Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Overkommelig iltmikroskopiassisteret biofabrikation af multicellulære sfæroider

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63403
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1
1Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medical and Health Sciences, Ghent University, 2Health and Happiness (H&H) Group, National Food Innovation Hub, 3Institute of Analytical Chemistry and Food Chemistry, Graz University of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Protokollen beskriver sfæroidgenerering med høj gennemstrømning til bioprint ved hjælp af den multiparametriske analyse af deres iltning og celledød på et standard fluorescensmikroskop. Denne tilgang kan anvendes til at kontrollere sfæroidernes levedygtighed og udføre standardisering, hvilket er vigtigt i modellering af 3D-væv, tumormikromiljø og vellykket (mikro) vævsbiofabrikation.

Abstract

Multicellulære sfæroider er vigtige værktøjer til at studere vævs- og kræftfysiologi i 3D og bruges ofte i vævsteknik som vævssamlingsenheder til biofabrikation. Mens den vigtigste kraft i sfæroidmodellen er at efterligne fysisk-kemiske gradienter på vævsmikroskalaen, ignoreres det virkelige fysiologiske miljø (herunder dynamik i metabolisk aktivitet, iltning, celledød og proliferation) inde i sfæroiderne generelt. Samtidig er virkningerne af vækstmediets sammensætning og dannelsesmetoden på den resulterende sfæroidfænotype veldokumenterede. Således kræves karakterisering og standardisering af sfæroidfænotype for at sikre reproducerbarheden og gennemsigtigheden af forskningsresultaterne. Analysen af gennemsnitlig sfæroidiltning og værdien afO2-gradienter i tre dimensioner (3D) kan være en enkel og universel måde til sfæroidfænotypekarakterisering, der peger på deres metaboliske aktivitet, overordnede levedygtighed og potentiale til at rekapitulere in vivo-vævsmikromiljø . Visualiseringen af 3D-iltning kan let kombineres med multiparametrisk analyse af yderligere fysiologiske parametre (såsom celledød, proliferation og cellesammensætning) og anvendes til kontinuerlig iltningsovervågning og / eller slutpunktsmålinger. Indlæsningen afO2-sonden udføres under stadiet af sfæroiddannelse og er kompatibel med forskellige protokoller for sfæroidgenerering. Protokollen omfatter en højgennemstrømningsmetode til sfæroidgenerering med indførte røde og nær-infrarøde emitterende ratiometriske fluorescerendeO2 nanosensorer og beskrivelsen af multiparametervurdering af sfæroidiltning og celledød før og efter bioprint. De eksperimentelle eksempler viser komparativO2-gradientanalyse i homo- og heterocellulære sfæroider samt sfæroidbaserede bioprintede konstruktioner. Protokollen er kompatibel med et konventionelt fluorescensmikroskop med flere fluorescensfiltre og en lysemitterende diode som lyskilde.

Introduction

Molekylært ilt (O2) er en af de vigtigste metabolitter, der regulerer celle- og vævslevedygtighed, funktion og død. Under fysiologiske forhold reguleres lokal vævsiltning dynamisk ved vævssekularisering, blodgennemstrømning og cellemetabolisme, hvilket i nogle tilfælde fører til dannelse afO2-gradienter, hypoxisk mikromiljø og / eller oxidativ stress 1,2. Celler registrererO2-gradienterne gennem den direkte involvering af den molekylæreO2 i signalfunktionen (via hypoxi-inducerbar faktor (HIF)-medieret signalering, histonlysindemethylaser KDM og på anden måde), ændringer i cellulær redoxpotentiale (reaktivO2-art, der registrerer gennem Nrf2 / Keap1-signalering eller jernregulerende proteiner) og kan efterfølgende justere deres metabolisme, proliferation, styrke og differentiering3. Således er heterogenitet af celle- og vævsiltning, dets gradienter og tilhørende fænomener vigtige aktører i vævsudvikling og homeostase. Forskellige væv og celletyper kræver ofte forskellige 'normale' fysiologiskeO2-niveauer, som definerer den særlige vævsarkitektur med celler placeret i henhold til vævetO2-mikrogradienter 4. Nogle celletyper er følsomme over forO2-fald (f.eks. neuroner, hepatocytter, bugspytkirtelceller eller muskelceller)5,6, mens andre kan modstå ekstrem hypoxi og danne stejleO2-gradienter (f.eks. i tarm- og tyktarmsepitelen)7. Med fremskridtene inden for vævsbioengineering og biofabrikation bliver nødvendigheden afO2-kvantificering i mikroaggregater og sfæroide 3D-vævskonstruktioner vigtige. En af bekymringerne er standardiseringen af de multicellulære sfæroidmodel fysiologiske parametre, som afhænger af metoden til sfæroidgenerering og kulturbetingelser8. Derudover kan ukontrolleret anvendelse afO2-frigivende biomaterialer ellerO2-perfusion i mikrotiser, der mangler funktionel vaskularisering, være giftig for celler, føre til omprogrammering af deres metabolisme og nedsat overlevelse i perioden efter transplantation 9,10. Troværdigheden afO2-målemetoden og optimeringen af iltningsmiljøet for at nå den effektive kultur af fysiologisk relevante mikroaggregater blev for nylig bevist ved matematisk modellering af pluripotente stamcelleafledte leversfæroider, der blev brugt som et eksempel11. Et andet felt, hvor kendskabet til vævO2-niveauer anerkendes, er kræftbehandling 12,13. Heterogen tumorhypoxi kan forringe vellykket kræftbehandling. Måling og kontrol af de nøjagtige iltningsniveauer under patientbehandling eller tumorhypoximodellering ville muliggøre forbedring af individuelle og personlige terapistrategier14. Således er kvantitativ overvågning af dynamisk iltning i biofabrikerede konstruktioner og 3D-tumormodeller et fremtrædende redskab til fysiologisk analyse af deres respirationsaktivitet, metabolisme og optimering af vævskultur, fremstillingsbetingelser eller grundlæggende undersøgelser af hypoxi-medieret terapeutisk respons.

En række metoder muliggør multiplexet (eller multiparameter) analyse af celleoxygenation i sfæroid- og mikroaggregeringsvævskonstruktioner. Banebrydende med neurosfærer og tumorsfæroider 15,16,17 muliggør den phosphorescens levetidsbilleddannelsesmikroskopi (PLIM)-baserede tilgang direkte kvantificering af celleiltning i levende mikrovæv og etablering af dens sammenhæng med cellelevedygtighed, proliferation eller distribution af de funktionelle celletyper. På trods af kraften i tilgangen er PLIM mikroskopi opgradering stadig ikke bredt tilgængelig, selv blandt de populære mikroskopi leverandører18,19. Heldigvis kan et stort antal cellegennemtrængende O2-følsomme nanopartikelsonder også bruges til den fluorescensintensitetsbaserede ratiometriske målemodus 15,17,20,21,22,23,24. Sonden vil typisk vise to emissionsbølgelængder, dvs. O2-følsom og ufølsom (reference), som kan måles på et fluorescensmikroskop, screeningsbillede med højt indhold eller mikropladelæser. SådanneO2-sensing nanopartikler kan fremstilles ved udfældningsteknik med de biokompatible polymerer,O2-sensing og referencefarvestoffer, der spænder over synlige og nær-infrarøde spektre, eller de kan købes kommercielt 2,25. Da analysen af tykke 3D-mikrotiser ville drage fordel af brugen af rødforskudte fluorescerende farvestoffer, blev den ratiometriskeO2-sensing nanopartikelsonde multimodale infrarøde nummer 1 (MMIR1), der består af O2-sensing PtTPTBPF26 og reference aza-BODIPY27 farvestoffer imprægneret i en positivt ladet polymethacrylatbaseret copolymer, konstrueret28. Med dette design er etO2-følsomt signal (nær-infrarødt, excitation (exc.) = 635 nm, emission (em.) = 760 nm; Isens) påvirkes af [O2]-koncentrationen via fosforescensslukningsprocessen, mens den røde referencefarvestofintensitet (exc. = 580 nm, em. = 650 nm; Iref) forbliver upåvirket (figur 1A). Således kan Iref / Isens-forholdet (R) i farvede celler muliggøre O2-kalibrering22.

Her beskriver vi en semi-kvantitativ tilgang til overvågning af levende celleiltning i sfæroider og bioprintede konstruktioner, der hjælper med at estimereO2-gradienter i endepunkts- og kinetiske målinger. En sådanO2-billeddannelse kan udføres med andre typer ratiometriskeO2-sonder (figur 1B) og afhængigt af antallet af tilgængelige lyskilder og fluorescensfiltre kan den bruges sammen med andre farvestoffer til at få information om levende / døde celler, mitokondriefunktion og sporing af andre celletyper. Avancerede målemetoder såsom fluorescens levetid billeddannelse mikroskopi (FLIM) kan også anvendes19. Den største udfordring ved brug af cellefarvningsfarvestoffer ogO2-følsomme nanopartikler er optimeringen af farvningsprotokollen. I tilfælde af MMIR1-sonden og beslægtede nanopartikler er celler enten forfarvede eller co-inkuberede under processen med sfæroiddannelse. I den beskrevne protokol blev O2-sondefarvede sfæroider genereret på lavhækt agaroseoverflade29,30,31,32 (figur 1C), hvilket muliggør efterfølgende sfæroidbaseret bioprint og multiparameteranalyse afO2 og celledød. For at illustrere anvendeligheden af tilgangen blev iltningsniveauerne i homo- eller heterocellulære (dannet med tilsætning af humane navlestrengselendotelceller, HUVEC) humane dental pulp stamceller (hDPSC) sfæroider sammenlignet før og efter bioprint ved hjælp af konventionelt fluorescensmikroskop.

Protocol

1. Høj gennemstrømningsgenerering af sfæroider med inkorporeretO2-følsom sonde

  1. Fremstilling af mikromønstret agarosebelagt vævskulturplade
    BEMÆRK: Mikromønstrede agarosebelagte vævskulturplader anvendes til samtidig generering af et stort antal sfæroider (1585 pr. PDMS-stempel, se Tabel over materialer) til bioprint og andre anvendelser, hvor der er behov for flere eksperimentelle replikater eller store sfæroidnumre.
    1. Alle sterile materialer og instrumenter (spatler og pincet) forberedes ved autoklavering, hvor det er muligt, eller ved filtersterilisering. Rengør de genanvendelige PDMS-stempler33 fra agarose og opbevar dem aseptisk i 70% ethanol. Gør dette mindst 1 dag før sfæroidgenerering.
    2. Overfør mikromønstrede PDMS-stempler fra et opbevaringshætteglas til en steril petriskål og lufttør med den glatte overflade op under de sterile laminære luftstrømsforhold i 10 minutter.
    3. Sæt hvert frimærke med en mikromønstret overflade op (og glat overflade ned) midt i brønden på en 12-brønds steril vævskulturplade. Lufttør i 1-2 min med et åbent låg.
      BEMÆRK: Det er meget vigtigt at fordampe den overskydende væske, da kun tørre stempler klæber perfekt til plastoverfladen og forbliver fastgjort under proceduren.
    4. Væg 1,5 g agarose i en ren 200 ml glasflaske, tilsæt 50 ml sterilt destilleret vand, dæk med låg og smelt i en mikrobølgeovn for at fremstille 50 ml 3% homogen agaroseopløsning.
      FORSIGTIG: Agaroseopløsningen er ekstremt varm og skal håndteres med forsigtighed. Hvis den rystes umiddelbart efter smelteproceduren, kan den varme agaroseopløsning begynde at boble og sprænge ud af beholderen. For at undgå lejlighedsvise traumer skal du bruge tilstrækkeligt store kar fyldt med maksimalt 50% af volumenet med agaroseopløsningen.
    5. Ved hjælp af en steril serologisk pipette tilsættes straks ~ 2 ml varm agaroseopløsning til hver brønd i cellekulturpladerne med 12 brønde for fuldstændigt at dække det indsatte PDMS-stempel. Lad agarose størkne i 20 minutter ved at inkubere under den sterile luftstrøm med pladelåget åbnet.
      BEMÆRK: Agaroselaget skal være mindst to gange tykkere end PDMS-stemplet for at sikre integriteten af agarosemikrobrøndene efter fjernelsen af PDMS-stemplet (figur 1C).
    6. Brug en steril lille spatel til nøjagtigt at dreje agarose med det indlejrede PDMS-stempel på hovedet i hver brønd for at få den glatte stempeloverflade op. Tilsæt ~ 200 μL sterilt vand på stemplets glatte overside, fjern det forsigtigt fra agarose med en spatel, og fjern det fra brønden. Undgå at beskadige mikrobrøndene.
    7. Der tilsættes 1 ml tilsvarende sterile cellekulturmedier til agarosestemplerne til direkte brug. Dæk pladen med låget og inkuber natten over ved 4 °C. Brug PBS-opløsning (i stedet for medium) til langtidsopbevaring (op til 2 uger ved 4 °C). Lad ikke agarose tørre. Før brug opvarmes de mikromønstrede plader af agarose i 1 time ved 37 °C i en CO2-inkubator .
      BEMÆRK: Inkubation er nødvendig for at udligne og fjerne luftbobler fra agarosemikrobrønde. Fortsæt med protokoltrin 1.2.
  2. Forberedelse O2 sondebelastede sfæroider
    1. Brug α-minimal essentielt medium (MEM) suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS) og vækstfaktorer suppleret endotelcellevækstmedium 2 til dyrkning af henholdsvis hDPSC- og HUVEC-cellelinjer. Forbered hDPSC / HUVEC heterocellulært sfæroid vækstmedium ved at tilføje HUVEC og hDPSC vækstmedier i forholdet 1: 1.
    2. Forbered 70% -90% sammenflydende cellekultur (~ 3-4 dages forberedelse). Til generering af heterocellulære sfæroider skal du forberede henholdsvis hDPSC- og HUVEC-kulturer.
      BEMÆRK: Passagenummeret på HUVEC og hDPSC må ikke overstige 8. For at sikre hurtig vækst af cellekulturer opdeles altid ved 1/3 af den samlede cellekultur (ved 70%-80% sammenløb) ved hjælp af en ny kolbe hver 3. til 4. dag.
    3. Skyl 70%-90% sammenflydende cellekultur med forvarmet (37 °C) PBS (10 ml pr. 75 cm2 kolbe). Tilsæt dissocierende enzymopløsning (0,05% trypsin og 1 mM EDTA; 1 ml pr. 75 cm2 kolbe) og inkuber i 3-5 minutter ved 37 °C i 5% CO2, 95% fugtighed til celleløsning og kontroller celleløsning under mikroskopet. Når det er gjort, neutraliser trypsin med komplette cellekulturmedier indeholdende 10% FBS (5 ml medier pr. 1 ml dissociationsopløsning).
      BEMÆRK: Undgå overeksponering af celler til den dissocierende enzymopløsning, da dette kan påvirke deres levedygtighed.
    4. For HUVEC dyrket i et lavt FBS-medium skal du udføre trypsinneutralisering ved at tilsætte 0,5 ml 100% FBS til den trypsinbehandlede cellekultur efterfulgt af centrifugering for at overføre celler til deres vækstmedium.
      BEMÆRK: Den eller de opnåede cellesuspensioner skal indeholde ~ 1 million celler pr. 1 ml. Om nødvendigt kan der tilføjes et yderligere centrifugeringstrin til protokollen for at koncentrere cellesuspension.
    5. Dissociere celleaggregater ved pipettering ved hjælp af en 1000 μL pipettespids på toppen af en 10 ml serologisk pipette for at opnå enkeltcellesuspension. Brug et tællekammer (hæmocytometer af Neubauer-typen eller alternativer) til at tælle antallet af celler pr. 1 ml af cellesuspensionen34. Fortynd cellesuspensionen til 500.000 celler pr. Ml. For heterocellulær hDPSC / HUVEC i 1: 1 sfæroidforhold tilsættes lige store mængder tilsvarende cellesuspensioner for at have en endelig cellekoncentration på 500.000 celler pr. Ml.
      BEMÆRK: Variation i cellekoncentration i suspension tilsat et mikromønstret agarosestempel gør det muligt at ændre den gennemsnitlige størrelse af producerede sfæroider, hvilket afhænger af et celletal pr. Mikrobrønd af et agarosestempel. I den beskrevne opsætning genereres sfæroider på ~ 300 celler fra 1 ml indeholdende 500.000 celler på et agarosestempel med 1585 mikrobrønde.
    6. Der tilsættes koncentreretO2-sondeopløsning (nanopartikler, 1 mg/ml stam) til den fremstillede cellesuspension til en endelig koncentration på 5 μg/ml.
      BEMÆRK: Sfæroiddannelse i nærvær afO2-sensing nanopartikler giver effektiv farvning, som bevares i mindst 5 dage (figur 1D). I modsætning hertil vil farvning af præformerede multicellulære sfæroider med nanopartikler være mindre effektiv15.
    7. Udveksling af 1 ml gamle medier i en mikromønstret brønd af 12-brønds agarosebelagte cellekulturplader (se trin 1.1.7) til 1 ml af den forberedte cellesuspension (500.000 celler pr. 1 ml med 5 μg/mlO2-sonde ). Kultur sfæroiderne i CO2 inkubator i 2-5 dage i kontinuerlig tilstedeværelse afO2-sonden for at sikre dens belastning under sfæroiddannelse og komprimering.
      BEMÆRK: Undgå overdreven medium fordampning i sfæroidkultur. Om nødvendigt tilsættes forsigtigt (forstyr ikke sfæroiderne i mikrobrønde) 0,2-0,5 ml kulturmedier med den ekstra O2-sondefortynding.
    8. Efter sfæroiddannelsen skal du udveksle vækstmediet med en frisk uden sonden. Sondefarvningen bevares i genererede sfæroider i 7-14 dage eller længere, hvilket muliggør langsigtet overvågning af dens signaler i sfæroider.

2. Sfæroider bioprint

BEMÆRK: Sfæroider bioprintes i en methacrylamidmodificeret gelatine (GelMA) baseret bioink. Nedenfor er en beskrivelse af bioinkingredienserne, proceduren for bioinkpræparat og bioprint.

  1. Bioink forberedelse
    1. En 10 % (w/v) GelMA-opløsning (2 ml) fremstilles i medium under en laminær luftstrøm35 som følger: Afvej 0,2 g steril GelMA med en substitutionsgrad på 78 i et 15 ml rør, tilsæt 1,9 ml α-MEM og lad det opløses ved at blande det på en roterende ryster ved 37 °C (~2 timer).
      BEMÆRK: Tilsæt ikke den fulde mængde medium, fordi andre forbindelser såsom sfæroider og fotoinitiator Li-TPO-L vil blive tilføjet senere.
    2. Resuspend sfæroider i de mikromønstrede brønde ved pipettering og saml dem i et 15 ml rør. Udfør en ekstra skylning med PBS for at sikre, at alle sfæroider opsamles fra agarosemikrobrøndene. Undgå at røre ved /beskadige agarosemikrobrøndene, da flager af agarose kan blokere nålen under bioprint.
    3. Saml sfæroider ved centrifugering i et 15 ml rør ved 300 x g i 5 minutter ved 20 °C. Aspirer supernatanten med en pipette, tilsæt 50 μL medium til sfæroiderne og resuspend dem ved blid pipettering.
    4. Tilsæt sfæroidblandingen til den varme GelMA-opløsning og bland ved blid pipettering. Oprethold sfæroidkoncentrationen til 6340-12860 sfæroider (fra 4-8 mikromønstre) pr. Ml bioink til bioprint. Undgå højere koncentrationer af sfæroider, da det let forårsager blokering af tryknålen.
    5. Der tilsættes filtersteriliseret fotoinitiator Li-TPO-L-stamopløsning (32 mg/ml) i en endelig koncentration på 2 mol% i forhold til antallet af dobbeltbindinger og blandes ved blid pipettering36,37.
      BEMÆRK: Mængden af Li-TPO-L kan beregnes i henhold til ligningen:
      Volumen af fotoinitiator (PI) = (0,000385 molNH2- grupper / g GelMA x 294,10 g Li-TPO-L / mol x 0,78 x 0,02) / 0,032 g Li-TPO-L / ml x 0,2 g GelMA = 0,0107 ml Li-TPO-L lager
  2. Fremgangsmåde for bioprint
    1. Se trinnene i tillægsprotokol 1 for design af stilladser i CAD. Følg nedenstående trin for at bioprinte designet.
    2. Luk enden af en steril 3 cc patron med en spidshætte (luerlås) og fyld med bioblæk ved pipettering. Indsæt et stempel i patronen. Hold patronen på hovedet, og fjern spidshætten, skub stemplet mod bioblækket, indtil al luft fra patronen er fjernet.
      BEMÆRK: Undgå kontakt mellem GelMA bioink og patronens sider, da dette kan hæmme stemplets bevægelse på grund af gelering af bioblækket.
    3. Lad bioblæk kølen af i bioprinterens varme kappe ved 23 °C (20-30 min). Skru en trykadapter i på toppen af patronen. Luk klemmen på indløbsrøret for at forhindre, at bioblækket lækker, monter en 22 G konisk PE-nål på patronen. Tilpas nålens størrelse og diameter til stilladsets design og sfæroiddiameter og koncentration.
      BEMÆRK: Brug mundmaske og sprøjtehandsker for at forhindre kontaminering.
    4. Sprøjt bioprinteren med 70% ethanol og tør den af med absorberende papir. Installer patronen i varmekappen på det ekstruderingsbaserede skrivehoved. Sæt tryktilslutningsslet i, og åbn klemmen på indstået. Indlæs G-kodefilen for dit design i udskrivningssoftwaren.
    5. Start måling af nålelængde. Reguler tryktrykket ved at dispensere lidt bioink i en steril petriskål. Et udskrivningstryk på 0,025-0,045 MPa er typisk for udskrivning af GelMA-baserede bioblæk38.
    6. Installer en 6-brønds plade, åbn brøndpladen, luk emhætten, og start udskrivningen. Efter udskrivning skal stilladserne være fysisk tværbundne i 10 minutter ved 5 °C og bestråle de trykte stilladser i 60 s med en UV LED-lampe (365 nm; 500 mW ifølge producenten).
      BEMÆRK: UV-tværbindingstiden afhænger af UV-lysets egenskaber, fotoinitiatortype og koncentration, den ønskede stillads tværbindingsgrad, hævelse og elasticitetsmodul.
    7. De tilsvarende vækstmedier indeholdende 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin (P/S) tilsættes straks til alle brønde med bioprintede gitre (2 ml pr. brønd af en cellekulturplade med 6 brønde).
    8. Dyrkning i en 37 °C CO2-inkubator , indtil du starter mikroskopien. For bioprintet konstruktionsmikroskopi skal du overføre et trykt vaffelgitter til en mikroskopiskål, dække med billedmedier og fortsætte med trin 3.2 og 3.3.
      BEMÆRK: I tilfælde af flydende bioprintede konstruktioner skal de fastgøres i mikroskopiskålen uden en indvirkning på cellelevedygtigheden, f.eks. med cytokompatibel lim. Ved omvendt mikroskopoverførsel skal bioprintet til en mikroskopi glasbundsskål og dækkes med et billedmedie (~ 200-500 μL, se noten til trin 3.1 for billeddannelse af mediesammensætning) for at undgå uønsket flydende af prøven. Farvning med yderligere fluorescerende sonder kan udføres i cellekulturskålen inden overførsel af bioprintede konstruktioner til mikroskopifade (se trin 3.1.6).

3. Ratiometrisk fluorescens levende mikroskopi af sfæroid oxygenering i det biofabrikerede væv

BEMÆRK: For at konvertere O2-sondens ratiometriske intensitetsrespons (R) til de faktiske hypoxiniveauer skal sonderesponsen kalibreres ved hjælp af procedurer beskrevet i24. Da den ratiometriske kalibrering imidlertid er instrumentspecifik og kræver installation af en T/O2/CO 2/CO2-kontrolleret inkubator (ikke altid tilgængelig), er anvendelsen af semi-kvantitativ forholdsdetektion den foretrukne løsning.

  1. Fremstilling af sfæroider til levende billeddannelsesanalyse
    1. Til sfæroidfastgørelse under dette trin skal du forbelægge de sterile mikroskopiskåle med kollagen IV og / eller poly-D-lysin eller bruge kommercielt tilgængelige39. Kontroller kompatibiliteten af mikroskopi retter med arbejdsafstanden og andre egenskaber ved formålet med dit mikroskop.
      BEMÆRK: I tilfælde af billeddannelse med flere parametre skal alle yderligere farvningsprocedurer udføres i kulturpladefadene med tilstrækkelig mængde medier, der beskytter celler mod fordampning, osmotisk chok eller anden belastning. Forbered og forvarm billeddannelsesmedium inden brug: DMEM suppleret med natriumbicarbonat (1,2 g / l), HEPES-Na, pH 7,2 (10 mM), natriumpyruvat (1 mM), L-glutamin (2 mM) og glucose (5 mM) uden phenolrød.
    2. Brug en 1 ml pipette til forsigtigt at vaske O2-sonden forfarvede sfæroider ud af agarosemikrobrøndene. Mens sfæroiderne stadig flyder i medierne, skal du overføre dem til et 15 ml konisk bundrør.
    3. For at sikre indsamling af alle sfæroider fra en mikromønstret brønd skylles brønden 1 til 3 gange med de yderligere 1 ml kulturmedier, der kombinerer alle sfæroidsuspensioner i et hætteglas. Lad hætteglasset stå lodret i op til 10 minutter for at lade sfæroiderne slå sig ned på bunden af hætteglasset og danne en synlig pellet.
    4. Fjern forsigtigt medierne fra røret og lad sfæroiderne være uforstyrrede. Forsigtigt resuspend dem i mængden af frisk kultur medium, der vil være tilstrækkelig til mindst 20 sfæroider pr mikroskopi prøve skål. Dette vil minimere brugen af kulturmedierne og forenkle lokalisering af sfæroider under billeddannelse.
      BEMÆRK: Brug den autoklaverbare siliciumdel af μ 12-brønds plade (se materialetabel), der er fastgjort til dækglasset, som en mikroskopiprøveskål (24 x 60 mm, tykkelse nr. 1) med et maksimalt medievolumen på 300 μL pr. Brønd. Siliciumdelen af dette kulturkammer kan steriliseres og genbruges med andre plast- og glasoverflader, når de klæbes til fadet.
    5. Tilsæt straks lige stor mængde sfæroidsuspension til hver mikroskopiskål / brønd. Lad sfæroiderne stå i 1 time ved 37 °C i en CO2-inkubator for at fastgøre dem til mikroskopiskålens overflade. Til iltningsanalyse kombineret med anvendelse af andre farvestoffer fortsættes med trin 3.1.6. For simpel iltningsanalyse fortsæt med trin 3.1.7.
      BEMÆRK: Utilstrækkelig inkubationstid (<1 time) kan føre til lejlighedsvis fjernelse af sfæroider og tab under medieudvekslingen, hvilket afbryder dit eksperiment. Samtidig kan overinkubation (>3 timer) føre til delvis eller fuldstændigt tab af deres 3D-organisation på grund af migration af celler fra sfæroider til mikroskopiskåloverfladen og påvirke deres iltning i realtid.
    6. (valgfrit) Udskift forsigtigt mediet med en, der indeholder fluorescerende sonde(r) fortyndet til farvningskoncentration, og fortsæt inkubationen i yderligere 1 time for at nå optimal intensitet. For at undgå fjernelse af sfæroider under medieudveksling skal du forsigtigt aspirere mediet med en 200 μL pipette fra kanterne af mikroskopifadene og udføre medium tilsætning sidevis i mikroskopiskålen. Fortsæt med trin 3.1.7.
      BEMÆRK: For effektiv farvning med sonder med dårlig diffusion i flercellede aggregater skal belastningskoncentrationen og / eller tiden forlænges. Før brug skal du bestemme de valgfri sondeindlæsningsparametre i indledende eksperimenter.
    7. Fjern mediet fra mikroskopiskålen og skyl en gang med billedmedier. Tilsæt den nøjagtige mængde billedmedier til prøven (f.eks. 300 μL pr. mikrobrønd μ-kammer i en 12-brønds kulturplade). Fortsæt med trin 3.2.
  2. Erhvervelse af billeder
    1. Tænd mikroskopet og tilsluttede enheder (dvs. excitationslyskilde, kamera, computer, inkubator og andre fungerende elektroniske blokke) 30 minutter før billeddannelse for at varme op og blive ligevægtige til måleforholdene (temperatur, forskellige værdier afO2, 5% CO2, fugtighed, hvis det kræves). Start den mikroskopi-driftssoftware, der leveres med den nøjagtige mikroskopopsætning.
      BEMÆRK: Den beskrevne protokol er tilpasset CellSens Dimension-softwaren v.3.
    2. Vælg de relevante excitations- (kilde, effekt) og emissionsfiltre og eksponeringstiden for udvalgte fluorescerende (eller fosforescerende) sonder. For multiparameter-, 3D- og timelapse-mikroskopianalyser skal du skrive den eller de automatiserede målesekvensprotokoller i driftsmikroskopsoftwaren.
    3. Empirisk bestemme de optimale billeddannelsesindstillinger for hver sonde, eksperimentel model og cellelinje i foreløbige eksperimenter. Sørg for, at indstillingerne har minimal fotobleaching i referencekanaler (Iref) ogO2 sensing (Isens) og minimal effekt på intensitetsforholdet (R = Iref / Isens), især i 3D- og time-lapse-måleeksperimenter.
    4. Opsæt mikroskopiskålen med farvede sfæroider på mikroskopitrinnet. Brug målet med lav forstørrelse til at forhåndsvise prøven i transmissionslys, foretage indledende fokus på sfæroider og lokalisere dem i midten af billedet.
      BEMÆRK: Standard 4x til 10x forstørrelsesluftmål er tilstrækkelige til forfokusering, mens vi til den faktiske måling anbefaler 20x til 40x med numerisk blænde (NA) på 0,6 eller højere (luft- eller vandnedsænkning) mål med tilstrækkelig arbejdsafstand til sfæroider fastgjort til fadet.
    5. Bring målet med den krævede høje forstørrelse til arbejdsstillingen. Fokus på transmissionslystilstand i det midterste (ækvatoriale) tværsnit af sfæroiden. Oxygenering i 3D-objekter afhænger direkte af dybden af billeddannelsesafsnittet. For at sikre dette skal du analysere lignende tværsnit i og mellem grupper, f.eks. Midterste og øverste / nederste tværsnit af sfæroider.
      BEMÆRK: For detaljeret og præcis analyse og rekonstruktion afO2-gradienter anbefaler vi at scanne og producere Z-stakke ved hjælp af konfokale, lysark eller to-foton (bedste mulighed) mikroskoper. For konventionel bredfeltmikroskopi, hvor signalet fra alle tværsnit indsamles samtidigt, kan der foretages en gennemsnitlig estimering ved det midterste tværsnit snarere end en nøjagtig analyse afO2-gradienter . I dette tilfælde defineres det midterste tværsnit som et fokusafsnit, hvor sfæroiderne har maksimal diameter med et skarpt fokus på deres grænser.
    6. Juster indstillingerne for indsamling af fluorescens-/fosforescensreferencesignaler og følsomme spektralkanaler iO2-sonden og andre fluorescensprober, der anvendes til multiparametrisk billeddannelse.
    7. Til den kvantitative intensitetsbaserede sammenligning skal du anvende de samme valgte billedindstillinger for eksponeringstiden, excitationslyskildeeffekt, opløsning, scanningshastighed og pinhole-størrelse for alle målte objekter i grupper.
      BEMÆRK: Mange leverandørforvejede mikroskopi-softwareversioner muliggør automatiske beregninger af intensitetsforholdet. Anvend funktionsfletning til intensitetsmålinger af reference og følsomme kanaler iO2-sonden , når du skriver billedoptagelsesprogrammet i den eksperimentelle leder i den billedbehandlingssoftware, der bruges her.
    8. Indsaml billeder fra den samme optiske sektion til reference og følsomme spektralkanaler iO2-sonden og om nødvendigt yderligere fluorescenskanaler. Til denne protokol skal du bruge MMIR1-sonden med den røde reference (ekskl. = 580 nm, em. = 650 nm) og nær infrarødO2-følsom (ekskl. = 635 nm, em. = 760 nm) spektre.
    9. Gentag trin 3.2.5-3.2.8 for at indsamle et tilstrækkeligt antal datapunkter til statistisk analyse. Til dynamisk analyse af de hurtigt udviklende cellulære reaktioner ved behandling med forskellige lægemidler, mitokondrielle afkoblere eller hæmmere af elektrontransportkæden og andre hurtigtvirkende forbindelser skal du anvende time-lapse-målemodus (trin 3.2.10).
    10. Udfør målingerne i billedmedier ved 37 °C med periodisk belysning af prøven, og indsaml signaler fra de fluoroforer, der er af interesse (f.eks.O2-sondereference - og sensorkanaler), f.eks. hver 10. s. i over 2 minutter.
    11. Udfør en fokuskontrol for hver sfæroid, når den periodiske måling er udført for at sikre, at der ikke var nogen fokusdrift under billeddannelsen. Gentag om nødvendigt. Fortsæt med trin 3.3 til dataanalyse.
      BEMÆRK: Uden cellestimulering og lægemiddeltilsætning kan time-lapse-måling udføres for at vurdere fotostabiliteten sammenlignet med referencefarvestoffet, f.eks. fluorescein, calceingrøn AM eller tetramethylrhodaminmethylester.
  3. Billedpræsentation
    BEMÆRK: Her beskriver vi, hvordan man automatisk beregner O2 sondeintensitetsforhold (R) i sfæroider ved hjælp af forholdsanalysefunktion i billeddannelsessoftwaren og anvend pixel for pixel R-beregning for at generere falske R-fordelingsbilleder af sfæroidmikroskopisektionen. R kan også beregnes manuelt ud fra intensitetsdataene for reference- og følsomme spektralkanaler indsamlet fra det samme interesseområde (ROI) af sfæroidbilledet ved anvendelse af den enkle formel R = IRef/Isens24,34. Hvis det ikke er muligt at udtrække intensitetsdataene fra det rå billede i den tilsvarende mikroskopisoftware, kan intensitetsdataene opnås ved hjælp af programmer som ImageJ eller Fiji (se Diskussion).
    1. Åbn .vsi-filen med O2-sondeintensitetsdata fra reference- og følsomme spektralkanaler, der er lavet i flettet tilstand. Åbn vinduet med funktionen til analyse af forhold fra målemenuen. Vælg referencekanalens intensitet som tæller og intensiteten af den følsomme kanal som nævneren til R-beregning.
      BEMÆRK: Det omvendte forhold mellem reference og følsomme signaler til beregning af R er også muligt, men i dette tilfælde vil R falde med stigningen iO2.
    2. Anvend tilsvarende intensitetstærskelindstillinger på hver spektralkanal for at trække baggrunden fra det flettede intensitetsbillede. Bliv ved med at øge tærskelværdierne, indtil billedbaggrunden er ensartet sort. Anvend tærskelparameteren ens på alle sfæroidbilleder i det datasæt, der anvendes i sammenlignende analyse.
      BEMÆRK: Brug eksempelvinduet til at optimere tærskelindstillingerne ved at observere det foreløbigt beregnede falske farve R-billede af sfæroider. Alle pixels med en intensitet, der er lavere end den aktuelle værdi i tærskelfeltet, fjernes fra R-analysen og præsenteres som sorte pletter. Efter tærskelpåføringen skal kun det område, der svarer til sfæroidfluorescens, visualiseres. Den foreløbige estimering af den gennemsnitlige baggrundsintensitet (områder uden sfæroider) af de uafhængige spektralkanaler forenkler valget af en passende tærskel til billedet. Derudover hjælper anvendelse af sfæroid ROI-grænser, der er identificeret fra det tilsvarende transmissionslyssfæroidbillede til det fusionerede fluorescensbillede, med nøjagtig bestemmelse af tærskelparametrene for at forhindre overdreven subtraktion af signalintensiteterne uden baggrund.
    3. Hold baggrundsindstillingerne for tælleren og nævnerintensiteterne på 0, da baggrunden allerede var trukket fra med tærskelanvendelsen.
    4. Juster skaleringsfaktoren (Skala) til forholdsbilledet, indtil eksempelbilledet giver den ønskede opløsning af R-gradienten. Anvend skaleringsparameteren ens på alle sfæroidbilleder i det datasæt, der anvendes i sammenlignende analyse.
      BEMÆRK: Skaleringsparameteren skal være stor nok (mindst 1.000) til at sikre, at R-billedet indeholder så mange oplysninger som muligt og kan ses som en opløsningsfaktor for R-numeriske data.
    5. Anvend justerede parametre på sfæroidbilledet ved at trykke på Anvend. Juster billedets lysstyrke og kontrast i vinduet Juster display fra menuen Med værktøjsvinduer.
    6. Bestem manuelt grænserne for sammenkædning og afkobling af et forholdsfordelingshistogram ved hjælp af indstillingen Fast skalering i vinduet Juster visning. Dette bestemmer rækkevidden af den falske farvebjælke for R-parameterpræsentationen.
      BEMÆRK: For at sammenligne sfæroidbilleder mellem forskellige grupper er det vigtigt at holde et lignende farvebjælkeområde for alle analytiske prøver. Da en række ændringer af R-parameteren kan være forskellige mellem grupper, bør det valgte falske farvebjælkeområde være universelt for fordelingshistogrammer i alle analytiske grupper.
    7. Sfæroider er ikke ofte ideelt sfæriske, antager, at sfæroiddiameteren er den længste linje trukket gennem midten (ofte en hypoxisk kerne) af sfæroiden. Brug den lineære linealfunktion fra målemenuen til at bestemme sfæroiddiameteren. Eksportér data som en regnearkstabelfil.
    8. Vælg ROI for en krævet størrelse (så lille som muligt) og form (f.eks. Rund) og anvend den på periferien og den hypoxiske kerne af sfæroiden. Transformer ROI til måleobjektet for at analysere den gennemsnitlige R (perifer R-Rp og kerne R-Rc) inden for det valgte ROI. Eksportér data i et regnearkskompatibelt tabelformat.
      BEMÆRK: Sfæroider har ikke identiskO2-fordeling blandt gruppen, og de hypoxiske kerner lokaliserer ikke perfekt med sfæroidcentrene. For at forenkle og standardisere analysen antager vi, at de mest hypoxiske områder svarer til den ideelle kerne i midten af sfæroiden. Rc målt i disse zoner anvendes til beregninger afO2-gradientområdet (Rp-R c) og stejlheden (Rp-R c) /r, hvor r (ideelt set en afstand mellem periferi og hypoxiske kerne-ROI'er) er en omtrentlig radius af sfæroiden i μm beregnet ud fra diametermålingerne. Eventuelt kan sfæroidO2-gradienter præsenteres som lineære linjeprofiler af R-parameterændring (linjeprofilvindue i målemenu) lavet langs sfæroiddiameteren. Disse data kan også eksporteres som en regnearkstabelfil.
    9. Anvend målinger på hver mikroskopi sektion af sfæroider for at opnå datasættet af sfæroiddiametre, Rc og Rp for at udføre yderligere beregninger og statistisk sammenligning. Kombiner alle data i én regnearksfil.
    10. Til timelapse-analyse af fotoblegerning eller dynamiske reaktioner på forskellige stimuli skal du anvende det valgte investeringsafkast på de samme koordinater på hvert billede i et sæt. Hvis du vil sammenligne R-parametre, skal du præsentere dem som en procentdel fra R i den første cyklus i et timelapse-billedsæt.
    11. Til fotobleachinganalyse skal du bruge R fra flere ROI'er til at beregne den gennemsnitlige R i procenter for hver timelapse-cyklus og spore ændringerne.
    12. Antag, at fotobleachingeffekten ikke er kritisk, hvis der var mindre end 5% fald i den oprindelige intensitet efter 12 cyklusser med kontinuerlig belysning. Sammenlign altid dynamiske ændringer med en fotobleachingkurve som en kontrol for at sikre betydningen af ratiometrisk timelapse-respons (se figur 2A,B).
    13. Fra de opnåede parametre beregnes r, (Rp-R c) og (Rp-R c) / r for individuelle sfæroider i et datasæt. Analyser normaliteten af datafordelingen ved Kolmogorov-Smirnov eller relevante tests. Vælg den relevante statistiske metode til dataanalyse, og fortsæt med datapræsentationstal.
      BEMÆRK: De data, der præsenteres her, blev normalt fordelt, og en uafhængig t-test ved p = 0,05 blev implementeret til statistisk sammenligning mellem sfæroidgrupper.

Representative Results

Den høje gennemstrømningsproduktion afO2-sonde forfarvede sfæroider ved hjælp af mikromønstret agarosemetode er skematisk illustreret i figur 1C, der viser eksempler på agarosemikrobrønde uden og med de forfarvede sfæroider. Effektiviteten af sfæroiddannelse på agarosebelægning og deres form / sfæricitet kan være cellespecifik. For eksempel dannede humane tyktarm HCT116-celler aldrig ideelle sfæriske strukturer ved hjælp af agarosemikrobrøndmetoden i modsætning til lipidbelagt overflade17, mens hDPSC'er alene og samdyrket med HUVEC altid producerede sfæroider af meget reproducerbar form og størrelse proportional med cellesammensætning, indledende celleantal og varighed af sfæroiddannelse / vækst. Alle de testede celletyper akkumulerede effektivt O2-sondenanopartikler under sfæroiddannelse (figur 1B) og bevarede denne farvning over mindst 5 dage, hvilket lod deres anvendelse til bioprint og efterfølgende overvågning af det bioprintede vævsiltning (figur 1D).

Figure 1
Figur 1: Princippet omO2-sondefunktion og dens anvendelse til sfæroidfarvning og bioprint. (A) Et forenklet Yablonski-diagram, der forklarer princippet omO2-sensing af de fosforescerende nanopartikelsonder (NP). Overførslen af energi til molekylærO2 under den forbudte triplet ophidsede tilstand (T) fører til et fald i fosforescensintensiteten, der er omvendt proportional med fosforescensens levetid tau, τ (ændringer fra τ1 ved 0%O2 til τ2 ved 21%O2), hvilket er tiden mellem excitation til singlet tilstand (S1) og dens tilbagevenden til jordtilstanden (G0)42. KvantitativO2-måling kan foretages ved ratiometrisk måling eller ved måling af τ (fosforescenslevetidsmålinger). (B) Et eksempel på farvning af humane dental pulp stamceller (hDPSC) sfæroider farvet med forskellige typer nanopartikelO2-sonder , vist i transmissionslys,reference ogO2-følsomme farvestoffluorescenskanaler. Skalabjælken er 100 μm. (C) Skemaer med høj gennemstrømningO2-sonde forfarvet sfæroidgenerering ved hjælp af mikromønstret agarosemetode. Fra venstre mod højre: PDMS siliciumstempel placeret i en brønd på kulturpladen, et eksempel på et mikrobrøndmønster i agarose (4x forstørrelse) og et eksempel på MMIR1 forfarvede sfæroider produceret af HCT116 humane tyktarmskræftceller på dag 2 efter såning på mikromønstret agarose (4x forstørrelse). Skalabjælken er 100 μm. (D) Fra venstre mod højre: en bioprintet vaffelkonstruktion og mikroskopianalyse af MMIR1 forfarvet sfæroid bioprintet konstruktion på dag 1 og 5 efter bioprint. Fluorescenssignalet svarer tilO2-følsomt fosforescerende farvestof i MMIR1 nanopartikler (exc. = 635 nm/em. = 760 nm). Skalabjælken er 400 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

På den beskrevne mikroskopiopsætning (konventionelt bredfeltfluorescensmikroskop udstyret med den lysemitterende diode (LED) som lyskilde) blev rød/nær-infrarød MMIR1-sonde fundet som den bedste med hensyn til fotostabilitet af dens reference og følsomme farvestoffer med det mindre end 5% fald i lysstyrken i deres oprindelige intensitetsforhold (R = Iref / Isens ) efter 12 cyklusser med kontinuerlig belysning. Dette gjorde det muligt at anvende MMIR1-sonde til dynamisk realtidsundersøgelse af hurtig respirationsrespons i hDPSC-sfæroider ved behandling med mitokondriel uncoupler (FCCP) og hæmmer af kompleks I af elektrontransportkæden (rotenon) (figur 2A,B). Vi fandt ud af, at FCCP i de stamcelleafledte sfæroider kun viste mild afkoblingseffekt med et lille fald i cellerespirationen inden for ~ 80 s efter tilsætning af dette lægemiddel i overensstemmelse med tidligere rapporterede metaboliske træk ved DPSC40. På den anden side hæmmede rotenon stærkt åndedræt, hvilket førte til sfæroider reoxygenering (afspejlet som stigningen i Rp - sfæroid periferiforhold og Rc - sfæroid kerneforhold) og spredning af periferi-til-kerneO2 gradienter inden for ~ 80 s efter stimulering (figur 2A). Topunkts semikalibrering af MMIR1-sondeforholdet (R) ved højt (atmosfærisk) og lavt (i nærvær af natriumsulfit og glucoseoxidase i billeddannelsesmedier)O2-niveauer bekræftede faldet i R, relateret til faldet i iltning i sfæroider med foreløbig hæmmet respiration ved antimycin A/rotenoncocktailbehandling (figur 2C ), der illustrerer, hvordan målingen af MMIR1-sonden R kan anvendes til semi-kvantitativ overvågning af langsigtede steady-state og hurtige iltningsresponser i 3D.

Figure 2
Figur 2: Kinetisk analyse afO2-sonderespons på forskellige stimuli. (A) Repræsentativt resultat af hDPSC-sfæroid oxygeneringsbilleddannelse i hvile og som reaktion på FCCP- og rotenonbehandlinger. Skalastang er 100 μm. (B) Kinetisk respons af MMIR1-intensitetsforhold til FCCP- og rotenonbehandling sammenlignet med det indledende fotoblegningsintensitetsforhold kinetik (%). (C) Ændringer i intensitetsforholdsbillederne af MMIR1-sonden i hDPSC-sfæroider ved iltede (antimycin A + rotenon-tilsætning) og deoxygenerede (glucoseoxidase-addition) tilstande. Farvebjælken repræsentererO2-sondens intensitetsforhold (R = Iref / Isens) fordeling på tværs af billedet. Klik her for at se en større version af denne figur.

For at illustrere MMIR1-sondeapplikation til levende metabolisk billeddannelse blev den sammenlignende analyse afO2-gradienter i homocellulære hDPSC versus heterocellulære hDPSC / HUVEC (1: 1) sfæroider udført. Ved at udnytte tilgængeligheden af frie blå og grønne fluorescensspektralkanaler sammen med Hoechst 34580 (HXT) og SYTOX Green (SYTOX) blev der udført for at demonstrere anvendelsen afO2-sonde til multiparametriske undersøgelser (figur 3). Ved hjælp af den automatiserede protokol med pixel-for-pixel intensitetsforholdsberegninger leveret af billeddannelsessoftwaren falsk farveforhold blev der produceret billeder af R-fordeling i sfæroider, der visualiserede realtidsdetekterede periferi-til-kerneO2-gradienter i alle typer sfæroider: med den iltede periferi og hypoxiske nicher i midten (figur 2 og figur 3A). Rp- og Rc-værdier samt stejlheden afO2-gradient i de midterste tværsnit varierede imidlertid for forskellige sfæroidtyper: se linjeprofilerne for de midterste tværsnit i hDPSC versus hDPSC /HUVEC-sfæroider og hDPSC versus bioprintede hDPSC-sfæroider (figur 3B,C). Da der ikke var nogen bredt accepteret måde at beskriveO2-gradienter på, introducerede vi flere parametre, der muliggør let sammenligning og detaljeret beskrivelse af generel sfæroid oxygenering: Rp og Rc og sådanne egenskaber vedO2-gradienter som en forskel mellem de iltede og hypoxiske zoner som (Rp-R c) og gennemsnitlige ændringer i iltning pr. μm som (Rp-R c) / r, hvor r er en afstand mellem periferi og hypoxisk kerne, der korrelerer i det midterste tværsnit med sfæroidradius (figur 3D). Statistisk sammenligning af disse parametre sammen med data fra nekrotiske døde celler visualiseret af SYTOX i sfæroider hjalp os med at drage foreløbige konklusioner om oprindelsen af de sfæroidcelletypespecifikke O2-fordelingsgradienter.

Figure 3
Figur 3: Sammenlignende analyse af iltningsgradienter i sfæroider. (A) Repræsentative eksempler på levende mikroskopi af iltning (ratiometrisk fluorescensmikroskopi af MMIR1) og levende/døde cellefarvning (Hoechst 34580, HXT, blå og SYTOX Green, SYTOX) i homocellulære hDPSC-sfæroider før og efter udskrivning og heterocellulære hDPSC/HUVEC (1:1) sfæroider. hDPSC'er i alle typer sfæroider var fra samme cellekultur. Sfæroider blev forfarvet med 5 μg / ml MMIR1-sonde i 2 dage under deres dannelse og derefter anvendt enten til billeddannelse eller bioprint (kun hDPSC-sfæroider) med efterfølgende billeddannelsesanalyse på dag 1 efter bioprint. Falske farvebilleder af intensitetsforholdet (Iref/Isens) billeder af MMIR1-farvede sfæroider svarer til deres periferi-til-kerneO2 gradienter. Skalabjælken er 100 μm. Farvebjælken repræsentererO2-sondens intensitetsforhold (R = Iref/Isens) fordeling på tværs af billedet. Tallene 1 og 2 af diametertværsnit svarer til intensitetsprofiler vist i B og C. (B,C) Sammenligning af intensitetsforholdsprofiler mellem homogen hDPSC versus heterogen hDPSC/HUVEC-sfæroider (B) og homogene hDPSC-sfæroider før og efter bioprint (C). Profiler blev målt for tværsnit af sfæroider vist på (A). D) Skematisk gengivelse af parametre, der anvendes til beskrivelse af periferi-til-kerneO2-gradienter i sfæroider, hvor r er en radius af sfæroid, og Rp og Rc er intensitetsforholdet mellem periferien og kerneområdet af sfæroid tilsvarende. Farvebjælken repræsenterer skematisk fordeling afO2-gradient fra høje (røde) til lave (blå) niveauer i ideelt sfærisk sfæroid. (E,F) Sammenlignende analyse af periferi-til-kerneO2-gradienter (Rp-R c) / r-værdier i hDPSC / HUVEC og hDPSC-sfæroider (E) og i hDPSC-sfæroider før og på dag 1 efter bioprint (F). Statistisk analyse blev udført for en eksperimentel gentagelse (n = 18-23). Kasser svarer til standardafvigelser. Stjerner angiver den statistiske forskel mellem grupper (ved p = 0,05); ** = p < 0,0005. Klik her for at se en større version af denne figur.

Sammenlignet med homocellulære hDPSC-sfæroider havde hDPSC / HUVEC-sfæroider signifikant stejlere gradienter: højere værdier af (Rp-R c) / r-parameter og rækkevidde (Rp-R c; Figur 3F). Samtidig viste de højere iltning af periferien (Rp) og kernen (Rc) (figur 4A, tabel 1). Interessant nok var de også statistisk større (figur 4A, tabel 1), hvilket tyder på, at sådanne forskelle i iltning var forårsaget af deres forskellige cellulære bioenergetiske profiler. Disse data er i overensstemmelse med de velkendte metaboliske træk ved HUVEC-celler, der generelt har lavere respirationsaktivitet af celler med den stærke afhængighed af glykolyse og pentosephosphatveje som de vigtigste bioenergetiske kilder til ATP og NAD (P)H41. Samtidig genereres den udtalte periferi-til-kerneO2-gradient dannet i heterogene sfæroider sandsynligvis af hDPSC i deres sammensætning, karakteriseret ved hyperpolariserede mitokondrier og aktiv elektrontransportkæde40 og ifølge resultaterne om hDPSC-sfæroider iltning, der har stærk respirationsaktivitet (figur 3, figur 4A og tabel 1 ). Således er generelt højere levedygtighed af hDPSC / HUVEC-sfæroider bekræftet af den lavere intensitet af deres døde celler, der farvning med SYTOX (figur 3A) potentielt er forbundet med deres højere iltningsniveauer.

For at illustrere anvendeligheden af levende mikroskopi billeddannelse af sfæroid iltning i biofabrikation blev MMIR1 O2-sonde præ-farvede sfæroider anvendt til bioprint i GelMA bioink med følgende sammenligning afO2 gradienter i hDPSC sfæroider før og på dag 1 efter bioprint (figur 3A, C, F, figur 4B og tabel 2). Bioprintede hDPSC-sfæroider havde signifikant iltet periferi (højere Rp) sammenlignet med sfæroider, målt før bioprint, mens deres kerneiltning havde lignende værdier (figur 4B). Ændringer i deres periferiiltning påvirker området (en stigning i (Rp-R c) og stejlhed (øget (Rp-R c)/r) af deres periferi-til-kerneO2-gradienter , som var statistisk forskellige fra hDPSC-sfæroider målt før bioprint (figur 3F og figur 4B). Farvningen af de døde celler var generelt lysere i bioprintede sfæroider, hvilket tyder på, at nedsat sfæroid levedygtighed er involveret i ændringen af sfæroid iltning (figur 3A).

Figure 4
Figur 4: Sammenlignende analyse af MMIR1-farvede sfæroiders diameter og intensitetsforhold. (A) Sammenligning mellem hetero-hDPSC/HUVEC og homocellulære hDPSC-sfæroider. (B) Sammenligning af homocellulære hDPSC-sfæroider før og efter bioprint. Rp og Rc - intensitetsforhold i periferien og kernen i sfæroiderne tilsvarende; (Rp-R c) - forskellen i intensitetsforhold, svarende til områdetO2-gradient i sfæroider. Statistisk analyse blev udført for en eksperimentel replikat (n = 18-23). Kasser svarer til standardafvigelser. Stjerner angiver den statistiske forskel mellem grupper (ved p = 0,05), hvor * = p < 0,005 og ** = p < 0,0005. Klik her for at se en større version af denne figur.

Type sfæroid (N) Diameter [μm] Rp [a.u.] Rc [a.u.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./μm]
hDPSC / HUVEC (18) 113.2 ± 10.6 0.779 ± 0.034 0.398 ± 0.055 0.982 ± 0.051 0.00677 ± 0.00091
hDPSC (18) 88.1 ± 9.9 0.558 ± 0.025 0.331 ± 0.034 0.227 ± 0.032 0.00520 ± 0.00090
p-værdi 1,5 x 10-8 * 1,5 x 10-21 * 1,3 x 10-4 * 1,4 x 10-12 * 9,2 x 10-6 *

Tabel 1. Sfæroiddiameter, intensitetsforhold i sfæroidernes kerne (Rc) og periferi (Rp), forskellen i intensitetsforhold (Rp-R c) og (Rp-R c) / r-værdi i heterogen hDPSC / HUVEC og homogene hDPSC-sfæroider. p-værdien af en t-test på N-sfæroider viser statistisk forskel og er også angivet med en stjerne.

Type sfæroid (N) Diameter [μm] Rp [a.u.] Rc [a.u.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./μm]
hDPSC (18) 88.1 ± 9.9 0.558 ± 0.025 0.331 ± 0.034 0.227 ± 0.032 0.00520 ± 0.00090
Bioprintet hDPSC (23) 80,9 ± 12,5 0.584 ± 0.023 0.323 ± 0.038 0.261 ± 0.039 0.00658 ± 0.00144
p-værdi 0.054 0.0024 * 0.46 9,9 x 10-4 * 6,3 x 10-6 *

Tabel 2. Sfæroiddiameter, intensitetsforhold i sfæroidernes kerne (Rc) og periferi (Rp), forskellen i intensitetsforhold (Rp-R c) og (Rp-R c) / r-værdi i homogene hDPSC-sfæroider før og efter bioprint. p-værdi af statistisk analyse (N-sfæroider). Den statistiske forskel er angivet med en stjerne.

Discussion

Betydning. Vævsiltningsmåling giver et indblik i celle- og vævsspecifik metabolisme, vævsvækst og -udvikling, levedygtighed, tumorgenese og cellemigration samt interaktion med mikrober og andre patogener. Den præsenterede metode giver et nyt værktøj til bedre forståelse af fysiologien i multicellulære sfæroidkulturer: analyse af iltning med ratiometriske nanopartikelO2-sonder og giver mulighed for at vurdere hypoxi, visualisere afhængigheden af bestemte energiproduktionsveje og supplerer modelleringsundersøgelser og alternative metaboliske billeddannelsesmetoder43,44 på et bredt tilgængeligt billigt fluorescensmikroskop. Ratiometriske målinger kan udføres på et fluorescens-bredfelt (pulserende LED-excitation foretrækkes), laserscanningskonfokal, lysark og to-fotonmikroskoper, ideelt udstyret med T- og O2-inkubatorkamre. Det er vigtigt, at præsenteret O2-mikroskopimåling let kan kombineres med den levende multiparameteranalyse af forskellige fysiologiske parametre og cellesporstoffer (i tilfælde af heterocellulære sfæroidkulturer), levedygtighed (levende / død farvning), lipidmetabolisme (lipidfølende fluorescerende sonder), pH-dynamik (farvestoffer, nanopartikler og fluorescerende proteiner) eller [Ca2+ ], udført i tilgængelige fluorescensspektralkanaler eller parallelt, hvilket giver et udvidet overblik over realtidscellefunktionen i sfæroider, bioprintede konstruktioner og potentielle vævstransplantationer.

Sfæroidkulturer finder anvendelse i undersøgelser af kræftceller, tumor- og stamcellenichemikromiljø, tumoroider, lægemiddeleffektivitet og toksicitetsscreening og faktisk som vævsbyggesten til vævsbiofabrikation og selvmontering45. De kan genereres fra flere celletyper ved hjælp af en række forskellige tilgange46. Populariteten af sfæroidmodellen nødvendiggør deres standardisering ud fra forskningsintegritet og forbedring af dataanalyse, som for nylig blev forsøgt ved udvikling af den første sfæroiddatabase8.

Vores protokol forventes at hjælpe med bedre at forstå levende sfæroidmetabolisme, standardisere denne eksperimentelle model og efterfølgende forbedre deres langsigtede stabilitet, reproducerbarhed og levedygtighed inden for bioprintede og implanterbare materialer.

Ændringer. Denne protokol beskriver brugen af mikromønstret agarose lavtilhævende overflade (mikromoldbaseret dannelse29) til højtydende generering af O2-sondebelastede sfæroider til iltningsanalyse. De alternative metoder til sfæroidproduktion såsom hængende dråbe, anvendelse af ultralave fastgørelsesplader, lipidbelægning eller fritflydende dannelse er også kompatible med den foreslåede O2-sondebelastningsprotokol. Den præsenterede protokol blev optimeret til hDPSC-sfæroider og co-kultur sfæroider af hDPSC med HUVEC (1: 1). Andre cellelinjer er bestemt gældende 15,17,47,48; dog kan en vis protokoloptimering være påkrævet på grund af de forskellige celleadhæsionsegenskaber, dyrkningsbetingelser, metaboliske substratkrav og cellekompatibilitet med nanopartikelfarvning. Valget af en passende ratiometrisk nanopartikelbaseretO2-følsom sonde skal foretages afhængigt af den specifikke cellemodel og i henhold til sondens fotoblegningsegenskaber ved den anvendte mikroskopiopsætning (lyskildens intensitet og type, kameraets spektrale følsomhed) og tilgængeligheden af passende excitations-/emissionsfiltre til tilsvarende reference- ogO2-følsomme spektralkanaler i sonden.

Nogle ratiometriskeO2-sonder er kommercielt tilgængelige2. Alternativt kan de fremstilles internt ved co-udfældning af reference ogO2-følsomme farvestoffer med en polymer som beskrevet andetsteds 24,25,49. For hver enkelt model skal de indledende tests udføres for at bestemme de passende sonde- og optimale mikroskopibetingelser og for at minimere effekten af sondefotobleaching eller fotoinduceretO2-forbrug under ratiometriske målinger. Tidligere undersøgelser afO2-sensing nanopartikler viste deres lave celletoksicitet, hvilket muliggør anvendelse i en lang række farvningskoncentrationer (1-20 μg / ml). Da nogle kationiske nanopartikler kan samle sig selv under opbevaring, anbefaler vi at holde deres belastningskoncentration så lav som muligt for at minimere deres potentielle virkning på sfæroiddannelsen. Eventuelt kan nanopartikelsuspensionen filtreres (0,2 μm) eller ryddes ved centrifugering (10.000 x g, 5 min.) inden brug for at fjerne alle aggregater fra suspensionen.

Selvom BioCAD- og HMI-softwaren er specifik for den præsenterede bioprinter, gælder denne protokol for andre bioprintere, da forberedelsen af bioblækket, samlingen, påfyldningen af en standardpatron og designet af et porøst hydrogelstillads leveres. Desuden bør bioprintparametrene såsom udskrivningshastighed og temperatur være sammenlignelige for forskellige ekstruderingsbaserede bioprintere. Tryktryk og stiverdiameter afhænger af nåletype og diameter, bioinksammensætning, temperatur og resulterende viskositet, men de kan være et udgangspunkt for at optimere udskrivningsparametre til bioprint GelMA-baserede bioblæk med forskellige bioprintere, selvom nogle bioprintere bruger spindler i stedet for lufttryk til at ekstrudere bioblæk50.

Kritiske trin og fejlfinding. Et af de kritiske trin er valget afO2-sonde , som er baseret på følgende overvejelser: For det første den tilgængelige fluorescensmikroskopopsætning (dvs. kompatibel excitationslyskilde, filtre til excitation og emission, kamerafølsomhed og spektraltransmission og numerisk blænde af målet), som kan begrænse antallet af tilgængelige sonder med hensyn til deres fototabilitet, lysstyrke og potentiel fototoksicitet. Det er også vigtigt at bemærke, at nogle typer nedsænkningsolie (i tilfælde af olienedsænkningsmål) kan forstyrre røde og infrarøde fluorescenssignaler. Vi ser fotostabilitetstestene som meget vigtige, og at de skal udføres under indledende opsætning og indledende tests. Potentiel spektral krydstale mellem fluorescerende kanaler og forskellige farvestoffer skal overvejes. Faktisk skal den potentielle mørke og fotoinducerede toksicitet afO2-sonden og andre udvalgte farvestoffer i forhold til den specifikke cellemodel evalueres under protokoloptimering51. Det specifikke problem for nanopartikler kan være deres selvaggregering, som kan afbødes ved at optimere deres arbejdskoncentration, sammensætningen af farvningsmediet (f.eks. Serumindhold), sonikering af nanopartikler før blanding med medium eller ved anvendelse afO2-sonde forfarvede og vaskede celler til sfæroiddannelse i stedet for sondebelastning under sfæroiddannelse og komprimeringsprocedure.

Vi observerede ikke problemer forbundet med lysindtrængningsdybden med beskrevne sfæroidmodeller, men dette skal overvejes, når man vælger ratiometriske intensitetssignaler, størrelse af sfæroid og biofabrikerede konstruktioner (vævstransplantater) og optimering af cellefarvning med respektive farvestoffer. MMIR1-sonde med tæt matchende røde og nær-infrarøde emissionsbølgelængder forventes at give den laveste baggrund og bedste vævslysindtrængning sammenlignet med andre rød/blå eller grøn-emitterende fluorescerende biosensorsonder.

Produktion og håndtering af forholdsbilleder (og potentielt spektral unmixing eller deconvolution) kan udføres i en leverandør leveret software eller i open source-muligheder som ImageJ, Fiji 52,53, napari (https://napari.org), MATLAB og andre. Et kritisk trin vil være at trække baggrunds- og måle signalintensitetsændringer i et lineært område.

Kalibrering afO2-sonde: Rotenon og antimycin A er hæmmere af komplekser I og III i henholdsvis mitokondrieelektrontransportkæden, der blokerer cellerespiration 54,55,15 og inducerer spredning afO2-gradienter i sfæroider og deres ligevægt med miljøet O2. Ændring af den miljømæssigeO2-koncentration (dvs. 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0%O2) vil således muliggøre ratiometrisk intensitet eller fosforescenslevetidskalibrering af denO2-følsomme sonde i celler. Typisk erO2-kontrollerede inkubatorer ikke i stand til at opnå absolut 0%O2, og i visse situationer kræves en hurtig test af sondens reaktion på deoxygenering. I sådanne tilfælde skal der tilsættes 25-100 μg/ml glucoseoxidase ellerNa2SO3/K2HPO4-blanding (50 mg/ml for hver forbindelse til 10x opløsning i destilleret vand) til prøven. Det er vigtigt, at hvis cellelinjen har en signifikant grad af ikke-mitokondrieltO2-forbrug, skal du overveje dette, når du udfører hæmning af åndedræt og kalibreringsforsøg.

Begrænsninger og fremtidig forskning. Hovedbegrænsningen ved den foreslåede metode og den ratiometriske detektion generelt er kalibrering og konvertering af observerede forholdsniveauer til de faktiskeO2-niveauer, hvilket på grund af iboende forskelle i hardware- og brugerbilledoptagelsesindstillinger ville gøre forholdet kalibreringsinstrument- og cellespecifikt. Det er vigtigt, at for et bredfeltfluorescensmikroskop og beskrevet opsætning afspejler forholdsbillederne kombinerede fremskrivninger snarere end ideelle optiske sektioner, og O2-kalibrering ville ikke give mening. På den anden side viser vi, at semi-kvantitative forholdsmålinger giver statistisk signifikant og let at måle komparativ fænotyping af sfæroider produceret fra forskellige kilder og med forskelle i iltning.

Den fremtidige forskning i at gøre mere tilgængelige og overkommelige mikroskopi tilgange designet til levende 3D-objekter som SPIM, lysark, theta, to-foton og luminescens levetid billeddannelse kombineret med maskinindlæring 56,57,58,59,19, vil bidrage til at bringe multiparametrisk O 2 billeddannelse til endnu mere kvantitative applikationer.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde er blevet støttet af den særlige forskningsfondsbevilling fra Gent Universitet (BOF/STA/202009/003) og EU's FP7 ITN-program "Chebana", tilskudsaftale nr. 264772 (for AVK). Data er tilgængelige efter anmodning. G-kode til bioprint er tilgængelig til deling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 Also available from Sigma
12 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 665-180 Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable Ibidi 81201 Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes Nerbe plus 02-502-3001 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3cc Cartridge, UV secure, luer lock RegenHU C-033CC-UV Also available from CelIink and others
3D Discovery Bioprinter RegenHU N/A Bioprinter equiped with an extrusion based printhead, heating mantle, UV-LED curing lamp, 3D Discovery HMI software (CAD/CAM software with direct machine control) and BioCAD software (version 1.1-12)
6 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 657160 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674-25MG Used as inhibitor of complex III of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
B-Braun Tip Cap, luer lock RegenHU TC-BB-B Also available from Regemat, Cellink and others
Cell view cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment, sterile Greiner bio-one 627861 For microscopy of bioprinted spheroids
Collagen from human placenta, type IV Sigma C5533 For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
D(+)-Glucose Merck 8342 Prepare 1M stock solution, 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free Sigma-Aldrich D5030-10X1L For preparation of imaging medium
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Also available from Lonza and others
Endothelial Growth SupplementMix PromoCell C-39216 Also available from Lonza and others
FCCP, Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920-10MG Used as mitochondrial uncoupler
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-098 Also available from Sigma
GelMA N/A N/A GelMA was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782] but are also available from Xpect Inx
Glucose-oxidase from Aspergillus nige (10000 u) Sigma-Aldrich G7141 Used to test the response of probe to deoxygenation
GlutaMAX 100x Supplement Gibco 35050-038 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 2mM)
HEPES (1M) Gibco 15630-080 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Hoechst 34580 Invitrogen (Life Technologies) H21486 Also available from Sigma, BDBiosciences and others
Human dental pulp stem cells (hDPSC) Lonza PT-5025 Also available from ATCC or other vendors
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2517 Also available from ATCC or other vendors
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) Merck 4873 For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
Li-TPO N/A N/A Li-TPO-L was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent)  [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97
8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] but comparable photo-initiators are available from Sigma
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium Gibco 32561-029 Also available from Sigma and others
Micro-patterned 3D-printed PDMS stamps, wells with a diameter 400 µm, thickness, total well numbers 1585 Self-fabricated These stamps were self-fabricated by the Centre for Microsystems Technology (Professor Dr Jan Vanfleteren, University of Gent) but can also be obtained commercially from Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit)
Na2SO3 (sodium sulfite) Sigma-Aldrich 239321-500G For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
O2 probes: MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+ N/A N/A Can be prepared ‘in-house’ using commercially available dyes, polymers and precipitation method [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Some nanoparticles are available commercially as discussed in [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x ]
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution Gibco 15140-122 Also available from Sigma . Apply in dilution 1:100
Petri dishes, sterile Greiner bio-one 633181 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Piston for 3cc cartridge RegenHU P-03CC-UV Also available from Cellink, Regemat and others
Poly-D-lysine Sigma P6407-5mg For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
PVDF syringe filter 0.22 µm Novolab A35149 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Rotenone Sigma-Aldrich R8875-1G Used as inhibitor of complex I of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SYTOX Green Invitrogen (Life Technologies) S7559 Also available from Sigma, Promega and others
Taper tip 22 gauge (conical PE needle Amada Myachi Europe 22K62222 Similar products are also available from RegenHU, Cellink, Regemat and others
Tissue culture flask (75 cm2) VWR 734-2313 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Ultrapure Agarose Invitrogen (Life Technologies) 16500-500 Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope Olympus N/A Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Biological detection by optical oxygen sensing. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8700-8732 (2013).
  2. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
  3. Cordeiro, I. R., Tanaka, M. Environmental oxygen is a key modulator of development and evolution: From molecules to ecology: Oxygen-sensitive pathways pattern the developing organism, linking genetic and environmental components during the evolution of new traits. BioEssays. 42 (9), 2000025 (2020).
  4. Wenger, R. H., Kurtcuoglu, V., Scholz, C. C., Marti, H. H., Hoogewijs, D. Frequently asked questions in hypoxia research. Hypoxia. 3, 35 (2015).
  5. Erecińska, M., Silver, I. A. Tissue oxygen tension and brain sensitivity to hypoxia. Respiration Physiology. 128 (3), 263-276 (2001).
  6. Gholipourmalekabadi, M., Zhao, S., Harrison, B. S., Mozafari, M., Seifalian, A. M. Oxygen-generating biomaterials: a new, viable paradigm for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 34 (12), 1010-1021 (2016).
  7. Zheng, L., Kelly, C. J., Colgan, S. P. Physiologic hypoxia and oxygen homeostasis in the healthy intestine. A review in the theme: cellular responses to hypoxia. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 309 (6), 350-360 (2015).
  8. Peirsman, A., et al. MISpheroID: a knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nature Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
  9. Suvarnapathaki, S., Wu, X., Lantigua, D., Nguyen, M. A., Camci-Unal, G. Breathing life into engineered tissues using oxygen-releasing biomaterials. NPG Asia Materials. 11 (1), 1-18 (2019).
  10. Salazar-Noratto, G. E., et al. Understanding and leveraging cell metabolism to enhance mesenchymal stem cell transplantation survival in tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells. 38 (1), 22-33 (2020).
  11. Leedale, J. A., et al. Mathematical modelling of oxygen gradients in stem cell-derived liver tissue. Plos One. 16 (2), 0244070 (2021).
  12. Sutherland, R., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
  13. Walenta, S., Dötsch, J., Bourrat-Flöck, B., Mueller-Klieser, W. Size-dependent oxygenation and energy status in multicellular tumor spheroids. Oxygen Transport to Tissue XII. , Springer. (1990).
  14. Hompland, T., Fjeldbo, C. S., Lyng, H. Tumor hypoxia as a barrier in cancer therapy: Why levels matter. Cancers. 13 (3), 499 (2021).
  15. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  16. Dmitriev, R. I., Borisov, S. M., Jenkins, J., Papkovsky, D. B. Multi-parametric imaging of tumor spheroids with ultra-bright and tunable nanoparticle O2 probes. Imaging, manipulation, and analysis of biomolecules, cells, and tissues XIII. , International Society for Optics and Photonics. (2015).
  17. Dmitriev, R. I., et al. Versatile conjugated polymer nanoparticles for high-resolution O2 imaging in cells and 3D tissue models. ACS Nano. 9 (5), 5275-5288 (2015).
  18. Okkelman, I. A., Puschhof, J., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Visualization of Stem Cell Niche by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. Intestinal Stem Cells. , Springer. 65-97 (2020).
  19. Dmitriev, R. I., Intes, X., Barroso, M. M. Luminescence lifetime imaging of three-dimensional biological objects. Journal of Cell Science. 134 (9), 1-17 (2021).
  20. Yasukagawa, M., Yamada, K., Tobita, S., Yoshihara, T. Ratiometric oxygen probes with a cell-penetrating peptide for imaging oxygen levels in living cells. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. 383, 111983 (2019).
  21. Xie, B. -R., et al. A near infrared ratiometric platform based π-extended porphyrin metal-organic framework for O2 imaging and cancer therapy. Biomaterials. 272, 120782 (2021).
  22. Düssmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O 2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death & Disease. 8 (6), 2853 (2017).
  23. Roussakis, E., et al. Theranostic biocomposite scaffold membrane. Biomaterials. 212, 17-27 (2019).
  24. Kondrashina, A. V., et al. A phosphorescent nanoparticle-based probe for sensing and imaging of (intra) cellular oxygen in multiple detection modalities. Advanced Functional Materials. 22 (23), 4931-4939 (2012).
  25. Borisov, S. M., et al. Precipitation as a simple and versatile method for preparation of optical nanochemosensors. Talanta. 79 (5), 1322-1330 (2009).
  26. Borisov, S., Nuss, G., Klimant, I. Red light-excitable oxygen sensing materials based on platinum (II) and palladium (II) benzoporphyrins. Analytical Chemistry. 80 (24), 9435-9442 (2008).
  27. Strobl, M., Rappitsch, T., Borisov, S. M., Mayr, T., Klimant, I. NIR-emitting aza-BODIPY dyes-new building blocks for broad-range optical pH sensors. Analyst. 140 (21), 7150-7153 (2015).
  28. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  29. Fukuda, J., et al. Micromolding of photocrosslinkable chitosan hydrogel for spheroid microarray and co-cultures. Biomaterials. 27 (30), 5259-5267 (2006).
  30. Thomsen, A. R., et al. A deep conical agarose microwell array for adhesion independent three-dimensional cell culture and dynamic volume measurement. Lab on a Chip. 18 (1), 179-189 (2018).
  31. Gevaert, E., et al. High throughput micro-well generation of hepatocyte micro-aggregates for tissue engineering. PloS One. 9 (8), 105171 (2014).
  32. De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
  33. Rivron, N. C., et al. Tissue deformation spatially modulates VEGF signaling and angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (18), 6886-6891 (2012).
  34. Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring phagosome pH by ratiometric fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (106), e53402 (2015).
  35. Billiet, T., Gevaert, E., De Schryver, T., Cornelissen, M., Dubruel, P. The 3D printing of gelatin methacrylamide cell-laden tissue-engineered constructs with high cell viability. Biomaterials. 35 (1), 49-62 (2014).
  36. Tytgat, L., et al. Photopolymerizable materials for cell encapsulation. 3D Printing and Biofabrication. Ovsianikov, A., Yoo, J., Mironov, V. , Springer International Publishing. Berlin. 353-396 (2018).
  37. Markovic, M., et al. Hybrid tissue engineering scaffolds by combination of three-dimensional printing and cell photoencapsulation. Journal of Nanotechnology in Engineering and Medicine. 6 (2), 0210011 (2015).
  38. De Moor, L., et al. Hybrid bioprinting of chondrogenically induced human mesenchymal stem cell spheroids. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 484 (2020).
  39. Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Hynes, J., Papkovsky, D. B. Kinetic analysis of local oxygenation and respiratory responses of mammalian cells using intracellular oxygen-sensitive probes and time-resolved fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 183-207 (2014).
  40. Uribe-Etxebarria, V., Agliano, A., Unda, F., Ibarretxe, G. Wnt signaling reprograms metabolism in dental pulp stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (8), 13068-13082 (2019).
  41. Vizán, P., et al. Characterization of the metabolic changes underlying growth factor angiogenic activation: identification of new potential therapeutic targets. Carcinogenesis. 30 (6), 946-952 (2009).
  42. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Quenched-phosphorescence detection of molecular oxygen: applications in life sciences. Royal Society of Chemistry. , (2018).
  43. Perottoni, S., et al. Intracellular label-free detection of mesenchymal stem cell metabolism within a perivascular niche-on-a-chip. Lab on a Chip. 21 (7), 1395-1408 (2021).
  44. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) and extracellular flux analyses. Redox Biology. 30, 101420 (2020).
  45. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  46. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), 20160877 (2017).
  47. Dmitriev, R. I., et al. Imaging oxygen in neural cell and tissue models by means of anionic cell-permeable phosphorescent nanoparticles. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (2), 367-381 (2015).
  48. Jenkins, J., Borisov, S. M., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Sulforhodamine nanothermometer for multiparametric fluorescence lifetime imaging microscopy. Analytical Chemistry. 88 (21), 10566-10572 (2016).
  49. Fercher, A., Borisov, S. M., Zhdanov, A. V., Klimant, I., Papkovsky, D. B. Intracellular O2 sensing probe based on cell-penetrating phosphorescent nanoparticles. ACS Nano. 5 (7), 5499-5508 (2011).
  50. Wagner, M., Karner, A., Gattringer, P., Buchegger, B., Hochreiner, A. A super low-cost bioprinter based on DVD-drive components and a raspberry pi as controller. Bioprinting. 23, 00142 (2021).
  51. Golub, A. S., Pittman, R. N. Monitoring parameters of Oxygen transport to cells in the microcirculation. Quenched-Phosphorescence Detection of Molecular Oxygen. , 193-204 (2018).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Huang, C., Becker, M. F., Keto, J. W., Kovar, D. Annealing of nanostructured silver films produced by supersonic deposition of nanoparticles. Journal of Applied Physics. 102 (5), 054308 (2007).
  54. Foster, K. A., Galeffi, F., Gerich, F. J., Turner, D. A., Müller, M. Optical and pharmacological tools to investigate the role of mitochondria during oxidative stress and neurodegeneration. Progress in Neurobiology. 79 (3), 136-171 (2006).
  55. Schmidt, C. A., Fisher-Wellman, K. H., Neufer, P. D. From OCR and ECAR to energy: perspectives on the design and interpretation of bioenergetics studies. The Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101140 (2021).
  56. Stelzer, E. H., Lindek, S. Fundamental reduction of the observation volume in far-field light microscopy by detection orthogonal to the illumination axis: confocal theta microscopy. Optics Communications. 111 (5-6), 536-547 (1994).
  57. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
  58. Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
  59. von Chamier, L., et al. Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).

Tags

Bioengineering udgave 182 biofabrikation bioprint fluorescensmikroskopi hypoxi metabolisme,O2-følsom sonde iltning stamceller sfæroider
Overkommelig iltmikroskopiassisteret biofabrikation af multicellulære sfæroider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Okkelman, I. A., Vercruysse, C.,… More

Okkelman, I. A., Vercruysse, C., Kondrashina, A. V., Borisov, S. M., Dmitriev, R. I. Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids. J. Vis. Exp. (182), e63403, doi:10.3791/63403 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter