Primer İnsan Burun Epitel Hücreleri: Hassas Tıp Bağlamında Biyobankacılık
Summary
Burada, hava-sıvı arayüzünde primer insan nazal epitel (HNE) hücrelerinin izolasyonu, amplifikasyonu ve farklılaşması ve güçlendirilmiş HNE’nin başarılı bir şekilde dondurulmasına ve daha sonra çözülmesine izin veren bir biyobankacılık protokolü açıklanmaktadır. Protokol, farklılaşmış HNE hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerini ve farklı modülatör tedavileri üzerine CFTR ile ilişkili klorür sekresyon düzeltmesini analiz eder.
Abstract
İnsan nazal epitel (HNE) hücrelerinin basit, invaziv olmayan nazal fırçalama ile toplanması kolaydır. Hasta kaynaklı primer HNE hücreleri, Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) fonksiyonunun bir indeksi olarak siklik AMP aracılı Klorür (Cl-) taşınımını ölçmek için hava-sıvı arayüz koşullarında psödo-tabakalı bir epitel haline getirilebilir ve farklılaştırılabilir. Burun fırçalama kalitesi ve kriyoprezervasyonda hücre yoğunluğu gibi kritik adımlar verimli bir şekilde gerçekleştirilirse, HNE hücreleri başarılı bir şekilde biyobankaya yatırılabilir. Ayrıca, kısa devre akım çalışmaları, donarak çözülmenin HNE hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerini ve CFTR modülatörlerine tepkisini önemli ölçüde değiştirmediğini göstermektedir. Bu çalışmada kullanılan kültür koşullarında, kriyov başına 2 x 106’dan az hücre dondurulduğunda, başarısızlık oranı çok yüksektir. Kriyov başına en az 3 x 106 hücre dondurmanızı öneririz. Bir CFTR düzelticisini bir CFTR güçlendiricisi ile birleştiren ikili tedavilerin, F508del-homozigot HNE hücrelerinde CFTR aktivitesi için karşılaştırılabilir bir düzeltme etkinliğine sahip olduğunu gösteriyoruz. Üçlü terapi VX-445 + VX-661 + VX-770, ikili terapi VX-809 + VX-770’e kıyasla CFTR aktivitesinin düzeltilmesini önemli ölçüde arttırmıştır. HNE hücrelerinde CFTR aktivitesinin ölçülmesi, CFTR modülatör tedavisine rehberlik etmek için yararlı olan umut verici bir klinik öncesi biyobelirteçtir.
Introduction
Kistik Fibrozis (KF), Epitel 1,2’nin apikal yüzeyinde bulunan bir anyon kanalı olan CFTR proteininin yokluğuna veya işlev bozukluğuna yol açan Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) genindeki mutasyonlardan kaynaklanan otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. CFTR tedavisindeki son gelişmeler hastalığın prognozunu iyileştirmiş ve CFTR düzelticileri ile CFTR güçlendiricilerini birleştiren son onaylanmış ilaçlar, en sık görülen p.Phe508del mutasyonu (F508del)3,4 mutasyonunu taşıyan KF hastalarında akciğer fonksiyonlarında ve yaşam kalitesinde önemli iyileşmelere yol açmıştır. Bu umut verici terapötik ilerlemeye rağmen, KF hastalarının yaklaşık% 10’u, bu CFTR modülatörleri tarafından kurtarılamayan mutasyonlar taşıdıkları için uygun değildir. Bu hastalar için, spesifik mutasyonlar için en etkili kombinasyonu bulmak için diğer ilaçları veya ilaç kombinasyonlarını test etmeye ihtiyaç vardır ve kişiselleştirilmiş tedavilerin önemini vurgulamaktadır.
İnsan nazal epitel (HNE) hücrelerinin basit, invaziv olmayan nazal fırçalama ile toplanması kolaydır ve CFTR fonksiyonunun bir indeksi olarak siklik AMP aracılı Klorür (Cl−) transportunun nicelleştirilmesine izin verir. HNE hücreleri, insan hava yolunun doğru bir modelini verir, ancak ömürleri kültürde sınırlıdır. Kültür tekniklerinin optimizasyonu sayesinde, hasta kaynaklı primer HNE hücreleri, Rho ile ilişkili kinaz inhibitörü (ROCKi) ile şartlı olarak yeniden programlanabilir, çoğaltılabilir ve mikro gözenekli filtrelerüzerindeki hava-sıvı arayüzü (ALI) koşullarında psödo-tabakalaşmış bir epitel haline getirilebilir 5,6. HNE kültürü için çok sayıda kültür protokolü mevcuttur (ticari olarak temin edilebilir, serumsuz, “ev yapımı”, besleyici hücrelerle ortak kültür, vb.) ve büyümeyi, hücre popülasyonu farklılaşmasını ve epitel fonksiyonunu etkileyecek şekilde medya ve kültür koşullarının seçimi tanımlanmıştır 7,8. Buradaki protokol, CFTR fonksiyon tahlilleri için ALI’de farklılaştırılan çok sayıda HNE hücresinin başarılı bir şekilde elde edilmesini sağlayan basitleştirilmiş, besleyicisiz, ROCKi amplifikasyon yöntemi sunar.
Diferansiye HNE hücrelerinde, CFTR modülatörleri ile 48 saatlik bir tedavinin, CFTR’ye bağımlı Cl– akımının elektrofizyolojik düzeltmesini indüklemek için yeterli olduğunu ve in vitro olarak gözlenen düzeltmenin hastanın klinik iyileşmesi ile ilişkili olabileceğini gösterdik9. Bu nedenle HNE hücreleri, sadece temel KF araştırmaları için değil, hastaya özgü KFTR modülatör testi ile klinik öncesi çalışmalar için de uygun bir modeli temsil etmektedir. Bu kişiselleştirilmiş tedavi bağlamında, protokolün amacı, koşullarımızda yetiştirilen KF hastalarından kriyokorunmuş HNE hücrelerinin CFTR düzeltme çalışmaları için uygun bir model olduğunu doğrulamaktı ve taze ve dondurulmuş çözülmüş hücrelerden CFTR’ye bağımlı Cl-transportunu karşılaştırırken benzer sonuçlar beklenebilirdi. Çalışma ayrıca ikili ve üçlü tedaviler kullanırken farklı CFTR modülatörlerinin etkinliğini de değerlendirdi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kişiselleştirilmiş tıp bağlamında CFTR aktivitesini ölçmek için insan bronşiyal epitel (HBE) hücreleri için vekil olarak hasta kaynaklı nazal epitel hücrelerinin kullanılması, HNE üreme hücrelerinin kültür 9,11’deki özellikleri olarak önerilmiştir. HNE’nin HBE hücre kültürlerine göre güçlü avantajı, kolayca ve invaziv olmayan bir şekilde örneklenmeleridir. HNE hücre kültürlerinde kısa devre akım ölçümleri, epitel boyunca C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışmaya katıldıkları için tüm hastalara ve ailelerine içtenlikle teşekkür ederiz. Bu çalışma Fransız Derneği Vaincre la Mucoviscidose’den gelen hibelerle desteklendi; Fransız Birliği ABCF 2 ve Vertex İlaç İnovasyon Ödülleri.
Materials
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
- Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
- Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
- Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
- McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
- Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
- Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
- Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
- Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
- Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
- Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
- Dale, T. P., Borg D’anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
- Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).
- Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).
