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Biology

पूर्ण लंबाई प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बनाए रखते हुए mRNA से एक आंतरिक ट्रांसलेशनल प्रारंभ साइट को निकालना

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63405
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल Gja1 में एक एकल M213L उत्परिवर्तन का वर्णन करता है जो पूर्ण-लंबाई Connexin43 पीढ़ी को बरकरार रखता है लेकिन छोटे GJA1-20k आंतरिक रूप से अनुवादित आइसोफॉर्म के अनुवाद को रोकता है।

Abstract

CRISPR-Cas9 जीन-संपादन प्रणाली, जीनोम मरम्मत तंत्र के आधार पर, जीन-संशोधित माउस मॉडल की पीढ़ी को पारंपरिक सजातीय पुनर्संयोजन के सापेक्ष अधिक तेज़ी से और आसानी से सक्षम बनाता है। CRISPR-Cas9 प्रणाली विशेष रूप से आकर्षक है जब एक एकल-बिंदु उत्परिवर्तन वांछित है। गैप जंक्शन प्रोटीन, कोनेक्सिन 43 (Cx43), जीन Gja1 द्वारा एन्कोडेड है, जिसमें एक एकल कोडिंग एक्सोन है और इसे spliced नहीं किया जा सकता है। हालांकि, Gja1 न केवल पूर्ण लंबाई Cx43 प्रोटीन का उत्पादन करता है, बल्कि आंतरिक अनुवाद के रूप में जानी जाने वाली प्रक्रिया द्वारा छह एन-टर्मिनस कटे हुए आइसोफोर्म तक का उत्पादन करता है, आंतरिक AUG (मेथिओनिन) स्टार्ट साइटों पर राइबोसोमल अनुवाद दीक्षा का परिणाम। GJA1-20k Cx43 का सबसे अधिक उत्पन्न कटा हुआ आइसोफोर्म है जो Gja1 mRNA की स्थिति 213 पर AUG कोडॉन में शुरू किया गया है। क्योंकि अवशेष 213 Cx43 के अंतिम ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन के अंत में होता है, GJA1-20k प्रभावी रूप से एक स्वतंत्र प्रोटीन के रूप में Cx43 की 20 kDa C-टर्मिनस पूंछ है। पिछले जांचकर्ताओं ने कोशिकाओं में, पहचान की, कि GJA1-20k की एक महत्वपूर्ण भूमिका प्लाज्मा झिल्ली के लिए पूर्ण लंबाई Cx43 गैप जंक्शन हेमिचैनल की तस्करी की सुविधा प्रदान करना है। विवो में इस घटना की जांच करने के लिए, एक जीजेए 1 बिंदु-उत्परिवर्तन के साथ एक उत्परिवर्ती माउस उत्पन्न किया गया था जो एटीजी (मेथिओनिन) को टीटीए (ल्यूसीन, एम 213 एल उत्परिवर्तन) के साथ अवशेष 213 पर प्रतिस्थापित करता है। M213L का परिणाम यह है कि Gja1 mRNA और पूर्ण लंबाई Cx43 अभी भी उत्पन्न होते हैं, फिर भी Gja1-20k का अनुवाद काफी कम हो जाता है। यह रिपोर्ट एक एमिनो एसिड उत्परिवर्तित (Gja1M213L / M213L) माउस मॉडल विकसित करने के लिए प्रतिबंध एंजाइम साइट को चुनने पर केंद्रित है। यह प्रोटोकॉल CRISPR-Cas9 प्रणाली द्वारा आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों और पीसीआर और प्रतिबंध एंजाइम उपचार के संयोजन से तेजी से जीनोटाइपिंग का वर्णन करता है।

Introduction

पूर्ण लंबाई Connexin 43 (Cx43) और एन टर्मिनस कटा हुआ आइसोफॉर्म, GJA1-20k, एक ही GJA1 mRNA द्वारा एन्कोडेड, लेकिन अनुवाद शुरू करने के लिए विभिन्न स्टार्ट कोडोन1 का उपयोग करें। Cx43 अनुवाद पहले AUG स्टार्ट कोडोन पर होता है, जबकि GJA1-20k अनुवाद अवशेष 213 पर AUG पर शुरू होता है। यह पहले पाया गया था कि GJA1-20k में पूर्ण-लंबाई Cx43 तस्करी, एक्टिन स्थिरीकरण, और विट्रो 1,2,3 में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के विनियमन के लिए आवश्यक भूमिकाएं हैं।

वीवो में GJA1-20k की भूमिका को समझने के लिए, एक GJA1-20k "नॉक-आउट" माउस मॉडल उत्पन्न किया गया था जिसने पूर्ण-लंबाई Cx43 बनाने की क्षमता को बनाए रखा था। दृष्टिकोण CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक मेथिओनिन (एम) से एक ल्यूसीन (एल) (Gja1M213L / M213L) 4 के लिए 213 पर एकल अवशेषों को प्रतिस्थापित करने के लिए किया गया था। एक आंतरिक एम टू एल उत्परिवर्तन नाटकीय रूप से होने वाले आंतरिक अनुवाद की संभावना को कम कर देता है, फिर भी पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन 4 के अनुवाद और कार्य को बरकरार रखताहै। क्योंकि जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) और उत्परिवर्तित एलील में समान आकार और निकट-समान एमआरएनए उत्पाद होते हैं, इसलिए चूहों में जीनोटाइप की पुष्टि करने में काफी कठिनाई होती है। डीएनए अनुक्रमण उत्परिवर्तन की पहचान कर सकता है लेकिन नियमित उपयोग के लिए बहुत महंगा और समय लेने वाला है। सामान्य तौर पर, कई तेजी से जीनोटाइपिंग विधियों की स्थापना की गई है, जैसे कि रियल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर), मिनीसक्वेंसिंग-लिगेशन, उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघलने वाला विश्लेषण, और टेट्रा-प्राइमर प्रवर्धन दुर्दम्य उत्परिवर्तन प्रणाली पीसीआर (एआरएमएस-पीसीआर) 5,6,7,8। फिर भी इन वैकल्पिक तरीकों को कई चरणों, अद्वितीय संसाधनों और / या कई विशिष्ट प्राइमर सेट की आवश्यकता होती है जो गैर-विशिष्ट पीसीआर उत्पादों को प्रेरित कर सकते हैं।

यह प्रोटोकॉल CRISPR-Cas9 द्वारा एक एकल अमीनो एसिड उत्परिवर्तन बनाने के लिए एक विस्तृत जीन लक्ष्यीकरण और संपादन दृष्टिकोण का परिचय देता है, और उत्परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए तेजी से जीनोटाइपिंग प्रस्तुत की जाती है। जीनोटाइप पहचान में लक्ष्य जीन की पहचान करने के लिए प्राइमरों के केवल एक सेट का उपयोग करके प्रतिबंध एंजाइमों का रचनात्मक उपयोग शामिल है। पाठकों को संदर्भ 4 के लिए संदर्भ 4 के लिए संदर्भ 4 के लिए एक अवशेष Gja1M213L / M213L प्रतिस्थापन उत्परिवर्तन जो अभी भी पूर्ण लंबाई प्रोटीन उत्पन्न करता है जो अभी भी एक छोटे आंतरिक रूप से अनुवादित truncation आइसोफोर्म उत्पन्न करने में विफल रहता है के कारण अचानक कार्डियक मृत्यु के गहन electrophysiological प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए संदर्भ 4 के लिए संदर्भ 4 के लिए संदर्भ4 के लिए संदर्भित कर रहे हैं। यह प्रोटोकॉल अन्य चूहों के मॉडल को अंतर्जात पूर्ण-लंबाई प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बनाए रखते हुए ब्याज के आइसोफोर्म के आंतरिक अनुवाद को कम करने के लिए एक बिंदु उत्परिवर्तन का उपयोग करने में मदद करेगा।

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Protocol

"सभी पशु देखभाल और अध्ययन प्रोटोकॉल को देवदार-सिनाई मेडिकल सेंटर और यूटा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था। 8-9 सप्ताह की उम्र में वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त C57BL / 6J मादा चूहों ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग प्रयोगों के लिए किया गया था।

1. जीन लक्ष्यीकरण के लिए तैयारी

  1. CRISPOR वेब एल्गोरिथ्म 4,9,10 का उपयोग कर लक्षित उत्परिवर्तन साइट कोडिंग M213 के आसपास गाइड लक्ष्य अनुक्रम का चयन करें (सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: GJA1 कोडिंग अनुक्रम से विपरीत स्ट्रैंड में एक 20-बेस गाइड अनुक्रम (ATTCAGAGCGAGAGACACCA), 62 के एमआईटी स्कोर11 के साथ चुना गया था जिसमें संभावित दरार साइट उत्परिवर्तित होने के लिए कोडोन के डाउनस्ट्रीम 16 ठिकानों के बाद स्थित है (एटीजी) (चित्रा 1; पूरे सीआरआरएनए अनुक्रम को तालिका 1 में दिखाया गया है)।
  2. CrRNA और tracrRNA को संश्लेषित करें जो Cas9 के साथ गाइड RNA12 के रूप में बातचीत करते हैं।
    नोट: यद्यपि गाइड आरएनए का एमआईटी स्कोर 62 है, लेकिन पीएएम से 12 से अधिक आधारों के चार बेमेल के साथ केवल एक संभावित ऑफ-टारगेट उत्परिवर्तन है। इसलिए, इस गाइड आरएनए को सुरक्षित माना जाता है।
  3. एक एकल अमीनो एसिड प्रतिस्थापन (टीटीए के लिए एटीजी) पेश करने के लिए गाइड अनुक्रम के पूरक एक दाता ओलिगो डिजाइन; M213L) के साथ 60 और 48 आधार होमोलॉजी हथियारों के साथ क्रमशः 5'- और 3'-पक्षों में।
    नोट: इस दाता oligo एक मूक उत्परिवर्तन (TCC करने के लिए TCG) पेश करके PAM (AGG करने के लिए ACG) के विघटन के लिए एक बिंदु उत्परिवर्तन शामिल हैं; S217S) CRISPR होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (HDR) 13 के बाद फिर से संपादन से बचने के लिए इच्छित उत्परिवर्तन (चित्रा 1 और तालिका 1) की शुरूआत के लिए।
  4. NaCl (200 mM अंतिम एकाग्रता) का उपयोग करने के लिए oligos के 10 μg अवक्षेपित करने के लिए pronuclear microinjection बफर (Tris-HCl के 10 mM, pH 7.5; EDTA के 0.1 mM, और spermine और spermidine14 के बिना NaCl के 100 mM) में नमक कैरी-ओवर को कम करने के लिए।
    नोट: 70% इथेनॉल के साथ डीएनए गोली को न धोएं क्योंकि गोली को समाधान में भंग किया जा सकता है।
  5. दाता ओलिगो के 50 ng/ μL, crRNA/ tracrRNA मिश्रण के 60 ng/μL (1:1 दाढ़ अनुपात) (चरण 1.2 से), और eSpCas9 प्रोटीन के 50 ng/μL ( सामग्री की तालिका देखें) को अंतिम आयतन 20 μL (तालिका 2) में CRISPR मिश्रण बनाने के लिए मिलाएं। दाता ओलिगो की एकाग्रता को कम करें यदि उच्च विषाक्तता देखी जाती है (उदाहरण के लिए, 25 एनजी / μL)।

2. superovulation के प्रेरण, अंडे की कटाई, CRISPR मिश्रण के प्रोन्यूक्लियर microinjection, और ब्लास्टोसिस्ट स्क्रीनिंग

नोट:: यह कार्यविधि पहले प्रकाशित सामान्य प्रोटोकॉल14 का पालन करता है।

  1. पीएमएसजी के 5 आईयू (गर्भवती घोड़ी के सीरम गोनाडोट्रोपिन) ( सामग्री की तालिका देखें) को 100 μL बाँझ पानी में 8 सप्ताह की उम्र में 5-10 चूहों को लगभग 3:00 p.m पर एक इंट्रापेरिटोनियल दृष्टिकोण द्वारा इंजेक्ट करें ( दिन 1)।
  2. एचसीजी के 5 आईयू (मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन) ( सामग्री की तालिका देखें) को 100 μL में अंडे के दाताओं को बाँझ पानी के 100 μL में पीएमएसजी इंजेक्शन (दिन 3) के बाद 46-48 घंटे के इंट्रापेरिटोनियल दृष्टिकोण से इंजेक्ट करें। स्थापित 1: 1 स्टड पुरुषों के साथ प्रजनन.
  3. Hyaluronidase के साथ M2 माध्यम में निषेचित अंडे फसल, 10:00 a.m के आसपास M2 माध्यम के 100 μL में तीन बार धोएं, फिर mWM15 या KSOM16 मध्यम (दिन 4) में रखें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. CRISPR मिश्रण (चरण 1.3) को 1-सेल चरण भ्रूण में पेश करें जो चूहों से काटा गया प्रोन्यूक्लियर माइक्रोइंजेक्शन14 में M2 के 100 μL में पैराफिन तेल के साथ कवर किया गया था, जो एक उलटा माइक्रोस्कोप पर एक उलटा माइक्रोस्कोप पर एक विपरीत-बढ़ाने वाले प्रकाशिकी के साथ दोपहर के अंत में (वीडियो 1) के साथ कवर किया गया था।
    नोट: CRISPR मिश्रण के प्रोन्यूक्लियर माइक्रोइंजेक्शन को 1-सेल चरण भ्रूण पर 14-16 h postcoitum (p.c. पर किया गया था। इंजेक्ट किए गए भ्रूण को कुछ घंटों के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत किया गया था और सर्जिकल रूप से प्राप्तकर्ता आईसीआर चूहों में 18-20 घंटे पी.c पर स्थानांतरित कर दिया गया था, जिसमें एक ही सुबह एक संभोग प्लग था।
  5. पुनः संयोजक जानवरों का उत्पादन करने के लिए प्रत्येक प्राप्तकर्ता में 20-30 2-सेल भ्रूण स्थानांतरित करें।
    नोट: सामान्य प्रोटोकॉल14 का पालन करें या दक्षता को मान्य करने और विषाक्तता की जांच करने के लिए 4 दिनों के लिए mWM या KSOM माध्यम में उन भ्रूणों को संस्कृति करें। CRISPR मिश्रण की विषाक्तता स्वीकार्य है जब इंजेक्ट किए गए भ्रूण का कम से कम एक तिहाई उनके बीच कई पुनः संयोजकों के साथ पूरी तरह से विस्तारित ब्लास्टोसिस्ट चरण तक जल्दी पहुंचता है। उसी समय, 90% से अधिक अप्रवासी भ्रूण एक समानांतर संस्कृति में एक ही ब्लास्टोसिस्ट चरण तक पहुंचते हैं। ब्लास्टसिस्ट स्क्रीनिंग के लिए चरण 2.6-2.9 का पालन करें जो आवश्यक नहीं है, लेकिन एचडीआर की सफलता दर को मापने के लिए पसंद किए जाने पर किया जा सकता है।
  6. व्यक्तिगत रूप से एकल पीसीआर ट्यूबों (दिन 8) में एक माइक्रोपिपेटर के साथ एक प्लग किए गए ठीक पिपेट टिप का उपयोग करके संस्कृति माध्यम के 2 μL के साथ पूरी तरह से विस्तारित ब्लास्टोसिस्ट के लिए जल्दी उठाएं; वीडियो 2)।
  7. पाचन मिश्रण के 8 μL में लाइस ब्लास्टोसिस्ट (चरण 3.2 के समान; सामग्री की तालिका देखें) और 10 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रक्रिया, फिर भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। कुल 15 μL PCR मिश्रण (चरण 3) में PCR के लिए टेम्पलेट के रूप में lysate के 2 μL का उपयोग करें।
  8. NlaIII (चरण 3-5) के साथ प्रतिबंध पाचन के बाद पीसीआर नमूनों के agarose जेल वैद्युतकणसंचलन17 द्वारा HDR की प्रभावकारिता की जांच करें।
  9. उत्परिवर्तन की अखंडता की पुष्टि करने के लिए संस्थापकों और बाद की संतानों में 668 बीपी एम्प्लिकॉन17 को अनुक्रमित करके लक्षित पुनर्संयोजन की स्थिति की पुष्टि करें।

3. डीएनए निष्कर्षण

नोट: प्रसवोत्तर दिन 10 में चूहों काउपयोग जन्म के लगभग 2-4 सप्ताह बाद GJA1-20k नॉक-आउट माउस की अचानक मृत्यु के कारण इस प्रयोग के लिए किया गया था। पहले प्रकाशित रिपोर्ट18 के बाद एक अधिक सामान्य प्रोटोकॉल भी लागू किया जा सकता है।

  1. साफ कैंची के साथ पैर की अंगुली या पूंछ टिप के 1-3 मिमी काटें और इसे 0.2 मिलीलीटर 8-स्ट्रिप पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें। पैर की अंगुली या पूंछ के नमूनों के बीच संदूषण से बचने के लिए, 70% इथेनॉल या 10% ब्लीच का उपयोग करके प्रत्येक नमूने से पहले पूर्व-साफ कैंची या माउस प्रति एक ब्लेड या साफ का उपयोग करें। यदि पूंछ के बाद खून बहता है, तो रक्तस्राव को रोकने के लिए धुंध के साथ संक्षिप्त दबाव लागू करें। पूंछ के नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें जब तक कि निष्कर्षण लगभग एक सप्ताह तक न हो जाए।
  2. एक 100 μL / ट्यूब में ऊतक लाइसिस समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण करें, इसके बाद एक टेबलटॉप मिनी-सेंट्रीफ्यूज (कमरे के तापमान पर 10 सेकंड के लिए 2,200 x g ) के साथ स्पिन-डाउन करें। सुनिश्चित करें कि पूंछ के नमूने समाधान में डूबे हुए हैं।
  3. निम्नलिखित प्रोग्राम द्वारा सेट किए गए थर्मल साइकलर पर ट्यूब सेट करें; 10 मिनट (ऊतक लाइसिस) के लिए 75 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट (निष्क्रियता) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, और 4 डिग्री सेल्सियस (होल्डिंग)। एक सप्ताह तक के लिए ऊतक लिसेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें यदि पीसीआर को तुरंत निष्पादित नहीं किया जा सकता है।

4. पीसीआर द्वारा डीएनए प्रवर्धन

  1. न्यूक्लिएज मुक्त एच2ओ के 5 μL, 10 μM आगे और रिवर्स प्राइमर के 0.75 μL, और पीसीआर मास्टर मिश्रण के 7.5 μL ( सामग्री की तालिका देखें) प्रति नमूना नए पीसीआर ट्यूब में (प्राइमर अनुक्रमों के लिए तालिका 1 देखें) के 7.5 μL युक्त एक पीसीआर समाधान तैयार करें (प्राइमर अनुक्रमों के लिए तालिका 1 देखें)। यदि कई नमूने हैं, तो प्रति ट्यूब 14 μL को एलीकोट करने के लिए सामग्री को स्केल करें।
  2. चरण 3.1 में तैयार किए गए पीसीआर समाधान में ऊतक लिसेट का 1 μL जोड़ें। सावधान रहें कि पूंछ को न छुएं।
  3. अच्छी तरह से मिलाएं और एक टेबलटॉप मिनी-सेंट्रीफ्यूज के साथ नीचे स्पिन करें (कमरे के तापमान पर 10 एस के लिए 2,200 एक्स जी )।
  4. नीचे उल्लिखित कार्यक्रम द्वारा सेट किए गए थर्मल साइकलर पर ट्यूब सेट करें। पीसीआर उत्पादों को 1-2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या ~1 वर्ष पर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: 3 मिनट के लिए 95 °C (चरण 1, प्रारंभिक विकृतीकरण), 15 s (चरण 2, विकृतीकरण) के लिए 95 °C, 15 s के लिए 60 °C (चरण 2, Annealing), 45 s के लिए 72 °C (चरण 2, एक्सटेंशन), 35 चक्रों के लिए चरण 2 को दोहराएं, 10 मिनट के लिए 72 °C (चरण 3, अंतिम एक्सटेंशन), और 4 °C (चरण 4, होल्डिंग)।

5. प्रतिबंध एंजाइम के साथ इनक्यूबेशन

  1. न्यूक्लिएज मुक्त H2O के 7 μL, 10x CutSmart बफर के 2 μL, और NlaIII प्रतिबंध एंजाइम के 1 μL युक्त एंजाइम समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। यदि कई नमूने हैं, तो मिश्रण बनाने के लिए प्रत्येक सामग्री को गुणा करें और प्रति ट्यूब 10 μL ऐलीकोट करें।
  2. प्रति ट्यूब एंजाइम समाधान के लिए चरण 3 में प्राप्त पीसीआर उत्पाद के 10 μL जोड़ें।
  3. अच्छी तरह से मिलाएं और एक टेबलटॉप मिनी-सेंट्रीफ्यूज के साथ नीचे स्पिन करें (कमरे के तापमान पर 10 एस के लिए 2,200 एक्स जी )।
  4. नीचे उल्लिखित प्रोग्राम द्वारा सेट किए गए थर्मल साइकलर या हीट ब्लॉक पर ट्यूबों को सेट करें। इनक्यूबेशन के बाद उत्पाद को 1-2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर या -20 डिग्री सेल्सियस पर ~ 1 वर्ष पर स्टोर करें।
    नोट: 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (कम से कम 2 घंटे; कम इनक्यूबेशन समय के परिणामस्वरूप अपर्याप्त दरार हो सकती है) और धारण करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।

6. डीएनए बैंड का पता लगाने

  1. वैद्युतकणसंचलन के लिए डीएनए जेल दाग युक्त एक 1.5% agarose जेल तैयार करें।
    1. 1x TAE बफर के 50 mL में 0.75 ग्राम agarose जोड़ें मिश्रण और माइक्रोवेव में गर्मी के बाद जब तक agarose पूरी तरह से भंग हो जाता है. ठंडा होने के बाद, डीएनए दाग के 5 μL जोड़ें और धीरे से मिश्रण।
    2. जेल मोल्ड (मोल्ड प्रति 25 मिलीलीटर) में डालें और जेल को ठोस करने की अनुमति दें। बेहतर संकल्प और अलगाव प्राप्त करने के लिए, आवश्यकतानुसार 2.5% -4% तक agarose एकाग्रता बढ़ाएं।
  2. अच्छी तरह से पचाए गए पीसीआर उत्पाद के 10 μL लोड करें। यदि आवश्यक हो तो 6x लोड हो रहा है बफर मिश्रण.
  3. 35 मिनट के लिए 100 वी के साथ जेल चलाएं।
    नोट:: इन पैरामीटर ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता हो सकती है।
  4. यूवी प्रकाश (302 एनएम तरंग दैर्ध्य) के तहत छवि।

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Representative Results

CRISPR / Cas9 जीन-संपादन प्रणाली टीटीए उत्परिवर्तन के लिए एक एटीजी और टीसीजी उत्परिवर्तन के लिए एक मूक टीसीसी का उत्पादन करती है, जो क्रमशः 56,264,279 से 56,264,281 और माउस गुणसूत्र 10 पर 56,264,291 से 56,264,293 पर, या 869 से 871 और 881 से 883 पर टीसीजी उत्परिवर्तन के लिए एक मूक टीसीसी का उत्पादन करती है। उन उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप जीजेए 1 प्रोटीन पर ल्यूसीन (एम 213 एल) उत्परिवर्तन के लिए मेथिओनिन 213 और टीटीजी उत्परिवर्तन के लिए टीटीसी अवांछित जीन संस्करण (चित्रा 1) से बचने के लिए पास के पीएएम अनुक्रम को बाधित करता है। उत्परिवर्तन का विवरण पिछली रिपोर्ट4 में वर्णित है।

उचित जीनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए, पीसीआर उत्पादों को एगारोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 2, चरण 4) से पहले प्रतिबंध एंजाइम "NlaIII" द्वारा पचाने की आवश्यकता होती है। जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है, जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) एलील पीसीआर उत्पादों को दो अलग-अलग बेस पेयर उत्पादों (227 बीपी और 441 बीपी) में काटा जाएगा। इसके विपरीत, उत्परिवर्ती एलील पीसीआर उत्पाद उत्परिवर्तन (चित्रा 2 बी) द्वारा NlaIII मान्यता साइट की कमी के कारण बरकरार (668 बीपी) होंगे। सामान्य agarose वैद्युतकणसंचलन पचा पीसीआर उत्पादों (चरण 5) का उपयोग करके किया जा सकता है। Agarose जेल में विशिष्ट बैंड प्रत्येक जीनोटाइप (डब्ल्यूटी, जंगली प्रकार) को इंगित करते हैं; हेट, विषमयुग्मजी; एचएम, होमोजीगस)। ऊपर उल्लिखित प्रतिबंध के कारण, प्रत्येक जीनोटाइप के परिणामस्वरूप विभिन्न आकारों के कई बैंड होते हैं (चित्रा 2 सी)। बैंड डब्ल्यूटी (227 बीपी और 441 बीपी) में दो बैंड, हेट में तीन बैंड (227 बीपी, 441 बीपी और 668 बीपी) और एचएम (668 बीपी) में क्रमशः एक बैंड होंगे। एकल प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करके जेल इमेजिंग के अनुसार, चूहों के उचित जीनोटाइप को प्रतिष्ठित किया जा सकता है।

हमारे प्रयोग में, इक्कीस संस्थापकों को शुरू में उत्पादित किया गया था, जिनमें से नौ विषमयुग्मजी या मोज़ेक जानवर थे। प्रजनन की उम्र तक बढ़ने से पहले नौ संस्थापकों में से दो की मृत्यु हो गई, सबसे अधिक संभावना है कि द्वि-एलेलिक उत्परिवर्ती दैहिक कोशिकाओं के उच्च-सामग्री मोज़ेकवाद के कारण। दो स्वतंत्र उत्परिवर्ती लाइनों को बाद में शेष सात संस्थापकों से कम से कम दो पीढ़ियों के लिए जंगली-प्रकार के C57BL / 6J चूहों को बैकक्रॉसिंग करके स्थापित किया गया था। क्योंकि लक्षित उत्परिवर्तन घातक होता है जब समयुग्मजी होता है, इसलिए हमें संभावित ऑफ-टारगेट म्यूटेशन को और पतला करने के लिए विषमयुग्मजी के रूप में लाइन को बनाए रखना पड़ा। होमोजाइगस प्रयोगात्मक जानवरों को बाद की पीढ़ियों को इंटरक्रॉस करके उत्पादित किया गया था।

यह ध्यान देने योग्य है कि 50 एनजी / μL पर दाता ओलिगोस के साथ अपेक्षाकृत उच्च भ्रूण विषाक्तता को भ्रूण में दाता ओलिगोस के इंजेक्शन के लिए अनुभव किया गया था। हालांकि, 12.5 एनजी / μL की दाता एकाग्रता ने परिणामी पिल्लों में लक्षित पुनर्संयोजन को प्रेरित नहीं किया। इसके अतिरिक्त, यह पाया गया कि ओलिगोस के इथेनॉल वर्षा को जोड़ा गया था, जिससे दूषित पदार्थों को हटाने में मदद मिली और कुशल, लक्षित जीनोम संपादन को शामिल करने की अनुमति मिली। ध्यान दें कि 70% इथेनॉल के साथ डीएनए गोली को धोने से छर्रे को एक समाधान में भंग कर दिया जाता है। इसलिए, NaCl का उपयोग 200 mM अंतिम एकाग्रता पर किया गया था ताकि 10 μg ओलिगोस को अवक्षेपित किया जा सके ताकि नमक को प्रोन्यूक्लियर माइक्रोइंजेक्शन बफर में ले जाने से कम किया जा सके। ब्लास्टोसिस्ट विश्लेषण के साथ परीक्षण इंजेक्शन इथेनॉल वर्षा के साथ दाता oligos के 50 या 25 ng / μL का उपयोग करके प्रयास किया गया था। प्रत्येक स्थिति की सफलता दर 76.9% (50 एनजी / μL के साथ 13 नमूनों में से 10) और 25.0% (25 एनजी / μL के साथ 12 नमूनों में से 3) (चित्रा 3 ए-सी) थी। हालांकि इथेनॉल वर्षा के साथ ओलिगो के 50 एनजी / μL अभी भी कुछ हद तक विषाक्त थे, कई अंडों को इंजेक्ट करने की आवश्यकता थी, और उच्च सफलता दर पर पुनः संयोजकों का उत्पादन किया गया था। इसलिए, दाता ओलिगोस के 50 एनजी / μL को अंततः इथेनॉल वर्षा के साथ इंजेक्ट किया गया था और 50.0% सफलता दर के साथ संस्थापक जानवरों को प्राप्त किया गया था (32 पिल्लों में से 16 में 21 बचे लोगों और जन्म के बाद 11 मौत सहित पुनर्संयोजन था)। अनुक्रमण द्वारा पुष्टि किए गए स्थिर संचरण के साथ समान उत्परिवर्तन या मोनोएललिक या समान उत्परिवर्तन के जर्मलाइन संचरण वाले संस्थापक जानवरों में से दो का उपयोग स्वतंत्र लाइनों को स्थापित करने के लिए किया गया था। आम सहमति यह है कि जंगली-प्रकार के जानवरों के साथ दो पीढ़ियों को बैकक्रॉस करना और एन्हांस्ड-फिडेलिटी कैस 9 प्रोटीन का उपयोग करके प्रमुख ऑफ-टार्गेटिंग घटनाओं को समाप्त कर देता है। ऐसी घटनाओं की संख्या सांख्यिकीय रूप से डे नोवो उत्परिवर्तन19,20 की पृष्ठभूमि दर से अलग नहीं है।

अवांछित जीनोटाइप (जंगली प्रकार या अनुचित पुनः संयोजक) वाले जानवरों को प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है और अध्ययन के निष्कर्ष पर सीओ2 इनहेलेशन द्वारा euthanized किया गया था, जिसके बाद आईएसीयूसी प्रोटोकॉल के अनुसार ग्रीवा अव्यवस्था थी।

Figure 1
चित्रा 1: CRISPR/Cas9 द्वारा जीन लक्ष्यीकरण के लिए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व( A) होमोलॉग पुनर्संयोजन के लिए लक्षित अनुक्रम। अनुक्रमों के बीच एकल-अक्षर अमीनो एसिड दिखाए गए हैं। रंगीन हाइलाइट्स होमोलॉजी आर्म (ग्रे), म्यूटेशन कोडोन (ग्रीन), पीएएम अनुक्रम (ऑरेंज), और जीआरएनए लक्ष्य अनुक्रम (ब्लू) का संकेत देते हैं। नीला तीर gRNA को इंगित करता है। NlaIII प्रतिबंध साइट बिंदीदार रेखा द्वारा रेखांकित किया गया है। (बी) बिंदु उत्परिवर्तन के लिए डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती एलील और दाता ओलिगो के योजनाबद्ध अनुक्रमों के परिणामस्वरूप एम 213 एल उत्परिवर्तन हुआ। TCC to TCG अवांछित PAM के विघटन के लिए एक मूक उत्परिवर्तन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: योजनाबद्ध पीसीआर उत्पादों और WT और उत्परिवर्ती एलील के प्रतिबंध साइट. (A,B) PCR की योजना और NlaIII द्वारा पाचन। प्राइमर उत्परिवर्तन स्थल के चारों ओर Gja1 डीएनए के 668 बीपी को बढ़ाते हैं। डब्ल्यूटी एलील पीसीआर उत्पादों को NlaIII द्वारा दो अलग-अलग आकारों में पचाया गया था। इसके विपरीत, उत्परिवर्ती एलील पचा नहीं है और बरकरार पीसीआर उत्पादों को बनाए रखता है। (सी) agarose जेल की प्रतिनिधि छवि WT और उत्परिवर्ती एलील को इंगित करता है। प्रत्येक माउस जीनोटाइप में एक विशिष्ट बैंड आकार था; डब्ल्यूटी (लेन 1, 3, और 5), हेट (लेन 2), और एचएम (लेन 4)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: CRISPR मिश्रण में दाता ओलिगोस की दो अलग-अलग खुराकों में पुनर्संयोजन दक्षता। (A) डोनर ओलिगोस की विभिन्न खुराकों (25 या 50 ng / μL) के साथ इंजेक्ट किए गए मोरुले या ब्लास्टोसिस्ट के जीनोटाइपिंग परिणाम जंगली प्रकार (WT; लेन # 10, 12, और 14), विषमयुग्मजी / मोज़ेक (हेट / मोज़ेक; लेन # 1, 2, 3, 6, 8, 9, 11, और 13), होमोजीगस (होम; लेन # 4 और 5) या प्रवर्धित नहीं (लेन # 7)। जंगली प्रकार सकारात्मक नियंत्रण और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एच2ओ लेन # 17 और # 18 के बीच लोड किए गए थे। (B-D) पाई चार्ट दाता ओलिगोस (बी, सी) की दो अलग-अलग खुराकों में CRISPR मिश्रण की पुनर्संयोजन दक्षता का प्रतिनिधित्व करते हैं और दाता ओलिगोस (डी) के 50 एनजी / μL के साथ इंजेक्ट किए गए संस्थापक जानवरों की। ध्यान दें कि पैदा हुए 32 जानवरों में से 11 या तो माताओं द्वारा मारे गए थे या दूध छुड़ाने से पहले मर गए थे। पीसीआर में बढ़ाने में विफल रहे नमूनों को पुनर्संयोजन दक्षता की गणना में बाहर रखा गया था। सभी नमूनों से अलग-अलग जीनोटाइप दर को तालिका 3 और तालिका 4 में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नाम दृश्यों टिप्पणियाँ
crRNA 5' AUUCAGAGCGAGAGACACCAGU
UUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 3'		 रेखांकन CRSPR लक्ष्य अनुक्रम को इंगित करता है
ओलिगो डोनर डीएनए 5' CCCCACCAGGGGTGGACTGCTTCCTCTCACG
TCCCACGGAGAAAACCATCTTCATCATCTCTCTCT
TACTGGTGGTGGTCGTTGGTGTCTCTCTCGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT
GAATATCATTGAGCTCTTCTATGTCTTCTTCTC 3'		 रेखांकन उत्परिवर्तित कोडोन को इंगित करता है। मुट्ठी 60 बीपी टीटीए म्यूटेशन से पहले और 48 बीपी के बाद टीसीजी म्यूटेशन होमोलॉगी आर्म हैं
जीनोटाइपिंग प्राइमर आगे 5 ' TGGGATTGAAGAACGGCA 3'
जीनोटाइपिंग प्राइमर रिवर्स 5 'CCACGATAGCTAAGGGCTGGGG 3'

तालिका 1: अनुक्रम जानकारी.

घटक स्टॉक समाधान राशि अंतिम एकाग्रता
दाता oligo Rnase-free H2O में 1μg/μL 1.0 μL 50 ng/μL
GJA1 crRNA Rnase-free H2O में 1μg/μL 0.4 μL 20 ng/μL
ट्रैकरआरएनए Rnase-free H2O में 1μg/μL 0.8 μL 40 ng/μL
eSpCas9 प्रोटीन Rnase-free H2O में 1μg/μL 1.0 μL 50 ng/μL
आरएनएसे मुक्त इंजेक्शन बफर 0.1 mM EDTA pH 8.0 16.8 μL
10 mM Tris-HCl pH 7.5
100 mM NaCl
कुल मात्रा 20.0 μL

तालिका 2: CRISPR मिश्रण की नुस्खा.

लेन # (चित्रा 3) दाता ओलिगो conc. ओहदा प्रवर्धित नहीं जंगली प्रकार Het/mosaic होम नोट
1 50 ng/μl मोरुला Het/mosaic हटाने
2 50 ng/μl मोरुला Het/mosaic
3 50 ng/μl मोरुला Het/mosaic
4 50 ng/μl मोरुला होम
5 50 ng/μl मोरुला होम
6 50 ng/μl मोरुला Het/mosaic हटाने
7 50 ng/μl मोरुला N/A
8 50 ng/μl मोरुला Het/mosaic
9 50 ng/μl मोरुला Het/mosaic
10 50 ng/μl मोरुला जंगली प्रकार
11 50 ng/μl मोरुला Het/mosaic
12 50 ng/μl मोरुला जंगली प्रकार
13 50 ng/μl मोरुला Het/mosaic निवेशन
14 50 ng/μl मोरुला जंगली प्रकार
- 3/13 (23.1%) 8/13 (61.5%) 2/13 (15.4%)
15 25 ng/μl मोरुला N/A
16 25 ng/μl मोरुला N/A
17 25 ng/μl मोरुला N/A
18 25 ng/μl मोरुला N/A
19 25 ng/μl मोरुला जंगली प्रकार
20 25 ng/μl मोरुला N/A
21 25 ng/μl मोरुला जंगली प्रकार
22 25 ng/μl मोरुला जंगली प्रकार
23 25 ng/μl ब्लास्टोसिस्ट N/A
24 25 ng/μl ब्लास्टोसिस्ट जंगली प्रकार
25 25 ng/μl ब्लास्टोसिस्ट Het/mosaic
26 25 ng/μl ब्लास्टोसिस्ट जंगली प्रकार
27 25 ng/μl ब्लास्टोसिस्ट N/A
28 25 ng/μl ब्लास्टोसिस्ट जंगली प्रकार
29 25 ng/μl ब्लास्टोसिस्ट जंगली प्रकार
30 25 ng/μl ब्लास्टोसिस्ट Het/mosaic सम्मिलन/
31 25 ng/μl ब्लास्टोसिस्ट जंगली प्रकार
32 25 ng/μl ब्लास्टोसिस्ट Het/mosaic निवेशन
33 25 ng/μl ब्लास्टोसिस्ट जंगली प्रकार
- 9/12 (75.0%) 3/12 (25.0%) 0 (0.0%)

तालिका 3: Morula और ब्लास्टोसिस्ट से जीनोटाइपिंग परिणाम.

जानवर # दाता ओलिगो conc. ओहदा प्रवर्धित नहीं जंगली प्रकार Het/mosaic होम नोट
d1 50 ng/μl मृत पिल्ला जंगली प्रकार
d2 50 ng/μl मृत पिल्ला Het/mosaic
d3 50 ng/μl मृत पिल्ला Het/mosaic हटाने
d4 50 ng/μl मृत पिल्ला जंगली प्रकार
d5 50 ng/μl मृत पिल्ला Het/mosaic
d6 50 ng/μl मृत पिल्ला जंगली प्रकार
d7 50 ng/μl मृत पिल्ला Het/mosaic
d8 50 ng/μl मृत पिल्ला Het/mosaic
34 50 ng/μl लाइव पिल्ला Het/mosaic
35 50 ng/μl लाइव पिल्ला जंगली प्रकार
36 50 ng/μl लाइव पिल्ला जंगली प्रकार
37 50 ng/μl लाइव पिल्ला Het/mosaic स्वतंत्र रेखा के रूप में उपयोग किया जाता है
38 50 ng/μl लाइव पिल्ला जंगली प्रकार
39 50 ng/μl लाइव पिल्ला जंगली प्रकार
40 50 ng/μl लाइव पिल्ला जंगली प्रकार
41 50 ng/μl लाइव पिल्ला Het/mosaic
42 50 ng/μl लाइव पिल्ला जंगली प्रकार
43 50 ng/μl लाइव पिल्ला जंगली प्रकार
44 50 ng/μl लाइव पिल्ला जंगली प्रकार
45 50 ng/μl लाइव पिल्ला जंगली प्रकार
d1 50 ng/μl मृत पिल्ला होम
d2 50 ng/μl मृत पिल्ला जंगली प्रकार
d3 50 ng/μl मृत पिल्ला Het/mosaic
46 50 ng/μl लाइव पिल्ला Het/mosaic
47 50 ng/μl लाइव पिल्ला Het/mosaic निवेशन
48 50 ng/μl लाइव पिल्ला Het/mosaic निवेशन
49 50 ng/μl लाइव पिल्ला Het/mosaic
50 50 ng/μl लाइव पिल्ला जंगली प्रकार
51 50 ng/μl लाइव पिल्ला Het/mosaic स्वतंत्र रेखा के रूप में उपयोग किया जाता है
52 50 ng/μl लाइव पिल्ला जंगली प्रकार
53 50 ng/μl लाइव पिल्ला Het/mosaic सम्मिलन/
54 50 ng/μl लाइव पिल्ला जंगली प्रकार
16/32 (50.0%) 15/32 (46.9%) 1/32 (3.1%)

तालिका 4: संस्थापक जानवरों से जीनोटाइपिंग परिणाम।

वीडियो 1: भ्रूण के लिए CRISPR इंजेक्शन. CRISPR मिश्रण को चरण 2.4 में वर्णित 1-सेल चरण भ्रूण में इंजेक्ट किया जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 2: ब्लास्टोसिस्ट उठाओ. ब्लास्टोसिस्ट दिखा रहा प्रतिनिधि वीडियो चरण 2.6 में उठाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

जीन-संशोधित माउस मॉडल जीन फ़ंक्शन को समझने के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण है। हालांकि, चूंकि GJA1-20k आंतरिक रूप से अनुवादित आइसोफॉर्म का अनुवाद उसी Gja1 mRNA से पूर्ण-लंबाई Cx43 के रूप में किया जाता है, इसलिए पूर्ण-लंबाई Cx43 अभिव्यक्ति को बनाए रखने के लिए एक रचनात्मक रणनीति तैयार की गई थी, फिर भी GJA1-20k अभिव्यक्ति को दबाया गया था। दृष्टिकोण GJA1-20k के आंतरिक प्रारंभ कोडोन के उत्परिवर्तन पर आधारित है। एक एकल बिंदु उत्परिवर्तन के साथ, M213 को Gja1 mRNA पर L पर स्विच किया गया था, जो GJA1-20k अभिव्यक्ति को दबाने में सफल रहा, लेकिन पूर्ण-लंबाई Cx43 अभिव्यक्ति4 को बनाए रखा।

हालांकि, एकल आंतरिक अनुवाद प्रारंभ साइट के बिंदु-उत्परिवर्तन ने एक और कठिनाई प्रस्तुत की: माउस जीनोटाइप का निर्धारण। एक एकल अवशेष प्रतिस्थापन विशिष्ट प्राइमर बनाने के लिए बहुत छोटा है। इसके अतिरिक्त, डब्ल्यूटी और उत्परिवर्तन एलील में समान आधार जोड़े होते हैं। इन समस्याओं को हल करने के लिए जीनोटाइपिंग प्रोटोकॉल में एक और कदम जोड़ा गया था। चूंकि GJA1-20k (लक्षित उत्परिवर्तन साइट) के प्रारंभ कोडोन को प्रतिबंध एंजाइम, NlaIII द्वारा मान्यता प्राप्त है, इसलिए NlaIII द्वारा मान्यता प्राप्त नहीं होने वाली साइट उत्परिवर्तित थी (चित्रा 1; सीटीटीए के लिए कैटजी)। इसके अलावा, एक पीसीआर उत्पाद उत्पन्न करने के लिए प्राइमरों को डिज़ाइन किया गया था जिसमें कोई अन्य NlaIII उपयुक्त साइट नहीं है। प्रतिबंध एंजाइम के साथ एंजाइम पाचन चरण जोड़कर बिंदु-उत्परिवर्तित माउस लाइन के लिए एक उचित जीनोटाइपिंग प्रोटोकॉल स्थापित किया गया था। आम तौर पर, एंजाइम पाचन अल्पकालिक इनक्यूबेशन (37 डिग्री सेल्सियस पर 0.5-2.0 घंटे) द्वारा किया जाता है; रात भर इनक्यूबेशन (~ 16 ज) पूरी तरह से पूरे पीसीआर उत्पाद को पचाने की सिफारिश की जाती है। लक्ष्य अनुक्रम में उत्परिवर्तन की शुरूआत के परिणामस्वरूप डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती एलील के बीच गलत पहचान होती है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में पर्याप्त पाचन के लिए रात भर इनक्यूबेशन की सिफारिश की जाती है जब तक कि पसंद के प्रतिबंध एंजाइम में स्टार गतिविधि21 न हो।

वर्तमान परियोजना का उद्देश्य एटीजी (मेथिओनिन) को टीटीए (ल्यूसीन) में बदलकर दूसरी अनुवाद दीक्षा स्थल को बाधित करना है। NlaIII तेजी से स्क्रीनिंग के लिए एक सुविधाजनक प्रतिबंध एंजाइम है क्योंकि यह लक्ष्यीकरण साइट में CATG को पहचानता है। साइटोसिन (सी) अक्सर अनुवाद दीक्षा साइट से ठीक पहले KOZAK अनुक्रम के साथ जुड़ा हुआ है। NcoI (C/CATGG) और NdeI (CA/TATG) इस क्षेत्र में स्क्रीनिंग के लिए अन्य बहुमुखी प्रतिबंध एंजाइम हैं यदि वैकल्पिक कोडोन का उपयोग उन प्रतिबंध स्थलों के निर्माण/ विलोपन के लिए किया जाना चाहिए। यदि मूक उत्परिवर्तन की शुरूआत प्रतिबंध साइट-आधारित स्क्रीनिंग के लिए अनुमोदित नहीं है, तो व्यक्तिगत नमूनों के अनुक्रमण को22,23 की आवश्यकता होती है। इस परियोजना में, लक्षित पुनर्संयोजन काफी कुशल था।

यह M213L उत्परिवर्ती माउस लाइन हमें GJA1-20k के कार्य का विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है। हाल ही में, इस माउस लाइन का उपयोग करते हुए, यह पहचाना गया था कि GJA1-20kतस्करी और हृदय 4 में पूर्ण लंबाई वाले Cx43 गैप जंक्शनों के गठन के लिए आवश्यक है। दिलचस्प बात यह है कि होमोजीगस एम 213 एल उत्परिवर्तन (Gja1M213L / M213L), क्योंकि यह GJA1-20k उत्पन्न नहीं कर सकता है, हमेशा जन्म के 2-4 सप्ताह बाद अचानक मृत्यु में परिणाम देता है क्योंकि संबंधित दिल कार्डियक इंटरकैलेटेड डिस्क पर गैप जंक्शन नहीं बनाते हैं। इसके विपरीत, एक विषमयुग्मजी M213L उत्परिवर्तन सामान्य कार्डियक फ़ंक्शन के करीब प्रकट करता है, और चूहों में डब्ल्यूटी जानवरों के समान जीवन कालहोता है। पिछले इन विट्रो अध्ययन से यह भी पता चला है कि M213L उत्परिवर्तन उचित अंतराल जंक्शन गठन को बाधित करताहै। इसके अलावा, इस अंतर जंक्शन व्यवधान बहिर्जात GJA1-20k अभिकर्मक द्वारा बचाया जाता है। बेसल स्थिति4 और इन विट्रो अध्ययन 1 के तहत विषमयुग्मजी M213L उत्परिवर्ती माउस दिल में सामान्य अंतर जंक्शन गठन के आधार पर, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है किM213L उत्परिवर्तन के साथ पूर्ण लंबाई Cx43 एक अंतराल जंक्शन प्रोटीन के रूप में उचित कार्य बनाए रखता है।

Cx43 तस्करी में GJA1-20k की आवश्यक भूमिका के अलावा, GJA1-20k माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली को समृद्ध करता है, सुरक्षात्मक माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन और बायोजेनेसिस 3,24,25 को प्रेरित करता है। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के संदर्भ में, GJA1-20k (Gja1M213L / WT) के विषमयुग्मजी उत्परिवर्तन वाले चूहों में ischemia / reperfusion चोट के लिए अत्यधिक संवेदनशीलता है। जब ischemia / reperfusion के संपर्क में, वयस्क Gja1M213L / WT चूहों में उनके WT समकक्षों25 की तुलना में बहुत बड़ा infarct आकार और अधिक बाधित माइटोकॉन्ड्रिया होता है।

संक्षेप में, M213L उत्परिवर्तन युक्त नई माउस लाइन आंतरिक रूप से अनुवादित GJA1-20k के विश्लेषण के लिए सहायक है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पूर्ण लंबाई वाले Cx43 और छोटे GJA1-20k दोनों को सभी स्तनधारी अंग प्रणालियों में व्यक्त किया जाता है। भविष्य के अध्ययनों से एक्स्ट्राकार्डियक जीजेए 1-20के की भूमिका का पता लगाने की उम्मीद है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

परियोजना को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान (R01HL152691, R01HL138577, और R01HL159983) द्वारा RMS को समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL 8-Strip PCR tube Thomas Scientific 1148A28
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen 15575-038 For pronuclear micorinjection buffer
10x CutSmart buffer New England Biolabs B7204S Digestion buffer for NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7.5 Invitrogen 15567-027 For pronuclear micorinjection buffer
50x TAE Buffer Invitrogen 24710-030
96-well Thermal cycler Applied Biosystems Model # 9902
Agarose Sigma-Aldrich A9539
C57BL/6J The Jackson Laboratory 664 mouse strain
Chemidoc MP imaging system Bio-rad To take gel image by 302 nm UV light
eSpCas9 protein MilliporeSigma ESPCAS9PRO-50UG
Gel Lading Dye Purple (6x) New England Biolabs B7024S Loading buffer for electrophoresis
Gloves
hCG (human chorionic gonadotropin) MilliporeSigma 23-073-425G
Hyaluronidase MilliporeSigma H3884-100MG
Image Lab software Bio-rad To analyze gel image
Inverted stereo microscope whit plasDIC Zeiss Axiovert A1
KAPA Mouse Genotyping Kits Roche Diagnostics KK7352 For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix
KSOM LifeGlobal ZEKS-050 embryo culture medium
Lab coart
M2 medium MilliporeSigma MR015D
NlaIII New England Biolabs R0125S To digest PCR product
Nuclease-Free Water Ambion AM9937 To dilute reagents
Paraffin oil Nacalai USA 2613785
Plugged 20 μL fine pipette tip FisherScientific 02-707-171 To pick up blastocytes
PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin) ProSpec-Tany HOR-272
Sodium Chloride Invitrogen AM9760G For pronuclear micorinjection buffer
SYBR safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102 To detect bands in gel
tracrRNA Dharmacon U-002000-120 Guid RNA

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References

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पूर्ण लंबाई प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बनाए रखते हुए mRNA से एक आंतरिक ट्रांसलेशनल प्रारंभ साइट को निकालना
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Shimura, D., Hunter, J., Katsumata, M., Shaw, R. M. Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein. J. Vis. Exp. (181), e63405, doi:10.3791/63405 (2022).

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