटेड निर्माण माइक्रोस्कोपी के लिए, एक प्रिंटेड वफ़ल ग्रिड को माइक्रोस्कोपी डिश में स्थानांतरित करें, इमेजिंग मीडिया के साथ कवर करें, और चरण 3.2 और 3.3 के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: फ्लोटिंग बायोप्रिंटेड निर्माणों के मामले में, उन्हें सेल व्यवहार्यता पर प्रभाव के बिना माइक्रोस्कोपी डिश में तय किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, साइटोकॉम्पैटिबल गोंद के साथ। उल्टे माइक्रोस्कोप स्थानांतरण के लिए, एक माइक्रोस्कोपी ग्लास-बॉटम डिश में बायोप्रिंट और इमेजिंग मीडिया (~ 200-500 μL, इमेजिंग मीडिया संरचना के लिए चरण 3.1 के लिए नोट देखें) के साथ कवर करने के लिए नमूना के अवांछित फ्लोटिंग से बचने के लिए। अतिरिक्त फ्लोरोसेंट जांच के साथ धुंधला माइक्रोस्कोपी व्यंजन के लिए bioprinted निर्माणों के हस्तांतरण से पहले सेल संस्कृति पकवान में किया जा सकता है (चरण 3.1.6 देखें)।

3. बायोफैब्रिकेटेड ऊतक में गोलाकार ऑक्सीकरण की रेशियोमेट्रिक प्रतिदीप्ति लाइव माइक्रोस्कोपी

नोट:: वास्तविक हाइपोक्सियास्तरों में O 2 जांच के ratiometric तीव्रता प्रतिक्रिया (R) कनवर्ट करने के लिए, जांच प्रतिक्रिया24 में वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग कर कैलिब्रेट किया जा करने के लिए है। हालांकि, जैसा कि रेशियोमेट्रिक अंशांकन साधन-विशिष्ट है और टी / ओ 2/ सीओ 2-नियंत्रित इनक्यूबेटर (हमेशा उपलब्ध नहीं) की स्थापना की आवश्यकता होती है, अर्ध-मात्रात्मक अनुपात का पता लगाने का उपयोग पसंदीदा विकल्प है।

  1. लाइव इमेजिंग विश्लेषण के लिए गोलाकार की तैयारी
    1. इस चरण के दौरान गोलाकार लगाव के लिए, कोलेजन IV और / या पॉली-डी-लाइसिन के साथ बाँझ माइक्रोस्कोपी व्यंजनों को पूर्व-कोट करें या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लोगों का उपयोगकरें। काम करने की दूरी और अपने माइक्रोस्कोप के उद्देश्य की अन्य विशेषताओं के साथ माइक्रोस्कोपी व्यंजनों की संगतता की जांच करें।
      नोट: बहु-पैरामीटर इमेजिंग के मामले में, सभी अतिरिक्त धुंधला प्रक्रियाओं को वाष्पीकरण, आसमाटिक सदमे या अन्य तनाव से कोशिकाओं की रक्षा करने वाले मीडिया की पर्याप्त मात्रा के साथ संस्कृति प्लेट व्यंजनों में किया जाना चाहिए। उपयोग करने से पहले तैयार और प्रीवार्म इमेजिंग माध्यम तैयार करें: डीएमईएम को सोडियम बाइकार्बोनेट (1.2 ग्राम / एल), HEPES-Na, पीएच 7.2 (10 एमएम), सोडियम पाइरूवेट (1 एमएम), एल-ग्लूटामाइन (2 एमएम), और ग्लूकोज (5 एमएम) के साथ पूरक किया गया, फिनोल लाल के बिना।
    2. एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करते हुए, धीरे से ओ2-प्रोब पूर्व-दाग वाले गोलाकार को एगारोज़ माइक्रोवेल से धो लें। जबकि गोलाकार अभी भी मीडिया में तैरते हैं, उन्हें 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे ट्यूब में स्थानांतरित करते हैं।
    3. एक micropatterned अच्छी तरह से से सभी गोलाकार के संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए, संस्कृति मीडिया के अतिरिक्त 1 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से 1 से 3 बार कुल्ला, एक शीशी में सभी गोलाकार निलंबन संयोजन। शीशी को 10 मिनट तक ऊर्ध्वाधर स्थिति में छोड़ दें ताकि गोलाकार को एक दृश्यमान छर्रे बनाने वाली शीशी के तल पर बसने दिया जा सके।
    4. ध्यान से ट्यूब से मीडिया को हटाने के लिए गोलाकार अबाधित छोड़. धीरे से उन्हें ताजा संस्कृति माध्यम की मात्रा में फिर से निलंबित कर दिया जो माइक्रोस्कोपी नमूना पकवान प्रति कम से कम 20 गोलाकार के लिए पर्याप्त होगा। यह संस्कृति मीडिया के उपयोग को कम करेगा और इमेजिंग के दौरान गोलाकार का पता लगाने को सरल बनाएगा।
      नोट: μ-कक्ष 12-अच्छी तरह से प्लेट के autoclavable सिलिकॉन भाग का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें) एक माइक्रोस्कोपी नमूना पकवान (24 x 60 मिमी, मोटाई # 1) के रूप में कवर ग्लास से जुड़ा हुआ है, जिसमें 300 μL प्रति अच्छी तरह से अधिकतम मीडिया मात्रा है। इस संस्कृति कक्ष के सिलिकॉन भाग को निष्फल किया जा सकता है और पकवान का पालन करने पर किसी भी अन्य प्लास्टिक और कांच की सतहों के साथ पुन: उपयोग किया जा सकता है।
    5. तुरंत प्रत्येक माइक्रोस्कोपी डिश / अच्छी तरह से गोलाकार निलंबन की समान मात्रा जोड़ें। माइक्रोस्कोपी डिश की सतह से जुड़ने के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए गोलाकार छोड़ दें। ऑक्सीजनेशन विश्लेषण के लिए अन्य रंगों के उपयोग के साथ युग्मित चरण 3.1.6 के साथ आगे बढ़ें। सरल ऑक्सीकरण विश्लेषण के लिए चरण 3.1.7 के साथ आगे बढ़ें।
      नोट:: अपर्याप्त इनक्यूबेशन समय (<1 ज) मीडिया एक्सचेंज के दौरान कभी-कभी गोलाकार हटाने और हानि का कारण बन सकता है, जो आपके प्रयोग को निरस्त कर सकता है। उसी समय, ओवर-इनक्यूबेशन (>3 एच) गोलाकार से माइक्रोस्कोपी डिश की सतह पर कोशिकाओं के प्रवास के कारण उनके 3 डी संगठन के आंशिक या पूर्ण नुकसान का कारण बन सकता है और उनके वास्तविक समय ऑक्सीकरण को प्रभावित कर सकता है।
    6. (वैकल्पिक) ध्यान से फ्लोरोसेंट जांच (ओं) से युक्त एक के साथ माध्यम का आदान-प्रदान एकाग्रता धुंधला करने के लिए पतला और इष्टतम तीव्रता तक पहुंचने के लिए एक अतिरिक्त 1 घंटे के लिए इनक्यूबेशन जारी रखें। मीडिया एक्सचेंज के दौरान गोलाकार को हटाने से बचने के लिए, माइक्रोस्कोपी व्यंजनों के किनारों से 200 μL पिपेट के साथ माध्यम को ध्यान से एस्पिरेट करें और माइक्रोस्कोपी डिश में मध्यम अतिरिक्त साइडवाइज प्रदर्शन करें। चरण 3.1.7 के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: बहुकोशिकीय समुच्चय में खराब प्रसार वाली जांच के साथ कुशल धुंधला करने के लिए, लोडिंग एकाग्रता और / या समय को लम्बा खींचें। उपयोग करने से पहले, प्रारंभिक प्रयोगों में वैकल्पिक जांच लोडिंग पैरामीटर निर्धारित करें।
    7. माइक्रोस्कोपी डिश से माध्यम को हटा दें और इमेजिंग मीडिया के साथ एक बार कुल्ला करें। नमूने में इमेजिंग मीडिया की सटीक मात्रा जोड़ें (उदाहरण के लिए, 12-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के μ-कक्ष के प्रति माइक्रोवेल 300 μL)। चरण 3.2 के साथ आगे बढ़ें।
  2. छवि अधिग्रहण
    1. माइक्रोस्कोप और जुड़े उपकरणों (यानी, उत्तेजना प्रकाश स्रोत, कैमरा, कंप्यूटर, इनक्यूबेटर, और अन्य ऑपरेटिंग इलेक्ट्रॉनिक ब्लॉक) को गर्म करने के लिए इमेजिंग से 30 मिनट पहले चालू करें और माप की स्थिति (तापमान, ओ2, 5% सीओ2, आर्द्रता के विभिन्न मूल्यों यदि आवश्यक हो तो) के लिए संतुलित हो जाएं। माइक्रोस्कोपी ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर सटीक माइक्रोस्कोप सेट-अप के साथ प्रदान की शुरू करें।
      नोट:: वर्णित प्रोटोकॉल CellSens आयाम सॉफ़्टवेयर v.3 के लिए अनुकूलित है।
    2. उपयुक्त उत्तेजना (स्रोत, शक्ति) और उत्सर्जन फिल्टर और चुने गए फ्लोरोसेंट (या स्फुरदीप्त) जांच के लिए एक्सपोज़र समय का चयन करें। मल्टी-पैरामीटर, 3 डी, और टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए, ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर में स्वचालित माप अनुक्रम प्रोटोकॉल (ओं) लिखें।
    3. अनुभवजन्य रूप से प्रारंभिक प्रयोगों में प्रत्येक जांच, प्रयोगात्मक मॉडल और सेल लाइन के लिए इष्टतम इमेजिंग सेटिंग्स निर्धारित करें। सुनिश्चित करें कि सेटिंग्स संदर्भ (मैंरेफरी) और ओ2 संवेदन (मैंसेंस) चैनलों में कम से कम photobleaching है और तीव्रता अनुपात (आर = मैंरेफरी /
    4. माइक्रोस्कोपी चरण पर दाग गोलाकार के साथ माइक्रोस्कोपी डिश सेट करें। कम आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करते हुए, संचरण प्रकाश में नमूने का पूर्वावलोकन करें, गोलाकार पर प्रारंभिक ध्यान केंद्रित करें और उन्हें छवि के केंद्र में खोजें।
      नोट: मानक 4x से 10x आवर्धन हवा के उद्देश्य पूर्व-ध्यान केंद्रित करने के लिए पर्याप्त होंगे, जबकि वास्तविक माप के लिए हम 0.6 या उच्चतर (वायु या जल विसर्जन) उद्देश्यों के संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ 20x से 40x की सिफारिश करते हैं, जिसमें पकवान से जुड़े गोलाकार के लिए पर्याप्त काम करने की दूरी होती है।
    5. आवश्यक उच्च आवर्धन के साथ उद्देश्य को कार्य स्थिति में लाएं। गोलाकार के मध्य (भूमध्यरेखीय) क्रॉस-सेक्शन में संचरण प्रकाश मोड पर ध्यान केंद्रित करें। 3 डी वस्तुओं में ऑक्सीकरण सीधे इमेजिंग अनुभाग की गहराई पर निर्भर करता है। यह सुनिश्चित करने के लिए, समूहों में और उनके बीच समान क्रॉस-सेक्शन का विश्लेषण करें, उदाहरण के लिए, मध्य, और गोलाकार के ऊपर / नीचे क्रॉस-सेक्शन।
      नोट: विस्तृत और सटीक विश्लेषण और O2 gradients के पुनर्निर्माण के लिए, हम confocal, प्रकाश शीट, या दो फोटॉन (सबसे अच्छा विकल्प) माइक्रोस्कोप का उपयोग कर Z-स्टैक स्कैनिंग और उत्पादन की सलाह देते हैं। पारंपरिक वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी के लिए, जहां सभी क्रॉस-सेक्शन से सिग्नल एक साथ एकत्र किए जाएंगे, ओ2 ग्रेडिएंट के सटीक विश्लेषण के बजाय मध्य क्रॉस-सेक्शन द्वारा एक औसत अनुमान लगाया जा सकता है। इस मामले में, मध्य क्रॉस-सेक्शन को एक फोकल सेक्शन के रूप में परिभाषित किया गया है, जहां गोलाकार में उनकी सीमाओं पर तेज फोकस के साथ अधिकतम व्यास होता है।
    6. संदर्भ के प्रतिदीप्ति / फॉस्फोरेसेंस संकेतों और ओ2 जांच के संवेदनशील वर्णक्रमीय चैनलों और मल्टीपैरामीट्रिक इमेजिंग के लिए लागू अन्य प्रतिदीप्ति जांच के संग्रह के लिए सेटिंग्स समायोजित करें।
    7. मात्रात्मक तीव्रता-आधारित तुलना के लिए, समूहों में सभी मापी गई वस्तुओं के लिए एक्सपोज़र समय, उत्तेजना प्रकाश स्रोत शक्ति, रिज़ॉल्यूशन, स्कैन गति और पिनहोल आकार की समान चुनी हुई इमेजिंग सेटिंग्स लागू करें।
      नोट:: कई विक्रेता-प्रदान की गई माइक्रोस्कोपी सॉफ़्टवेयर संस्करण तीव्रता अनुपात की स्वचालित गणना के लिए सक्षम करें। संदर्भ और ओ2 जांच के संवेदनशील चैनलों की तीव्रता माप के लिए फ़ंक्शन मर्ज लागू करें, जब यहां उपयोग किए जाने वाले इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में प्रयोगात्मक प्रबंधक में इमेजिंग अधिग्रहण कार्यक्रम लिखते हैं।
    8. ओ2 जांच के संदर्भ और संवेदनशील वर्णक्रमीय चैनलों के लिए एक ही ऑप्टिकल अनुभाग से छवियों को इकट्ठा करें और यदि आवश्यक हो, तो अतिरिक्त प्रतिदीप्ति चैनल। इस प्रोटोकॉल के लिए, लाल संदर्भ (exc. = 580 nm, em. = 650 nm) और अवरक्त O2-संवेदनशील (exc. = 635 nm, em. = 760 nm) स्पेक्ट्रा के पास MMIR1 जांच का उपयोग करें।
    9. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त संख्या में डेटा बिंदुओं को एकत्रित करने के लिए चरण 3.2.5-3.2.8 दोहराएँ। विभिन्न दवाओं, माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलर्स या इलेक्ट्रॉन-परिवहन श्रृंखला और अन्य तेजी से अभिनय करने वाले यौगिकों के अवरोधकों के साथ उपचार पर तेजी से विकसित सेलुलर प्रतिक्रियाओं के गतिशील विश्लेषण के लिए, टाइम-लैप्स माप मोड (चरण 3.2.10) का उपयोग करें।
    10. इमेजिंग मीडिया में माप का प्रदर्शन करें, नमूने की आवधिक रोशनी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर और ब्याज के फ्लोरोफोरस के संकेतों को इकट्ठा करें (उदाहरण के लिए, ओ2 जांच संदर्भ और संवेदन चैनल), उदाहरण के लिए, 2 मिनट से अधिक के लिए हर 10 सेकंड।
    11. प्रत्येक गोलाकार के लिए एक फोकस जांच करें एक बार आवधिक माप यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि इमेजिंग के दौरान कोई फोकस बहाव नहीं था। यदि आवश्यक हो तो दोहराएं। डेटा विश्लेषण के लिए चरण 3.3 के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: सेल उत्तेजना और दवा के अलावा के बिना, समय-अंतराल माप को संदर्भ डाई की तुलना में फोटोस्टेबिलिटी का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, फ्लोरोसीन, कैल्सीन ग्रीन एएम या टेट्रामिथाइलरोडामाइन मिथाइल एस्टर।
  3. छवि प्रस्तुति
    नोट: यहां हम वर्णन करते हैं कि ओ की स्वचालित रूप से गणना कैसे करें2 इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में अनुपात विश्लेषण फ़ंक्शन का उपयोग करके गोलाकार में जांच तीव्रता अनुपात (आर) और पिक्सेल आर गणना द्वारा पिक्सेल लागू करने के लिए गोलाकार माइक्रोस्कोपी अनुभाग के गलत रंग आर वितरण छवियों को उत्पन्न करने के लिए। R की गणना संदर्भ और संवेदनशील वर्णक्रमीय चैनलों के तीव्रता डेटा से मैन्युअल रूप से भी की जा सकती है जो सरल सूत्र R = I के अनुप्रयोग द्वारा गोलाकार छवि के ब्याज के एक ही क्षेत्र (ROI) से एकत्र किए गए हैंरेफरी/Iसंवेदन24,34. यदि संबंधित माइक्रोस्कोपी सॉफ़्टवेयर में कच्ची छवि से तीव्रता डेटा निकालना संभव नहीं है, तो तीव्रता डेटा को ImageJ या Fiji (चर्चा देखें) जैसे कार्यक्रमों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।
    1. संदर्भ और मर्ज किए गए मोड में बनाए गए संवेदनशील वर्णक्रमीय चैनलों से O2-जांच तीव्रता डेटा के साथ .vsi फ़ाइल खोलें. माप मेनू से अनुपात विश्लेषण फ़ंक्शन विंडो खोलें। अंश के रूप में संदर्भ चैनल की तीव्रता और R गणना के लिए हर के रूप में संवेदनशील चैनल की तीव्रता चुनें।
      नोट: R की गणना के लिए संदर्भ और संवेदनशील संकेतों का उलटा अनुपात भी संभव है, लेकिन इस मामले में, R O2 में वृद्धि के साथ कम हो जाएगा।
    2. मर्ज की गई तीव्रता छवि से पृष्ठभूमि को घटाने के लिए प्रत्येक वर्णक्रमीय चैनल पर संगत तीव्रता थ्रेशोल्ड सेटिंग्स लागू करें. थ्रेशोल्ड मानों को तब तक बढ़ाते रहें जब तक कि छवि पृष्ठभूमि समान रूप से काली न हो जाए। तुलनात्मक विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले डेटा सेट में सभी गोलाकार छवियों के लिए समान रूप से थ्रेशोल्ड पैरामीटर लागू करें।
      नोट:: प्रारंभिक परिकलित false रंग R छवि गोलाकार की देख कर थ्रेशोल्ड सेटिंग्स ऑप्टिमाइज़ करने के लिए पूर्वावलोकन विंडो का उपयोग करें। थ्रेशोल्ड फ़ील्ड में वर्तमान मान से कम तीव्रता वाले सभी पिक्सेल को R विश्लेषण से हटा दिया जाएगा और काले धब्बों के रूप में प्रस्तुत किया जाएगा। थ्रेशोल्ड एप्लिकेशन के बाद, केवल गोलाकार प्रतिदीप्ति के अनुरूप क्षेत्र को विज़ुअलाइज़ किया जाना चाहिए। स्वतंत्र वर्णक्रमीय चैनलों की औसत पृष्ठभूमि तीव्रता (गोलाकार के बिना क्षेत्र) का प्रारंभिक अनुमान छवि के लिए एक उपयुक्त सीमा की पसंद को सरल बनाता है। इसके अतिरिक्त, गोलाकार ROI सीमाओं का अनुप्रयोग, संबंधित संचरण प्रकाश गोलाकार छवि से मर्ज की गई प्रतिदीप्ति छवि के लिए पहचाने जाने से गैर-पृष्ठभूमि सिग्नल तीव्रता के अत्यधिक घटाव को रोकने के लिए थ्रेशोल्ड पैरामीटर के सटीक निर्धारण में मदद मिलती है।
    3. अंश और हर तीव्रता के लिए पृष्ठभूमि सेटिंग्स को 0 पर रखें, क्योंकि पृष्ठभूमि पहले से ही थ्रेशोल्ड एप्लिकेशन के साथ घटाई गई थी।
    4. जब तक पूर्वावलोकन छवि R ग्रेडिएंट का वांछित रिज़ॉल्यूशन प्रदान नहीं करती तब तक अनुपात छवि के लिए स्केलिंग कारक (स्केल) समायोजित करें. तुलनात्मक विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले डेटा सेट में सभी गोलाकार छवियों के लिए समान रूप से स्केलिंग पैरामीटर लागू करें।
      नोट:: स्केलिंग पैरामीटर पर्याप्त बड़ा होना चाहिए (कम से कम 1,000) यह सुनिश्चित करने के लिए कि R छवि में जितना संभव हो उतना जानकारी है और इसे R संख्यात्मक डेटा के लिए रिज़ॉल्यूशन कारक के रूप में देखा जा सकता है।
    5. लागू करें दबाकर, गोलाकार छवि के लिए समायोजित पैरामीटर लागू करें। उपकरण विंडो मेनू से प्रदर्शन विंडो समायोजित करें में छवि की चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें.
    6. मैन्युअल रूप से लिंकिंग और अनलिंकिंग सीमाओं का निर्धारण किसी अनुपात वितरण हिस्टोग्राम में प्रदर्शन समायोजित करें विंडो में निश्चित स्केलिंग विकल्प का उपयोग करके। यह R पैरामीटर प्रस्तुति के लिए गलत-रंग पट्टी की श्रेणी निर्धारित करेगा।
      नोट:: विभिन्न समूहों के बीच गोलाकार छवियों की तुलना करने के लिए, सभी विश्लेषणात्मक नमूनों के लिए एक समान रंग पट्टी श्रेणी रखना महत्वपूर्ण है। चूंकि आर पैरामीटर के परिवर्तनों की एक श्रृंखला समूहों के बीच अलग हो सकती है, इसलिए चुने गए झूठे रंग बार रेंज को सभी विश्लेषणात्मक समूहों में वितरण हिस्टोग्राम के लिए सार्वभौमिक होना चाहिए।
    7. गोलाकार अक्सर आदर्श रूप से गोलाकार नहीं होते हैं, मान लें कि गोलाकार व्यास गोलाकार के केंद्र (अक्सर एक हाइपोक्सिक कोर) के माध्यम से खींची गई सबसे लंबी रेखा है। माप मेनू से रैखिक शासक समारोह का उपयोग करते हुए, गोलाकार व्यास निर्धारित करें। डेटा को स्प्रेडशीट तालिका फ़ाइल के रूप में निर्यात करें.
    8. एक आवश्यक आकार (जितना संभव हो उतना छोटा) और आकार (जैसे, गोल) का आरओआई चुनें और इसे परिधि और गोलाकार के हाइपोक्सिक कोर पर लागू करें। चुने गए ROI के अंदर औसत R (परिधीय R-Rp और कोर R-Rc) का विश्लेषण करने के लिए ROI को माप ऑब्जेक्ट में बदलें। किसी स्प्रेडशीट-संगत तालिका स्वरूप में डेटा निर्यात करें.
      नोट: गोलाकार में समूह के बीच समान O2 वितरण नहीं होता है और हाइपोक्सिक कोर पूरी तरह से गोलाकार केंद्रों के साथ सह-स्थानीयकरण नहीं करते हैं। विश्लेषण को सरल और मानकीकृत करने के लिए हम मानते हैं कि सबसे हाइपोक्सिक क्षेत्र गोलाकार के केंद्र में आदर्श कोर के अनुरूप हैं। इन क्षेत्रों में मापा गया आरसी ओ2 ग्रेडिएंट रेंज (आर पी-आरसी) और स्टीपेननेस (आरपी-आर सी) / आर की गणना के लिए लागू किया जाता है, जहां आर (आदर्श रूप से, परिधि और हाइपोक्सिक कोर आरओआई के बीच की दूरी) व्यास माप से गणना की गई μm में गोलाकार की अनुमानित त्रिज्या है। वैकल्पिक रूप से, गोलाकार O2 gradients को गोलाकार व्यास के साथ किए गए R पैरामीटर परिवर्तन (माप मेनू में लाइन प्रोफ़ाइल विंडो) के रैखिक रेखा प्रोफाइल के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है। इस डेटा को स्प्रेडशीट टेबल फ़ाइल के रूप में भी निर्यात किया जा सकता है।
    9. गोलाकार व्यास के डेटा सेट को प्राप्त करने के लिए गोलाकार के प्रत्येक माइक्रोस्कोपी अनुभाग पर माप लागू करें, आगे की गणना और सांख्यिकीय तुलना करने के लिए आरसी और आरपी । एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में सभी डेटा संयोजित करें.
    10. विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए फोटोब्लीचिंग या गतिशील प्रतिक्रियाओं के समय-अंतराल विश्लेषण के लिए, चुने गए आरओआई को एक सेट में प्रत्येक छवि पर एक ही निर्देशांक पर लागू करें। आर पैरामीटर की तुलना करने के लिए, उन्हें एक समय-अंतराल छवि सेट में पहले चक्र के आर से प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत करें।
    11. फोटोब्लीचिंग विश्लेषण के लिए प्रत्येक समय-अंतराल चक्र के लिए प्रतिशत में औसत आर की गणना करने और परिवर्तनों को ट्रैक करने के लिए कई आरओआई से आर का उपयोग करें।
    12. मान लें कि फोटोब्लीचिंग प्रभाव महत्वपूर्ण नहीं है यदि निरंतर रोशनी के 12 चक्रों के बाद प्रारंभिक तीव्रता में 5% से कम की कमी थी। हमेशा एक नियंत्रण के रूप में एक photobleaching वक्र के साथ गतिशील परिवर्तनों की तुलना करने के लिए ratiometric समय चूक प्रतिक्रिया के महत्व को सुनिश्चित करने के लिए ( चित्रा 2A, B देखें).
    13. प्राप्त पैरामीटर से r, (Rp-R c) और (Rp-R c) / r की गणना एक डेटा सेट में अलग-अलग गोलाकार के लिए करें। Kolmogorov-Smirnov या प्रासंगिक परीक्षणों द्वारा डेटा वितरण की सामान्यता का विश्लेषण करें। डेटा विश्लेषण के लिए उपयुक्त सांख्यिकीय विधि चुनें और डेटा प्रस्तुति आंकड़ों के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: यहां प्रस्तुत डेटा को सामान्य रूप से वितरित किया गया था और गोलाकार समूहों के बीच सांख्यिकीय तुलना के लिए पी = 0.05 पर एक स्वतंत्र टी-परीक्षण लागू किया गया था।

Representative Results

माइक्रोपैटर्न्ड एगारोज़ विधि का उपयोग करके ओ2 प्रोब प्री-स्टेन्ड गोलाकार के उच्च थ्रूपुट उत्पादन को चित्रा 1 सी में योजनाबद्ध रूप से चित्रित किया गया है जो पूर्व-दाग वाले गोलाकार के बिना और उसके साथ एगारोज़ माइक्रोवेल के उदाहरण दिखाता है। Agarose कोटिंग पर गोलाकार गठन की दक्षता और उनके आकार / sphericity सेल विशिष्ट हो सकता है। उदाहरण के लिए, मानव बृहदान्त्र HCT116 कोशिकाओं ने लिपिड-लेपित सतह17 के विपरीत, एगारोज़ माइक्रोवेल विधि का उपयोग करके आदर्श गोलाकार संरचनाओं का गठन कभी नहीं किया, जबकि अकेले hDPSCs और HUVEC के साथ सह-संवर्धित हमेशा सेल संरचना, प्रारंभिक सेल संख्या, और गोलाकार गठन / विकास की अवधि के आनुपातिक रूप से अत्यधिक पुनरुत्पादक आकार और आकार के गोलाकार का उत्पादन करते थे। सभी परीक्षण किए गए सेल प्रकारों ने गोलाकार गठन (चित्रा 1 बी) के दौरान ओ2 जांच नैनोकणों को कुशलतापूर्वक जमा किया और कम से कम 5 दिनों में इस धुंधलापन को संरक्षित किया, जिससे बायोप्रिंटिंग के लिए उनके उपयोग और बायोप्रिंटेड ऊतक ऑक्सीकरण (चित्रा 1 डी) की बाद की निगरानी की अनुमति मिली।

Figure 1
चित्रा 1: ओ2 जांच समारोह के सिद्धांत और गोलाकार धुंधला और bioprinting के लिए इसके आवेदन. (ए) एक सरलीकृत याब्लोंस्की आरेख, जो स्फुरदीप्त नैनोपार्टिकल (एनपी) जांच द्वारा ओ 2-सेंसिंग के सिद्धांत की व्याख्या करता है। निषिद्ध त्रिक उत्तेजित अवस्था (टी) के दौरान आणविक O2 में ऊर्जा का स्थानांतरण फॉस्फोरेसेंस तीव्रता की कमी की ओर जाता है, जो स्फुरदीप्ति जीवनकाल ताऊ के व्युत्क्रमानुपाती होता है, π (0% O 2 पर π1 से21% O2 पर π 2 तक बदलता है), जो एकल अवस्था (S1) के लिए उत्तेजना और जमीन की स्थिति (G0)42 में इसकी वापसी के बीच का समय है। मात्रात्मक O2 माप ratiometric माप द्वारा या मापने के द्वारा किया जा सकता है π (फॉस्फोरेसेंस जीवनकाल माप)। (बी) मानव दंत लुगदी स्टेम सेल (एचडीपीएससी) के विभिन्न प्रकार के नैनोपार्टिकल ओ2 जांच के साथ सना हुआ गोलाकार के धुंधला होने का एक उदाहरण, संचरण प्रकाश, संदर्भ और ओ2-संवेदनशील डाई प्रतिदीप्ति चैनलों में दिखाया गया है। स्केल बार 100 μm है। (C) उच्च-थ्रूपुट O2 प्रोब पूर्व-दाग गोलाकार पीढ़ी के योजनाबद्ध माइक्रोपैटर्न्ड agarose विधि का उपयोग कर। बाएं से दाएं: पीडीएमएस सिलिकॉन स्टैंप को संस्कृति प्लेट के एक कुएं में रखा गया है, अगरोज़ (4x आवर्धन) में एक माइक्रोवेल पैटर्न का एक उदाहरण है, और एमएमआईआर 1 का एक उदाहरण पूर्व-सना हुआ गोलाकार का एक उदाहरण एचसीटी 116 मानव बृहदान्त्र कैंसर कोशिकाओं से उत्पादित किया जाता है, जो कि माइक्रोपैटर्नेड एगारोज़ (4x आवर्धन) पर बीज बोने के बाद दिन 2 पर होता है। स्केल बार 100 μm है। (D) बाएं से दाएं: बायोप्रिंटिंग के बाद दिनों 1 और 5 पर MMIR1 पूर्व-दाग वाले गोलाकार बायोप्रिंटेड निर्माण का एक बायोप्रिंटेड वफ़ल-निर्माण और माइक्रोस्कोपी विश्लेषण। प्रतिदीप्ति संकेत MMIR1 नैनोकणों में O2-संवेदनशील स्फुरदीप्त डाई से मेल खाता है (exc. = 635 nm/em. = 760 nm)। स्केल बार 400 μm है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वर्णित माइक्रोस्कोपी सेट-अप पर (प्रकाश-उत्सर्जक डायोड (एलईडी) के साथ एक प्रकाश स्रोत के रूप में सुसज्जित पारंपरिक वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप) लाल / निकट-अवरक्त MMIR1 जांच को इसके संदर्भ की फोटोस्टेबिलिटी और संवेदनशील रंगों के संदर्भ में सबसे अच्छा पाया गया था, जिसमें उनकी प्रारंभिक तीव्रता अनुपात की चमक में 5% से कम की कमी थी (R = Iref / Isens ) निरंतर रोशनी के 12 चक्रों के बाद। इसने माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलर (एफसीसीपी) के साथ उपचार पर एचडीपीएससी गोलाकार में तेजी से श्वसन प्रतिक्रिया के गतिशील वास्तविक समय के अध्ययन के लिए एमएमआईआर 1 जांच का उपयोग करने की अनुमति दी और इलेक्ट्रॉन-परिवहन श्रृंखला (रोटेनोन) के जटिल I के अवरोधक (चित्रा 2 ए, बी)। हमने पाया कि स्टेम सेल-व्युत्पन्न गोलाकार में, एफसीसीपी ने इस दवा को जोड़ने के बाद ~ 80 सेकंड के भीतर सेल श्वसन की थोड़ी सी कमी के साथ केवल हल्के अनकपलिंग प्रभाव प्रदर्शित किया, डीपीएससी40 की पहले से रिपोर्ट की गई चयापचय विशेषताओं के साथ समझौते में। दूसरी ओर, रोटेनोन ने श्वसन को दृढ़ता से रोक दिया जिससे गोलाकार पुन: ऑक्सीकरण होता है (आरपी - गोलाकार परिधि अनुपात और आरसी - गोलाकार कोर अनुपात की वृद्धि के रूप में परिलक्षित होता है) और परिधि-से-कोर ओ2 ग्रेडिएंट का अपव्यय उत्तेजना के बाद ~ 80 सेकंड के भीतर (चित्रा 2 ए)। उच्च (वायुमंडलीय) और कम (इमेजिंग मीडिया में सोडियम सल्फाइट और ग्लूकोज ऑक्सीडेज की उपस्थिति में) पर एमएमआईआर 1 जांच अनुपात (आर) के दो-बिंदु अर्ध-अंशांकन ने आर की कमी की पुष्टि की, जो एंटीमाइसिन ए / रोटेनोन कॉकटेल उपचार (चित्रा 2 सी) द्वारा प्रारंभिक बाधित श्वसन के साथ गोलाकार में ऑक्सीकरण की कमी से संबंधित है। ), यह दर्शाता है कि एमएमआईआर 1 जांच आर के माप को 3 डी में दीर्घकालिक स्थिर-राज्य और त्वरित ऑक्सीकरण प्रतिक्रियाओं की अर्ध-मात्रात्मक निगरानी के लिए कैसे लागू किया जा सकता है।

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए ओ2 जांच प्रतिक्रिया का गतिज विश्लेषण। (ए) एचडीपीएससी गोलाकार ऑक्सीकरण इमेजिंग का प्रतिनिधि परिणाम आराम से और एफसीसीपी और रोटेनोन उपचारों के जवाब में। स्केल बार 100 μm है। (B) प्रारंभिक photobleaching तीव्रता अनुपात कैनेटीक्स (%) की तुलना में FCCP और rotenone उपचार के लिए MMIR1 तीव्रता अनुपात की काइनेटिक प्रतिक्रिया। (सी) ऑक्सीजनयुक्त (एंटीमाइसिन ए + रोटेनोन अतिरिक्त) और डीऑक्सीजनीकृत (ग्लूकोज ऑक्सीडेज अतिरिक्त) राज्यों में एचडीपीएससी गोलाकार में एमएमआईआर 1 जांच की तीव्रता अनुपात छवियों में परिवर्तन। रंग पट्टी छवि भर में O2 जांच तीव्रता अनुपात (R = Iref / Isens) वितरण का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

लाइव चयापचय इमेजिंग के लिए MMIR1 जांच आवेदन को स्पष्ट करने के लिए, होमोसेलुलर hDPSC बनाम heterocellular hDPSC / HUVEC (1: 1) गोलाकार में O2 ग्रेडिएंट का तुलनात्मक विश्लेषण किया गया था। Hoechst 34580 (HXT) और SYTOX ग्रीन (SYTOX) के साथ मुक्त नीले और हरे रंग के प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय चैनलों की उपलब्धता का लाभ उठाते हुए मल्टीपैरामीट्रिक अध्ययन (चित्रा 3) के लिए ओ2 जांच के आवेदन को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था। इमेजिंग सॉफ़्टवेयर द्वारा प्रदान किए गए पिक्सेल-दर-पिक्सेल तीव्रता अनुपात गणना के स्वचालित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए गोलाकार में आर वितरण की झूठी-रंग अनुपात छवियों का उत्पादन किया गया था, जो सभी प्रकार के गोलाकार में वास्तविक समय की पहचान की गई परिधि-से-कोर ओ2 ग्रेडिएंट की कल्पना करता है: केंद्र में ऑक्सीजन युक्त परिधि और हाइपोक्सिक niches के साथ (चित्रा 2 और चित्रा 3 ए)। हालांकि, आरपी और आरसी मान, साथ ही साथ मध्य क्रॉस-सेक्शन में ओ2 ग्रेडिएंट की steepness विभिन्न गोलाकार प्रकारों के लिए भिन्न होती है: hDPSC बनाम hDPSC / HUVEC गोलाकार और hDPSC बनाम bioprinted hDPSC गोलाकार (चित्रा 3B, C) में मध्य क्रॉस-सेक्शन की लाइन प्रोफाइल देखें। चूंकि ओ2 ग्रेडिएंट का वर्णन करने का कोई व्यापक रूप से स्वीकृत तरीका नहीं था, इसलिए हमने सामान्य गोलाकार ऑक्सीकरण की आसान तुलना और विस्तृत विवरण की अनुमति देने वाले कई पैरामीटर पेश किए: आरपी और आरसी, और ओ2 ग्रेडिएंट की ऐसी विशेषताएं ऑक्सीजनयुक्त और हाइपोक्सिक ज़ोन के बीच अंतर के रूप में (आरपी-आर सी), और प्रति μm ऑक्सीकरण के औसत परिवर्तन (आरपी-आर सी) / आर, जहां आर परिधि और हाइपोक्सिक कोर के बीच की दूरी है, जो गोलाकार त्रिज्या (चित्रा 3 डी) के साथ मध्य क्रॉस-सेक्शन में सहसंबंधित है। गोलाकार में SYTOX द्वारा विज़ुअलाइज़ किए गए परिगलित मृत कोशिकाओं के डेटा के साथ इन मापदंडों की सांख्यिकीय तुलना ने हमें गोलाकार सेल-प्रकार-विशिष्ट O2 वितरण ग्रेडिएंट की उत्पत्ति पर प्रारंभिक निष्कर्ष निकालने में मदद की।

Figure 3
चित्र 3: गोलाकार में ऑक्सीकरण ग्रेडिएंट का तुलनात्मक विश्लेषण। (A) ऑक्सीकरण के लाइव माइक्रोस्कोपी के प्रतिनिधि उदाहरण (MMIR1 की रेशियोमेट्रिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी) और जीवित / मृत सेल स्टेनिंग (Hoechst 34580, HXT, नीले और SYTOX ग्रीन, SYTOX) में होमोसेलुलर hDPSC गोलाकार से पहले और बाद में, और हेटरोसेलुलर hDPSC / HUVEC (1: 1) गोलाकार। गोलाकार के सभी प्रकार में hDPSCs एक ही सेल संस्कृति से थे। गोलाकार को उनके गठन के दौरान 2 दिनों के लिए एमएमआईआर 1 जांच के 5 μg / mL के साथ पूर्व-दाग दिया गया था, और फिर या तो इमेजिंग या बायोप्रिंटिंग (केवल एचडीपीएससी गोलाकार) के लिए उपयोग किया जाता था, बायोप्रिंटिंग के बाद दिन 1 पर बाद के इमेजिंग विश्लेषण के साथ। तीव्रता अनुपात की झूठी रंग छवियों (मैंरेफरी / स्केल बार 100 μm है। रंग पट्टी छवि भर में O2 जांच तीव्रता अनुपात (R = Iref/Isens) वितरण का प्रतिनिधित्व करता है। व्यास क्रॉस-सेक्शन की संख्या 1 और 2 बी और सी में दिखाए गए तीव्रता प्रोफाइल के अनुरूप हैं( बी, सी) सजातीय एचडीपीएससी बनाम विषम एचडीपीएससी / एचयूवीईसी गोलाकार (बी) और सजातीय एचडीपीएससी गोलाकार के बीच तीव्रता अनुपात प्रोफाइल की तुलना बायोप्रिंटिंग (सी) से पहले और बाद में। प्रोफाइल को (ए) पर दिखाए गए गोलाकार के क्रॉस-सेक्शन के लिए मापा गया था। (घ) गोलाकारों में परिधि-से-कोर O2-ग्रेडिएंट के विवरण के लिए उपयोग किए जाने वाले पैरामीटरों का योजनाबद्ध निरूपण, जहां r गोलाकार की त्रिज्या है और Rp और Rc तदनुसार गोलाकार के परिधि और कोर क्षेत्र के तीव्रता अनुपात हैं। रंग पट्टी योजनाबद्ध रूप से आदर्श रूप से गोलाकार गोलाकार गोलाकार में उच्च (लाल) से कम (नीले)स्तरों तक ओ 2 ग्रेडिएंट के वितरण का प्रतिनिधित्व करती है। (E,F) परिधि-से-कोर O 2-gradients (Rp-R c) / r मानों का तुलनात्मक विश्लेषण hDPSC / HUVEC और hDPSC गोलाकार (E) में और hDPSC गोलाकार में बायोप्रिंटिंग (एफ) के बाद और दिन 1 पर। सांख्यिकीय विश्लेषण एक प्रयोगात्मक पुनरावृत्ति (एन = 18-23) के लिए किया गया था। बक्से मानक विचलन के अनुरूप हैं। तारांकन समूहों के बीच सांख्यिकीय अंतर को इंगित करते हैं (पी = 0.05 पर); ** = पी < 0.0005. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

होमोसेलुलर एचडीपीएससी गोलाकार की तुलना में, एचडीपीएससी / एचयूवीईसी गोलाकार में काफी तेज ग्रेडिएंट थे: (आर पी-आरसी) / आर पैरामीटर और रेंज (आरपी-आर सी) के उच्च मूल्य; चित्रा 3F)। उसी समय, उन्होंने परिधि (आरपी) और कोर (आरसी) (चित्रा 4 ए, तालिका 1) के उच्च ऑक्सीकरण को प्रदर्शित किया। दिलचस्प बात यह है कि वे सांख्यिकीय रूप से भी बड़े थे (चित्रा 4 ए, तालिका 1), यह सुझाव देते हुए कि ऑक्सीकरण में इस तरह के अंतर उनके विभिन्न सेलुलर बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल के कारण थे। ये डेटा एचयूवीईसी कोशिकाओं की प्रसिद्ध चयापचय विशेषताओं के साथ समझौते में हैं, जो आमतौर पर एटीपी और एनएडी (पी) एच41 के मुख्य बायोएनर्जेटिक स्रोतों के रूप में ग्लाइकोलाइसिस और पेंटोज-फॉस्फेट मार्गों पर मजबूत निर्भरता के साथ कोशिकाओं की कम श्वसन गतिविधि रखते हैं। उसी समय, विषम गोलाकार में गठित स्पष्ट परिधि-से-कोर ओ2 ढाल संभवतः उनकी संरचना में एचडीपीएससी द्वारा उत्पन्न होता है, जो हाइपरपोलराइज्ड माइटोकॉन्ड्रिया और सक्रिय इलेक्ट्रॉन-परिवहन श्रृंखला40 की विशेषता है और, एचडीपीएससी के परिणामों के अनुसार गोलाकार ऑक्सीकरण, मजबूत श्वसन गतिविधि (चित्रा 3, चित्रा 4 ए, और तालिका 1) ). इस प्रकार, आम तौर पर HDPSC / HUVEC गोलाकार की उच्च व्यवहार्यता SYTOX (चित्रा 3A) के साथ उनकी मृत कोशिकाओं की कम तीव्रता से पुष्टि की जाती है, संभावित रूप से उनके उच्च ऑक्सीकरण स्तरों से जुड़ी होती है।

बायोफैब्रिकेशन में गोलाकार ऑक्सीकरण की लाइव माइक्रोस्कोपी इमेजिंग की प्रयोज्यता को स्पष्ट करने के लिए, एमएमआईआर 1 ओ2-प्रोब पूर्व-दाग वाले गोलाकार का उपयोग जेलएमए बायोइंक में बायोप्रिंटिंग के लिए किया गया था, जिसमें बायोप्रिंटिंग के पहले और दिन 1 पर एचडीपीएससी गोलाकार में ओ2 ग्रेडिएंट की निम्नलिखित तुलना के साथ (चित्रा 3 ए, सी, एफ, चित्रा 4 बी, और तालिका 2)। बायोप्रिंटेड एचडीपीएससी गोलाकार में गोलाकार की तुलना में काफी ऑक्सीजनयुक्त परिधि (उच्च आरपी) थी, जिसे बायोप्रिंटिंग से पहले मापा गया था, जबकि उनके कोर ऑक्सीकरण में समान मूल्य थे (चित्रा 4 बी)। उनकी परिधि ऑक्सीकरण में परिवर्तन सीमा (आरपी-आर सी) की वृद्धि और उनके परिधि-से-कोर ओ2 ग्रेडिएंट की steepness (बढ़ी हुई (Rp-R c)/r) को प्रभावित करते हैं, जो बायोप्रिंटिंग (चित्रा 3F और चित्रा 4B) से पहले मापे गए hDPSC गोलाकार से सांख्यिकीय रूप से अलग थे। मृत कोशिकाओं को धुंधला आम तौर पर बायोप्रिंटेड गोलाकार में उज्ज्वल था, यह सुझाव देते हुए कि गोलाकार व्यवहार्यता में कमी गोलाकार ऑक्सीकरण (चित्रा 3 ए) के परिवर्तन में शामिल है।

Figure 4
चित्र 4: MMIR1-दाग वाले गोलाकार व्यास और तीव्रता अनुपात का तुलनात्मक विश्लेषण। (A) हेटरो-hDPSC/HUVEC और होमोसेलुलर hDPSC गोलाकार के बीच तुलना। (बी) बायोप्रिंटिंग से पहले और बाद में होमोसेलुलर एचडीपीएससी गोलाकार की तुलना। आरपी और आरसी - परिधि पर तीव्रता अनुपात और तदनुसार गोलाकार के कोर; (Rp-R c) - तीव्रता अनुपात में अंतर, गोलाकार में O2 ग्रेडिएंट की सीमा के अनुरूप। सांख्यिकीय विश्लेषण एक प्रयोगात्मक प्रतिकृति (एन = 18-23) के लिए किया गया था। बक्से मानक विचलन के अनुरूप हैं। तारांकन समूहों के बीच सांख्यिकीय अंतर को इंगित करते हैं (p = 0.05 पर), जहां * = p < 0.005 और ** = p < 0.0005। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

गोलाकार का प्रकार (N) व्यास [μm] Rp [a.u.] आरसी [a.u.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./μm]
hDPSC / HUVEC (18) 113.2 ± 10.6 0.779 ± 0.034 0.398 ± 0.055 0.982 ± 0.051 0.00677 ± 0.00091
hDPSC (18) 88.1 ± 9.9 0.558 ± 0.025 0.331 ± 0.034 0.227 ± 0.032 0.00520 ± 0.00090
पी-मान 1.5 x 10-8 * 1.5 x 10-21 * 1.3 x 10-4 * 1.4 x 10-12 * 9.2 x 10-6 *

तालिका 1. गोलाकार व्यास, गोलाकार के कोर (आरसी) और परिधि (आरपी) पर तीव्रता अनुपात, विषम एचडीपीएससी / एचयूवीईसी और सजातीय एचडीपीएससी गोलाकार में तीव्रता अनुपात (आरपी-आर सी) और (आरपी-आर सी) / आर मान में अंतर। एन गोलाकार पर एक टी-परीक्षण का पी-मान सांख्यिकीय अंतर को दर्शाता है और एक तारांकन चिह्न के साथ भी इंगित किया जाता है।

गोलाकार का प्रकार (N) व्यास [μm] Rp [a.u.] आरसी [a.u.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./μm]
hDPSC (18) 88.1 ± 9.9 0.558 ± 0.025 0.331 ± 0.034 0.227 ± 0.032 0.00520 ± 0.00090
Bioprinted hDPSC (23) 80.9 ± 12.5 0.584 ± 0.023 0.323 ± 0.038 0.261 ± 0.039 0.00658 ± 0.00144
पी-मान 0.054 0.0024 * 0.46 9.9 x 10-4 * 6.3 x 10-6 *

तालिका 2. गोलाकार व्यास, गोलाकार के कोर (आरसी) और परिधि (आरपी) पर तीव्रता अनुपात, बायोप्रिंटिंग से पहले और बाद में सजातीय एचडीपीएससी गोलाकार में तीव्रता अनुपात (आरपी-आर सी) और (आरपी-आर सी) / आर मान में अंतर। सांख्यिकीय विश्लेषण का पी-मान (एन गोलाकार)। सांख्यिकीय अंतर एक तारांकन चिह्न के साथ इंगित किया गया है।

Discussion

अर्थ। ऊतक ऑक्सीकरण माप सेल और ऊतक-विशिष्ट चयापचय, ऊतक विकास और विकास, व्यवहार्यता, और सेल माइग्रेशन, और रोगाणुओं और अन्य रोगजनकों के साथ बातचीत पर एक अंतर्दृष्टि देता है। प्रस्तुत विधि बहुकोशिकीय गोलाकार संस्कृतियों के शरीर विज्ञान की बेहतर समझ के लिए एक नया उपकरण देती है: रेशियोमेट्रिक नैनोपार्टिकल ओ 2 जांचके साथ ऑक्सीकरण का विश्लेषण और हाइपोक्सिया का आकलन करने के लिए साधन प्रदान करता है, विशेष ऊर्जा उत्पादन मार्गों पर निर्भरता की कल्पना करता है और मॉडलिंग अध्ययन और वैकल्पिक चयापचय इमेजिंग दृष्टिकोण43,44 के पूरक एक व्यापक रूप से उपलब्ध कम लागत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर. रेशियोमेट्रिक माप एक प्रतिदीप्ति वाइडफील्ड (स्पंदित एलईडी उत्तेजना पसंदीदा), लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल, लाइट शीट और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप पर किया जा सकता है, आदर्श रूप से टी और ओ2 इनक्यूबेटर कक्षों से सुसज्जित है। महत्वपूर्ण रूप से, प्रस्तुत ओ2 माइक्रोस्कोपी माप को विभिन्न शारीरिक मापदंडों और सेल ट्रेसर्स (हेटरोसेलुलर गोलाकार संस्कृतियों के मामले में), व्यवहार्यता (लाइव / मृत धुंधला), लिपिड चयापचय (लिपिड-सेंसिंग फ्लोरोसेंट जांच), पीएच की गतिशीलता (रंजक, नैनोकणों और फ्लोरोसेंट प्रोटीन) या [सीए2 + के लाइव मल्टी-पैरामीटर विश्लेषण के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है। ], उपलब्ध प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय चैनलों में या समानांतर में प्रदर्शन किया, गोलाकार, bioprinted निर्माणों, और संभावित ऊतक प्रत्यारोपण में वास्तविक समय सेल समारोह पर एक विस्तारित दृश्य दे रही है।

गोलाकार संस्कृतियों को कैंसर कोशिकाओं, ट्यूमर और स्टेम सेल आला माइक्रोएन्वायरमेंट, ट्यूमरोइड्स, दवा दक्षता और विषाक्तता स्क्रीनिंग के अध्ययन में उपयोग किया जाता है, और वास्तव में ऊतक बायोफैब्रिकेशन और आत्म-असेंबली 45 के लिए ऊतक निर्माणब्लॉकों के रूप में। वे विभिन्न प्रकार के विभिन्नदृष्टिकोणों 46 द्वारा कई सेल प्रकारों से उत्पन्न किए जा सकते हैं। गोलाकार मॉडल की लोकप्रियता को अनुसंधान अखंडता और डेटा विश्लेषण के सुधार के दृष्टिकोण से उनके मानकीकरण की आवश्यकता होती है, जिसे हाल ही में पहले गोलाकार डेटाबेस8 के विकास द्वारा प्रयास किया गया था।

हमारे प्रोटोकॉल से लाइव गोलाकार चयापचय को बेहतर ढंग से समझने में मदद करने, इस प्रयोगात्मक मॉडल को मानकीकृत करने और बाद में बायोप्रिंटेड और प्रत्यारोपण योग्य सामग्रियों के भीतर उनकी दीर्घकालिक स्थिरता, पुनरुत्पादन और व्यवहार्यता में सुधार करने की उम्मीद है।

संशोधन। यह प्रोटोकॉल ऑक्सीजन विश्लेषण के लिए O2 प्रोब-लोडेड गोलाकार की उच्च उपज पीढ़ी के लिए माइक्रोपैटर्न्ड एगारोज़ कम-अनुयायी सतह (माइक्रोमोल्ड-आधारित गठन29) के उपयोग का वर्णन करता है। गोलाकार उत्पादन के वैकल्पिक तरीके जैसे कि फांसी ड्रॉप, अल्ट्रा-कम अनुलग्नक प्लेटों का आवेदन, लिपिड कोटिंग, या फ्री-फ्लोटिंग गठन भी सुझाए गए ओ2 जांच लोडिंग प्रोटोकॉल के साथ संगत हैं। प्रस्तुत प्रोटोकॉल को HDPSC गोलाकार और HUVEC (1: 1) के साथ hDPSC के सह-संस्कृति गोलाकार के लिए अनुकूलित किया गया था। अन्य सेल लाइनें निश्चित रूप से लागू होती हैं 15,17,47,48; हालांकि, कुछ प्रोटोकॉल अनुकूलन विभिन्न सेल आसंजन गुणों, संस्कृति की स्थिति, चयापचय सब्सट्रेट आवश्यकताओं, और nanoparticle धुंधला के साथ सेल संगतता के कारण आवश्यक हो सकता है। एक उपयुक्त रेशियोमेट्रिक नैनोपार्टिकल-आधारित ओ2-संवेदनशील जांच का विकल्प विशिष्ट सेल मॉडल के आधार पर और उपयोग किए गए माइक्रोस्कोपी सेट-अप (प्रकाश स्रोत की तीव्रता और प्रकार, कैमरे की वर्णक्रमीय संवेदनशीलता) और संबंधित संदर्भ और जांच के ओ2-संवेदनशील वर्णक्रमीय चैनलों के लिए उपयुक्त उत्तेजना / उत्सर्जन फिल्टर की उपलब्धता पर जांच फोटोब्लीचिंग गुणों के आधार पर किया जाना है।

कुछ ratiometric O2 जांच व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं2. वैकल्पिक रूप से, उन्हें संदर्भ के सह-अवक्षेपण और ओ2-संवेदनशील रंगों द्वारा एक बहुलक के साथ घर में तैयार किया जा सकता है जैसा कि कहीं और24,25,49 वर्णित है। प्रत्येक व्यक्तिगत मॉडल के लिए, प्रारंभिक परीक्षणों को उचित जांच और इष्टतम माइक्रोस्कोपी स्थितियों को निर्धारित करने के लिए और रेशियोमेट्रिक माप के दौरान जांच फोटोब्लीचिंग या फोटोप्रेरित ओ2 खपत के प्रभाव को कम करने के लिए किया जाना चाहिए। ओ 2-सेंसिंग नैनोकणों के पिछले अध्ययनों ने अपने कम सेल विषाक्तता का प्रदर्शन किया, जिससे धुंधला सांद्रता (1-20 μg / mL) की एक विस्तृत श्रृंखला में आवेदन की अनुमति मिली। जैसा कि कुछ कैटिओनिक नैनोकणों को भंडारण के दौरान आत्म-समुच्चय कर सकते हैं, हम गोलाकार गठन पर उनके संभावित प्रभाव को कम करने के लिए उनकी लोडिंग एकाग्रता को यथासंभव कम रखने की सलाह देते हैं। वैकल्पिक रूप से, नैनोपार्टिकल निलंबन को फ़िल्टर किया जा सकता है (0.2 μm) या निलंबन से सभी समुच्चय को हटाने के लिए उपयोग करने से पहले centrifugation (10,000 x g, 5 मिनट) द्वारा साफ किया जा सकता है।

यद्यपि बायोकैड और एचएमआई सॉफ्टवेयर प्रस्तुत बायोप्रिंटर के लिए विशिष्ट हैं, यह प्रोटोकॉल अन्य बायोप्रिंटरों पर लागू होता है, क्योंकि बायोइंक की तैयारी, असेंबली, एक मानक कारतूस को भरना, और एक झरझरा हाइड्रोजेल पाड़ का डिजाइन प्रदान किया जाता है। इसके अलावा, प्रिंटिंग दर और तापमान जैसे बायोप्रिंटिंग पैरामीटर विभिन्न एक्सट्रूज़न-आधारित बायोप्रिंटरों के लिए तुलनीय होने चाहिए। मुद्रण दबाव और अकड़ व्यास सुई प्रकार और व्यास, बायोइंक संरचना, तापमान और परिणामी चिपचिपाहट पर निर्भर करते हैं, लेकिन वे विभिन्न बायोप्रिंटरों के साथ बायोप्रिंट गेलएमए-आधारित बायोइंक्स के लिए प्रिंटिंग पैरामीटर को अनुकूलित करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु हो सकते हैं, हालांकि कुछ बायोप्रिंटर बायोइंक50 को बाहर निकालने के लिए हवा के दबाव के बजाय स्पिंडल का उपयोग करते हैं।

महत्वपूर्ण चरण और समस्या निवारण. महत्वपूर्ण चरणों में से एक ओ2 जांच का विकल्प है, जो निम्नलिखित विचारों पर आधारित है: सबसे पहले, उपलब्ध प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप सेट-अप (यानी, संगत उत्तेजना प्रकाश स्रोत, उत्तेजना और उत्सर्जन के लिए फ़िल्टर, कैमरा संवेदनशीलता और वर्णक्रमीय संचरण और उद्देश्य के संख्यात्मक एपर्चर), जो उनके फोटोस्टेबिलिटी के संबंध में उपलब्ध जांच की संख्या को सीमित कर सकते हैं, चमक और संभावित phototoxicity. यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कुछ प्रकार के विसर्जन तेल (तेल-विसर्जन उद्देश्यों के मामले में) लाल और अवरक्त प्रतिदीप्ति संकेतों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। हम फोटोस्टेबिलिटी परीक्षणों को अत्यधिक महत्वपूर्ण मानते हैं और उन्हें प्रारंभिक सेट-अप और प्रारंभिक परीक्षणों के दौरान किया जाना चाहिए। फ्लोरोसेंट चैनलों और विभिन्न रंगों के बीच संभावित वर्णक्रमीय क्रॉसस्टॉक पर विचार किया जाना चाहिए। दरअसल, विशिष्ट सेल मॉडल के संबंध में ओ2 जांच और अन्य चयनित रंजक की संभावित अंधेरे और फोटोप्रेरित विषाक्तता का मूल्यांकन प्रोटोकॉल अनुकूलन51 के दौरान किया जाना चाहिए। नैनोकणों के लिए विशिष्ट मुद्दा उनके आत्म-एकत्रीकरण हो सकता है, जिसे उनके काम की एकाग्रता, धुंधला माध्यम की संरचना (जैसे, सीरम सामग्री) का अनुकूलन करके कम किया जा सकता है, माध्यम के साथ मिश्रण करने से पहले नैनोकणों की sonication या ओ2-जांच पूर्व-दाग और धोया कोशिकाओं का उपयोग करके गोलाकार गठन के बजाय गोलाकार गठन के बजाय गोलाकार गठन और कॉम्पैक्टाइजेशन प्रक्रिया के दौरान लोड हो रहा है।

हमने वर्णित गोलाकार मॉडल के साथ प्रकाश प्रवेश गहराई से जुड़ी समस्याओं का निरीक्षण नहीं किया, लेकिन इस पर विचार किया जाना चाहिए जब रेशियोमेट्रिक तीव्रता संकेतों, गोलाकार और बायोफैब्रिकेटेड निर्माणों (ऊतक ग्राफ्ट) के आकार और संबंधित रंजक के साथ सेल धुंधला का अनुकूलन करते हैं। एमएमआईआर 1 जांच में लाल और निकट-अवरक्त उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का बारीकी से मिलान करने से अन्य लाल / नीले या हरे-उत्सर्जक फ्लोरोसेंट बायोसेंसर जांच की तुलना में सबसे कम पृष्ठभूमि और सबसे अच्छा ऊतक प्रकाश प्रवेश प्रदान करने की उम्मीद है।

उत्पादन और अनुपात छवियों (और संभावित वर्णक्रमीय unmixing या deconvolution) की हैंडलिंग एक विक्रेता प्रदान सॉफ्टवेयर में या इस तरह के ImageJ, फिजी52,53, napari (https://napari.org), MATLAB, और अन्य के रूप में opensource विकल्पों में किया जा सकता है. एक महत्वपूर्ण कदम पृष्ठभूमि को घटाने और एक रैखिक सीमा में संकेत तीव्रता परिवर्तनों को मापने में होगा।

O2 जांच का अंशांकन: Rotenone और antimycin A माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के परिसरों I और III के अवरोधक हैं, क्रमशः, सेल श्वसन54,55,15 को अवरुद्ध करते हैं और गोलाकार में O2-gradients के अपव्यय को प्रेरित करते हैं और पर्यावरणीय O2 के साथ उनके संतुलन को प्रेरित करते हैं। इस प्रकार, पर्यावरणीय O 2 एकाग्रता (यानी,20%, 15%, 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0% O 2) को बदलने से कोशिकाओं में O2-संवेदनशील जांच के ratiometric तीव्रता या फॉस्फोरेसेंस जीवनकाल अंशांकन के लिए अनुमति मिलेगी। आमतौर पर, ओ2-नियंत्रित इनक्यूबेटर पूर्ण 0% ओ2 प्राप्त करने में सक्षम नहीं होते हैं और कुछ स्थितियों में, डीऑक्सीजनेशन के लिए जांच की प्रतिक्रिया का एक त्वरित परीक्षण आवश्यक है। ऐसे मामलों में, ग्लूकोज ऑक्सीडेज के 25-100 μg / mL या Na2SO3 / K2HPO4 मिश्रण (आसुत पानी में 10x समाधान के लिए प्रत्येक यौगिक के लिए 50 मिलीग्राम / एमएल) को नमूने में जोड़ा जाना चाहिए। महत्वपूर्ण रूप से, यदि सेल लाइन में गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ओ2 खपत की एक महत्वपूर्ण डिग्री है, तो श्वसन और अंशांकन प्रयोगों के निषेध का प्रदर्शन करते समय इस पर विचार करें।

सीमाएं और भविष्य के अनुसंधान। प्रस्तावित विधि की मुख्य सीमा और सामान्य रूप से रेशियोमेट्रिक डिटेक्शन, वास्तविक ओ2 स्तरों में मनाया गया अनुपात स्तरों का अंशांकन और रूपांतरण है, जो हार्डवेयर और उपयोगकर्ता छवि अधिग्रहण सेटिंग्स में आंतरिक अंतर के कारण अनुपात अंशांकन साधन- और सेल-विशिष्ट बना देगा। महत्वपूर्ण रूप से, एक वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और वर्णित सेटअप के लिए, अनुपात छवियां आदर्श ऑप्टिकल वर्गों के बजाय संयुक्त अनुमानों को प्रतिबिंबित कर रही हैं और ओ2 अंशांकन समझ में नहीं आएगा। दूसरी ओर, हम दिखाते हैं कि अर्ध-मात्रात्मक अनुपात माप विभिन्न स्रोतों से उत्पादित गोलाकार के सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण और आसानी से मापने वाले तुलनात्मक फेनोटाइपिंग प्रदान करते हैं और ऑक्सीकरण में अंतर रखते हैं।

एसपीआईएम, लाइट शीट, थीटा, दो-फोटॉन और ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग जैसे लाइव 3 डी ऑब्जेक्ट्स के लिए डिज़ाइन किए गए अधिक सुलभ और किफायती माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण बनाने में भविष्य के शोध, मशीन लर्निंग56,57,58,59,19 के साथ संयुक्त, मल्टीपैरामीट्रिक ओ2 इमेजिंग को और भी अधिक मात्रात्मक अनुप्रयोगों में लाने में मदद करेंगे।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को गेन्ट विश्वविद्यालय (बीओएफ / एसटीए / 202009 / 003) और यूरोपीय संघ के एफपी 7 आईटीएन कार्यक्रम "चेबाना" के विशेष अनुसंधान निधि अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है, अनुदान समझौता संख्या 264772 (एवीके के लिए)। अनुरोध पर डेटा उपलब्ध है। बायोप्रिंटिंग के लिए जी कोड साझा करने के लिए उपलब्ध है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 Also available from Sigma
12 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 665-180 Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable Ibidi 81201 Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes Nerbe plus 02-502-3001 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3cc Cartridge, UV secure, luer lock RegenHU C-033CC-UV Also available from CelIink and others
3D Discovery Bioprinter RegenHU N/A Bioprinter equiped with an extrusion based printhead, heating mantle, UV-LED curing lamp, 3D Discovery HMI software (CAD/CAM software with direct machine control) and BioCAD software (version 1.1-12)
6 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 657160 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674-25MG Used as inhibitor of complex III of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
B-Braun Tip Cap, luer lock RegenHU TC-BB-B Also available from Regemat, Cellink and others
Cell view cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment, sterile Greiner bio-one 627861 For microscopy of bioprinted spheroids
Collagen from human placenta, type IV Sigma C5533 For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
D(+)-Glucose Merck 8342 Prepare 1M stock solution, 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free Sigma-Aldrich D5030-10X1L For preparation of imaging medium
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Also available from Lonza and others
Endothelial Growth SupplementMix PromoCell C-39216 Also available from Lonza and others
FCCP, Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920-10MG Used as mitochondrial uncoupler
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-098 Also available from Sigma
GelMA N/A N/A GelMA was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782] but are also available from Xpect Inx
Glucose-oxidase from Aspergillus nige (10000 u) Sigma-Aldrich G7141 Used to test the response of probe to deoxygenation
GlutaMAX 100x Supplement Gibco 35050-038 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 2mM)
HEPES (1M) Gibco 15630-080 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Hoechst 34580 Invitrogen (Life Technologies) H21486 Also available from Sigma, BDBiosciences and others
Human dental pulp stem cells (hDPSC) Lonza PT-5025 Also available from ATCC or other vendors
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2517 Also available from ATCC or other vendors
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) Merck 4873 For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
Li-TPO N/A N/A Li-TPO-L was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent)  [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97
8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] but comparable photo-initiators are available from Sigma
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium Gibco 32561-029 Also available from Sigma and others
Micro-patterned 3D-printed PDMS stamps, wells with a diameter 400 µm, thickness, total well numbers 1585 Self-fabricated These stamps were self-fabricated by the Centre for Microsystems Technology (Professor Dr Jan Vanfleteren, University of Gent) but can also be obtained commercially from Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit)
Na2SO3 (sodium sulfite) Sigma-Aldrich 239321-500G For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
O2 probes: MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+ N/A N/A Can be prepared ‘in-house’ using commercially available dyes, polymers and precipitation method [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Some nanoparticles are available commercially as discussed in [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x ]
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution Gibco 15140-122 Also available from Sigma . Apply in dilution 1:100
Petri dishes, sterile Greiner bio-one 633181 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Piston for 3cc cartridge RegenHU P-03CC-UV Also available from Cellink, Regemat and others
Poly-D-lysine Sigma P6407-5mg For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
PVDF syringe filter 0.22 µm Novolab A35149 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Rotenone Sigma-Aldrich R8875-1G Used as inhibitor of complex I of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SYTOX Green Invitrogen (Life Technologies) S7559 Also available from Sigma, Promega and others
Taper tip 22 gauge (conical PE needle Amada Myachi Europe 22K62222 Similar products are also available from RegenHU, Cellink, Regemat and others
Tissue culture flask (75 cm2) VWR 734-2313 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Ultrapure Agarose Invitrogen (Life Technologies) 16500-500 Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope Olympus N/A Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water

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Okkelman, I. A., Vercruysse, C.,… More

Okkelman, I. A., Vercruysse, C., Kondrashina, A. V., Borisov, S. M., Dmitriev, R. I. Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids. J. Vis. Exp. (182), e63403, doi:10.3791/63403 (2022).

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