Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Prisvärd syremikroskopi-assisterad biofabricering av multicellulära sfäroider

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63403
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1
1Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medical and Health Sciences, Ghent University, 2Health and Happiness (H&H) Group, National Food Innovation Hub, 3Institute of Analytical Chemistry and Food Chemistry, Graz University of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Protokollet beskriver sfäroidgenerering med hög genomströmning för bioprinting med hjälp av den multiparametriska analysen av deras syresättning och celldöd på ett standardfluorescensmikroskop. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas för att kontrollera sfäroidernas livskraft och utföra standardisering, vilket är viktigt vid modellering av 3D-vävnad, tumörmikromiljö och framgångsrik (mikro) vävnadsbiofabricering.

Abstract

Multicellulära sfäroider är viktiga verktyg för att studera vävnads- och cancerfysiologi i 3D och används ofta inom vävnadsteknik som vävnadsmonteringsenheter för biofabricering. Medan den sfäroida modellens huvudsakliga kraft är att efterlikna fysikalisk-kemiska gradienter i vävnadsmikroskalan, ignoreras i allmänhet den verkliga fysiologiska miljön (inklusive dynamik i metabolisk aktivitet, syresättning, celldöd och proliferation) inuti sfäroiderna. Samtidigt är effekterna av tillväxtmediets sammansättning och bildningsmetoden på den resulterande sfäroidfenotypen väl dokumenterade. Således krävs karakterisering och standardisering av sfäroidfenotyp för att säkerställa reproducerbarheten och transparensen i forskningsresultaten. Analysen av genomsnittlig sfäroid syresättning och värdet avO2-gradienter i tre dimensioner (3D) kan vara ett enkelt och universellt sätt för sfäroidfenotypkarakterisering, vilket pekar på deras metaboliska aktivitet, övergripande livskraft och potential att rekapitulera in vivo-vävnadsmikromiljö . Visualiseringen av 3D-syresättning kan enkelt kombineras med multiparametrisk analys av ytterligare fysiologiska parametrar (såsom celldöd, proliferation och cellsammansättning) och tillämpas för kontinuerlig syresättningsövervakning och / eller slutpunktsmätningar. Laddningen avO2-sonden utförs under sfäroidbildningsstadiet och är kompatibel med olika protokoll för sfäroidgenerering. Protokollet innehåller en höggenomströmningsmetod för sfäroidgenerering med introducerade röda och nära infraröda emitterande ratiometriska fluorescerandeO2-nanosensorer och beskrivningen av multiparameterbedömning av sfäroid syresättning och celldöd före och efter bioprinting. De experimentella exemplen visar jämförandeO2-gradientanalys i homo- och heterocellulära sfäroider samt sfäroidbaserade bioprintade konstruktioner. Protokollet är kompatibelt med ett konventionellt fluorescensmikroskop med flera fluorescensfilter och en ljusdiod som ljuskälla.

Introduction

Molekylärt syre (O2) är en av de viktigaste metaboliterna som reglerar cell- och vävnadens livskraft, funktion och död. Under fysiologiska förhållanden regleras lokal vävnadssyresättning dynamiskt genom vävnadsvaskularisering, blodflöde och cellmetabolism, vilket i vissa fall leder till bildandet avO2-gradienter, hypoxisk mikromiljö och / eller oxidativ stress 1,2. Celler känner avO2-gradienterna genom direkt involvering av molekylärO2 i signalfunktionen (via hypoxiinducerbar faktor (HIF)-medierad signalering, histonlysindemetylaser KDM och på annat sätt), förändringar i cellulär redoxpotential (reaktivO2-art som avkänner genom Nrf2/Keap1-signalering eller järnreglerande proteiner) och kan därefter justera deras metabolism, proliferation, styrka och differentiering3. Således är heterogeniteten hos cell- och vävnadssyresättning, dess gradienter och tillhörande fenomen viktiga aktörer i vävnadsutveckling och homeostas. Olika vävnader och celltyper kräver ofta olika "normala" fysiologiskaO2-nivåer, som definierar den speciella vävnadsarkitekturen med celler placerade enligt vävnadenSO2-mikrogradienter 4. Vissa celltyper är känsliga förO2-minskning (t.ex. neuroner, hepatocyter, öceller i bukspottkörteln eller muskelceller)5,6, medan andra tål extrem hypoxi och bildar brantaO2-gradienter (t.ex. i tarm- och tjocktarmsepitelia)7. Med framstegen inom vävnadsbioengineering och biofabricering blir nödvändigheten avO2-kvantifiering i mikroaggregat och sfäroida 3D-vävnadskonstruktioner viktig. En av farhågorna är standardiseringen av de multicellulära sfäroidmodellens fysiologiska parametrar, som beror på metoden för sfäroidgenerering och odlingsförhållanden8. Dessutom kan okontrollerad applicering avO2-frisättande biomaterial ellerO2-perfusion i mikrotissuer som saknar funktionell vaskularisering vara giftig för celler, leda till omprogrammering av deras metabolism och minskad överlevnad under perioden efter transplantation 9,10. Trovärdigheten hosO2-mätmetoden och optimeringen av syresättningsmiljön för att nå den effektiva odlingen av fysiologiskt relevanta mikroaggregat bevisades nyligen genom matematisk modellering av pluripotenta stamceller-härledda leversfäroider som används som exempel11. Ett annat område där kunskapen om vävnadO2-nivåer erkänns är cancerbehandling12,13. Heterogen tumörhypoxi kan försämra framgångsrik cancerbehandling. Mätning och kontroll av de exakta syresättningsnivåerna under patientbehandling eller tumörhypoximodellering skulle möjliggöra förbättring av individuella och personliga terapistrategier14. Således är kvantitativ övervakning av dynamisk syresättning i biofabricerade konstruktioner och 3D-tumörmodeller ett framträdande verktyg för fysiologisk analys av deras andningsaktivitet, metabolism och optimering av vävnadskultur, tillverkningsförhållanden eller grundläggande studier av det hypoximedierade terapeutiska svaret.

Ett antal metoder möjliggör multiplexerad (eller multiparameter) analys av cellsyresättning i sfäroida och mikroaggregerade vävnadskonstruktioner. Pionjär med neurosfärer och tumörsfäroider 15,16,17, möjliggör fosforescens livstidsavbildningsmikroskopi (PLIM) -baserad metod för direkt kvantifiering av cellsyresättning i levande mikrovävnader och fastställer dess korrelation med cellviabilitet, proliferation eller distribution av de funktionella celltyperna. Trots kraften i tillvägagångssättet är PLIM-mikroskopiuppgradering fortfarande inte allmänt tillgänglig även bland de populära mikroskopileverantörerna18,19. Lyckligtvis kan ett stort antal cellpenetrerandeO2-känsliga nanopartikelsonder också användas för fluorescensintensitetsbaserat förhållandemetriskt mätläge 15,17,20,21,22,23,24. Vanligtvis skulle sonden visa två emissionsvåglängder, dvsO2-känsliga och okänsliga (referens), som kan mätas på ett fluorescensmikroskop, screeningbildare med högt innehåll eller mikroplattläsare. SådanaO2-avkännande nanopartiklar kan framställas genom utfällningsteknik med de biokompatibla polymererna,O2-avkänning och referensfärgämnen som spänner över synliga och nära infraröda spektra, eller de kan köpas kommersiellt 2,25. Eftersom analysen av tjocka 3D-mikrotämnen skulle gynnas av användningen av rödförskjutna fluorescerande färgämnen, konstruerades den ratiometriska O2-avkännande nanopartikelsonden multimodal infraröd nummer 1 (MMIR1), bestående av O2-avkännande PtTPTBPF26 och referens aza-BODIPY27-färgämnen impregnerade i en positivt laddad polymetakrylatbaserad sampolymer28. Med denna konstruktion är enO2-känslig signal (nära infraröd, excitation (exc.) = 635 nm, emission (em.) = 760 nm; Isens) påverkas av [O2] koncentrationen via fosforescenssläckningsprocessen, medan den röda referensfärgämnesintensiteten (exc. = 580 nm, em. = 650 nm; Iref) förblir opåverkad (figur 1A). Således kan Iref / Isens ratio (R) i färgade celler möjliggöraO2-kalibrering 22.

Här beskriver vi ett semikvantitativt tillvägagångssätt för övervakning av syresättning av levande celler i sfäroider och bioprintade konstruktioner, vilket hjälper till att uppskattaO2-gradienter i slutpunkt och kinetiska mätningar. SådanO2-avbildning kan utföras med andra typer av ratiometriskaO2-sonder (figur 1B) och beroende på antalet tillgängliga ljuskällor och fluorescensfilter kan de användas med andra färgämnen för att få information om levande / döda celler, mitokondriell funktion och spårning av andra celltyper. Avancerade mätlägen som fluorescens livstidsavbildningsmikroskopi (FLIM) kan också användas19. Den största utmaningen med användning av cellfärgningsfärger ochO2-känsliga nanopartiklar är optimeringen av färgningsprotokollet. När det gäller MMIR1-sonden och besläktade nanopartiklar är cellerna antingen förfärgade eller saminkuberade under processen för sfäroidbildning. I det beskrivna protokollet genereradesO2-sondfärgade sfäroider på låghäftande agarosyta 29,30,31,32 (figur 1C), vilket möjliggör efterföljande sfäroidbaserad bioprinting och flerparameteranalys avO2 och celldöd. För att illustrera tillämpningen av tillvägagångssättet jämfördes syresättningsnivåerna i homo- eller heterocellulära (bildade med tillsats av humana navelvenendotelceller, HUVEC) humana tandmassastamceller (hDPSC) sfäroider före och efter bioprinting, med användning av konventionellt fluorescensmikroskop.

Protocol

1. Generering med hög genomströmning av sfäroider med inbyggdO2-känslig sond

  1. Förbereda mikromönstrad agarosbelagd vävnadsodlingsplatta
    OBS: Mikromönstrade agarosbelagda vävnadsodlingsplattor används för samtidig generering av ett stort antal sfäroider (1585 per PDMS-stämpel, se materialtabell) för bioprinting och andra tillämpningar, där flera experimentella replikat eller stora sfäroidnummer behövs.
    1. Förbered alla sterila material och instrument (spatlar och pincett) genom autoklavering där så är möjligt eller genom filtersterilisering. Rengör de återvinningsbara PDMS-stämplarna33 från agaros och förvara dem aseptiskt i 70% etanol. Gör detta minst 1 dag före sfäroidgenerering.
    2. Överför mikromönstrade PDMS-stämplar från en förvaringsflaska till en steril petriskål och lufttorka med den släta ytan uppåt under de sterila laminära luftflödesförhållandena i 10 minuter.
    3. Lägg varje stämpel med en mikromönstrad yta uppåt (och slät yta ner) i mitten av brunnen på en 12-brunns steril vävnadsodlingsplatta. Lufttorka i 1-2 min med öppet lock.
      OBS: Det är mycket viktigt att avdunsta överskottsvätskan eftersom endast torra stämplar perfekt fastnar på plastytan och förblir fästa under proceduren.
    4. Väg 1,5 g agaros i en ren 200 ml glasflaska, tillsätt 50 ml sterilt destillerat vatten, täck med lock och smält i en mikrovågsugn för att göra 50 ml 3% homogen agaroslösning.
      VARNING: Agaroslösningen är extremt varm och måste hanteras med försiktighet. Om den skakas omedelbart efter smältproceduren kan den heta agaroslösningen börja bubbla och brista ut ur kärlet. För att undvika tillfälliga traumor, använd tillräckligt stora kärl fyllda med maximalt 50% av volymen med agaroslösningen.
    5. Använd en steril serologisk pipett tillsätt omedelbart ~ 2 ml varm agaroslösning till varje brunn av 12-brunns cellodlingsplattorna för att helt täcka den införda PDMS-stämpeln. Låt agaroset stelna i 20 minuter genom att inkubera under det sterila luftflödet med plåtlocket öppet.
      OBS: Agarosskiktet bör vara minst två gånger tjockare än PDMS-stämpeln för att säkerställa integriteten hos agarosmikrobrunnarna efter borttagning av PDMS-stämpeln (Figur 1C).
    6. Använd en steril liten spatel och vrid agarosen exakt med den inbäddade PDMS-stämpeln upp och ner i varje brunn för att få den släta stämpelytan uppe. Tillsätt ~ 200 μL sterilt vatten på stämpelns släta ovansida, lossa det försiktigt från agarosen med en spatel och ta bort det från brunnen. Undvik att skada mikrobrunnarna.
    7. Tillsätt 1 ml motsvarande sterila cellodlingsmedier till agarosstämplarna för direkt användning. Täck plattan med locket och inkubera över natten vid 4 °C. Använd PBS-lösning (istället för medium) för långvarig lagring (upp till 2 veckor vid 4 °C). Låt inte agarosen torka. Värm de agarosmikromönstrade plattorna före användning i 1 timme vid 37 °C i enCO2-inkubator .
      OBS: Inkubation behövs för att balansera och ta bort luftbubblor från agarosmikrobrunnar. Fortsätt med protokollsteg 1.2.
  2. Förbereda O2 sondbelastade sfäroider
    1. Använd α-minimalt essentiellt medium (MEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och tillväxtfaktorer kompletterade endotelcelltillväxtmedium 2 för odling av hDPSC- respektive HUVEC-cellinjer. Förbered hDPSC / HUVEC heterocellulärt sfäroidtillväxtmedium genom att tillsätta HUVEC- och hDPSC-tillväxtmedier i ett förhållande 1: 1.
    2. Förbered 70% -90% sammanflytande cellodling (~ 3-4 dagars beredning). För generering av heterocellulära sfäroider, förbered hDPSC- respektive HUVEC-kulturer.
      OBS: Passagenumret för HUVEC och hDPSC får inte överstiga 8. För att säkerställa snabb tillväxt av cellkulturer delas alltid vid 1/3 av den totala cellkulturen (vid 70% -80% sammanflöde) med hjälp av en ny kolv var tredje till fjärde dag.
    3. Skölj 70%-90% sammanflytande cellodling med förvärmd (37 °C) PBS (10 ml per 75 cm2 kolv). Tillsätt dissocierande enzymlösning (0,05 % trypsin och 1 mM EDTA; 1 ml per 75 cm2 kolv) och inkubera i 3–5 minuter vid 37 °C i 5 %CO2, 95 % luftfuktighet för cellavskiljning och kontrollera cellavskiljning under mikroskopet. När du är klar, neutralisera trypsin med komplett cellodlingsmedier innehållande 10% FBS (5 ml media per 1 ml dissociationslösning).
      OBS: Förhindra överexponering av celler till den dissocierande enzymlösningen eftersom detta kan påverka deras livskraft.
    4. För HUVEC odlad i ett lågt FBS-medium, utför trypsinneutralisering genom att tillsätta 0,5 ml 100% FBS till den trypsinbehandlade cellkulturen, följt av centrifugering för att överföra celler till deras tillväxtmedium.
      OBS: Den erhållna cellsuspensionen bör innehålla ~ 1 miljon celler per 1 ml. Vid behov kan ytterligare ett centrifugeringssteg läggas till protokollet för att koncentrera cellsuspensionen.
    5. Dissociera cellaggregat genom pipettering med användning av en 1000 μL pipettspets på toppen av en 10 ml serologisk pipett för att erhålla encellssuspension. Använd en räknekammare (hemocytometer av Neubauer-typ eller alternativ) för att räkna antalet celler per 1 ml cellsuspension34. Späd cellsuspensionen till 500 000 celler per ml. För heterocellulär hDPSC / HUVEC i sfäroidförhållandet 1: 1, tillsätt lika stora volymer motsvarande cellsuspensioner för att få en slutlig cellkoncentration på 500 000 celler per ml.
      OBS: Variation av cellkoncentration i suspension tillsatt till en mikromönstrad agarosstämpel gör det möjligt att ändra medelstorleken på producerade sfäroider, vilket beror på ett cellnummer per mikrobrunn av en agarosstämpel. I den beskrivna uppsättningen genereras sfäroider av ~ 300 celler från 1 ml innehållande 500 000 celler på en agarosstämpel med 1585 mikrobrunnar.
    6. Tillsätt koncentreradO2-sond (nanopartiklar, 1 mg/ml stamlösning) till den beredda cellsuspensionen till en slutlig koncentration av 5 μg/ml.
      OBS: Sfäroidbildning i närvaro avO2-avkännande nanopartiklar ger effektiv färgning, som bevaras i minst 5 dagar (Figur 1D). Däremot kommer färgning av förformade multicellulära sfäroider med nanopartiklar att vara mindre effektiv15.
    7. Byt ut 1 ml gamla medier i en mikrotönstrad brunn av 12-brunns agarosbelagda cellodlingsplattor (se steg 1.1.7) mot 1 ml av den beredda cellsuspensionen (500 000 celler per 1 ml, med 5 μg/mlO2-sond ). Odla sfäroiderna i CO2-inkubatorn i 2-5 dagar i kontinuerlig närvaro avO2-sonden för att säkerställa dess belastning under sfäroidbildning och komprimering.
      OBS: Undvik överdriven medelavdunstning i sfäroidkultur. Vid behov, försiktigt (stör inte sfäroiderna i mikrobrunnar) tillsätt 0,2-0,5 ml odlingsmedier med den ytterligare O2-sondutspädningen.
    8. Efter sfäroidbildningen, byt ut tillväxtmediet med en ny utan sonden. Sondfärgningen kommer att bevaras i genererade sfäroider i 7-14 dagar eller längre, vilket möjliggör långsiktig övervakning av dess signaler i sfäroider.

2. Bioprinting av sfäroider

OBS: Sfäroider är bioprintade i ett metakrylamidmodifierat gelatin (GelMA) baserat biobläck. Nedan följer en beskrivning av bioinkingredienserna, proceduren för beredning av biobläck och bioprinting.

  1. Bioink beredning
    1. Förbered en 10 % (w/v) GelMA-lösning (2 ml) i medium under ett laminärt luftflöde35 enligt följande: väg 0,2 g steril GelMA med en substitutionsgrad på 78 i ett 15 ml rör, tillsätt 1,9 ml α-MEM och låt det lösas upp genom att blanda på en roterande skakmaskin vid 37 °C (~2 timmar).
      OBS: Tillsätt inte hela mängden medium, eftersom andra föreningar som sfäroider och fotoinitiator Li-TPO-L kommer att tillsättas senare.
    2. Resuspend sfäroider i de mikroberönstrade brunnarna genom pipettering och samla dem i ett 15 ml rör. Utför en extra sköljning med PBS för att säkerställa att alla sfäroider samlas in från agarosmikrobrunnarna. Undvik att röra vid / skada agarosmikrobrunnarna eftersom flingor av agaros kan blockera nålen under bioprinting.
    3. Samla sfäroider genom centrifugering i ett 15 ml rör vid 300 x g i 5 min vid 20 ° C. Aspirera supernatanten med en pipett, tillsätt 50 μL medium till sfäroiderna och resuspendera dem genom mild pipettering.
    4. Tillsätt sfäroidblandningen till den varma GelMA-lösningen och blanda genom skonsam pipettering. Behåll sfäroidkoncentrationen till 6340-12860 sfäroider (från 4-8 mikromönster) per ml biobläck för bioprinting. Undvik högre koncentrationer av sfäroider eftersom det lätt orsakar blockering av trycknålen.
    5. Tillsätt filtersteriliserad fotoinitiator Li-TPO-L stamlösning (32 mg/ml) i en slutlig koncentration av 2 mol% med avseende på antalet dubbelbindningar och blanda med skonsam pipettering36,37.
      OBS: Mängden Li-TPO-L kan beräknas enligt ekvationen:
      Volym fotoinitierare (PI) = (0,000385 mol NH2-grupper / g GelMA x 294,10 g Li-TPO-L / mol x 0,78 x 0,02) / 0,032 g Li-TPO-L / ml x 0,2 g GelMA = 0,0107 ml Li-TPO-L-lager
  2. Bioprinting förfarande
    1. Se stegen i tilläggsprotokoll 1 för utformning av byggnadsställningar i CAD. Följ stegen nedan för att bioprinta designen.
    2. Stäng änden av en steril 3 cc patron med ett spetslock (luerlås) och fyll med biobläck genom pipettering. Sätt i en kolv i patronen. Håll patronen upp och ner och ta bort spetslocket, tryck kolven mot biobläcket tills all luft från patronen har tagits bort.
      OBS: Undvik kontakten mellan GelMA biobläck och patronens sidor, eftersom detta kan hämma kolvens rörelse på grund av gelering av biobläcket.
    3. Låt biobläcket svalna i bioskrivarens värmemantle vid 23 °C (20-30 min). Skruva i en tryckadapter på toppen av patronen. Stäng klämman på inloppsröret för att förhindra att biobläcket läcker, montera en 22 G konisk PE-nål på patronen. Anpassa nålstorleken och diametern till ställningens design och sfäroiddiameter och koncentration.
      OBS: Använd munskydd och sprayade handskar för att förhindra kontaminering.
    4. Spraya bioskrivaren med 70% etanol och torka av den med absorberande papper. Montera patronen i värmemanteln på det extruderingsbaserade skrivhuvudet. Anslut tryckinloppet och öppna klämman på inloppet. Ladda G-kodfilen för din design i utskriftsprogrammet.
    5. Starta mätning av nållängd. Reglera trycktrycket genom att dosera lite biobläck i en steril petriskål. Ett trycktryck på 0,025-0,045 MPa är typiskt för utskrift av GelMA-baserade biobläck38.
    6. Installera en 6-brunnsplatta, öppna brunnsplattan, stäng huven och börja skriva ut. Efter utskrift, låt byggnadsställningarna vara fysiskt tvärbundna i 10 minuter vid 5 ° C och bestråla de tryckta byggnadsställningarna i 60 s med en UV LED-lampa (365 nm; 500 mW enligt tillverkaren).
      OBS: UV-tvärbindningstiden beror på egenskaperna hos UV-ljuset, fotoinitiatortyp och koncentration, önskad tvärbindningsgrad för byggnadsställningar, svullnad och elasticitetsmodul.
    7. Tillsätt omedelbart motsvarande tillväxtmedier innehållande 100 U/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin (P/S) till alla brunnar med bioprintade galler (2 ml per brunn av en cellodlingsplatta med 6 brunnar).
    8. Odling i en 37 ° C CO2-inkubator tills du börjar mikroskopin. För bioprintad konstruktionsmikroskopi överför du ett tryckt våffelgaller till en mikroskopiskål, täcker med bildbehandlingsmedier och fortsätter med steg 3.2 och 3.3.
      OBS: När det gäller flytande bioprintade konstruktioner måste de fixeras i mikroskopiskålen utan effekt på cellens livskraft, t.ex. med cytokompatibelt lim. För inverterad mikroskopöverföring, bioprintet till en mikroskopi glasbotten skål och täcka med ett bildmedie (~ 200-500 μL, se anmärkningen till steg 3.1 för bildbehandling av mediekomposition) för att undvika oönskad flytande av provet. Färgning med ytterligare fluorescerande sonder kan göras i cellodlingsskålen före överföringen av bioprintade konstruktioner till mikroskopiskålar (se steg 3.1.6).

3. Ratiometrisk fluorescens levande mikroskopi av sfäroid syresättning i den biofabricerade vävnaden

OBS: För att omvandla det förhållandemetriska intensitetssvaret (R) hosO2-sonden till de faktiska hypoxinivåerna måste sondsvaret kalibreras med hjälp av förfaranden som beskrivs i24. Eftersom den förhållandemetriska kalibreringen är instrumentspecifik och kräver installation av en T/O2/CO2-kontrollerad inkubator (inte alltid tillgänglig) är användningen av semikvantitativ kvotdetektion det föredragna alternativet.

  1. Framställning av sfäroider för analys av levande avbildning
    1. För sfäroidbindning under detta steg, förbelägga de sterila mikroskopiskålarna med kollagen IV och / eller poly-D-lysin eller använd kommersiellt tillgängliga39. Kontrollera mikroskopidiskarnas kompatibilitet med arbetsavståndet och andra egenskaper hos målet för ditt mikroskop.
      OBS: Vid avbildning med flera parametrar måste alla ytterligare färgningsprocedurer göras i odlingsplattans diskar med tillräcklig mängd media som skyddar celler från avdunstning, osmotisk chock eller annan stress. Förbered och förvärm avbildningsmedium före användning: DMEM kompletterat med natriumbikarbonat (1,2 g / L), HEPES-Na, pH 7,2 (10 mM), natriumpyruvat (1 mM), L-glutamin (2 mM) och glukos (5 mM), utan fenolrött.
    2. Använd en 1 ml pipett och tvätta försiktigt ut O 2-sondens förfärgade sfäroider från agarosmikrobrunnarna. Medan sfäroiderna fortfarande flyter i media, överför dem till ett 15 ml koniskt bottenrör.
    3. För att säkerställa insamling av alla sfäroider från en mikropatternerad brunn, skölj brunnen 1 till 3 gånger med ytterligare 1 ml odlingsmedier och kombinera alla sfäroidsuspensioner i en injektionsflaska. Låt flaskan stå i vertikalt läge i upp till 10 minuter för att låta sfäroiderna sätta sig ner på botten av injektionsflaskan och bilda en synlig pellets.
    4. Ta försiktigt bort mediet från röret och lämna sfäroiderna ostörda. Resuspendera dem försiktigt i den mängd färskt odlingsmedium som kommer att räcka för minst 20 sfäroider per mikroskopiprovskål. Detta kommer att minimera användningen av odlingsmediet och förenkla lokalisering av sfäroider under avbildning.
      OBS: Använd den autoklaverbara kiseldelen av μ 12-brunnsplattan (se materialtabell) fäst vid täckglaset som en mikroskopiprovskål (24 x 60 mm, tjocklek # 1) med en maximal medievolym på 300 μL per brunn. Kiseldelen av denna kulturkammare kan steriliseras och återanvändas med andra plast- och glasytor när de fästs vid skålen.
    5. Tillsätt omedelbart lika stor volym sfäroidsuspension till varje mikroskopiskål / brunn. Låt sfäroiderna stå i 1 timme vid 37 °C i enCO2-inkubator för att fästa på ytan av mikroskopiskålen. För syresättningsanalys i kombination med användning av andra färgämnen fortsätt med steg 3.1.6. För enkel syresättningsanalys fortsätt med steg 3.1.7.
      OBS: Otillräcklig inkubationstid (<1 h) kan leda till tillfällig borttagning och förlust av sfäroid under medieutbytet, vilket avbryter experimentet. Samtidigt kan överinkubation (>3 h) leda till partiell eller fullständig förlust av deras 3D-organisation på grund av migrering av celler från sfäroider till mikroskopiskålens yta och påverka deras syresättning i realtid.
    6. (valfritt) Byt försiktigt ut mediet mot en som innehåller fluorescerande sond (er) utspädd till färgningskoncentration och fortsätt inkubationen i ytterligare 1 timme för att nå optimal intensitet. För att undvika avlägsnande av sfäroider under medieutbyte, aspirera försiktigt mediet med en 200 μL pipett från kanterna på mikroskopiskålarna och utför medium tillsats i sidled i mikroskopiskålen. Fortsätt med steg 3.1.7.
      OBS: För effektiv färgning med sonder med dålig diffusion i flercelliga aggregat, förläng belastningskoncentrationen och / eller tiden. Före användning bestämmer du de valfria sondladdningsparametrarna i preliminära experiment.
    7. Ta bort mediet från mikroskopiskålen och skölj en gång med bildbehandling. Tillsätt den exakta mängden bildbehandlingsmedier till provet (t.ex. 300 μL per mikrobrunn av μ-kammare i en 12-brunns odlingsplatta). Fortsätt med steg 3.2.
  2. Bildförvärv
    1. Slå på mikroskopet och anslutna enheter (dvs. excitationsljuskälla, kamera, dator, inkubator och andra elektroniska block) 30 minuter före avbildning för att värma upp och bli jämvikt med mätförhållandena (temperatur, olika värden påO2, 5% CO2, fuktighet om det behövs). Starta mikroskopi-driftsprogramvaran som medföljer den exakta mikroskopuppsättningen.
      OBS: Det beskrivna protokollet är anpassat för CellSens Dimension-programvaran v.3.
    2. Välj lämpliga excitationsfilter (källa, effekt) och emissionsfilter och exponeringstid för valda fluorescerande (eller fosforescerande) sonder. För multiparameter-, 3D- och time-lapse-mikroskopianalyser skriver du de automatiserade mätsekvensprotokollen i programvaran för operationsmikroskop.
    3. Empiriskt bestämma de optimala bildinställningarna för varje sond, experimentell modell och cellinje i preliminära experiment. Se till att inställningarna har minimal fotoblekning i referens (Iref) och O2 avkänning (I sens) kanaler och minimal effekt påintensitetsförhållandet (R = Iref / Isens), särskilt i 3D- och time-lapse-mätexperiment.
    4. Ställ in mikroskopiskålen med färgade sfäroider på mikroskopistadiet. Använd målet med låg förstoring, förhandsgranska provet i överföringsljus, gör preliminärt fokus på sfäroider och lokalisera dem i mitten av bilden.
      OBS: Standard 4x till 10x förstoringsluftmål räcker för förfokusering, medan vi för den faktiska mätningen rekommenderar 20x till 40x med numerisk bländare (NA) på 0,6 eller högre (luft- eller vattennedsänkning) mål som har tillräckligt arbetsavstånd för sfäroider fästa vid skålen.
    5. Ta med målet med den höga förstoring som krävs till arbetspositionen. Fokusera på överföringsljusläge i sfäroidens mellersta (ekvatoriella) tvärsnitt. Syresättning i 3D-objekt beror direkt på djupet av bildsektionen. För att säkerställa detta, analysera liknande tvärsnitt i och mellan grupper, t.ex. mellersta och övre / nedre tvärsnitt av sfäroider.
      OBS: För detaljerad och exakt analys och rekonstruktion avO2-gradienter rekommenderar vi att du skannar och producerar Z-staplar med hjälp av konfokal-, ljusplåt- eller tvåfotonmikroskop (bästa alternativet). För konventionell bredfältsmikroskopi, där signalen från alla tvärsnitt kommer att samlas in samtidigt, kan en genomsnittlig uppskattning av det mellersta tvärsnittet snarare än en exakt analys avO2-gradienter göras. I detta fall definieras det mellersta tvärsnittet som en fokalsektion, där sfäroiderna har maximal diameter med ett skarpt fokus på sina gränser.
    6. Justera inställningarna för insamling av fluorescens-/fosforescenssignaler från referens- och känsliga spektralkanaler iO2-sonden och andra fluorescenssonder som används för multiparametrisk avbildning.
    7. För den kvantitativa intensitetsbaserade jämförelsen, använd samma valda bildinställningar för exponeringstid, excitationsljuskällans effekt, upplösning, skanningshastighet och nålhålsstorlek för alla uppmätta objekt i grupper.
      OBS: Många leverantörsbaserade mikroskopiprogramvaruversioner möjliggör automatiska beräkningar av intensitetsförhållandet. Tillämpa funktionssammanslagning till intensitetsmätningar av referens- och känsliga kanaler förO2-sonden , när du skriver bildförvärvsprogrammet i experimenthanteraren i bildprogramvaran som används här.
    8. Samla in bilder från samma optiska sektion för referens- och känsliga spektralkanaler iO2-sonden och, om det behövs, ytterligare fluorescenskanaler. För detta protokoll, använd MMIR1-sonden med den röda referensen (exc. = 580 nm, em. = 650 nm) och nära infraröd O2-känslig (exc. = 635 nm, em. = 760 nm) spektra.
    9. Upprepa steg 3.2.5–3.2.8 för att samla in ett tillräckligt antal datapunkter för statistisk analys. För dynamisk analys av de snabbt utvecklande cellulära svaren vid behandling med olika läkemedel, mitokondriella frikopplingar eller hämmare av elektrontransportkedjan och andra snabbverkande föreningar, använd time-lapse-mätläget (steg 3.2.10).
    10. Utför mätningarna i bildbehandlingsmedier vid 37 °C med periodisk belysning av provet och samla in signaler från de fluoroforer som är av intresse (t.ex. O2-sondreferens- och avkänningskanaler), t.ex. var 10:e sekund i över 2 minuter.
    11. Utför en fokuskontroll för varje sfäroid när den periodiska mätningen är klar för att säkerställa att det inte fanns någon fokusdrift under avbildningen. Upprepa vid behov. Fortsätt med steg 3.3 för dataanalys.
      OBS: Utan cellstimulering och läkemedelstillsats kan time-lapse-mätning utföras för att bedöma fotostabiliteten, jämfört med referensfärgämnet, t.ex. fluorescein, kalceingrön AM eller tetrametylrhodaminmetylester.
  3. Bild presentation
    OBS: Här beskriver vi hur man automatiskt beräknar O2 sondinsitetsförhållande (R) i sfäroider med hjälp av förhållandeanalysfunktionen i bildprogramvaran och tillämpa pixel för pixel R-beräkning för att generera falska R-distributionsbilder av sfäroidmikroskopisektionen. R kan också beräknas manuellt från intensitetsdata för referens- och känsliga spektralkanaler som samlats in från samma intressanta region (ROI) för sfäroidbilden genom tillämpning av den enkla formeln R = IRef/Jagsens24,34. Om det inte är möjligt att extrahera intensitetsdata från den råa bilden i motsvarande mikroskopiprogramvara kan intensitetsdata erhållas genom att använda sådana program som ImageJ eller Fiji (se Diskussion).
    1. Öppna .vsi-filen med O 2-sondinsitetsdata från referens- och känsliga spektralkanaler som gjorts i sammanslaget läge. Öppna fönstret för förhållandeanalysfunktionen från måttmenyn. Välj referenskanalens intensitet som täljare och intensiteten för den känsliga kanalen som nämnare för R-beräkning.
      OBS: Det omvända förhållandet mellan referens och känsliga signaler för beräkning av R är också möjligt, men i detta fall kommer R att minska med ökningen avO2.
    2. Använd motsvarande inställningar för intensitetströskel för varje spektralkanal för att subtrahera bakgrunden från den sammanslagna intensitetsbilden. Fortsätt öka tröskelvärdena tills bildbakgrunden är enhetligt svart. Tillämpa tröskelparametern lika på alla sfäroidbilder i datauppsättningen som används i jämförande analys.
      OBS: Använd förhandsgranskningsfönstret för att optimera tröskelinställningarna genom att observera den preliminärt beräknade falska färg-R-bilden av sfäroider. Alla pixlar med en intensitet som är lägre än det aktuella värdet i tröskelfältet tas bort från R-analysen och presenteras som svarta fläckar. Efter tröskelapplikationen bör endast det område som motsvarar sfäroidfluorescens visualiseras. Den preliminära uppskattningen av den genomsnittliga bakgrundsintensiteten (områden utan sfäroider) hos de oberoende spektralkanalerna förenklar valet av ett lämpligt tröskelvärde för bilden. Dessutom bidrar applicering av sfäroida ROI-gränser, identifierade från motsvarande överföringsljussfäroidbild till den sammanslagna fluorescensbilden, till exakt bestämning av tröskelparametrarna för att förhindra överdriven subtraktion av de icke-bakgrundssignalintensiteterna.
    3. Håll bakgrundsinställningarna för täljaren och nämnarens intensitet på 0, eftersom bakgrunden redan har subtraherats med tröskelapplikationen.
    4. Justera skalningsfaktorn (Skala) till förhållandebilden tills förhandsgranskningsbilden ger önskad upplösning av R-gradienten. Tillämpa skalningsparametern lika på alla sfäroidbilder i datauppsättningen som används i jämförande analys.
      OBS: Skalningsparametern bör vara tillräckligt stor (minst 1 000) för att säkerställa att R-bilden innehåller så mycket information som möjligt och kan ses som en upplösningsfaktor för R-numeriska data.
    5. Använd justerade parametrar på sfäroidbilden genom att trycka på Apply. Justera bildens ljusstyrka och kontrast i fönstret Justera visning från verktygsfönstrets meny.
    6. Bestäm manuellt länknings- och avlänkningsgränserna för ett histogram för fördelning av förhållandet med hjälp av alternativet för fast skalning i fönstret Justera visning. Detta bestämmer intervallet för falskfärgfältet för R-parameterpresentationen.
      OBS: För att jämföra sfäroidbilder mellan olika grupper är det viktigt att hålla ett liknande färgfältintervall för alla analytiska prover. Eftersom en rad ändringar av R-parametern kan skilja sig åt mellan grupper, bör det valda falska färgfältområdet vara universellt för distributions histogram i alla analytiska grupper.
    7. Sfäroider är inte ofta idealiskt sfäriska, antar att sfäroiddiametern är den längsta linjen som dras genom sfäroidens centrum (ofta en hypoxisk kärna). Använd den linjära linjalfunktionen från måttmenyn och bestäm sfäroiddiametern. Exportera data som en kalkylarkstabellfil.
    8. Välj ROI för önskad storlek (så liten som möjligt) och form (t.ex. rund) och applicera den på periferin och den hypoxiska kärnan i sfäroiden. Omvandla ROI till mätobjektet för att analysera den genomsnittliga R (perifer R-Rp och kärna R-Rc) inuti den valda ROI. Exportera data i ett kalkylbladskompatibelt tabellformat.
      OBS: Sfäroider har inte identiskO2-fördelning mellan gruppen och de hypoxiska kärnorna samlokaliseras inte perfekt med sfäroidcentra. För att förenkla och standardisera analysen antar vi att de mest hypoxiska områdena motsvarar den ideala kärnan i mitten av sfäroiden. Rc mätt i dessa zoner tillämpas för beräkningar avO2-gradientområde (Rp-R c) och branthet (Rp-R c) /r, där r (helst ett avstånd mellan periferi och hypoxisk kärnrOTE) är en ungefärlig radie för sfäroiden i μm beräknad utifrån diametermätningarna. Valfritt kan sfäroidAO2-gradienter presenteras som linjära linjeprofiler för R-parameterändring (linjeprofilfönster i måttmenyn) gjorda längs sfäroiddiametern. Dessa data kan också exporteras som en kalkylbladstabellfil.
    9. Applicera mätningar på varje mikroskopisektion av sfäroider för att erhålla datauppsättningen för sfäroiddiametrar, Rc och Rp för att utföra ytterligare beräkningar och statistisk jämförelse. Kombinera all data i en kalkylarksfil.
    10. För time-lapse-analys av fotoblekning eller dynamiska svar på olika stimuli, applicera den valda ROI på samma koordinater på varje bild i en uppsättning. För att jämföra R-parametrar, presentera dem i procent från R för den första cykeln i en time-lapse-bilduppsättning.
    11. För fotoblekningsanalys använd R från flera ROI för att beräkna den genomsnittliga R i procent för varje time-lapse-cykel och spåra förändringarna.
    12. Antag att fotoblekningseffekten inte är kritisk om det var mindre än 5% minskning av den ursprungliga intensiteten efter 12 cykler med kontinuerlig belysning. Jämför alltid dynamiska förändringar med en fotoblekningskurva som en kontroll för att säkerställa betydelsen av ratiometrisk time-lapse-respons (se figur 2A,B).
    13. Från de erhållna parametrarna beräknas r, (Rp-R c) och (Rp-R c) / r för enskilda sfäroider i en datauppsättning. Analysera normaliteten i datafördelningen av Kolmogorov-Smirnov eller relevanta tester. Välj lämplig statistisk metod för dataanalys och fortsätt med datapresentationssiffror.
      OBS: De data som presenteras här fördelades normalt och ett oberoende t-test vid p = 0,05 implementerades för statistisk jämförelse mellan sfäroidgrupper.

Representative Results

Produktionen med hög genomströmning av O2-sondförfärgade sfäroider med mikromästrad agarosmetod illustreras schematiskt i figur 1C som visar exempel på agarosmikrobrunnar utan och med de förfärgade sfäroiderna. Effektiviteten av sfäroidbildning på agarosbeläggning och deras form / sfäricitet kan vara cellspecifik. Till exempel bildade humana kolon HCT116-celler aldrig idealiska sfäriska strukturer med hjälp av agarosmikrobrunnsmetod, i motsats till lipidbelagd yta17, medan hDPSC ensamma och samodlingade med HUVEC alltid producerade sfäroider med mycket reproducerbar form och storlek som är proportionell mot cellsammansättning, initialt cellantal och varaktighet av sfäroidbildning / tillväxt. Alla testade celltyper ackumulerade effektivtO2-sondens nanopartiklar under sfäroidbildning (figur 1B) och bevarade denna färgning under minst 5 dagar, vilket möjliggjorde deras användning för bioprinting och efterföljande övervakning av den bioprintade vävnadssyresättningen (figur 1D).

Figure 1
Figur 1: Princip förO2-sondfunktionen och dess tillämpning för sfäroidfärgning och bioprinting. (A) Ett förenklat Yablonski-diagram som förklarar principen omO2-avkänning av fosforescerande nanopartikelsonder (NP). Överföringen av energi till molekylärO2 under det förbjudna triplettexciterade tillståndet (T) leder till en minskning av fosforescensintensiteten omvänt proportionell mot fosforescenslivstiden tau, τ (förändringar från τ1 vid 0%O2 till τ2 vid21% O2), vilket är tiden mellan excitation till singlettillstånd (S1) och dess återgång till marktillståndet (G0)42. KvantitativO2-mätning kan göras genom ratiometrisk mätning eller genom mätning av τ (fosforescenslivslängdsmätningar). (B) Ett exempel på färgning av humana tandmassastamcellsstamceller (hDPSC) sfäroider färgade med olika typer av nanopartikelO2-sonder , som visas i överföringsljus, referens ochO2-känsliga färgämnesfluorescenskanaler. Skalstången är 100 μm. (C) Scheman förO2-sond med hög genomströmning förfärgad sfäroidgenerering med mikromönstrad agarosmetod. Från vänster till höger: PDMS-kiselstämpel placerad i en brunn på odlingsplattan, ett exempel på ett mikrobrunnsmönster i agaros (4x förstoring) och ett exempel på MMIR1 förfärgade sfäroider framtagna från HCT116 humana koloncancerceller på dag 2 efter sådd på mikromönstrad agaros (4x förstoring). Skalstången är 100 μm. (D) Från vänster till höger: en bioprintad våffelkonstruktion och mikroskopianalys av MMIR1 förfärgad sfäroidbioprintad konstruktion på dag 1 och 5 efter bioprinting. Fluorescenssignalen motsvararO2-känsligt fosforescerande färgämne i MMIR1 nanopartiklar (exc. = 635 nm / em. = 760 nm). Skalstången är 400 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

På den beskrivna mikroskopiuppsättningen (konventionellt widefield fluorescensmikroskop utrustat med den ljusemitterande dioden (LED) som ljuskälla) hittades röd / nära infraröd MMIR1-sond som den bästa när det gäller fotostabilitet av dess referens och känsliga färgämnen med mindre än 5% minskning av ljusstyrkan i deras ursprungligaintensitetsförhållande (R = Iref / I sens ) efter 12 cykler av kontinuerlig belysning. Detta gjorde det möjligt att använda MMIR1-sond för dynamisk realtidsstudie av snabb respiratorisk respons i hDPSC-sfäroider vid behandling med mitokondriell frikopplare (FCCP) och hämmare av komplex I i elektrontransportkedjan (rotenon) (figur 2A,B). Vi fann att i stamcellshärledda sfäroider visade FCCP endast mild frikopplingseffekt med en liten minskning av cellandning inom ~ 80 s efter tillsats av detta läkemedel, i överensstämmelse med tidigare rapporterade metaboliska egenskaper hos DPSC40. Å andra sidan hämmade rotenon starkt andningen vilket ledde till sfäroidreoxygenering (återspeglas som ökningen av Rp -sfäroidperiferiförhållandet och Rc -sfäroidkärnförhållandet) och avledning av periferi-till-kärnaO2-gradienterna inom ~ 80 s efter stimulering (Figur 2A). Tvåpunkts halvkalibrering av MMIR1-sondförhållandet (R) vid högt (atmosfäriskt) och lågt (i närvaro av natriumsulfit och glukosoxidas i bildbehandling)O2-nivåer bekräftade minskningen av R, relaterat till minskningen av syresättningen i sfäroider med preliminär hämmad andning genom antimycin A / rotenoncocktailbehandling (Figur 2C ), som illustrerar hur mätningen av MMIR1-sonden R kan tillämpas för semikvantitativ övervakning av långsiktiga steady-state- och snabba syresättningssvar i 3D.

Figure 2
Figur 2: Kinetisk analys avO2-sondens svar på olika stimuli. (A) Representativt resultat av hDPSC-sfäroid syresättningsavbildning i vila och som svar på FCCP- och rotenonbehandlingar. Skalstången är 100 μm. (B) Kinetiskt svar på MMIR1-intensitetsförhållandet till FCCP och rotenonbehandling jämfört med det initiala fotoblekningsintensitetsförhållandet kinetik (%). (C) Förändringar i intensitetsförhållandet bilder av MMIR1-sond i hDPSC-sfäroider vid syresatta (antimycin A + rotenonadition) och deoxygenerade (glukosoxidasadition) tillstånd. Färgfältet representerarO2-sondens intensitetsförhållande (R = Iref / Isens) fördelning över bilden. Klicka här för att se en större version av denna figur.

För att illustrera MMIR1-sondapplikationen för levande metabolisk avbildning utfördes den jämförande analysen avO2-gradienter i homocellulära hDPSC kontra heterocellulära hDPSC / HUVEC (1: 1) sfäroider. Genom att utnyttja tillgängligheten av fria blå och gröna fluorescensspektralkanaler samfärgning med Hoechst 34580 (HXT) och SYTOX Green (SYTOX) utfördes för att demonstrera tillämpningen avO2-sond för multiparametriska studier (figur 3). Med hjälp av det automatiska protokollet för pixel-för-pixel-intensitetsberäkningar som tillhandahålls av bildprogramvaran producerades falska färgförhållandebilder av R-distribution i sfäroider, som visualiserade realtidsdecenserade periferi-till-kärnaO2-gradienter i alla typer av sfäroider: med den syresatta periferin och hypoxiska nischer i mitten (figur 2 och figur 3A). Rp- och Rc-värdena, liksom brantheten hosO2-gradienten i de mellersta tvärsnitten varierade dock för olika sfäroidtyper: se linjeprofilerna för de mellersta tvärsnitten i hDPSC kontra hDPSC/HUVEC-sfäroider och hDPSC jämfört med bioprintade hDPSC-sfäroider (figur 3B,C). Eftersom det inte fanns något allmänt accepterat sätt att beskrivaO2-gradienter introducerade vi flera parametrar som möjliggjorde enkel jämförelse och detaljerad beskrivning av allmän sfäroid syresättning: Rp och Rc, och sådana egenskaper hosO2-gradienter som en skillnad mellan de syresatta och hypoxiska zonerna som (Rp-R c) och genomsnittliga förändringar av syresättning per μm som (Rp-R c) / r, där r är ett avstånd mellan periferi och hypoxisk kärna, korrelerande i mitten av tvärsnittet med sfäroidradie (figur 3D). Statistisk jämförelse av dessa parametrar tillsammans med data från nekrotiska döda celler visualiserade av SYTOX i sfäroider, hjälpte oss att dra preliminära slutsatser om ursprunget till de sfäroida celltypsspecifikaO2-distributionsgradienterna.

Figure 3
Figur 3: Jämförande analys av syresättningsgradienter i sfäroider. (A) Representativa exempel på levande mikroskopi av oxygenering (ratiometrisk fluorescensmikroskopi av MMIR1) och levande / död cellfärgning (Hoechst 34580, HXT, blå och SYTOX Green, SYTOX) i homocellulära hDPSC-sfäroider före och efter utskrift och heterocellulära hDPSC / HUVEC (1: 1) sfäroider. hDPSC i alla typer av sfäroider var från samma cellkultur. Sfäroider förfärgades med 5 μg/ml MMIR1-sond i 2 dagar under bildandet och användes sedan antingen för avbildning eller bioprinting (endast hDPSC-sfäroider), med efterföljande avbildningsanalys dag 1 efter bioprinting. Bilder i falsk färg avintensitetsförhållandet (Iref/I sens) bilder av MMIR1-färgade sfäroider motsvarar deras periferi-till-kärnaO2-gradienter. Skalstången är 100 μm. Färgfältet representerarO2-sondens intensitetsförhållande (R = Iref / Isens) fördelning över bilden. Siffrorna 1 och 2 i diametertvärsnitten motsvarar intensitetsprofiler som visas i B och C. (B,C) Jämförelse av intensitetsförhållandeprofiler mellan homogen hDPSC kontra heterogena hDPSC/HUVEC-sfäroider (B) och homogena hDPSC-sfäroider före och efter bioprinting (C). Profilerna mättes för tvärsnitt av sfäroider som visas på (A). (D) Schematisk representation av parametrar som används för att beskriva periferi-till-kärnaO2-gradienter i sfäroider, där r är en radie av sfäroid och Rp och Rc är intensitetsförhållanden i periferin och kärnområdet för sfäroid på motsvarande sätt. Färgfältet representerar schematiskt fördelningen avO2-gradient från höga (röda) till låga (blå) nivåer i idealiskt sfärisk sfäroid. (E,F) Jämförande analys av periferi-till-kärna O2-gradienter (Rp-R c) / r-värden i hDPSC / HUVEC och hDPSC-sfäroider (E) och i hDPSC-sfäroider före och på dag 1 efter bioprinting (F). Statistisk analys gjordes för en experimentell upprepning (n = 18-23). Lådor motsvarar standardavvikelser. Asterisker indikerar den statistiska skillnaden mellan grupper (vid p = 0,05); ** = p < 0,0005. Klicka här för att se en större version av denna figur.

I jämförelse med homocellulära hDPSC-sfäroider hade hDPSC / HUVEC-sfäroider signifikant brantare gradienter: högre värden på (Rp-R c) / r-parameter och intervall (Rp-R c; Figur 3F). Samtidigt visade de högre syresättning av periferin (Rp) och kärnan (Rc) (figur 4A, tabell 1). Intressant nog var de också statistiskt större (figur 4A, tabell 1), vilket tyder på att sådana skillnader i syresättning orsakades av deras olika cellulära bioenergetiska profiler. Dessa data är i överensstämmelse med de välkända metaboliska egenskaperna hos HUVEC-celler som i allmänhet har lägre andningsaktivitet hos celler med det starka beroendet av glykolys och pentosfosfatvägar som de viktigaste bioenergetiska källorna till ATP och NAD (P) H41. Samtidigt genereras den uttalade periferi-till-kärnaO2-gradienten som bildas i heterogena sfäroider sannolikt av hDPSC i deras sammansättning, kännetecknad av hyperpolariserade mitokondrier och aktiv elektrontransportkedja40 och, enligt resultaten på hDPSC-sfäroiders syresättning, med stark andningsaktivitet (Figur 3, figur 4A och tabell 1 ). Således är generellt högre livskraft hos hDPSC / HUVEC-sfäroider som bekräftas av den lägre intensiteten hos deras döda celler som färgar med SYTOX (figur 3A) potentiellt kopplad till deras högre syresättningsnivåer.

För att illustrera tillämpligheten av levande mikroskopiavbildning av sfäroid syresättning vid biofabricering användes MMIR1 O 2-sond förfärgade sfäroider för bioprinting i GelMA biobläck med följande jämförelse avO2-gradienter i hDPSC-sfäroider före och på dag 1 efter bioprinting (figur 3A, C, F, figur 4B och tabell 2). Bioprintade hDPSC-sfäroider hade signifikant syresatt periferi (högre Rp) jämfört med sfäroider, mätt före bioprinting, medan deras kärnsyresättning hade liknande värden (Figur 4B). Förändringar i deras periferi syresättning påverkar intervallet (en ökning av (Rp-R c) och branthet (ökad (Rp-R c) / r) av deras periferi-till-kärnaO2-gradienter, som statistiskt skilde sig från hDPSC-sfäroider uppmätta före bioprinting (figur 3F och figur 4B). Färgningen av döda celler var i allmänhet ljusare i bioprintade sfäroider, vilket tyder på att minskad sfäroidviabilitet är involverad i förändringen av sfäroid syresättning (Figur 3A).

Figure 4
Figur 4: Jämförande analys av MMIR1-färgade sfäroiders diameter och intensitetsförhållande. (A) Jämförelse mellan hetero- hDPSC/HUVEC och homocellulära hDPSC-sfäroider. (B) Jämförelse av homocellulära hDPSC-sfäroider före och efter bioprinting. Rp och Rc - intensitetsförhållande vid periferin och kärnan i sfäroiderna på motsvarande sätt; (Rp-R c) - skillnaden i intensitetsförhållande, motsvarande intervalletO2-gradient i sfäroider. Statistisk analys gjordes för en experimentell replikat (n = 18-23). Lådor motsvarar standardavvikelser. Asterisker indikerar den statistiska skillnaden mellan grupper (vid p = 0,05), där * = p < 0,005 och ** = p < 0,0005. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Typ av sfäroid (N) Diameter [μm] Rp [a.u.] Rc [a.u.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./μm]
hDPSC / HUVEC (18) 113,2 ± 10,6 0,779 ± 0,034 0,398 ± 0,055 0,982 ± 0,051 0,00677 ± 0,00091
hDPSC (18) 88,1 ± 9,9 0,558 ± 0,025 0,331 ± 0,034 0,227 ± 0,032 0.00520 ± 0.00090
p-värde 1,5 x 10-8 * 1,5 x 10-21 * 1,3 x 10-4 * 1,4 x 10-12 * 9,2 x 10-6 *

Tabell 1. Sfäroiddiameter, intensitetsförhållande vid kärnan (Rc) och periferin (Rp) hos sfäroiderna, skillnaden i intensitetsförhållande (Rp-R c) och (Rp-R c) / r-värde i heterogena hDPSC / HUVEC och homogena hDPSC-sfäroider. p-värdet för ett t-test på N-sfäroider visar statistisk skillnad och indikeras också med en asterisk.

Typ av sfäroid (N) Diameter [μm] Rp [a.u.] Rc [a.u.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./μm]
hDPSC (18) 88,1 ± 9,9 0,558 ± 0,025 0,331 ± 0,034 0,227 ± 0,032 0.00520 ± 0.00090
Bioprintad hDPSC (23) 80,9 ± 12,5 0,584 ± 0,023 0,323 ± 0,038 0,261 ± 0,039 0.00658 ± 0.00144
p-värde 0.054 0.0024 * 0.46 9,9 x 10-4 * 6,3 x 10-6 *

Tabell 2. Sfäroiddiameter, intensitetsförhållande vid kärnan (Rc) och periferin (Rp) hos sfäroiderna, skillnaden i intensitetsförhållande (Rp-R c) och (Rp-R c) / r-värde i homogena hDPSC-sfäroider före och efter bioprinting. p-värde för statistisk analys (N-sfäroider). Den statistiska skillnaden indikeras med en asterisk.

Discussion

Betydelse. Vävnadssyresättningsmätning ger en inblick i cell- och vävnadsspecifik metabolism, vävnadstillväxt och utveckling, livskraft, tumörigenes och cellmigration samt interaktion med mikrober och andra patogener. Den presenterade metoden ger ett nytt verktyg för bättre förståelse av fysiologin hos multicellulära sfäroidkulturer: analys av syresättning med ratiometriska nanopartikel-O2-sonder och ger medel för att bedöma hypoxi, visualisera beroendet av särskilda energiproduktionsvägar och kompletterar modelleringsstudier och alternativa metaboliska avbildningsmetoder43,44 på ett allmänt tillgängligt billigt fluorescensmikroskop. Ratiometriska mätningar kan utföras på ett fluorescensbreddfält (pulserad LED-excitation föredras), laserskanningskonfokal, ljusplåt och tvåfotonmikroskop, idealiskt utrustade med T- ochO2-inkubatorkammare. Viktigt är att presenterad O2-mikroskopimätning enkelt kan kombineras med levande multiparameteranalys av olika fysiologiska parametrar och cellspårämnen (vid heterocellulära sfäroidkulturer), livskraft (levande / död färgning), lipidmetabolism (lipidavkännande fluorescerande sonder), dynamik i pH (färgämnen, nanopartiklar och fluorescerande proteiner) eller [Ca2+ ], utförd i tillgängliga fluorescensspektralkanaler eller parallellt, vilket ger en utökad bild av cellfunktionen i realtid i sfäroider, bioprintade konstruktioner och potentiella vävnadstransplantationer.

Sfäroidkulturer finner användning i studier av cancerceller, tumör- och stamcellsnischmikromiljö, tumöroider, läkemedelseffektivitet och toxicitetsscreening, och faktiskt som vävnadsbyggstenar för vävnadsbiofabricering och självmontering45. De kan genereras från flera celltyper med en mängd olika tillvägagångssätt46. Sfäroidmodellens popularitet kräver deras standardisering ur forskningsintegritetens synvinkel och förbättring av dataanalys, vilket nyligen försöktes genom utveckling av den första sfäroiddatabasen8.

Vårt protokoll förväntas hjälpa till att bättre förstå levande sfäroidmetabolism, standardisera denna experimentella modell och därefter förbättra deras långsiktiga stabilitet, reproducerbarhet och livskraft inom bioprintade och implanterbara material.

Ändringar. Detta protokoll beskriver användningen av mikromönstrad agaros låghäftande yta (mikromoldbaserad bildning29) för högavkastningsgenerering av O2-sondbelastade sfäroider för syresättningsanalys. De alternativa metoderna för sfäroidproduktion, såsom hängande droppe, applicering av ultralåga fästplattor, lipidbeläggning eller fritt flytande bildning är också kompatibla med det föreslagna O2-sondbelastningsprotokollet. Det presenterade protokollet optimerades för hDPSC-sfäroider och samodlingssfäroider av hDPSC med HUVEC (1:1). Andra cellinjer är verkligen tillämpliga 15,17,47,48; Viss protokolloptimering kan dock krävas på grund av de olika cellvidhäftningsegenskaperna, odlingsförhållandena, metaboliska substratkrav och cellkompatibilitet med nanopartikelfärgning. Valet av en lämplig förhållandemetrisk nanopartikelbaseradO2-känslig sond måste göras beroende på specifik cellmodell och enligt sondens fotoblekningsegenskaper vid den använda mikroskopiuppsättningen (ljuskällans intensitet och typ, kamerans spektralkänslighet) och tillgång till lämpliga excitations-/emissionsfilter för motsvarande referens- ochO2-känsliga spektralkanaler i sonden.

Vissa ratiometriskaO2-sonder är kommersiellt tillgängliga2. Alternativt kan de framställas internt genom samtidig utfällning av referens- ochO2-känsliga färgämnen med en polymer enligt beskrivningen någon annanstans 24,25,49. För varje enskild modell bör de preliminära testerna göras för att bestämma lämpliga sond- och optimala mikroskopiförhållanden och för att minimera effekten av sondfotoblekning eller fotoinduceradO2-förbrukning under förhållandemetriska mätningar. Tidigare studier avO2-avkännande nanopartiklar visade deras låga celltoxicitet, vilket möjliggjorde applicering i ett brett spektrum av färgningskoncentrationer (1-20 μg / ml). Eftersom vissa katjoniska nanopartiklar kan aggregera sig själva under lagring rekommenderar vi att du håller deras belastningskoncentration så låg som möjligt för att minimera deras potentiella effekt på sfäroidbildning. Eventuellt kan nanopartikelsuspensionen filtreras (0,2 μm) eller rensas genom centrifugering (10 000 x g, 5 min) före användning för att avlägsna allt aggregat från suspensionen.

Även om BioCAD- och HMI-programvaran är specifik för den presenterade bioskrivaren, är detta protokoll tillämpligt på andra bioskrivare, eftersom beredningen av biobläck, montering, fyllning av en standardpatron och utformningen av en porös hydrogelställning tillhandahålls. Dessutom bör bioprintingparametrarna som utskriftshastighet och temperatur vara jämförbara för olika extruderingsbaserade bioskrivare. Trycktryck och fjäderbensdiameter är beroende av nåltyp och diameter, biobläcksammansättning, temperatur och resulterande viskositet, men de kan vara en utgångspunkt för att optimera utskriftsparametrar för att bioprinta GelMA-baserade biobläck med olika bioskrivare, även om vissa bioskrivare använder spindlar istället för lufttryck för att extruderabiobläcket 50.

Kritiska steg och felsökning. Ett av de kritiska stegen är valet avO2-sond , som baseras på följande överväganden: för det första den tillgängliga fluorescensmikroskopuppsättningen (dvs. kompatibel excitationsljuskälla, filter för excitation och emission, kamerakänslighet och spektraltransmittans och numerisk bländare för målet), vilket kan begränsa antalet tillgängliga sonder med avseende på deras fotostabilitet, ljusstyrka och potentiell fototoxicitet. Det är också viktigt att notera att vissa typer av nedsänkningsolja (vid oljenedsänkningsmål) kan störa röda och infraröda fluorescenssignaler. Vi ser fotostabilitetstesterna som mycket viktiga och att de måste utföras under inledande upplägg och preliminära tester. Potentiell spektral överhörning mellan de fluorescerande kanalerna och olika färgämnen måste beaktas. Faktum är att den potentiella mörka och fotoinducerade toxiciteten hosO2-sonden och andra utvalda färgämnen, i förhållande till den specifika cellmodellen, måste utvärderas under protokolloptimering51. Den specifika frågan för nanopartiklar kan vara deras självaggregering, som kan mildras genom att optimera deras arbetskoncentration, sammansättningen av färgmediet (t.ex. seruminnehåll), ultraljudsbehandling av nanopartiklar före blandning med medium eller genom användning av O2-sond förfärgade och tvättade celler för sfäroidbildning istället för sondbelastning under sfäroidbildning och komprimeringsprocedur.

Vi observerade inte problem i samband med ljuspenetrationsdjupet med beskrivna sfäroidmodeller, men detta måste beaktas vid val av ratiometriska intensitetssignaler, storlek på sfäroida och biofabricerade konstruktioner (vävnadstransplantat) och optimering av cellfärgning med respektive färgämnen. MMIR1-sonden som har nära matchande röda och nära infraröda emissionsvåglängder förväntas ge den lägsta bakgrunden och bästa vävnadsljuspenetrationen jämfört med andra röda /blå eller grönemitterande fluorescerande biosensorsonder.

Produktion och hantering av förhållandebilder (och potentiellt spektral oblandning eller dekonvolution) kan göras i en leverantörs tillhandahållen programvara eller i opensource-alternativen som ImageJ, Fiji52,53, napari (https://napari.org), MATLAB och andra. Ett kritiskt steg kommer att vara att subtrahera bakgrunds- och mäta signalintensitetsförändringar i ett linjärt intervall.

Kalibrering avO2-sond: Rotenon och antimycin A är hämmare av komplex I respektive III i mitokondriell elektrontransportkedja, blockerar cellandning 54,55,15 och inducerar avledning av O2-gradienter i sfäroider och deras jämvikt med miljönO2. Således kommer förändring avO2-koncentrationen i miljön (dvs. 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0%O2) att möjliggöra ratiometrisk intensitet eller fosforescenslivstidskalibrering av denO2-känsliga sonden i celler. Typiskt kanO2-kontrollerade inkubatorer inte uppnå absolut 0%O2 och i vissa situationer krävs ett snabbt test av sondens svar på deoxygenering. I sådana fall måste 25–100 μg/ml glukosoxidas ellerNa2SO3/K2 HPO4-blandning (50 mg/ml för varje förening för 10x lösning i destillerat vatten) tillsättas till provet. Viktigt, om cellinjen har en signifikant grad av icke-mitokondriellO2-konsumtion, överväga detta när du utför hämning av andnings- och kalibreringsexperiment.

Begränsningar och framtida forskning. Huvudbegränsningen för den föreslagna metoden och den förhållandemetriska detektionen i allmänhet är kalibreringen och omvandlingen av observerade förhållandenivåer till de faktiskaO2-nivåerna , vilket på grund av inneboende skillnader i hårdvaru- och användarbildförvärvsinställningar skulle göra förhållandet kalibreringsinstrument- och cellspecifikt. Viktigt, för ett widefield fluorescensmikroskop och beskriven inställning, återspeglar förhållandebilderna kombinerade projektioner snarare än idealiska optiska sektioner ochO2-kalibrering skulle inte vara meningsfull. Å andra sidan visar vi att semikvanitativa kvotmätningar ger statistiskt signifikant och lätt att mäta jämförande fenotypning av sfäroider som produceras från olika källor och har skillnader i syresättning.

Den framtida forskningen för att göra mer tillgängliga och prisvärda mikroskopimetoder utformade för levande 3D-objekt som SPIM, ljusark, theta, tvåfoton och luminescens livstidsavbildning i kombination med maskininlärning56,57,58,59,19, kommer att bidra till att föra multiparametrisk O2-avbildning till ännu mer kvantitativa applikationer.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete har fått stöd av det särskilda forskningsfondsbidraget från Gent University (BOF/STA/202009/003) och EU FP7 ITN-programmet "Chebana", bidragsavtal nr 264772 (för AVK). Data finns tillgängliga på begäran. G-kod för bioprinting är tillgänglig för delning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 Also available from Sigma
12 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 665-180 Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable Ibidi 81201 Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes Nerbe plus 02-502-3001 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3cc Cartridge, UV secure, luer lock RegenHU C-033CC-UV Also available from CelIink and others
3D Discovery Bioprinter RegenHU N/A Bioprinter equiped with an extrusion based printhead, heating mantle, UV-LED curing lamp, 3D Discovery HMI software (CAD/CAM software with direct machine control) and BioCAD software (version 1.1-12)
6 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 657160 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674-25MG Used as inhibitor of complex III of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
B-Braun Tip Cap, luer lock RegenHU TC-BB-B Also available from Regemat, Cellink and others
Cell view cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment, sterile Greiner bio-one 627861 For microscopy of bioprinted spheroids
Collagen from human placenta, type IV Sigma C5533 For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
D(+)-Glucose Merck 8342 Prepare 1M stock solution, 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free Sigma-Aldrich D5030-10X1L For preparation of imaging medium
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Also available from Lonza and others
Endothelial Growth SupplementMix PromoCell C-39216 Also available from Lonza and others
FCCP, Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920-10MG Used as mitochondrial uncoupler
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-098 Also available from Sigma
GelMA N/A N/A GelMA was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782] but are also available from Xpect Inx
Glucose-oxidase from Aspergillus nige (10000 u) Sigma-Aldrich G7141 Used to test the response of probe to deoxygenation
GlutaMAX 100x Supplement Gibco 35050-038 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 2mM)
HEPES (1M) Gibco 15630-080 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Hoechst 34580 Invitrogen (Life Technologies) H21486 Also available from Sigma, BDBiosciences and others
Human dental pulp stem cells (hDPSC) Lonza PT-5025 Also available from ATCC or other vendors
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2517 Also available from ATCC or other vendors
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) Merck 4873 For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
Li-TPO N/A N/A Li-TPO-L was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent)  [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97
8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] but comparable photo-initiators are available from Sigma
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium Gibco 32561-029 Also available from Sigma and others
Micro-patterned 3D-printed PDMS stamps, wells with a diameter 400 µm, thickness, total well numbers 1585 Self-fabricated These stamps were self-fabricated by the Centre for Microsystems Technology (Professor Dr Jan Vanfleteren, University of Gent) but can also be obtained commercially from Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit)
Na2SO3 (sodium sulfite) Sigma-Aldrich 239321-500G For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
O2 probes: MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+ N/A N/A Can be prepared ‘in-house’ using commercially available dyes, polymers and precipitation method [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Some nanoparticles are available commercially as discussed in [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x ]
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution Gibco 15140-122 Also available from Sigma . Apply in dilution 1:100
Petri dishes, sterile Greiner bio-one 633181 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Piston for 3cc cartridge RegenHU P-03CC-UV Also available from Cellink, Regemat and others
Poly-D-lysine Sigma P6407-5mg For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
PVDF syringe filter 0.22 µm Novolab A35149 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Rotenone Sigma-Aldrich R8875-1G Used as inhibitor of complex I of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SYTOX Green Invitrogen (Life Technologies) S7559 Also available from Sigma, Promega and others
Taper tip 22 gauge (conical PE needle Amada Myachi Europe 22K62222 Similar products are also available from RegenHU, Cellink, Regemat and others
Tissue culture flask (75 cm2) VWR 734-2313 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Ultrapure Agarose Invitrogen (Life Technologies) 16500-500 Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope Olympus N/A Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Biological detection by optical oxygen sensing. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8700-8732 (2013).
  2. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
  3. Cordeiro, I. R., Tanaka, M. Environmental oxygen is a key modulator of development and evolution: From molecules to ecology: Oxygen-sensitive pathways pattern the developing organism, linking genetic and environmental components during the evolution of new traits. BioEssays. 42 (9), 2000025 (2020).
  4. Wenger, R. H., Kurtcuoglu, V., Scholz, C. C., Marti, H. H., Hoogewijs, D. Frequently asked questions in hypoxia research. Hypoxia. 3, 35 (2015).
  5. Erecińska, M., Silver, I. A. Tissue oxygen tension and brain sensitivity to hypoxia. Respiration Physiology. 128 (3), 263-276 (2001).
  6. Gholipourmalekabadi, M., Zhao, S., Harrison, B. S., Mozafari, M., Seifalian, A. M. Oxygen-generating biomaterials: a new, viable paradigm for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 34 (12), 1010-1021 (2016).
  7. Zheng, L., Kelly, C. J., Colgan, S. P. Physiologic hypoxia and oxygen homeostasis in the healthy intestine. A review in the theme: cellular responses to hypoxia. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 309 (6), 350-360 (2015).
  8. Peirsman, A., et al. MISpheroID: a knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nature Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
  9. Suvarnapathaki, S., Wu, X., Lantigua, D., Nguyen, M. A., Camci-Unal, G. Breathing life into engineered tissues using oxygen-releasing biomaterials. NPG Asia Materials. 11 (1), 1-18 (2019).
  10. Salazar-Noratto, G. E., et al. Understanding and leveraging cell metabolism to enhance mesenchymal stem cell transplantation survival in tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells. 38 (1), 22-33 (2020).
  11. Leedale, J. A., et al. Mathematical modelling of oxygen gradients in stem cell-derived liver tissue. Plos One. 16 (2), 0244070 (2021).
  12. Sutherland, R., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
  13. Walenta, S., Dötsch, J., Bourrat-Flöck, B., Mueller-Klieser, W. Size-dependent oxygenation and energy status in multicellular tumor spheroids. Oxygen Transport to Tissue XII. , Springer. (1990).
  14. Hompland, T., Fjeldbo, C. S., Lyng, H. Tumor hypoxia as a barrier in cancer therapy: Why levels matter. Cancers. 13 (3), 499 (2021).
  15. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  16. Dmitriev, R. I., Borisov, S. M., Jenkins, J., Papkovsky, D. B. Multi-parametric imaging of tumor spheroids with ultra-bright and tunable nanoparticle O2 probes. Imaging, manipulation, and analysis of biomolecules, cells, and tissues XIII. , International Society for Optics and Photonics. (2015).
  17. Dmitriev, R. I., et al. Versatile conjugated polymer nanoparticles for high-resolution O2 imaging in cells and 3D tissue models. ACS Nano. 9 (5), 5275-5288 (2015).
  18. Okkelman, I. A., Puschhof, J., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Visualization of Stem Cell Niche by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. Intestinal Stem Cells. , Springer. 65-97 (2020).
  19. Dmitriev, R. I., Intes, X., Barroso, M. M. Luminescence lifetime imaging of three-dimensional biological objects. Journal of Cell Science. 134 (9), 1-17 (2021).
  20. Yasukagawa, M., Yamada, K., Tobita, S., Yoshihara, T. Ratiometric oxygen probes with a cell-penetrating peptide for imaging oxygen levels in living cells. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. 383, 111983 (2019).
  21. Xie, B. -R., et al. A near infrared ratiometric platform based π-extended porphyrin metal-organic framework for O2 imaging and cancer therapy. Biomaterials. 272, 120782 (2021).
  22. Düssmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O 2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death & Disease. 8 (6), 2853 (2017).
  23. Roussakis, E., et al. Theranostic biocomposite scaffold membrane. Biomaterials. 212, 17-27 (2019).
  24. Kondrashina, A. V., et al. A phosphorescent nanoparticle-based probe for sensing and imaging of (intra) cellular oxygen in multiple detection modalities. Advanced Functional Materials. 22 (23), 4931-4939 (2012).
  25. Borisov, S. M., et al. Precipitation as a simple and versatile method for preparation of optical nanochemosensors. Talanta. 79 (5), 1322-1330 (2009).
  26. Borisov, S., Nuss, G., Klimant, I. Red light-excitable oxygen sensing materials based on platinum (II) and palladium (II) benzoporphyrins. Analytical Chemistry. 80 (24), 9435-9442 (2008).
  27. Strobl, M., Rappitsch, T., Borisov, S. M., Mayr, T., Klimant, I. NIR-emitting aza-BODIPY dyes-new building blocks for broad-range optical pH sensors. Analyst. 140 (21), 7150-7153 (2015).
  28. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  29. Fukuda, J., et al. Micromolding of photocrosslinkable chitosan hydrogel for spheroid microarray and co-cultures. Biomaterials. 27 (30), 5259-5267 (2006).
  30. Thomsen, A. R., et al. A deep conical agarose microwell array for adhesion independent three-dimensional cell culture and dynamic volume measurement. Lab on a Chip. 18 (1), 179-189 (2018).
  31. Gevaert, E., et al. High throughput micro-well generation of hepatocyte micro-aggregates for tissue engineering. PloS One. 9 (8), 105171 (2014).
  32. De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
  33. Rivron, N. C., et al. Tissue deformation spatially modulates VEGF signaling and angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (18), 6886-6891 (2012).
  34. Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring phagosome pH by ratiometric fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (106), e53402 (2015).
  35. Billiet, T., Gevaert, E., De Schryver, T., Cornelissen, M., Dubruel, P. The 3D printing of gelatin methacrylamide cell-laden tissue-engineered constructs with high cell viability. Biomaterials. 35 (1), 49-62 (2014).
  36. Tytgat, L., et al. Photopolymerizable materials for cell encapsulation. 3D Printing and Biofabrication. Ovsianikov, A., Yoo, J., Mironov, V. , Springer International Publishing. Berlin. 353-396 (2018).
  37. Markovic, M., et al. Hybrid tissue engineering scaffolds by combination of three-dimensional printing and cell photoencapsulation. Journal of Nanotechnology in Engineering and Medicine. 6 (2), 0210011 (2015).
  38. De Moor, L., et al. Hybrid bioprinting of chondrogenically induced human mesenchymal stem cell spheroids. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 484 (2020).
  39. Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Hynes, J., Papkovsky, D. B. Kinetic analysis of local oxygenation and respiratory responses of mammalian cells using intracellular oxygen-sensitive probes and time-resolved fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 183-207 (2014).
  40. Uribe-Etxebarria, V., Agliano, A., Unda, F., Ibarretxe, G. Wnt signaling reprograms metabolism in dental pulp stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (8), 13068-13082 (2019).
  41. Vizán, P., et al. Characterization of the metabolic changes underlying growth factor angiogenic activation: identification of new potential therapeutic targets. Carcinogenesis. 30 (6), 946-952 (2009).
  42. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Quenched-phosphorescence detection of molecular oxygen: applications in life sciences. Royal Society of Chemistry. , (2018).
  43. Perottoni, S., et al. Intracellular label-free detection of mesenchymal stem cell metabolism within a perivascular niche-on-a-chip. Lab on a Chip. 21 (7), 1395-1408 (2021).
  44. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) and extracellular flux analyses. Redox Biology. 30, 101420 (2020).
  45. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  46. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), 20160877 (2017).
  47. Dmitriev, R. I., et al. Imaging oxygen in neural cell and tissue models by means of anionic cell-permeable phosphorescent nanoparticles. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (2), 367-381 (2015).
  48. Jenkins, J., Borisov, S. M., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Sulforhodamine nanothermometer for multiparametric fluorescence lifetime imaging microscopy. Analytical Chemistry. 88 (21), 10566-10572 (2016).
  49. Fercher, A., Borisov, S. M., Zhdanov, A. V., Klimant, I., Papkovsky, D. B. Intracellular O2 sensing probe based on cell-penetrating phosphorescent nanoparticles. ACS Nano. 5 (7), 5499-5508 (2011).
  50. Wagner, M., Karner, A., Gattringer, P., Buchegger, B., Hochreiner, A. A super low-cost bioprinter based on DVD-drive components and a raspberry pi as controller. Bioprinting. 23, 00142 (2021).
  51. Golub, A. S., Pittman, R. N. Monitoring parameters of Oxygen transport to cells in the microcirculation. Quenched-Phosphorescence Detection of Molecular Oxygen. , 193-204 (2018).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Huang, C., Becker, M. F., Keto, J. W., Kovar, D. Annealing of nanostructured silver films produced by supersonic deposition of nanoparticles. Journal of Applied Physics. 102 (5), 054308 (2007).
  54. Foster, K. A., Galeffi, F., Gerich, F. J., Turner, D. A., Müller, M. Optical and pharmacological tools to investigate the role of mitochondria during oxidative stress and neurodegeneration. Progress in Neurobiology. 79 (3), 136-171 (2006).
  55. Schmidt, C. A., Fisher-Wellman, K. H., Neufer, P. D. From OCR and ECAR to energy: perspectives on the design and interpretation of bioenergetics studies. The Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101140 (2021).
  56. Stelzer, E. H., Lindek, S. Fundamental reduction of the observation volume in far-field light microscopy by detection orthogonal to the illumination axis: confocal theta microscopy. Optics Communications. 111 (5-6), 536-547 (1994).
  57. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
  58. Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
  59. von Chamier, L., et al. Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).

Tags

Bioengineering utgåva 182 biofabricering bioprinting fluorescensmikroskopi hypoxi metabolism,O2-känslig sond syresättning stamceller sfäroider
Prisvärd syremikroskopi-assisterad biofabricering av multicellulära sfäroider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Okkelman, I. A., Vercruysse, C.,… More

Okkelman, I. A., Vercruysse, C., Kondrashina, A. V., Borisov, S. M., Dmitriev, R. I. Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids. J. Vis. Exp. (182), e63403, doi:10.3791/63403 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter